CN112480482A - 一种发酵凝胶均质剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵技术领域，具体公开一种发酵凝胶均质剂及其制备方法和应用。所述发酵凝胶均质剂，包括以下质量百分比的组分：淀粉70‑80％、三氯化铁16‑24％和黄原胶4‑6％。所述的发酵凝胶均质剂可用于制备微生物发酵培养基，尤其适用于维生素B₁₂发酵生产中。本发明提供的发酵凝胶均质剂可以消除微生物发酵液中的蛋白结皮现象，提高菌体生长速率，延长发酵周期，提高发酵产物的产量，避免发酵后期营养物质匮乏造成的发酵提前终止的现象，可广泛应用于微生物发酵生产领域中。

Description

一种发酵凝胶均质剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，尤其涉及一种发酵凝胶均质剂及其制备方法和应用。

背景技术

维生素B₁₂为钴胺素类化合物，参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏，亦可与叶酸合用用于治疗各种巨幼红细胞性贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻。维生素B₁₂还用于神经系统疾病如神经炎、神经萎缩的治疗等。

高等动植物不能制造维生素B₁₂，自然界中的维生素B₁₂都是微生物合成的。目前国内外商品化的维生素B₁₂几乎都是通过微生物发酵进行生产的。但是微生物发酵生产维生素B₁₂目前存在以下缺陷：1)维生素B₁₂发酵培养基普遍采用的底料为玉米浆，该发酵培养基在消毒过程中会产生大面积絮凝，产生较多蛋白皮，易形成消毒死角，且极难清理，并导致发酵过程中的蛋白质利用效率降低，进而造成菌体发酵产生的B₁₂的产量较低。2)目前的发酵培养基在发酵生产维生素B₁₂的过程中，菌体生长缓慢，影响维生素B₁₂的合成。3)发酵培养基消毒后，速效磷源和氮源以游离的形式存在，在发酵前期迅速被利用，导致发酵后期磷、氮源缺失，进而导致发酵提早终止，影响维生素B₁₂的产量。

发明内容

针对现有维生素B₁₂发酵生产过程中存在的上述问题，本发明提供一种发酵凝胶均质剂及其制备方法和应用，该发酵凝胶均质剂可以消除微生物发酵液中的蛋白结皮现象，较少培养基中的消毒死角，降低大面积蛋白变性，提高蛋白利用率和消毒质量。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种发酵凝胶均质剂，包括以下质量百分比的组分：

淀粉70-80％、三氯化铁16-24％和黄原胶4-6％。

添加本发明提供的发酵凝胶均质剂后的发酵液在消毒后能够形成均质凝胶状态，为发酵过程中菌体在发酵液中的生长提供了一种特定的附着物，显著提高菌体生长速率和发酵产物含量。同时所述发酵凝胶均质剂在发酵液的发酵过程中会定量包裹部分磷源和氮源营养物，并使发酵液中的磷源和氮源营养物按一定的释放速率缓慢释放，以满足菌体在长时间发酵过程中磷源和氮源等营养物质的定量供应，延长发酵周期，提高发酵产物的产量，避免发酵后期营养物质匮乏造成的发酵提前终止的现象。本发明提供的发酵凝胶均质剂的成分简单易得，可广泛应用于微生物发酵生产领域中。

优选的，所述的发酵凝胶均质剂包括以下质量百分比的组分：

淀粉75％、三氯化铁20％和黄原胶5％。

该发酵凝胶均质剂的各组分采用上述的配比时，可进一步提高发酵液中的蛋白利用率，并进一步延长发酵周期。

本发明还提供所述发酵凝胶均质剂的制备方法，该制备方法至少包括以下步骤：

将所述淀粉和所述三氯化铁搅拌混合，待混合得到的混合物呈现均匀黄褐色后，加入所述黄原胶，混合均匀，得到所述发酵凝胶均质剂。

本发明还提供所述发酵凝胶均质剂的制备方法操作简单、对设备无特殊要求，得到的发酵凝胶均质剂运输方便且易保存，易在发酵领域推广使用。

优选的，所述发酵凝胶均质剂的制备方法，包括以下步骤：向双锥混合器加入所述淀粉，预混4-6min，加入所述三氯化铁混合25-50min,再加入黄原胶混合30-40min，得到所述发酵凝胶均质剂。

对淀粉单独进行预混的过程可以防止原料结块的问题，该工序也可有效防止后续加入的三氯化铁附着设备。三氯化铁原料极易吸潮，并易与黄原胶形成难容块状物，导致后续使用溶解困难。本方法中先将三氯化铁与淀粉混合进行保护，可以避免三氯化铁与黄原胶形成难溶块状物。

本发明还提供所述的发酵凝胶均质剂在制备微生物发酵培养基中的应用。

本发明还提供所述的发酵凝胶均质剂在维生素B₁₂发酵生产中的应用。

将本发明提供的发酵凝胶均质剂应用于在维生素B₁₂发酵生产中，可显著提高发酵液中营养物质的利用率和维生素B₁₂的发酵单位。

本发明还提供了一种发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，每升所述发酵培养基包括以下重量的组分：

玉米浆55-70g，氧化镁0.4-0.6g，甘油1.8-4.8g，七水合硫酸镁1-1.5g，硫酸铵0.8-1.2g，尿素0.4-0.6g，磷酸氢二铵0.5-1g，磷酸二氢钾0.5-1g，硫酸锌0.05-0.1g，碳酸钙1.7-1.8g，液糖40-50g，甜菜碱6-10g，所述的发酵凝胶均质剂0.8-1.2g，七水合氯化钴0.02-0.04g，5,6二甲基苯丙咪唑0.02-0.04g和消沫剂0.2-0.25g。

相对于现有技术，本发明提供的发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，在进行连消或实消过程中均未再出现过蛋白结皮现象，且连消或实消后发酵培养基中的水解氨氮比传统维生素B₁₂的发酵培养基显著提高，其中检测到的非水解氨氮比传统的维生素B₁₂的发酵培养基显著降低，说明该发酵凝胶均质剂可将一部分蛋白进行交联，提高蛋白利用率。同时，添加该发酵凝胶均质剂后，维生素B₁₂的发酵培养基连消或实消后游离磷比传统发酵培养基显著降低，说明该发酵凝胶均质剂可将一部分磷进行交联，避免其在发酵前期被快速利用而降低发酵周期。此外，添加该发酵凝胶均质剂后的发酵培养基能够使维生素B₁₂的发酵平均单位显著提升，具有极高的应用价值。

优选的，所述每升所述发酵培养基包括以下重量的组分：

玉米浆65g，氧化镁0.5g，甘油3g，七水合硫酸镁1.2g，硫酸铵1g，尿素0.5g，磷酸氢二铵0.7g，磷酸二氢钾0.7g，硫酸锌0.07g，碳酸钙1.76g，液糖46g，甜菜碱8g，所述发酵凝胶均质剂1g，七水合氯化钴0.03g，5.6二甲基苯丙咪唑0.03g和消沫剂0.24g。

上述优选各组分的发酵培养基可进一步提高磷源的利用率和维生素B₁₂的发酵单位，在发酵过程中，发酵至98h后磷含量降为0，比传统发酵至54h时磷降为0的时间延长了44h；维生素B₁₂的发酵平均单位提升至246，比传统的发酵液平均单位150提高了96％。

优选的，所述消沫剂为发酵用有机硅消沫剂，所述发酵用有机硅消沫剂为本领域的常规发酵用有机硅消沫剂。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

发酵凝胶均质剂包括以下质量百分比的组分：淀粉75％、三氯化铁20％和黄原胶5％。

上述发酵凝胶均质剂的制备方法为：按发酵凝胶均质剂的质量配比向双锥混合器加入所述淀粉，预混5min，加入三氯化铁混合40min,再加入黄原胶混合30min，得到发酵凝胶均质剂。

利用上述得到的发酵凝胶均质剂配置发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，得到的发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基包括以下组分配比：

玉米浆65g/L，氧化镁0.5g/L，甘油3g/L，七水合硫酸镁1.2g/L，硫酸铵1g/L，尿素0.5g/L，磷酸氢二铵0.7g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，硫酸锌0.07g/L，碳酸钙1.76g/L，液糖46g/L，甜菜碱8g/L，发酵凝胶均质剂1g/L，七水合氯化钴0.03g/L，5.6二甲基苯丙咪唑0.03g/L和发酵用有机硅消沫剂0.24g/L。

将上述发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基进行消毒杀菌，具体消毒杀菌方法为：

将玉米浆、发酵凝胶均质剂、甘油和甜菜碱，按重量比混合后，用其总质量的400％的水进行连消，之后连消水2吨(第一部分连消)；

将氧化镁、七水合硫酸镁、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、硫酸锌、碳酸钙、液糖、七水合氯化钴、5.6二甲基苯丙咪唑和消沫剂按质量比混后加8吨水溶解，进行连消，之后连消水2吨(第一部分连消)；

将液糖进行连消(第三部分连消)；

将上述三部分连消产物混合后用连消水定容体积至98吨，使其中的各组分满足发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基中各组分的含量。

发酵生产维生素B₁₂：

利用200吨罐发酵生产维生素B₁₂，待上述连消后的发酵培养基的温度降至30℃时，接二级种子(脱单假单胞杆菌菌液)12吨；在发酵温度为32℃，转速为80rpm，通气比0.4V/V·min下发酵7d。

上述发酵生产维生素B₁₂的过程重复4个批次，并对各批次发酵液消毒杀菌过程中的蛋白结皮现象、发酵过程中的氨氮、磷源和维生素B₁₂的发酵单位进行监测。

实施例2

发酵凝胶均质剂包括以下质量百分比的组分：淀粉70％、三氯化铁24％和黄原胶6％。

上述发酵凝胶均质剂的制备方法为：按发酵凝胶均质剂的质量配比向双锥混合器加入所述淀粉，预混4min，加入三氯化铁混合25min,再加入黄原胶混合40min，得到发酵凝胶均质剂。

利用上述得到的发酵凝胶均质剂配置发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，得到的发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基包括以下组分配比：

玉米浆55g/L，氧化镁0.4g/L，甘油1.8g/L，七水合硫酸镁1g/L，硫酸铵0.8g/L，尿素0.4g/L，磷酸氢二铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸锌0.05g/L，碳酸钙1.7g/L，液糖40g/L，甜菜碱6g/L，发酵凝胶均质剂0.8g/L，七水合氯化钴0.02g/L，5,6二甲基苯丙咪唑0.02g/L和消沫剂0.2g/L。

将上述发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基进行消毒杀菌，具体消毒杀菌方法同实施例1相同，连消产物混合后用连消水定容体积至97吨，使其中的各组分满足发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基中各组分的含量。

发酵生产维生素B₁₂：

利用200吨罐发酵生产维生素B₁₂，待上述连消后的发酵培养基的温度降至30℃时，接二级种子(脱单假单胞杆菌菌液)10吨；在发酵温度为32℃，转速为80rpm，通气比0.4V/V·min下发酵7d。

上述发酵生产维生素B₁₂的过程重复4个批次，并对各批次发酵液消毒杀菌过程中的蛋白结皮现象、发酵过程中的氨氮、磷源和维生素B₁₂的发酵单位进行监测。

实施例3

发酵凝胶均质剂包括以下质量百分比的组分：淀粉80％、三氯化铁16％和黄原胶4％。

上述发酵凝胶均质剂的制备方法为：按发酵凝胶均质剂的质量配比向双锥混合器加入所述淀粉，预混6min，加入三氯化铁混合50min,再加入黄原胶混合35min，得到发酵凝胶均质剂。

利用上述得到的发酵凝胶均质剂配置发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，得到的发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基包括以下组分配比：

玉米浆70g/L，氧化镁0.6g/L，甘油4.8g/L，七水合硫酸镁1.5g/L，硫酸铵1.2g/L，尿素0.6g/L，磷酸氢二铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌0.05g/L，碳酸钙1.8g/L，液糖50g/L，甜菜碱10g/L，发酵凝胶均质剂1.2g/L，七水合氯化钴0.04g/L，5,6二甲基苯丙咪唑0.04g/L和消沫剂0.25g/L。

将上述发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基进行消毒杀菌，具体消毒杀菌方法与实施例1相同，连消产物混合后用连消水定容体积至99吨，使其中的各组分满足发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基中各组分的含量。

发酵生产维生素B₁₂：

利用200吨罐发酵生产维生素B₁₂，待上述连消后的发酵培养基的温度降至30℃时，接二级种子(脱单假单胞杆菌菌液)10吨；在发酵温度为32℃，转速为80rpm，通气比0.4V/V·min下发酵7d。

上述发酵生产维生素B₁₂的过程重复4个批次，并对各批次发酵液消毒杀菌过程中的蛋白结皮现象、发酵过程中的氨氮、磷源和维生素B₁₂的发酵单位进行监测。

对比例1

配置发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，不添加发酵凝胶均质剂，其它组分和含量与实施例1相同，得到的发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基的消毒杀菌方法和发酵生产维生素B₁₂的方法与实施例1相同。

上述发酵生产维生素B₁₂的过程重复4个批次，并对各批次发酵液消毒杀菌过程中的蛋白结皮现象、发酵过程中的氨氮、磷源和维生素B₁₂的发酵单位进行监测。

实施例1-3和对比例1中的发酵液连消过程中的蛋白结皮现象、发酵过程中的氨氮、磷源和维生素B₁₂的发酵单位的监测结果如表1所示。

表1

注：表1中的数据为4个实验批次数据的平均值。

由表1中的数据可知，1)添加本发明的发酵凝胶均质剂后，连消过程(消毒杀菌)中均未再出现大规模蛋白结皮现象；2)添加本发明的发酵凝胶均质剂后，发酵培养基消毒杀菌后的水解氨氮比对比例1提高10％以上，说明该发酵凝胶均质剂可明显提高蛋白利用率，非水解氨氮比对比例1降低15％以上，说明该发酵凝胶均质剂可将一部分蛋白进行交联(蛋白或氨基酸被交联，其氨基被保护或形成共价键，导致不能被检查，从而使检测的非水解氨氮降低)，提高蛋白利用率；3)添加本发明的发酵凝胶均质剂后，发酵培养基消毒杀菌后磷含量比对比例1降低，说明该发酵凝胶均质剂可将一部分游离磷进行交联，而发酵过程中消耗至磷含量为0的时间比对比例1的时间延长了44-50h；4)添加本发明的发酵凝胶均质剂后，维生素B₁₂发酵平均单位比对比例1平均单位提高22％以上，显著提高维生素B₁₂的产量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种发酵凝胶均质剂，其特征在于：包括以下质量百分比的组分：

淀粉70-80％、三氯化铁16-24％和黄原胶4-6％。

2.如权利要求1所述的发酵凝胶均质剂，其特征在于：包括以下质量百分比的组分：

淀粉75％、三氯化铁20％和黄原胶5％。

3.权利要求1或2所述的发酵凝胶均质剂的制备方法，其特征在于：将所述淀粉和所述三氯化铁搅拌混合均匀后，加入所述黄原胶混合均匀，得到所述发酵凝胶均质剂。

4.如权利要求3所述的发酵凝胶均质剂的制备方法，其特征在于：向双锥混合器加入所述淀粉，预混4-6min，加入所述三氯化铁混合25-50min,再加入所述黄原胶混合30-40min，得到所述发酵凝胶均质剂。

5.权利要求1或2所述的发酵凝胶均质剂在制备微生物发酵培养基中的应用。

6.权利要求1或2所述的发酵凝胶均质剂在维生素B₁₂发酵生产中的应用。

7.一种发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，其特征在于，每升所述发酵培养基包括以下重量的组分：

玉米浆55-70g，氧化镁0.4-0.6g，甘油1.8-4.8g，七水合硫酸镁1-1.5g，硫酸铵0.8-1.2g，尿素0.4-0.6g，磷酸氢二铵0.5-1g，磷酸二氢钾0.5-1g，硫酸锌0.05-0.1g，碳酸钙1.7-1.8g，液糖40-50g，甜菜碱6-10g，权利要求1或2所述的发酵凝胶均质剂0.8-1.2g，七水合氯化钴0.02-0.04g，5,6二甲基苯丙咪唑0.02-0.04g和消沫剂0.2-0.25g。

8.如权利要求7所述的发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，其特征在于，每升所述发酵培养基包括以下重量的组分：

玉米浆65g，氧化镁0.5g，甘油3g，七水合硫酸镁1.2g，硫酸铵1g，尿素0.5g，磷酸氢二铵0.7g，磷酸二氢钾0.7g，硫酸锌0.07g，碳酸钙1.76g，液糖46g，甜菜碱8g，所述发酵凝胶均质剂1g，七水合氯化钴0.03g，5.6二甲基苯丙咪唑0.03g和消沫剂0.24g。

9.如权利要求7所述的发酵生产维生素B₁₂的发酵培养基，其特征在于，所述消沫剂为发酵用有机硅消沫剂。