CN114807069A - 一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法。本发明的发酵方法分为酵母菌活化，驯化，接种发酵和纯化等步骤，且制备了特殊的底层填充凝胶的发酵培养基，配合金属离子溶液，实现了增强酶活并同时交联凝胶基质的协同作用，分析了盐析、离子层析、凝胶过滤等多种纯化方式，选择了最优条件，制备了高纯度高酶活的乳酸脱氢酶，是一种短周期产酶，高纯度提酶，更适用于工业化、规模化生产的新型乳酸脱氢酶发酵制备方式。

Description

一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法。
背景技术
乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，简称LDH)普遍存在于微生物及动物脏器中，是一种糖酵解酶，主要作用是催化乳酸氧化成丙酸，可分为D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和L-乳酸脱氢酶(L-LDH)，目前主要应用到白血病、心肌梗塞、肿瘤等的诊断中；可以作为食品添加剂于发酵奶制品、腌渍品、糖果制品和饮料等生产中，是生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒的主要原料。
目前制备乳酸脱氢酶方法有很多，传统的方法为利用动物的脏器制备乳酸脱氢酶，其缺陷在于脏器中其它组织的干扰因素较多，要去除其它无用组织并切碎，费时费力，LDH提取率较低，而且动物脏器成本较高，不易得到，无法应用到工业大规模生产。
利用微生物发酵的方法也有报道，例如CN102653735A公开了一种海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法，对菌种进行6～10次活化，再经定向驯化4～6次，在18～24℃逐级扩大培养，接入液体发酵培养基，在18～24℃培养至海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；后处理为离心，洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，石英研磨，收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
上述方法需要特殊菌种且需要对菌种进行长周期的活化和驯化，关键的，其得到粗酶液后，并未提出对提纯步骤的改进，公知的，在工业化生产中后续提纯处理的步骤是决定整个制备周期长短的关键步，相对于生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂所需的纯度，其提纯需要盐析、透析抽取、离子交换层析或其他如凝胶色谱过滤等提纯方法。综上，上文所述方法不适于工业生产，且耗时耗力成本较高。
因此，寻求一种易得到的菌种发酵制备乳酸脱氢酶，并具有简单的生产工艺流程，且成本较低可用于工业上生产的方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，提升乳酸脱氢酶提取率，简化纯化步骤以及便于工业化、规模化生产乳酸脱氢酶，本发明以易得的酵母菌作为发酵菌种，合理配置培养基，经活化，驯化，接种发酵和纯化等步骤，实现了短周期产酶，高纯度提酶，更适用于工业化、规模化生产的新型乳酸脱氢酶制备方式。
具体的，本发明的技术方案如下：
1.一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，步骤如下：
(1)酵母菌置于培养基A进行2次活化，酵母菌为市售酵母菌，优选的，为酿酒酵母菌；
(2)将活化后的酵母菌原始菌种接入培养基B，培养24～48h，得到液体菌液；
(3)液体菌液按1/10mL～1/8mL接入凝胶发酵培养基，再加入总浓度为0.5mmol/L～1.5mmol/L的金属离子化合物溶液，所述金属离子化合物的金属离子包括Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Fe3+中的至少一种，培养24h～48h；
(4)培养完成后，将凝胶发酵培养基用缓冲液洗脱，得发酵液，离心，洗涤，收集沉淀细胞；
(5)将沉淀细胞破碎，离心，收集上清液，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
(6)将得到的粗酶液纯化，纯化方式包括但不限于盐析、透析抽取、离子层析、凝胶过滤，制得乳酸脱氢酶。
步骤(1)中，培养基A为麦芽汁液体培养基，组分包括麦芽膏粉、琼脂粉、氯霉素和蒸馏水，其中按质量比，麦芽膏粉：琼脂粉：氯霉素为1000～1300：100～150：1。
步骤(2)中，培养基B为基础培养基，组分包括麦芽糖、酵母粉、琼脂粉、NaCl、KH2PO4·H2O、MgSO4、蒸馏水，其中按质量比，麦芽糖：酵母粉：琼脂粉：NaCl、KH2PO4·H2O、MgSO4为8～10：5～10：2～3：1：2：1；
步骤(3)中，发酵培养基组分包括但不限于凝胶、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、KH2PO4·H2O、吐温60、MgSO4、NaCl、丙酸钠、蒸馏水，其中按质量比，蛋白胨：酵母粉：葡萄糖：KH2PO4·H2O：吐温60：MgSO4：NaCl：丙酸钠为4～6：3～4：90～100：1～2：3～6：1：1：1.5～2；
上述培养基配置完成后，于121℃下灭菌20min。
步骤(3)中，凝胶为添加蒸馏水、交联剂至聚糖类物质中制备的交联多糖，即天然生物质凝胶，天然生物质凝胶填充至发酵培养基底层，占培养基总容量的1/6～1/5，凝胶上层为发酵培养基组分，本发明在凝胶基质的选择上做了详细实验，实验结果表明，单体聚合类凝胶因其可控稳定的分子量，具有更好的过滤性，但因可能残留的有害单体，不适用于发酵体系，不适合酵母菌的生长。
优选的，所述凝胶交联剂包括但不限于硼砂、磷酸酯、N,N聚丙烯酰胺，凝胶的选择为黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、瓜尔胶、苹果胶等交联的聚糖类物质，为实现发酵时兼顾提纯的目的，其他的生物质凝胶也包含在本发明的选择之内。
本发明凝胶作用为在发酵过程中逐步的将大分子物质和小分子物质分开，使得发酵完成后，酶的纯度更高，同时添加金属离子一方面提高酶的活性，另一方面，在凝胶-培养液离子迁移速率平衡后，金属离子与凝胶多糖的螯合作用可以保证凝胶的孔径稳定，防止凝胶在过渡溶胀后孔径扩大，导致所得产物过多渗析。
进一步的，步骤(3)中，接入液体菌液后，蒸馏水配置溶液，总浓度为0.1mmol/L～1.5mmol/L，溶质为Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Fe3+对应金属离子化合物中的至少一种，其金属离子化合物包括但不限于氯化物、硫酸盐，由流量控制器按10mL/min加入发酵培养基至凝胶-培养液离子迁移速率平衡；
优选的，所述溶质为Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+对应金属离子化合物中的至少一种；
优选的，所述溶质为Zn2+、Ca2+、Mg2+对应金属离子化合物中的至少一种；
优选的，所述溶质为Zn2+或Ca2+对应金属离子化合物；
优选的，所述溶质为ZnCl2或ZnSO4；
优选的，上述凝胶-培养液离子迁移速率由原子吸收检测，包括发酵液离子检测和凝胶最大溶胀离子释放检测。
步骤(4)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，洗脱速率为0.5mL/min。
步骤(5)中，沉淀细胞破碎方式为超声波破碎和研磨器加石英砂研磨破碎中的一种；
优选的，细胞破碎方式为超声波破碎。
步骤(6)中，乳酸脱氢酶粗酶液经40％～75％饱和硫酸铵盐析、透析抽取、离子交换层析，制得乳酸脱氢酶酶液；
优选的，乳酸脱氢酶粗酶液纯化步骤为：乳酸脱氢酶粗酶液经40～75％饱和硫酸铵盐析、转入透析袋中，以0.07mol/LpH＝7.38磷酸盐缓冲液为透析外液，透析20～40h，至透析外液紫外扫描曲线不再降低时结束透析、离子交换层析，制得乳酸脱氢酶酶液；
优选的，乳酸脱氢酶粗酶液纯化步骤为：向粗酶液中加入饱和度为40～75％硫酸铵，4℃静置，离心，将沉淀溶于磷酸缓冲液中，然后使用透析袋进行透析，在碳酸氢钠和EDTA中将透析袋煮沸，用蒸馏水彻底清洗干净，再置EDTA中煮沸，冷却后，存放于4℃，确保透析袋始终浸没在EDTA溶液内，使用前在透析袋内清洗干净，得到初步提纯的酶液；
优选的，饱和硫酸铵的饱和度为40～50％；
更优选的饱和硫酸铵的饱和度为45％；
优选的，纯化步骤为：LDH粗酶液经凝胶过滤，脱盐，洗脱液洗脱，凝胶色谱分析，制得LDH酶液。
此外，除上述方法，可根据不同需要和使用对象不同，将得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明的有益效果在于：
1.本发明所用菌种为市售酵母菌，价廉易得，且活化、驯化步骤简单，无需多次重复，LDH收率高，盐析收率达80％，纯化后的纯化倍数高；
2.本发明的发酵培养基为特制的培养基，包括上层的发酵液和下层的凝胶层，通过控制交联凝胶的孔径，在发酵过程中实现了酶和小分子杂质的分离，极大降低了后续提纯的难度，缩短了提纯周期，有利于大规模、工业化生产，其次考虑到发酵液含水量较高，凝胶在发酵液中会随时间进一步溶胀，本发明在发酵液中加入金属离子，金属离子可作为凝胶交联剂，凝胶多糖的螯合作用可以保证凝胶的孔径稳定，防止凝胶在过渡溶胀后孔径扩大，导致所得产物过多渗析，此外，金属离子的添加还取得了意料不到的技术效果，进一步的增加了酶的活性，实现了增强酶活并同时交联凝胶基质的协同作用，可根据实际需求，选择不同的金属离子，使发酵生产的灵活性得以提高。
3.本发明发酵制备的乳酸脱氢酶粗酶液即具有较高纯度，且酶活较高，进一步提纯主要应用于纯度要求高的丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒，若其他用途，如酒类发酵添加剂，则可以直接应用。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本公开的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1为0.5mmol/L、1mmol/L的Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Fe3+对LDH相对酶活的影响柱状图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明酵母菌为市售酿酒酵母菌；
麦芽汁液体培养基采用协定法配置；
实施例1
一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，步骤如下：
(1)培养基制备，步骤如下：
1)麦芽汁液体培养基：麦芽膏粉130.0g、琼脂15.0g、氯霉素0.1g、蒸馏水定容到1.0L，121℃灭菌20min；
2)基础培养基：麦芽糖5.0g、酵母粉5.0g、琼脂粉1.5g、NaCl 0.5g、KH2PO4H2O1.0g、硫酸镁0.5g，蒸馏水定容到1.0L，121℃灭菌20min。
3)发酵培养液：蛋白胨3g、酵母粉2g、葡萄糖50g、KH2PO4H2O 1.0g、吐温603mL、硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、丙酸钠0.8g、定容到1000ml、pH6.5，121℃灭菌20min；
4)凝胶发酵培养基制备：0.5mL甘油溶于150mL蒸馏水，在磁力搅拌下加入10g黄原胶胶粉，滴加3％硼酸盐溶液直至交联形成凝胶，填充至发酵培养基底部，占培养基底层1/6，保持上平面平整，与培养基壁间隙≤0.5mm，上层为发酵培养液；
(2)取一环菌种加入装有已灭菌的10mL麦芽汁试管中，26℃条件下培养24h后，加入到装有150mL的灭菌的麦芽汁液体培养基，26℃条件下培养24h后，弃去上清液，麦芽汁液体培养基底的酵母泥作为原始菌种，分离或扩培，培养时每8h摇一次；
(3)取一环活化后的原始菌种接入到装50ml基础培养基(121℃，20min高温灭菌)，30℃摇床培养24h；
(4)取10mL菌液接入100mL液体发酵液，置于凝胶发酵培养基中，滴加0.6mmol/L的ZnCl2溶液，由流量控制器按10mL/min加入发酵培养基至凝胶-培养液离子迁移速率平衡，在30℃培养48h，磷酸盐缓冲液洗脱凝胶，将得到的发酵液在5000r/min离心12min，用生理盐水洗涤2次之后，离心收集沉淀；
(5)将湿菌液与适量的磷酸缓冲液混匀，使用超声波细胞粉碎仪(功率300w，振幅25％)，将细胞破碎15min，然后12000r/min离心10min，粗酶液存在于上清液中；
(6)向粗酶液中加入饱和度为45％硫酸铵，4℃静置12h，12000r/min离心10min，将沉淀溶于pH6.5磷酸缓冲液中，然后使用透析袋进行透析，在1L的2％(W/V)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸12min，用蒸馏水彻底清洗干净，再置1mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸12min，冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在EDTA溶液内，使用前在透析袋内清洗干净。得到初步提纯的酶液；
(7)将(6)得到的酶液，使用DEAE-52离子交换层析进行纯化，DEAE-52离子交换纤维素经处理后装柱，离子交换纤维素层析柱经BufferA液(0.02mol/LTris-HCl，pH8.0)充分平衡。将预先用BufferA充分透析的酶液缓缓上柱，随即穿过层析柱流出。用相同缓冲液洗涤(流速1mL/min)。待杂质完全流出层析柱后，改用0.05mol/L EDTA溶液洗脱，收集酶液。
实施例2
培养基制备方法同实施例1相同，不同之处在于：凝胶制备：0.5mL甘油溶于130mL蒸馏水，在磁力搅拌下加入10g瓜尔胶胶粉，滴加4％wt硼酸盐溶液直至交联形成凝胶，填充至发酵培养基底部，保持上平面平整，紧贴培养基壁。
(1)利用麦芽汁液体培养基对酵母菌进行2次的复壮活化，有利于恢复菌种的性能；
(2)取一环活化后的原始菌种接入到装50mL基础培养基(121℃，20min高温灭菌)，30℃摇床培养24h；
(3)将液体菌液按10mL接入100mL发酵液的凝胶发酵培养基中，凝胶占培养基底层1/5，滴加1mmol/L的ZnCl2溶液，由流量控制器按10mL/min加入发酵培养基至凝胶-培养液离子迁移速率平衡，在30℃培养24h，磷酸盐缓冲液洗脱凝胶，得到发酵液，5000r/min离心12min，用生理盐水洗涤2次之后，离心收集沉淀，在30℃中培养24h；
(4)将得到的发酵液在5000r/min离心12min，用生理盐水洗涤2次之后，离心收集沉淀；
(5)将湿菌液与适量的缓冲液混匀，使用超声波细胞粉碎仪破碎细胞，然后离心，粗酶存在于上清液中；
(6)将得到的粗酶液进一步分离纯化，经40％饱和硫酸铵盐析，转入透析袋中，以0.07mol/LpH＝7.38磷酸盐缓冲液为透析外液，透析36h，至透析外液紫外扫描曲线不再降低时结束透析、离子交换层析，制得乳酸脱氢酶酶液。
实施例3
培养基制备方法同实施例1相同，不同之处在于：
凝胶制备：0.5mL甘油溶于100mL蒸馏水，在磁力搅拌下加入10g卡拉瓜尔胶胶粉，10μL移液枪滴加分析纯磷酸酯直至交联形成凝胶，填充至发酵培养基底部，保持上平面平整，紧贴培养基壁。
(1)取一环菌种加入装有已灭菌的10mL麦芽汁液体培养基中，26℃条件下培养24h后，加入到装有150mL的灭菌的麦芽汁液体培养基中，26℃条件下培养24h后，弃去上清液，麦芽汁液体培养基底的酵母泥作为原始菌种，由于分离或扩培，培养时每8h摇一次；
(2)取一环活化后的原始菌种接入到装50mL基础培养基(121℃，20min高温灭菌)，30℃摇床培养24h；
(3)取8mL菌液接入100mL液体发酵液，置于凝胶发酵培养基中，滴加0.5mmol/L的Mg2+溶液，由流量控制器按5mL/min加入发酵培养基至凝胶-培养液离子迁移速率平衡，在30℃培养36h，磷酸盐缓冲液洗脱凝胶，将得到的发酵液在5000r/min离心12min，用生理盐水洗涤2次之后，离心收集沉淀；
(4)将湿菌液与适量的磷酸缓冲液混匀，使用超声波细胞粉碎仪(功率300w，振幅25％)，将细胞破碎15min，然后12000r/min离心10min，粗酶液存在于上清液中；
(5)提纯：同实施例2。
实施例4
制备乳酸脱氢酶LDH过程同实施例1，不同之处在于，接种步骤，如下：
酿酒酵母扩培培养基为麦芽汁液体培养基，采用协定法制备：取50g粉碎麦芽，加入200mL 46～47℃的水，45℃水浴保温30min，并不断搅拌以1℃/min升温至70℃：加入100mL70℃的水保温1h然后在10～15min内冷却至室温：加水定量至450g，过滤得澄清麦芽汁，分装后121℃湿热灭菌20min后备用。
取8mL酵母菌液接入100mL液体发酵液，置于凝胶发酵培养基中，滴加0.12mmol/L的Fe2+溶液，由流量控制器按10mL/min加入发酵培养基至凝胶-培养液离子迁移速率平衡，在30℃培养36h，磷酸盐缓冲液洗脱凝胶，将得到的发酵液在5000r/min离心12min，用生理盐水洗涤2次之后，离心收集沉淀。
实施例5
在4℃条件下，酿酒酵母的乳酸脱氢酶的粗酶液中缓慢加入固体硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和度为40％，2h后5000r/min离心12min，取上清液，测上清液酶活力和蛋白质含量：再缓慢搅拌上清液并添加固体硫酸铵粉至45％饱和度。重复以上操作至上清液硫酸铵饱和度分别达40％、45％、50％、55％、65％和75％，测量各饱和度条件下离心后上清液的乳酸脱氢酶活力和蛋白浓度。确定合适的硫酸铵饱和度。
Figure BDA0003649110080000111
Vt——反应液总体积；
Vs——样品体积；
△A——每分钟吸光度变化；
6.22——还原型辅酶I(NADH)摩尔吸光系数；
取适量酿酒酵母LDH粗酶液，于5mL离心管中60～70℃保温15～20min，
5000r/min离心12min取上清液，即为灭活酶溶液。
表1酿酒酵母乳酸脱氢酶粗酶液的硫酸铵盐析数据
Figure BDA0003649110080000112
当粗酶液的硫酸铵饱和度为40％～50％时，酶活力下降缓慢，而在其它的浓度范围内，酶活力下降的比较快，酶的比活在40％～50％时稳定，之后则呈下降趋势。综合考虑硫酸铵盐析过程中杂蛋白的去除效果以及酶活力和比活的变化情况，选取粗酶液盐析的硫酸铵饱和度为45％。
实施例6
金属离子对乳酸脱氢酶活性的影响，实验步骤如下：
将50ul纯化乳酸脱氢酶与50uL浓度分别为0.5、1.0mmol/L的Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+溶液混合，在冰浴中放置15min后，在测得的最适pH和温度条件下反应，测定酿酒酵母乳酸脱氢酶活力。空白酶液做对照，研究不同金属离子对酶活性的影响。
实验结果如图1所示，可以看出，Zn2+，Mg2+、Ca2+、Fe2+对酶活力具有促进作用。其中Zn2+对酶活的影响最大，Zn2+是LDH的活性基，对LDH酶活有促进作用，且不过其促进作用和浓度的关系不大。Fe3+对酶活力起抑制作用，但在本发明中，Fe3+与凝胶基质的螯合作用特别明显，因此，在一定情况下，也可以选择Fe3+作为组分添加项，最后Fe2+的作用不是太明显，酶活基本上没有受到影响。
此外，当本发明提取LDH用于生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒时，Fe3+或者Fe2+因离子颜色和颜色反应不适用于制备白色试剂条。
因酶活受pH的影响，在添加金属离子时需要考虑对pH的影响，因此，可以将不同离子混合使用以达到最适pH，本发明培养液添加有缓冲液，pH影响不大，故不再做细致研究。
实施例7
培养基凝胶层的影响，步骤如下：
设不含凝胶层的发酵培养基作为对照组，以实施例1的盐析纯化方式，以实施例5方法分析对酶活的影响，结果如下：
表3盐析纯化后不同实施例的酶比活和收率
Figure BDA0003649110080000131
结果表明，在发酵过程中，凝胶层对酶的分离起到了较为显著的作用，且本发明在更换不同缓冲液洗脱时的结果差距不大，因此在工业生产时可在成本角度选择合适的缓冲液。
实施例8
乳酸脱氢酶纯化结果对比：
交联葡聚糖凝胶过滤：Sephadex G-25凝胶过滤柱，先用0.01mol/L，pH8.0的Tris-HC1缓冲液平衡，将经过层析得到的具有活力的试样上样，再用此缓冲液洗脱，洗脱液流速为0.2mL/min。合并各蛋白峰对应的试管中的溶液，测定其酶活力，洗脱液在280m下进行紫外检测，对有酶活的样品测定其蛋白含量。得到的乳酸脱氢酶纯化酶液于4℃保存备用。
表3酿酒酵母乳酸脱氢酶分离纯化结果
Figure BDA0003649110080000132
Figure BDA0003649110080000141
乳酸脱氢酶的盐析酶活回收率达到80％，凝胶过滤等纯化步骤的纯化倍数为15.7，回收率为27％，分离纯化效果十分显著。

Claims (10)

1.一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，步骤如下：
(1)酵母菌置于培养基A进行2次活化；
(2)将活化后的酵母菌原始菌种接入培养基B，培养24～48h，得到液体菌液；
(3)液体菌液按1/10mL～1/8mL接入凝胶发酵培养基，再加入总浓度为0.5mmol/L～1.5mmol/L的金属离子化合物溶液，所述金属离子化合物的金属离子包括Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Fe3+中的至少一种，培养24h～48h；
(4)培养完成后，将凝胶发酵培养基用缓冲液洗脱，得发酵液，离心，洗涤，收集沉淀细胞；
(5)将沉淀细胞破碎，离心，收集上清液，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
(6)将得到的乳酸脱氢酶粗酶液纯化，即得到乳酸脱氢酶，纯化方式包括盐析、透析抽取、离子层析和凝胶过滤。
2.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养基A为麦芽汁液体培养基，组分包括麦芽膏粉、琼脂粉、氯霉素和蒸馏水，其中按质量比，麦芽膏粉：琼脂粉：氯霉素为1000～1300：100～150：1。
3.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养基B为基础培养基，组分包括麦芽糖、酵母粉、琼脂粉、NaCl、KH2PO4·H2O、MgSO4、蒸馏水，其中按质量比，麦芽糖：酵母粉：琼脂粉：NaCl、KH2PO4·H2O、MgSO4为8～10：5～10：2～3：1：2：1。
4.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(3)中，凝胶发酵培养基组分包括蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、KH2PO4·H2O、吐温60、MgSO4、NaCl、丙酸钠，其中按质量比，蛋白胨：酵母粉：葡萄糖：KH2PO4·H2O：吐温60：MgSO4：NaCl：丙酸钠为4～6：3～4：90～100：1～2：3～6：1：1：1.5～2。
5.如权利要求2或3或4所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述培养基A或培养基B或凝胶发酵培养基配置完成后，于121℃下灭菌20min。
6.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(3)中，
所述凝胶发酵培养基为底层填充有凝胶的发酵培养基，凝胶占发酵培养基总容量的1/6～1/5；
接入液体菌液后，再加入总浓度为0.5mmol/L～1.5mmol/L的金属离子化合物溶液，所述金属离子化合物的金属离子包括Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Fe3+中的至少一种，由流量控制器按10mL/min加入发酵培养基至凝胶-培养液离子迁移速率平衡。
7.如权利要求6所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述凝胶的基质为黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、瓜尔胶中的至少一种。
8.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，洗脱速率为0.5mL/min；步骤(5)中，沉淀细胞的破碎方式为超声波破碎和研磨器加石英砂研磨破碎中的一种。
9.如权利要求1所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤(6)中，乳酸脱氢酶粗酶液经40％～75％饱和硫酸铵盐析、透析抽取、离子交换层析，制得乳酸脱氢酶。
10.如权利要求9所述的一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，乳酸脱氢酶粗酶液经45％饱和硫酸铵盐析、转入透析袋中，以0.07mol/LpH＝7.38磷酸盐缓冲液为透析外液，透析20～40h，至透析外液紫外扫描曲线不再降低时结束透析、离子交换层析，制得乳酸脱氢酶。
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