CN112592839A - 一株降解氨基甲酸乙酯的米根霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株降解氨基甲酸乙酯的霉菌——米根霉JQA3(Rhizopus oryzae JQA3)及其应用，所述米根霉JQA3保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20191029，保藏日期为2019年12月09日。该米根霉JQA3可应用于降解EC，当EC含量为5g/L时，发酵8d降解效果可达到56％以上；本发明Rhizopus oryzae JQA3菌株具有较好的液化力和糖化力，其液化酶活力达3765U·mL^‑1，糖化酶活力达5287.06U·mL^‑1。用该菌株制作白曲，可用于红曲黄酒的发酵，不仅能对原料进行液化和糖化，提高原料利用率，还能减少EC残留，提高产品的安全性。

Description

一株降解氨基甲酸乙酯的米根霉及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株降解氨基甲酸乙酯的米根霉及其应用。

(二)背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbonate，EC)在发酵酒类(黄酒、清酒、葡萄酒等)、蒸馏酒(威士忌、朗姆酒等)和发酵食品(酸奶、腐乳、乳酪等)中广泛存在。2007年2月，在法国里昂举行的IARC(国际癌症研究机构)会议上将EC归类为2A类致癌物(对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分)，引起广泛关注。降低发酵产品中的EC含量对于提高食品的安全性、促进相关产业的发展意义重大。

多位研究者已经提出了葡萄酒、啤酒、麦曲黄酒等发酵酒类中EC的控制途径，主要包括：控制前体物质(如尿素、精氨酸、瓜氨酸等)、调整工艺条件(如通风量、发酵温度、控制杂菌污染等)预防EC形成，利用降解酶去除已经产生的EC等。红曲黄酒是一种具有区域特色的发酵酒，以红曲和白曲为糖化发酵剂。目前，针对麦曲黄酒(以麦曲为糖化发酵剂)EC的控制方法比较多，但是针对红曲黄酒EC的控制方法较少，制约了我国红曲酒产业的发展。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株可降解氨基甲酸乙酯的米根霉，及其在微生物降解氨基甲酸乙酯中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一株降解氨基甲酸乙酯的霉菌——米根霉JQA3(Rhizopus oryzae JQA3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20191029，保藏日期为2019年12月09日。

该菌株是从来源于福建福安的白曲中分离获得。该菌株的生长条件为：PDA培养基(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH＝7)，30℃培养4d，经过PCR扩增内转录间隔区1和2、克隆测序和序列比对分析，鉴定为Rhizopus oryzae，该菌株命名为JQA3。

所述菌株的ITS1-5.8s-ITS4序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还涉及所述的米根霉JQA3在微生物催化分解氨基甲酸乙酯中的应用。米根霉JQA3产生的降解酶可作用于EC，降解生成氨、二氧化碳和乙醇，反应式如下所示：

H₂NCOOC₂H₅+H₂O→NH₃+CO₂+C₂H₅OH

具体的，所述应用为：以所述米根霉JQA3经发酵获得的酶液为催化剂，对酒中的氨基甲酸乙酯进行降解。

本发明还涉及所述的米根霉JQA3在制备白曲中的应用。具体的，以所述米根霉JQA3斜面培养物或液体培养液制备白曲。

所述白曲可用于红曲黄酒的酿造。利用该菌株生产的酒曲，用于红曲黄酒的酿造，能有效降低红曲黄酒发酵过程中有害物质EC的浓度。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株可降解氨基甲酸乙酯的微生物菌株——Rhizopus oryzae JQA3，该菌株可应用于降解EC，当EC含量为5g/L时，发酵8d降解效果可达到56％以上；本发明Rhizopus oryzae JQA3菌株具有较好的液化力和糖化力，其液化酶活力可达3765U·mL^-1，糖化酶活力可达5287.06U·mL^-1。用该菌株制作白曲，可用于红曲黄酒的发酵，不仅能对原料进行液化和糖化，提高原料利用率，还能减少EC残留，提高产品的安全性。

(四)附图说明

图1为本发明的Rhizopus oryzae JQA3在PDA培养基上的菌落形态；

图2为本发明的Rhizopus oryzae JQA3在显微镜下的形态图；

图3为菌种的系统发育树(基于ITS1-5.8s-ITS4序列)；

图4为菌株发酵上清液中EC浓度随时间的变化图；

图5为Rhizopus oryzae JQA3产EC降解酶的活力测定图；

图6为Rhizopus oryzae JQA3产液化酶和糖化酶的活力测定图；

图7为利用JQA3制备的白曲与福建白曲在酿造红曲酒中EC含量的对比图；

图8为利用JQA3制备的白曲与福建白曲酿造红曲酒中尿素含量的对比图；

图9为利用JQA3制备的白曲与福建白曲酿造红曲酒中氨基酸含量的对比图；

图10为利用JQA3制备的白曲与福建白曲酿造红曲酒中酒精度和色价的对比图；

图11为利用JQA3制备的白曲与福建白曲酿造红曲酒中总糖和总酸的对比图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：米根霉JQA3的分离及鉴定

一、JQA3的分离

以来源于福建福安白曲为样品，通过平板初筛、平板复筛、摇瓶复筛、EC降解力的检测等步骤，得到EC降解菌株JQA3。具体的筛选步骤如下：

(1)平板初筛：取福建福安白曲10g，放入装有10粒玻璃珠、90mL无菌水的三角瓶中，置于30℃、180rpm的摇床中振荡20min，使白曲与水充分混匀，吸取混合液1mL加入到含有9mL无菌水的试管中得到10^-1白曲稀释液；再从10^-1白曲稀释液中取1mL加入到9mL无菌水中，得到10^-2白曲稀释液；依次类推，得到10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7白曲稀释液。然后分别从10^-4，10^-5，10^-6，10^-7白曲稀释液中吸取0.2mL均匀涂布于初筛培养基平板上，30℃培养4天，挑取初筛平板上长出的菌落进行后续实验。

所述平板初筛培养基组成为(g·L^-1)：EC 2.5，NaCl 2，(NH₄)₂SO₄ 10，KH₂PO₄ 2.5，MgSO₄·7H₂O 0.7，FeSO₄·7H₂O 0.1，琼脂粉20，pH 5.0。能够在初筛培养基(EC为唯一碳源)平板上生长，表明菌株具有降解EC的活性。

(2)平板复筛：将平板初筛获得的菌株接种于EC含量分别为2.5g·L^-1，5g·L^-1，7.5g·L^-1，10g·L^-1，15g·L^-1，20g·L^-1的平板复筛培养基上，30℃培养4天，挑取在高EC含量的复筛平板上仍可生长的菌株作为进一步实验的菌株。

所述平板复筛培养基组成为(g·L^-1)：EC 2.5～20，NaCl 2，(NH₄)₂SO₄ 10，KH₂PO₄2.5，MgSO₄·7H₂O 0.7，FeSO₄·7H₂O 0.1，琼脂粉20，pH 5.0。

经过平板复筛，获得10株在EC含量超过10g·L^-1的复筛平板上仍可生长的菌株进行后续实验。不仅能降解EC，并且对EC的耐受度高，表明该菌株在降解EC方面有较好的应用价值。

(3)摇瓶复筛：将平板复筛获得的菌株接种于摇瓶复筛培养基中，取刚接种完立即灭活的培养物为对照，于30℃、150rpm摇床振荡培养5d。利用HPLC-FLD法检测发酵液上清中EC浓度的变化，分析菌株的EC降解效果。

所述摇瓶复筛培养基组成为(g·L^-1)：EC 5，NaCl 2，(NH₄)₂SO₄ 10，KH₂PO₄ 2.5，MgSO₄·7H₂O 0.7，FeSO₄·7H₂O 0.1，琼脂粉20，pH 5.0。

所述HPLC-FLD检测法为：EC标准品溶液和待测液首先进行衍生化处理：取待衍生化溶液1mL，加入600μL 9-羟基吨正丙醇溶液(0.02mol/L)，100μL盐酸溶液(1.5mol/L)，混匀，30℃暗处反应30min；反应液用有机膜(0.45μm)过滤，进样HPLC分析。

HPLC分析条件为：液相色谱仪Waters2695，色谱柱Agilent SB-C18 4.6×250mm，进样40μL，梯度洗脱流动相为0.02mol/L乙酸钠∶乙腈(0min，30:70v/v；5min，50:50v/v；25min，25:75v/v；26min，10:90v/v；29min，10:90v/v；30min，70:30v/v；36min，70:30v/v；)，流速0.8mL/min，检测波长λex为233nm，λem为600nm，柱温30℃。

经过摇瓶复筛，获得EC降解能力最好的菌株，编号为JQA3。JQA3菌株对EC的降解情况随时间的变化参见图4，以刚接种完立即灭活的培养物作为空白对照。

二、JQA3的鉴定

(1)JQA3菌株的形态学特征

将JQA3接种至PDA培养基上，30℃培养5天，菌落稠密，初期呈白色，后期转黑色。菌丝匍匐爬行，无色，假根发达，分枝呈根状，褐色，孢子囊黑色、近似球形，厚垣孢子无色。JQA3在PDA培养基上的菌落形态参见图1，在显微镜下的形态图参见图2。

(2)JQA3菌株的稳定性特征：

将JQA3接种在PDA培养基上，30℃条件下，经数代连续培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌的生物学性状稳定。

(3)JQA3菌株的ITS序列分析

1、ITS序列的扩增及测序

利用真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取JQA3基因组DNA，作为PCR反应的模板；ITS区域的扩增引物为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR反应体系为：30ng基因组DNA，50pmol引物ITS1，50pmol引物ITS4，10nmol dNTP混合物，2.5μL 10×buffer，1μL Pfu DNA Polymerase，加ddH₂O至25μL总体积。

PCR反应程序为：第一阶段，94℃预变性4min；第二阶段，94℃变性4s，55℃退火45s，72℃延伸l min，共30个循环；第三阶段，72℃延伸10min。

采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，1％琼脂糖凝胶，150v电压运行20min，采用凝胶成像系统分析结果。PCR产物采用DNA胶回收试剂盒(生工，上海)纯化，纯化后的ITS基因片段由生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序，得到604bp的核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)。

2、ITS序列的同源比对及系统进化树的建立

将ITS完整序列与GenBank中相似性较高的菌株进行比对，选取同源性较高的序列比对建树。采用邻接法(Neighbor-joining)，以MEGA V5.2程序，选用Kimura-2-parameter间隔模型进行系统发育分析。置信度采用bootstrap分析重复1000次。图3为基于ITS所构建的系统发育树。

依据JQA3的ITS分析结果，结合上述形态学鉴定结果，确认JQA3为米根霉(Rhizopus oryzae)，命名为米根霉(Rhizopus oryzae)JQA3(即CCTCC NO：M 20191029)。

三、JQA3的EC降解酶活力的检测

将JQA3在PDA培养基斜面培养物，接入50mL种子培养基/250mL摇瓶中，在30℃，150rpm摇床中培养48h，得到种子液；将3mL种子液接入75mL发酵培养基/500mL摇瓶中，在30℃，150rpm摇床中培养160h，培养过程中，每隔6-12h取样一次检测菌株的EC降解酶活力。

所述种子培养基组成为(g·L^-1)：葡萄糖20，蛋白胨30，MnSO₄ 0.2，pH自然。

所述发酵培养基组成为(g·L^-1)：葡萄糖20，蛋白胨30，NaCl 1.4mmol·L^-1，pH6.0。

所述JQA3菌株培养液的EC降解酶活力检测方法为：

(1)酶活的定义：在30℃、pH7.0条件下，1分钟转化EC产生1nmol乙醇或1nmol氨的酶量定义为1个酶活单位(U)。

(2)酶活检测方法：取300μL EC溶液，30℃水浴10min，加入酶液200μL，振荡混匀，30℃反应1h，加100μL 0.5M硫酸终止反应；空白对照组则在加入酶液后立即加入100μL0.5M硫酸，振荡使酶失活。最后按照Berthelot法测定生成的NH⁴⁺浓度。

经过EC酶活检测，结果如图5所示。由图可见，随着发酵时间的增加，菌株JQA3的EC降解酶活力先逐渐升高，在72h时产酶达到最大，为287.06U·g干菌^-1，之后随着发酵时间的继续延长产酶开始下降。

四、JQA3产液化酶和糖化酶活力的检测

将JQA3在PDA培养基斜面培养物，接入50mL种子培养基/250mL摇瓶中，在30℃，150rpm摇床中培养48h，得到种子液；将5mL种子液接入50g糯米培养基/500mL三角瓶中，28℃培养160h，培养过程中，每隔24h取样一次检测菌株的糖化酶活力。

所述种子培养基组成为(g·L^-1)：葡萄糖20，蛋白胨30，MnSO₄ 0.2，pH自然。

所述糯米培养基组成为：糯米50g，水80mL，浸泡12h后105℃灭菌50min。

所述JQA3菌株培养液的糖化酶活力检测方法为：

(1)酶活定义

在40℃条件下，水解1mg淀粉的酶量定义为1个酶活力单位，以U/mL表示

(2)酶活检测方法

40℃条件下，将适当稀释的酶液0.5mL与5mL 0.5％可溶性淀粉磷酸溶液反应10min，然后用5mL 0.1mol/L H₂SO₄终止反应。取0.5mL反应液与5mL碘液(0.4mmol/L I₂-KI)显色，在波长620nm处测吸光度。以0.5mL水代替0.5mL反应液为空白，以不加酶液(加同样体积的缓冲液)的管为对照。

经过液化酶活检测，结果如图6所示。由图可见，菌株JQA3的液化酶活力在72h达到最大，为3765U·mL^-1，之后液化酶活力不具有显著性差异。说明JQA3菌株液化力较强，可以进行酿造过程中的液化。

所述JQA3菌株培养液的糖化酶活力检测方法为：

(1)酶活的定义：在40℃，pH4.6条件下，1h内催化生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位(U/mL)。

(2)酶活检测方法：取100μL 1.33％可溶性淀粉溶液，60℃水浴5min，加入酶液100μL，60℃反应20min，速冷终止反应；空白对照组则以蒸馏水100μL取代酶液。最后加4.8mL蒸馏水，520nm波长下比色；

经过糖化酶活检测，结果如图6所示。由图可见，菌株JQA3的糖化酶活力在72h达到最大，为5287.06U·mL^-1，之后糖化酶活力不具有显著性差异。说明JQA3菌株糖化力较强，可以进行酿造过程中的糖化。

实施例2：利用JQA3斜面培养物和液体菌种制备白曲

一、利用JQA3斜面培养物制备白曲

(1)JQA3斜面培养物的制备

将JQA3在PDA培养基上，30℃培养5天，用无菌水洗下孢子，将孢子用无菌水调整浓度为10⁶～10⁷cfu/mL孢子悬液。

(2)酿造用白曲的制备

将糙米粉碎至细度为60目筛，米粉放入锅中翻拌烘炒，加热至110～120℃，保持10分钟。米粉摊凉至40℃以下，接入10％(v/w)步骤(1)制备的斜面培养物，搅拌均匀。将拌匀后的米粉用木制方框压模，再用刀切成长方形小块，规格为长×宽×高：3cm×2cm×2cm。将长方形小块30℃培养120小时，当长方形小块全部变为白色，45℃干燥24小时，即作为酿造用白曲。

二、利用JQA3液体菌种制备白曲

(1)JQA3液体菌种的制备

将JQA3在PDA培养基上，30℃培养5天，用无菌水洗下孢子，将孢子用无菌水调整浓度为10⁶～10⁷cfu/mL孢子悬液。将孢子悬液以10％(v/v)的接种量接种至液体培养基，在150rpm摇床上30℃培养12小时，取培养液作为液体菌种。

所述液体培养基质量终浓度组成为：蛋白胨3％，葡萄糖2％，MgSO₄0.2％，溶剂为自来水，pH值自然。

(2)酿造用白曲的制备

将糙米粉碎至细度为60目筛，米粉放入锅中翻拌烘炒，加热至110～120℃，保持10分钟。米粉摊凉至40℃以下，接入10％(v/w)步骤(1)制备的液体菌种，搅拌均匀。将拌匀后的米粉用木制方框压模，再用刀切成长方形小块，规格为长×宽×高：3cm×2cm×2cm。将长方形小块30℃培养72小时，当长方形小块全部变为白色，45℃干燥24小时，即作为酿造用白曲。

实施例4：利用JQA3制备的白曲酿造红曲酒

糯米按1:4(w/vol)的料水比加水浸泡12h，沥干。在0.15MPa蒸汽下蒸30min，制成酿酒用蒸饭，待蒸饭温度冷却到约30℃时，加入1.8(vol/w)的水，0.07(w/w)的福建白曲或JQA3白曲(按照实施例3方法以液体菌种制备)，0.06(w/w)的酿造用红曲(东阳东龙酒业有限公司)，0.0015(w/w)的黄酒专用活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)。30℃发酵10h，搅拌1次；28～30℃下静置发酵4d，密封后发酵8d。发酵结束后，取发酵醪液的上清液，85℃保温5min，过滤得到澄清酒体。检测每组酒液中EC、尿素、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、酒精度、总糖、总酸、色价的含量。

在模拟酿造红曲酒的过程中，经过测定，结果如图7所示，添加JQA3白曲后的EC含量最低，下降约39.13％。而尿素含量测定中(结果见图8)，添加JQA3白曲这组尿素含量最高，符合尿素与EC含量负相关规律。根据图9结果显示，添加JQA3白曲后酒液中精氨酸与瓜氨酸的含量比添加福建白曲和空白组都高，添加JQA3白曲后酒液中鸟氨酸的含量最低。图10和图11结果说明，实验组与空白组相比，酒液中酒精度均有所增加，但增加幅度并不大，酒液中总糖、总酸、色价的含量也没有显著的变化。结果说明，利用JQA3制备的白曲能够酿造红曲酒，而且还能降低红曲酒中EC的含量，且对酒精度、色价、总糖、总酸并没有显著的影响。与添加福建白曲相比，JQA3制备的白曲效果更好，成品酒中EC含量明显减少。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一株降解氨基甲酸乙酯的米根霉及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 604

<212> DNA

<213> Rhizopus oryzae

<400> 1

ctgcggaagg atcattaatt atgttaaagc gccttacctt agggtttcct ctggggtaag 60

tgattgcttc tacactgtga aaatttggct gagagactca gactggtcat gggtagacct 120

atctggggtt tgatcgatgc cactcctggt ttcaggagca cccttcataa taaacctaga 180

aattcagtat tataaagttt aataaaaaac aacttttaac aatggatctc ttggttctcg 240

catcgatgaa gaacgtagca aagtgcgata actagtgtga attgcatatt cagtgaatca 300

tcgagtcttt gaacgcagct tgcactctat ggtttttcta tagagtacgc ctgcttcagt 360

atcatcacaa acccacacat aacatttgtt tatgtggtaa tgggtcgcat cgctgtttta 420

ttacagtgag cacctaaaat gtgtgtgatt ttctgtctgg cttgctaggc aggaatatta 480

cgctggtctc aggatctttt tctttggttc gcccaggaag taaagtacaa gagtataatc 540

cagcaacttt caaactatga tctgaagtca ggtgggatta cccgctgaac ttaagcatat 600

cata 604

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (7)

1.一株降解氨基甲酸乙酯的霉菌——米根霉JQA3(Rhizopus oryzae JQA3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20191029，保藏日期为2019年12月09日。

2.如权利要求1所述的米根霉JQA3，其特征在于所述菌株的ITS1-5.8s-ITS4序列如SEQID NO:1所示。

3.权利要求1所述的米根霉JQA3在微生物催化分解氨基甲酸乙酯中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以所述米根霉JQA3经发酵获得的酶液为催化剂，对酒中的氨基甲酸乙酯进行降解。

5.权利要求1所述的米根霉JQA3在制备白曲中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于以所述米根霉JQA3斜面培养物或液体培养液制备白曲。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述白曲用于红曲黄酒的酿造。

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