CN108315315B - 一种制备阿魏酸脱羧酶的方法 - Google Patents

一种制备阿魏酸脱羧酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种制备阿魏酸脱羧酶的方法。该阿魏酸脱羧酶的制备方法包括：(1)将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养、离心收集细胞、细胞破碎，调细胞破碎液pH值和离子强度；(2)配制反胶团体系溶液和反萃取水相溶液；(3)利用反胶团进行萃取阿魏酸脱羧酶；(4)进行反萃取，得到含有阿魏酸脱羧酶的水溶液；(5)采用超滤膜过滤浓缩，截留液冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品。本发明可以实现阿魏酸脱羧酶制备的规模化、连续化，并且酶的生产工艺简便，生产周期短，酶活力回收率高，阿魏酸脱羧酶的生产成本较低。

Description

一种制备阿魏酸脱羧酶的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种制备阿魏酸脱羧酶的方法。
背景技术
阿魏酸脱羧酶(Ferulic acid decarboxyase，FAD)是催化阿魏酸发生非氧化脱羧反应产生4-乙烯基愈创木酚的酶，也是阿魏酸代谢产生香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)的关键酶。
4-乙烯基愈创木酚能产生特殊香味或丁香类香味，能提高食品的感官品质，主要用于食品以增加其香味成份，还用于烟草、日化、医药、香精合成等行业。香兰素的香气幽雅、微甜，广泛应用于化妆品、香烟及食品等行业，也用作植物生长促进剂、杀菌剂等，还用于食品中作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。
利用游离或固定化阿魏酸脱羧酶生产4-乙烯基愈创木酚和香兰素具有很大的潜力，日益得到重视，与微生物细胞反应相比，可避免细胞自身代谢产物对产品的污染、简化产物的分离纯化过程、降低生产成本。目前阿魏酸脱羧酶的生产和纯化逐渐形成产业，具有很好的市场前景。
阿魏酸脱羧酶的制备主要采用微生物发酵法，该方法包括微生物培养和酶的分离纯化，在生产成本构成中，分离纯化等下游工序的成本占有相当大的比重，因此，如何采用高效的分离技术是阿魏酸脱羧酶生产中需要解决的技术问题。
目前，阿魏酸脱羧酶的分离纯化方法主要采用盐析法、离子交换法等，如顾雯(云南大学博士论文，2011)通过亲和层析等方法获得了纯化的阿魏酸脱羧酶；如专利文件CN1206045(申请号98106195.8)公开了硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水层析等对阿魏酸脱羧酶进行分离纯化的方法；如专利文件CN 101397568(申请号200810233517.X)采用了亲和层析、阴离子柱、疏水柱等方法对阿魏酸脱羧酶进行了分离纯化。上述方法存在酶活力回收率低、生产周期长、工艺复杂、不能连续生产等问题，从而导致了生产成本较高。因此，改进现有生产技术以及开发新的生产技术以降低阿魏酸脱羧酶的生产成本势在必行。
阿魏酸脱羧酶存在于许多真菌、酵母和部分细菌中，不同微生物产生的阿魏酸脱羧酶的分子组成和分子量有较大差异，FAD分子相对较大，当采用反胶团技术分离时，必须设计一种新的反胶团体系，使形成的反胶团具有较大的内部空间尺寸，才能满足萃取FAD分子的需要。目前还没有关于采用反胶团萃取技术制备阿魏酸脱羧酶的报道。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供一种工艺简单、生产成本低、便于规模化生产的阿魏酸脱羧酶的制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种制备阿魏酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
(1)将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养，得细胞培养液，离心，制得菌体细胞，将细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量百分比浓度为25～35wt％的溶液，破碎细胞，得细胞破碎液；调破碎液pH值为9.0～10.0，用氯化钠调破碎液的离子强度为0.05～0.25mol/L，制得阿魏酸脱羧酶细胞破碎液；
(2)将正己烷与己醇按体积比(10～20)：1混合均匀，在混合液中加入表面活性剂，使表面活性剂浓度为100～200mmol/L，制得反胶团体系溶液；
将正丁醇加入到0.10～0.20mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，使正丁醇的质量百分比浓度为5～20wt％，用氯化钠调缓冲液的离子强度为1.5～2.5
mol/L，制得反萃取水相溶液；
(3)在15～30℃下，将步骤(1)制得的细胞破碎液与步骤(2)制得的反胶团体系溶液按体积比(2～15)：1混合均匀，离心，取有机相，制得阿魏酸脱羧酶有机溶液；
(4)在25～35℃下，将步骤(3)制得的阿魏酸脱羧酶有机溶液与步骤(2)制得的反萃取水相溶液按体积比(2～10)：1混合均匀，离心，制得阿魏酸脱羧酶水溶液；
(5)用超滤膜对步骤(4)制得的阿魏酸脱羧酶水溶液过滤，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品。
本发明的更优方案为：
步骤(1)中，破碎细胞采用高压匀浆机，工作压力为50～55MPa、温度为5～10℃。
步骤(2)中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂，两者的重量份配比为：阳离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂＝(2～10)：1，优选阳离子型表面活性剂为双十六烷基二甲基溴化铵(DHDAB)，优选非离子型表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯(Tween60)。
步骤(3)和步骤(4)中，离心条件为4000～5000r/min、2～5min。
步骤(5)中，超滤膜的截留分子量为20000Dal，工作压力为0.1～0.2MPa。
上述工艺条件如无特殊说明，均可采用本领域常规操作。
本发明的方法是利用反胶团萃取技术制备阿魏酸脱羧酶，从而达到降低生产成本、取得较好经济效果的目的。
本发明的有益效果如下：本发明的方法可以使阿魏酸脱羧酶的浓缩和分离纯化同时进行，减少酶的分离步骤，提高酶的制备效率，酶活力回收率高；本发明的方法使阿魏酸脱羧酶的生产工艺简便，生产周期短，萃取剂可循环使用，酶的生产成本较低；本发明的方法可以实现制备阿魏酸脱羧酶的规模化、连续化，便于其工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
本发明中阿魏酸脱羧酶的酶活力测定步骤如下：
取阿魏酸脱羧酶样品溶于去离子水中，用柠檬酸(0.2mol/L)-柠檬酸钠(0.1mol/L)缓冲液(pH5.2)将酶溶液稀释至酶活力单位为0.1～0.2U/mL，制得阿魏酸脱羧酶样品溶液。
取9.71g阿魏酸溶于50℃、1000mL的去离子水中，制得浓度为50mmol/L的阿魏酸溶液；取10.0mL阿魏酸溶液加入到90.0mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.2)中，摇匀，将溶液稀释10倍，制得底物溶液。
取2.0mL底物溶液加热到40℃，加入1.0mL阿魏酸脱羧酶样品溶液，混匀，于40℃反应30min后，立即在沸水浴中维持10min终止反应，离心收集上清液，冷却，制得待测溶液。采用高效液相色谱仪(购自上海天普分析仪器有限公司)测定待测溶液中生成的4-乙烯基愈创木酚的含量。
阿魏酸脱羧酶的酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟水解阿魏酸产生1μmol的4-乙烯基愈创木酚所需的酶量为1U。
原料来源：阿魏酸购自上海谱振生物科技有限公司，双十六烷基二甲基溴化铵、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯均购自天津市科密欧化学试剂开发中心，正丁醇、己醇、正己烷均购自天津市康科德科技有限公司。
实施例1～3所用的产阿魏酸脱羧酶的菌种为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CICC21890，该菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)CICC21890的培养方法如下：
取短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)CICC21890接种于20mL的种子培养基中，于32℃、150r/min下培养20h，制得液体种子；按接种量10％(v/v)接种于200mL发酵培养基中，于37℃、200r/min培养24h，制得含有阿魏酸脱羧酶的细胞培养液。经检测酶活力为572U/mL。
种子培养基组分如下(g/L)：葡萄糖10.0，酵母膏10.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，KH2PO41.0，MgSO40.5，pH 7.0。
发酵培养基组分如下(g/L)：葡萄糖100.0，酵母膏20.0，蛋白胨20.0，阿魏酸5.0，NaCl 5.0，KH2PO42.0，pH 7.0。
实施例4所用的产阿魏酸脱羧酶的菌种为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CICC20225，该菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心
(CICC)。
荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CICC20225的培养方法如下：
取荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CICC20225接种于20mL的种子培养基中，于32℃、150r/min下培养22h，制得液体种子；按接种量10％(v/v)接种于200mL发酵培养基中，于37℃、200r/min培养24h，制得含有阿魏酸脱羧酶的细胞培养液。经检测酶活力为526U/mL。
种子培养基组分如下(g/L)：葡萄糖10.0，酵母膏10.0，蛋白胨10.0，NH4H2PO42.0，MgSO41.0，pH 7.0。
发酵培养基组分如下(g/L)：葡萄糖60.0，甘油30.0，酵母膏20.0，蛋白胨20.0，NH4H2PO410.0，阿魏酸5.0，MgSO41.0，pH 7.0。
实施例1
一种制备阿魏酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
(1)将短小芽孢杆菌细胞培养液1000mL于4000r/min下离心15min，制得菌体细胞，将细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量百分比浓度为25wt％的悬浮液。用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压匀浆机破碎细胞三次，操作压力为55MPa，制得细胞破碎液。用氢氧化钠调细胞破碎液的pH值为9.0，加入氯化钠调溶液的离子强度为0.05mol/L，制得阿魏酸脱羧酶细胞破碎液。
(2)将正己烷与己醇按体积比10：1混合均匀，在混合液中按重量份配比5：1加入双十六烷基二甲基溴化铵(DHDAB)和聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯(Tween60)，使表面活性剂的浓度为200mmol/L，混合均匀，制得DHDAB-Tween60/己醇-正己烷反胶团体系溶液。
将正丁醇加入到0.20mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中，使正丁醇的质量百分比浓度为20wt％，用氯化钠调缓冲液的离子强度为2.5mol/L，制得反萃取水相溶液。
(3)在30℃下将步骤(1)制得的细胞破碎液与步骤(2)制得的DHDAB-Tween60/己醇-正己烷反胶团体系溶液按体积比2：1混合均匀，在4000r/min下离心5min，取有机相，制得含有阿魏酸脱羧酶的有机溶液。
(4)在35℃下将步骤(3)制得的阿魏酸脱羧酶有机溶液与步骤(2)制得的反萃取水相溶液按体积比2：1混合均匀，在4000r/min下离心4min，制得阿魏酸脱羧酶水溶液。
(5)用超滤膜在0.2MPa下对步骤(4)制得的阿魏酸脱羧酶水溶液过滤，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品1.32g。
经检测阿魏酸脱羧酶的酶活力回收率为94.1％，纯化倍数为4.1。
实施例2
如实施例1所述的制备阿魏酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤(1)中，用氢氧化钠调破碎液pH值为10.0；加入氯化钠调溶液的离子强度为0.25mol/L。
步骤(2)中，在己醇-正己烷溶液中加入DHDAB和Tween60，使表面活性剂的浓度为100mmol/L；在缓冲液中加入正丁醇，使正丁醇的质量百分比浓度为5wt％；用氯化钠调缓冲液的离子强度为1.5mol/L。
经检测阿魏酸脱羧酶的酶活力回收率为91.6％，纯化倍数为3.3。
实施例3
如实施例1所述的制备阿魏酸脱羧酶的方法，不同之处在于：
步骤(3)中，细胞破碎液与DHDAB-Tween60/己醇-正己烷反胶团体系溶液按体积比15：1混合均匀。
步骤(4)中，阿魏酸脱羧酶有机溶液与反萃取水相溶液按体积比10：1混合均匀。
经检测阿魏酸脱羧酶的酶活力回收率为92.5％，纯化倍数为3.6。
实施例4
一种制备阿魏酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
(1)将荧光假单胞菌细胞培养液1000mL于5000r/min下离心10min，制得菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量浓度为35wt％的悬浮液。用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压匀浆机破碎细胞四次，操作压力为50MPa，制得细胞破碎液。用氢氧化钠调细胞破碎液pH值为9.5，加入氯化钠调溶液的离子强度为0.15mol/L，制得阿魏酸脱羧酶细胞破碎液。
(2)将正己烷与己醇按体积比20：1混合均匀，在混合液中按重量份配比10：1加入双十六烷基二甲基溴化铵(DHDAB)和聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯(Tween60)，使表面活性剂的浓度为150mmol/L，制得DHDAB-Tween60/己醇-正己烷反胶团体系溶液。
将正丁醇加入到0.10mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH7.0)中，使正丁醇的质量百分比浓度为10wt％，用氯化钠调缓冲液的离子强度为2.0mol/L，制得反萃取水相溶液。
(3)在15℃下将步骤(1)制得的细胞破碎液与步骤(2)制得的DHDAB-Tween60/己醇-正己烷反胶团体系溶液按体积比10：1混合均匀，在5000r/min下离心3min，取有机相，制得含有阿魏酸脱羧酶有机溶液。
(4)在25℃下将步骤(3)制得的阿魏酸脱羧酶有机溶液与步骤(2)制得的反萃取水相溶液按体积比5：1混合均匀，在5000r/min下离心2min，制得阿魏酸脱羧酶水溶液。
(5)用超滤膜在0.1MPa下对步骤(4)制得的阿魏酸脱羧酶水溶液过滤，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品1.16g。
经检测阿魏酸脱羧酶的酶活力回收率为93.2％，纯化倍数为3.8。

Claims (1)

1.一种制备阿魏酸脱羧酶的方法，其特征为，包括以下步骤：
(1)将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养，得细胞培养液，离心，制得菌体细胞，将细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量百分比浓度为25～35wt％的溶液，破碎细胞，得细胞破碎液；调破碎液pH值为9.0～10.0，用氯化钠调破碎液的离子强度为0.05～0.25mol/L，制得阿魏酸脱羧酶细胞破碎液；
(2)将正己烷与己醇按体积比(10～20)：1混合均匀，在混合液中加入表面活性剂，使表面活性剂浓度为100～200mmol/L，制得反胶团体系溶液；将正丁醇加入到0.10～0.20mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，使正丁醇的质量百分比浓度为5～20wt％，用氯化钠调缓冲液的离子强度为1.5～2.5mol/L，制得反萃取水相溶液；
(3)在15～30℃下，将步骤(1)制得的细胞破碎液与步骤(2)制得的反胶团体系溶液按体积比(2～15)：1混合均匀，离心，取有机相，制得阿魏酸脱羧酶有机溶液；
(4)在25～35℃下，将步骤(3)制得的阿魏酸脱羧酶有机溶液与步骤(2)制得的反萃取水相溶液按体积比(2～10)：1混合均匀，离心，制得阿魏酸脱羧酶水溶液；
(5)用超滤膜对步骤(4)制得的阿魏酸脱羧酶水溶液过滤，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品；
所述步骤(1)中的微生物为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CICC21890或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CICC20225，以上菌株均保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；
所述步骤(1)中的破碎细胞采用高压匀浆机，工作压力为50～55MPa、温度为5～10℃；
所述步骤(2)中的表面活性剂为阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂，两者的重量份配比为：阳离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂＝(2～10)：1，阳离子型表面活性剂为双十六烷基二甲基溴化铵，非离子型表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯；
所述步骤(3)和步骤(4)中的离心条件为4000～5000r/min、2～5min；
所述步骤(5)中的超滤膜的截留分子量为20000Dal，工作压力为0.1～0.2MPa。
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