CN103305495B - 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 - Google Patents
一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103305495B CN103305495B CN201310244021.3A CN201310244021A CN103305495B CN 103305495 B CN103305495 B CN 103305495B CN 201310244021 A CN201310244021 A CN 201310244021A CN 103305495 B CN103305495 B CN 103305495B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- reverse micelle
- glutamic decarboxylase
- described step
- gad
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种制备谷氨酸脱羧酶的方法，步骤如下：（1）含谷氨酸脱羧酶的微生物细胞培养、离心收集细胞、细胞破碎，调细胞破碎液的pH值和离子强度；（2）配制反胶团萃取体系溶液和反萃取水相溶液；（3）利用反胶团进行萃取；（4）进行反萃取，得到含谷氨酸脱羧酶的水溶液；（5）超滤膜过滤浓缩，截留液冷冻干燥，制得谷氨酸脱羧酶产品。本发明可实现谷氨酸脱羧酶制备的连续化、规模化，并且酶的制备工艺简便，生产周期短，酶活力回收率高，萃取剂可循环使用，谷氨酸脱羧酶的生产成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备谷氨酸脱羧酶的方法，特别涉及利用反胶团萃取技术制备谷氨酸脱羧酶的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）是一种吡哆醛类裂解酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。谷氨酸脱羧酶是生物催化L-谷氨酸或其钠盐上的α-羧基进行脱羧反应生成γ-氨基丁酸和CO2的唯一酶，它还极可能作为特定的诊断酶来预测和区分糖尿病以及作为极具潜力的诊疗型酶制剂。
谷氨酸脱羧酶所催化产生的γ-氨基丁酸具有降血压、增进脑活力、营养神经细胞、保持神经安定、促进生长激素分泌和保肝利肾等多种生理功能，在医药和保健食品中具有广泛的应用价值，已被我国卫生部列为“新资源食品”。因此，GAD用于医疗和食品具有很大的潜力。利用游离或固定化谷氨酸脱羧酶进行γ-氨基丁酸的生物制备日益得到重视，与细胞催化相比，可以避免细胞自身代谢产物对产品的污染、简化γ-氨基丁酸的分离纯化过程、降低生产成本，目前谷氨酸脱羧酶的生产和纯化逐渐形成产业，有很好的市场前景。
谷氨酸脱羧酶的生产主要采用微生物发酵法和植物提取法。植物提取法是从大豆、米糠、大米胚芽、玉米胚芽等中提取，由于植物中谷氨酸脱羧酶的含量较低，提取前常需要对其内源性酶进行激活，导致生产成本较高，不利于大规模生产。微生物发酵法是以葡萄糖为原料，通过培养具有高活性谷氨酸脱羧酶的微生物细胞如大肠杆菌、乳酸菌等获得，其具有原料来源广泛、发酵周期短、生产成本低、易于实现工业化的特点，是一种经济有效的生产方法。微生物发酵法制备谷氨酸脱羧酶的过程包括微生物细胞的培养和酶的分离纯化，在酶的生产成本构成中，分离纯化等下游工序的成本占有相当大的比例，因此，如何采用高效的分离技术是谷氨酸脱羧酶生产中需要解决的技术问题。
目前，谷氨酸脱羧酶的分离纯化方法主要采用盐析法、离子交换法、凝胶色谱法等，如许建军（无锡轻工大学学报，2004.3）在进行谷氨酸脱羧酶酶学性质研究时，采用硫酸铵分级、DEAE-Sepharose CL-6B层析、Sephacryl S-200凝胶过滤等手段从乳酸菌细胞中分离纯化得到了收率为3.8%的纯谷氨酸脱羧酶。侯远策（黑龙江大学硕士论文，2011）在进行乳酸片球菌产谷氨酸脱羧酶的研究时，采用硫酸铵盐析、Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析对GAD进行了分离纯化，得到了收率为15.1％的纯谷氨酸脱羧酶。中国专利文献CN102367432A（申请号201110289796.3）采用镍柱亲和层析纯化方法获得谷氨酸脱羧酶。上述方法存在工艺复杂、生产周期较长、酶活力回收率低、不能连续生产等问题，从而导致了谷氨酸脱羧酶的生产成本较高。因此，改进现有生产技术以及开发新的生产技术以降低谷氨酸脱羧酶的生产成本势在必行。
反胶团萃取技术是一种新型的生物分离技术，是分离纯化生物活性物质的有效方法。反胶团是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的、内含微小水滴的、空间尺度仅为纳米级的集合型胶体，反胶团的微小界面和微小水相具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能和在疏水性环境中使亲水性大分子保持活性的功能。反胶团在生物分离过程中具有以下突出的优点：有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；分离和浓缩可同时进行，过程简便；能解决生物活性物质在非细胞环境中迅速失活的问题；易于放大和实现工业化生产；溶剂可反复使用，萃取成本低等。
在生化分离工程中形成反胶团体系常用的表面活性剂有阴离子型表面活性剂如琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）、阳离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）以及非离子型表面活性剂如失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80），常用的非极性有机溶剂有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷等，常用的助溶剂有丁醇、戊醇、己醇等。CTAB是一种阳离子型表面活性剂，形成的反胶团体系适用于相对分子量较大的蛋白质的分离，而Span80是一种非离子型表面活性剂，当其与阳离子型表面活性剂混合在一起形成反胶团时，能增大反胶团的尺寸，使大分子蛋白质的溶解度增加，并且CTAB和Span80构成的反胶团体系对蛋白质还具有更高的分离效率；当在有机溶剂中加入己醇等助溶剂时，也可增大反胶团的尺寸，使大分子蛋白质的溶解度增加。CTAB与异辛烷等形成的反胶团体系在生化分离工程中应用较多，它们形成的反胶团体系结构简单而稳定，体积相对较大，适用于蛋白质、酶等大分子的分离。采用反胶团萃取技术可实现酶分子的分离纯化，其生产成本较低，并能实现连续生产，具有很好的工业应用前景。
如中国专利文献CN1690196A（申请号200410037391.0）公开了一种利用反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，以纳豆激酶粗提液作为水相与反胶团溶液按比例混合，在10-35℃下进行萃取，使纳豆激酶进入反胶团溶液；再在反萃液中进行反萃取，在20-45℃温度下离心，分离得到纯化后的纳豆激酶水溶液。酶活回收率达到80%以上，纯化因子达到3以上。
不同来源的微生物谷氨酸脱羧酶的亚基组成和分子量具有较大差异，如大肠杆菌有6个相同的亚基，分子量为53kDa；短小乳杆菌（Lactobacillus brevis）的GAD有两个亚基，亚基分子量为60kDa；产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的GAD分子量为290kDa；乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.Lactis）的GAD只有一个亚基，亚基的分子量为54kDa。微生物产生的GAD分子相对较大，当采用反胶团进行萃取分离时，必须设计一种新的反胶团体系，使形成的反胶团具有较大的内部空间尺寸，才能满足溶解GAD分子的需要，从而导致目前还没有关于采用反胶团萃取技术制备谷氨酸脱羧酶的报道。
发明内容
本发明针对目前谷氨酸脱羧酶制备方法的不足，提供一种工艺简单、生产成本低、便于规模化生产的谷氨酸脱羧酶的制备方法。
本发明的方法是利用反胶团萃取技术从微生物细胞中制备谷氨酸脱羧酶，从而达到降低生产成本、取得较好经济效果的目的。
为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：
一种利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，步骤如下：
（1）将含谷氨酸脱羧酶的微生物细胞进行培养，得细胞培养液，离心，制得湿菌体细胞，将湿菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞悬浮液，破碎细胞，得到细胞破碎液；调细胞破碎液的pH值为5.5～7.0，然后加入无机盐调节溶液的离子强度为0.10～0.20mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液；
（2）将助溶剂加入到有机溶剂中，助溶剂与有机溶剂的体积比为1:（4～10），摇匀，再加入表面活性剂，使表面活性剂在有机溶液中的浓度为100～250mmol/L，混合均匀，制得反胶团体系溶液；
将缓冲剂加入到去离子水中配制0.10～0.20mol/L的缓冲溶液，再将反萃取助剂加入到缓冲溶液中，使反萃取助剂在缓冲溶液中的质量浓度为5～30wt%，摇匀，然后加入无机盐调节溶液的离子强度为1.0～2.0mol/L，制得反萃取水相溶液；
（3）将步骤（1）制得的含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液加入到步骤（2）制得的反胶团体系溶液中，反胶团体系溶液与细胞破碎溶液的体积比为1:（1～10），混合均匀，萃取操作温度为10～25℃，离心分相，取有机相，制得含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液；
（4）向步骤（3）制得的含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液，反萃取水相溶液与含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液的体积比为1:（1～10），混合均匀，反萃取操作温度为30～40℃，离心分相，制得含有谷氨酸脱羧酶的水溶液；
（5）将步骤（4）制得的含有谷氨酸脱羧酶的水溶液用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得谷氨酸脱羧酶。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的离心条件为3000～5000r/min、离心10～20min。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的细胞悬浮液中的细胞质量百分比浓度为25～35%。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的破碎细胞采用高压细胞破碎机，操作压力为50～60MPa，操作温度为5～15℃。
根据本发明优选的，所述步骤（1）和步骤（2）中的无机盐选自氯化钾或溴化钾。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的助溶剂选自正丁醇、正戊醇、己醇或庚醇之一。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的有机溶剂选自异辛烷、辛烷、正己烷或环己烷之一。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中表面活性剂为阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂，两者的重量份配比为：阳离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂=（1～5）:1，优选阳离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），优选非离子型表面活性剂为失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80）。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的缓冲剂选自磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠或乙酸-乙酸钠之一。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反萃取助剂选自乙醇、丙醇或异丙醇之一。
根据本发明优选的，所述步骤（3）和步骤（4）中的离心分相条件为3000～4000r/min、离心5～10min。
根据本发明优选的，所述步骤（5）中的超滤膜工作压力为0.1～0.3MPa，膜的截留分子量为40000～50000Dal，操作温度为25℃。
上述工艺条件如无特殊说明，均可采用本领域常规操作。
有益效果：
1、本发明的方法可以实现谷氨酸脱羧酶制备的连续化、规模化，便于其工业化生产。
2、本发明采用反胶团萃取技术，可以实现谷氨酸脱羧酶的高效分离，并且其分离纯化和浓缩可同时进行，酶活力回收率高。
3、本发明的方法使酶的制备工艺简便，生产周期短，萃取剂可循环使用，谷氨酸脱羧酶的生产成本较低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
本发明中谷氨酸脱羧酶的活力测定步骤如下：
向10mL0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.4）中加入5'-磷酸吡哆醛和L-谷氨酸钠(L-MSG)，使5'-磷酸吡哆醛的浓度为0.01mmol/L、L-谷氨酸钠的浓度为10mmol/L，振荡摇匀，制得底物溶液。
取200μL底物溶液，在37℃预热后加入谷氨酸脱羧酶，迅速混匀后，在37℃反应10min，立即沸水浴10min终止反应，离心收集上清液，采用高效液相色谱仪（购自上海天普分析仪器有限公司）测定反应生成的γ-氨基丁酸。
谷氨酸脱羧酶的酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmol的γ-氨基丁酸所需的酶量为1U。
谷氨酸脱羧酶的酶活力以每分钟产生1μmol的γ-氨基丁酸生成量计，据此计算酶活力回收率；萃取率为反胶团有机相溶液中的酶活力与细胞破碎液的酶活力的比值；反萃取率为反胶团有机相溶液中的酶活力与反萃取水相溶液中的酶活力的比值；纯化倍数等于反萃取水相溶液中的比酶活力与细胞破碎液的比酶活力的比值。
原料来源：十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80）均购自天津市科密欧化学试剂开发中心，异辛烷、辛烷、正己烷、环己烷均购自天津市康科德科技有限公司，乙醇购自天津市致远化学试剂有限公司，丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、己醇、庚醇均购自北京天宇祥瑞科技有限公司，谷氨酸脱羧酶样品购自上海晨易生物科技有限公司，5'-磷酸吡哆醛、L-谷氨酸钠均购自国药集团化学试剂公司。
实施例1～5所用产谷氨酸脱羧酶的菌种为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）CICC21909，该菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）CICC21909的培养方法如下：
取大肠埃希氏菌（Escherichia coli）CICC21909接种于装有20mL种子培养基的三角瓶中，30℃、150r/min摇床培养24h后，制得液体种子；然后按接种量10%接种于200mL发酵培养基中，发酵培养基中添加谷氨酸钠作为产酶诱导剂。37℃、250r/min摇床培养18h，制得含有谷氨酸脱羧酶的菌体细胞培养液。经检测产酶活力可达3790U/mL。
种子培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏5，蛋白胨5，NaCl5，KH2PO42，MgSO41，MnSO41，pH值7.0。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，L-谷氨酸钠5，NaCl3，KH2PO41，MgSO40.5，pH值6.5。
实施例6～8所用产谷氨酸脱羧酶的菌种为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.Lactis）CICC20396，该菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.Lactis）CICC20396的培养方法如下：
取产谷氨酸脱羧酶的菌种乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.Lactis）CICC20396接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中，30℃静置培养24h后，制得液体种子；然后按接种量5%接种于200mL发酵培养基中，发酵培养基中添加谷氨酸钠作为产酶诱导剂。37℃、250r/min摇床培养18h，发酵过程中通过补加NaOH（5mol/L）控制发酵液pH值维持在4.5-7.0，制得含有谷氨酸脱羧酶的菌体细胞培养液。经检测产酶活力可达2560U/mL。
种子培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏10，蛋白胨10，牛肉膏5，乙酸钠2，柠檬酸二铵2，吐温-801，KH2PO41，MgSO41，MnSO41，NaCl0.1，pH值6.8。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，牛肉膏5，L-谷氨酸钠5，乙酸钠1，柠檬酸二铵2，吐温-801，K2HPO41，MgSO41，MnSO41，pH值6.5。
实施例1
一种利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，步骤如下：
（1）将含谷氨酸脱羧酶的大肠埃希氏菌体细胞培养液1000mL在3000r/min条件下离心10min，制得湿菌体细胞，将湿菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量浓度为25wt%的悬浮液，冷却至10℃左右，采用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压细胞破碎机进行三次细胞破碎，破碎机操作压力为60MPa，制得细胞破碎液312mL。用盐酸调细胞破碎液的pH值为5.5，然后加入氯化钾调节溶液的离子强度为0.10mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液。
（2）将100mL正丁醇加入到400mL异辛烷中，摇匀，再加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80），两者的重量份配比为3:1，使表面活性剂在有机溶液中的浓度为250mmol/L，混合均匀，使CTAB和Span80均匀分布于正丁醇-异辛烷溶液中，制得澄清透明稳定的CTAB-Span80/正丁醇-异辛烷反胶团体系溶液。
将磷酸氢二钠和柠檬酸加入到去离子水中配制0.20mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH4.0）400mL，再将异丙醇加入到缓冲溶液中，使其在缓冲溶液中的质量浓度为10wt%，摇匀，然后加入氯化钾调节溶液的离子强度为2.0mol/L，制得反萃取水相溶液。
（3）将步骤（1）制得的含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液加入到步骤（2）制得的CTAB-Span80/正丁醇-异辛烷反胶团体系溶液中，反胶团体系溶液与细胞破碎溶液的体积比为1：1，250r/min振荡6min混合均匀，萃取操作温度为15℃，在萃取过程中谷氨酸脱羧酶进入到有机相溶液中的反胶团内部。在4000r/min下离心5min分相，取有机相，制得含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液。
（4）向步骤（3）制得的含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液，含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液与反萃取水相溶液的体积比为1:1，250r/min振荡15min混合均匀，反萃取操作温度为40℃，该过程中谷氨酸脱羧酶由有机相溶液中的反胶团内部进入到水相溶液中。在4000r/min下离心5min分相，制得含有谷氨酸脱羧酶的水溶液和反胶团有机溶液，反胶团有机溶液可循环使用。
（5）将步骤（4）制得的谷氨酸脱羧酶水溶液，在0.2MPa压力下采用截留分子量为50000的超滤膜过滤浓缩，除去其中残留的CTAB等物质，收集截留液，冷冻干燥，制得谷氨酸脱羧酶468mg。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到93.6%，纯化倍数达到3.8。
实施例2
如实施例1所述的利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤（1）中，调节细胞破碎液的pH值为7.0；再加入氯化钾将溶液的离子强度调节为0.20mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液。
步骤（2）中，在正丁醇-异辛烷溶液中加入CTAB和Span80，使表面活性剂在有机溶液中的浓度为150mmol/L。
步骤（2）中，配制0.10mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH4.2）400mL，再将异丙醇加入到缓冲溶液中，使其在缓冲溶液中的质量浓度为25wt%，摇匀，然后加入氯化钾调节溶液的离子强度为1.0mol/L，制得反萃取水相溶液。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到90.1%，纯化倍数达到3.0左右。
实施例3
如实施例1所述的利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，将细胞破碎溶液加入到CTAB-Span80/正丁醇-异辛烷反胶团体系溶液，其混合液的体积比为：反胶团体系溶液的体积：细胞破碎溶液的体积=1:3。
步骤（4）中，向含有谷氨酸脱羧酶的反胶团溶液中加入反萃取水相溶液，混合液的体积比为：反萃取水相溶液的体积：含有谷氨酸脱羧酶的反胶团溶液的体积=1:10。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到91.2%，纯化倍数达到3.1左右。
实施例4
如实施例1所述的利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，将60mL己醇加入到400mL正己烷中，摇匀，再加入CTAB和Span80，两者的重量份配比为5:1，使表面活性剂在有机溶液中的浓度为200mmol/L，混合均匀，使CTAB和Span80均匀分布于己醇-正己烷溶液中，制得澄清透明稳定的CTAB-Span80/己醇-正己烷反胶团体系溶液。
步骤（2）中，配制0.20mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.0）400mL，再将乙醇加入到缓冲溶液中，使其在缓冲溶液中的质量浓度为5wt%，摇匀，然后加入氯化钾调节溶液的离子强度为1.0mol/L，制得反萃取水相溶液。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到91.8%，纯化倍数达到3.4左右。
实施例5
如实施例1所述的利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤（1）中，向细胞破碎液中加入溴化钾，将溶液的离子强度调节为0.10mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液。
步骤（2）中，配制0.10mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH4.0）400mL，再将丙醇加入到缓冲溶液中，使丙醇的质量浓度为20wt%，摇匀，再加入溴化钾调节溶液的离子强度为2.0mol/L，制得反萃取水相溶液。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到93.1%，纯化倍数达到3.6左右。
实施例6
一种利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，步骤如下：
（1）将含谷氨酸脱羧酶的乳酸乳球菌体细胞培养液1000mL在3500r/min条件下离心15min，制得湿菌体细胞，将湿菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量浓度为35wt%的悬浮液，冷却至10℃左右，采用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压细胞破碎机进行四次细胞破碎，破碎机操作压力为50MPa，制得细胞破碎液222mL。调细胞破碎液的pH值为6.0，然后加入氯化钾调节溶液的离子强度为0.10mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液。
（2）将20mL正戊醇加入到200mL辛烷中，摇匀，再加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80），两者的重量份配比为4:1，使表面活性剂在有机溶液中的浓度为120mmol/L，混合均匀，使CTAB和Span80均匀分布于正戊醇-辛烷溶液中，制得澄清透明稳定的CTAB-Span80/正戊醇-辛烷反胶团体系溶液。
将乙酸和乙酸钠加入到去离子水中配制0.20mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.0）100mL，再将丙醇加入到缓冲溶液中，使其在缓冲溶液中的质量浓度为30wt%，摇匀，然后加入氯化钾调节溶液的离子强度为2.0mol/L，制得反萃取水相溶液。
（3）将步骤（1）制得的含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液加入到步骤（2）制得的CTAB-Span80/正戊醇-辛烷反胶团体系溶液中，反胶团体系溶液与细胞破碎溶液的体积比为1:2，250r/min振荡5min混合均匀，萃取操作温度为20℃，在萃取过程中谷氨酸脱羧酶进入到有机相溶液中的反胶团内部。在3000r/min下离心10min进行分相，取有机相，制得含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液。
（4）向步骤（3）制得的含有谷氨酸脱羧酶的反胶团溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液，含有谷氨酸脱羧酶的反胶团溶液与反萃取水相溶液的体积比为2:1，250r/min振荡10min混合均匀，反萃取操作温度为30℃，该过程中谷氨酸脱羧酶由有机相溶液中的反胶团内部进入到水相溶液中。在3000r/min下离心10min进行分相，制得含有谷氨酸脱羧酶的水溶液和反胶团有机溶液，反胶团有机溶液可循环使用。
（5）将步骤（4）制得的谷氨酸脱羧酶水溶液，在0.15MPa压力下采用截留分子量为40000Dal的超滤膜过滤浓缩，除去其中残留的CTAB等物质，收集截留液，冷冻干燥，制得谷氨酸脱羧酶386mg。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到92.7%，纯化倍数达到3.6左右。
实施例7
如实施例6所述的利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤（1）中，向细胞破碎液中加入溴化钾，将溶液的离子强度调节为0.20mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的溶液。
步骤（2）中，配制0.20mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.0）100mL，再将丙醇加入到缓冲溶液中，使丙醇的质量浓度为15wt%，摇匀，再加入溴化钾调节溶液的离子强度为1.0mol/L，制得反萃取水相溶液。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到90.6%，纯化倍数达到3.2左右。
实施例8
如实施例6所述的利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，将20mL庚醇加入到200mL环己烷中，摇匀，再加入CTAB和Span80，两者的重量份配比为2:1，使表面活性剂在有机溶液中浓度为100mmol/L，混合均匀，使CTAB和Span80均匀分布于庚醇-环己烷溶液中，制得澄清透明稳定的CTAB-Span80/庚醇-环己烷反胶团体系溶液。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到91.1%，纯化倍数达到3.3左右。
对比例1
一种利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法（参见CN1690196A（申请号200410037391.0）说明书实施例5的记载），步骤如下：
（1）同实施例1的步骤（1）。
（2）反胶团溶液由表面活性剂（Aliquat336+Span60）、戊醇、戊烷和水组成，其重量份配比为表面活性剂（Aliquat336+Span60）：戊醇：戊烷：水=（80+20）：100：800：0.5，混合均匀，制得反胶团溶液。
反萃取水相溶液包括异丙醇、氯化钾、甘氨酸-氢氧化钠和水，其重量份配比为异丙醇：氯化钾：甘氨酸-氢氧化钠：水=15：5：7：73，混合均匀，制得反萃取水相溶液。
（3）将步骤（1）制得的含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液加入到步骤（2）制得的反胶团溶液中，反胶团溶液与细胞破碎溶液的体积比为1：1，250r/min振荡6min混合均匀，萃取操作温度为15℃；将混合液在4000r/min下离心5min分相，取有机相，制得含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液。
（4）向步骤（3）制得的含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液，反胶团溶液与反萃取水相溶液的体积比为1:1，250r/min振荡15min混合均匀，反萃取操作温度为40℃；将混合液在4000r/min下离心5min分相，制得含有谷氨酸脱羧酶的水溶液和反胶团有机溶液，反胶团有机溶液可循环使用。
（5）将步骤（4）制得的谷氨酸脱羧酶水溶液，在0.2MPa压力下采用截留分子量为50000的超滤膜过滤浓缩，除去其中残留的CTAB等物质，收集截留液，冷冻干燥，制得谷氨酸脱羧酶372mg。
经检测谷氨酸脱羧酶的酶活力回收率达到76.8%，纯化倍数达到2.8。
所述步骤（2）中Aliquat336（三辛基甲基氯化铵）是阳离子型表面活性剂，Span60（失水山梨醇硬脂酸酯）是非离子型表面活性剂。
在对比例1中，酶活力回收率与实施例1的差距比较大，酶活力回收率下降了19.5%。在实施例1中，大肠杆菌产生的谷氨酸脱羧酶分子量比较大，萃取酶需要具有较大内部空间尺寸的反胶团体系。在实施例1和对比例1中，酶的萃取与反萃取操作条件是相同的，不同的是在对比例1中形成反胶团的表面活性剂是Aliquat336和Span60，而实施例1中形成反胶团的是CTAB和Span80，此外，表面活性剂、助溶剂、反萃取剂等物质的浓度也不相同，上述因素使形成的反胶团数量和反胶团内部尺寸都有差别。在实施例1中，除了形成反胶团的表面活性剂种类不同于对比例1外，表面活性剂的浓度比对比例1也高，所形成的反胶团数量增多、反胶团的内部空间尺寸增大，从而使谷氨酸脱羧酶几乎全部进入到反胶团内部，故实施例1的萃取率高，酶的活力回收率也高。因此，本发明的方法可以制备分子量较大的谷氨酸脱羧酶，并且酶活力回收率高、生产成本较低。
Claims (2)
1.一种利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，步骤如下：
（1）将含谷氨酸脱羧酶的微生物细胞进行培养，得细胞培养液，离心，制得湿菌体细胞，将湿菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞悬浮液，破碎细胞，得到细胞破碎液；调细胞破碎液的pH值为5.5～7.0，然后加入无机盐调节溶液的离子强度为0.10～0.20mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液；
（2）将助溶剂加入到有机溶剂中，助溶剂与有机溶剂的体积比为1:（4～10），摇匀，再加入表面活性剂，使表面活性剂在有机溶液中的浓度为100～250mmol/L，混合均匀，制得反胶团体系溶液；
将缓冲剂加入到去离子水中配制0.10~0.20mol/L的缓冲溶液，再将反萃取助剂加入到缓冲溶液中，使反萃取助剂在缓冲溶液中的质量浓度为5～30wt%，摇匀，然后加入无机盐调节溶液的离子强度为1.0～2.0 mol/L，制得反萃取水相溶液；
（3）将步骤（1）制得的含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液加入到步骤（2）制得的反胶团体系溶液中，反胶团体系溶液与细胞破碎溶液的体积比为1:（1～10），混合均匀，萃取操作温度为10～25℃，离心分相，取有机相，制得含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液；
（4）向步骤（3）制得的含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液，反萃取水相溶液与含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液的体积比为1:（1～10），混合均匀，反萃取操作温度为30～40℃，离心分相，制得含有谷氨酸脱羧酶的水溶液；
（5）将步骤（4）制得的含有谷氨酸脱羧酶的水溶液用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得谷氨酸脱羧酶；
所述步骤（1）中含谷氨酸脱羧酶的微生物细胞为大肠埃希氏菌或乳酸乳球菌；
所述步骤（2）中表面活性剂为阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂，两者的重量份配比为：阳离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂=（1～5）:1，阳离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，非离子型表面活性剂为失水山梨糖醇脂肪酸酯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的离心条件为3000~5000r/min、离心10~20min。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的细胞悬浮液中的细胞质量百分比浓度为25～35%。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的破碎细胞采用高压细胞破碎机，操作压力为50~60MPa，操作温度为5~15℃。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中的无机盐选自氯化钾或溴化钾。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的助溶剂选自正丁醇、正戊醇、己醇或庚醇之一。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的有机溶剂选自异辛烷、辛烷、正己烷或环己烷之一。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的缓冲剂选自磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠或乙酸-乙酸钠之一。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的反萃取助剂选自乙醇、丙醇或异丙醇之一。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中的离心分相条件为3000～4000r/min、离心5～10min。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中的超滤膜工作压力为0.1~0.3MPa，膜的截留分子量为40000～50000Dal，操作温度为25℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310244021.3A CN103305495B (zh) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310244021.3A CN103305495B (zh) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103305495A CN103305495A (zh) | 2013-09-18 |
| CN103305495B true CN103305495B (zh) | 2014-08-20 |
Family
ID=49131216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310244021.3A Expired - Fee Related CN103305495B (zh) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103305495B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103773731A (zh) * | 2014-01-03 | 2014-05-07 | 浙江大学宁波理工学院 | 一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法 |
| CN104480094A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-04-01 | 苏州嘉禧萝生物科技有限公司 | 一种分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法 |
| CN108315315B (zh) * | 2018-04-23 | 2021-12-10 | 齐鲁工业大学 | 一种制备阿魏酸脱羧酶的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0977835A1 (en) * | 1997-04-25 | 2000-02-09 | Diamyd Therapeutics AB | Use of a zwitterionic detergent/surfactant for purifying glutamic acid decarboxylase (gad) and a composition containing gad |
-
2013
- 2013-06-19 CN CN201310244021.3A patent/CN103305495B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103305495A (zh) | 2013-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109439701B (zh) | 生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基 | |
| JP4986038B2 (ja) | 高加水分解活性セルラーゼおよびヘミセルラーゼの製造方法 | |
| CN103497911B (zh) | 一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产 | |
| CN101735993A (zh) | 一种高效生产纤维素酶的方法 | |
| JP4998991B2 (ja) | セルラーゼの製造方法 | |
| CN103305495B (zh) | 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 | |
| CN105219661B (zh) | 合成低聚半乳糖的专用菌株及用其合成低聚半乳糖的方法 | |
| CN105567779A (zh) | 一种高产低分子量热凝胶的发酵方法 | |
| CN101654697B (zh) | 一种混菌发酵制备菜籽肽的方法 | |
| CN105886573A (zh) | 一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法 | |
| CN103131659B (zh) | 一种耐有机溶剂脂肪酶、其编码基因、产生菌株及应用 | |
| CN102517367B (zh) | 利用猪皮制备胶原蛋白抗氧化肽的方法 | |
| CN102703405A (zh) | 一种以麸皮为原料制备乳糖酶的方法 | |
| CN102382808A (zh) | 凝乳酶的制备方法 | |
| CN102533607B (zh) | 一株产β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法 | |
| CN109694892B (zh) | 制备红景天苷的方法和试剂盒 | |
| CN104726355A (zh) | 酿酒酵母孢子表达的(s)-羰基还原酶ii不对称转化制备(s)-苯乙二醇的方法 | |
| CN112143688B (zh) | 一种重组大肠杆菌的构建及其应用 | |
| CN107604036A (zh) | 一种制备β‑胡萝卜素的方法以及β‑胡萝卜素制品 | |
| CN105274041B (zh) | 一株重组大肠杆菌及其在生产2-丁醇中的应用 | |
| CN102168028A (zh) | 一种节杆菌突变株、利用该突变株生产乳糖酶的方法及用乳糖酶制备乳果糖的方法 | |
| CN115677823A (zh) | 一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法 | |
| CN101654693B (zh) | 微生物发酵制备菜籽肽的方法 | |
| JPH0358715B2 (zh) | ||
| CN109161570B (zh) | 一种提高发酵产n-乙酰神经氨酸的方法及发酵液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140820 Termination date: 20170619 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |