CN108752437B - 一种抗菌脂肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种抗菌脂肽及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。脂肽包括伊枯草菌素iturin、丰原素fengycin和表面活性素surfactin，各组分相对含量分别是49.7％–74.6％、13.3％–27.0％和10.4％–21.9％。本发明的抗菌脂肽可抑制细菌和真菌，在番茄青枯病的防治方面以及果实保鲜防腐方面显示出很好的效果，在农业生产上具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种抗菌脂肽及其制备方法，以及在植物病原菌防治中的应用。
背景技术
脂肽类抗生素是芽胞杆菌产生的重要抗菌活性物质，能够抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗支原体和抗肿瘤等，具备产量高、生产过程简便、稳定性好、不易产生耐药性，对人畜毒性低且对环境友好等优点，并且脂肽抗生素还能够促进细菌在植物根系定殖和诱导植物抗性，因而芽胞杆菌所产的抑菌脂肽在农作物生物防治领域具有巨大的应用潜力和研究价值。
脂肽是生防芽胞杆菌通过非核糖体多肽合成酶，利用多载体巯基化模板机制合成的，多肽合成酶的模块排列顺序决定了肽链中氨基酸残基的顺序。芽胞杆菌产生的脂肽包括伊枯草菌素(iturin)、丰原素(fengycin)和表面活性素(surfactin)等，其结构主要是由羟基/β-氨基脂肪酸与7/10个氨基酸以酞氨键连接形成的环肽。不同的芽胞杆菌菌株产生的脂肽组成不同，有的菌株仅产生一类脂肽，有的菌株可以同时产生两类或三类脂肽，与脂肽合成调控基因相关。例如，地衣芽胞杆菌MB01产生C12–C15surfactin脂肽；地衣芽胞杆菌V9T14产生C13–C15surfactin和C14–C17fengycin A/B脂肽；枯草芽孢杆菌K1产生的脂肽由C13–C16iturin A、C14–C16iturin C、C13–C17surfactin组成；解淀粉芽胞杆菌S76-3产生的脂肽由C14–C15iturin A、C13–C16surfactin和C14–C17plipastatin A、C16–C17plipastatin B组成；解淀粉芽胞杆菌SYBC H47产生的脂肽由C13–C15bacillomycin L、C16–C17fengycin A/B、C13–C15surfactin组成。
脂肽结构组成决定了其抑菌活性，脂肽iturin能够强烈抑制酵母菌和真菌，但对细菌的抑菌作用很微弱；fengycin对丝状真菌有很好的抑制作用，而对酵母和细菌无作用；surfactin能够破坏细菌和有脂膜包被的病毒，但对真菌的抗性不佳。不同脂肽成分，如surfactin和iturin、surfactin和fengycin、iturin和fengycin的混合使用都可以很大程度上提高脂肽的生物活性。
番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性的土传性维管束病害，轻则减产10％～30％，重则减产50％以上甚至绝收，造成了巨大的经济损失。番茄青枯病防治主要采用农业措施(栽培措施、作物轮作、品种抗性选择等)和化学药剂，但成效甚微。
枇杷属于我国亚热带特有的水果，栽培面积广，枇杷果实成熟于高温多湿季节，采收期较短。一般情况下，贮藏20天左右就会有大部分果实腐烂、食用品质急剧下降，从而造成严重的经济损失。炭疽病是枇杷果实采后重要病害，该病始于果园，具有潜伏侵染特性，杷果实成熟采收后，其生理状况发生改变，菌丝侵入果实扩展致病，常导致贮运期果实的大量腐烂。枇杷炭疽病的防治主要采用化学杀菌剂，但长期使用化学杀菌剂不仅使枇杷炭疽菌产生抗药性，而且农药残留也会导致环境污染及威胁人类健康等问题。
脂肽是芽胞杆菌产生的重要抗菌活性物质，能够抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗支原体和抗肿瘤等，具备产量高、生产过程简便、稳定性好、不易产生耐药性，对人畜毒性低且对环境友好等优点，并且脂肽还能够促进细菌在植物根系定殖和诱导植物抗性，能够作为一类生物农药用于植物病原菌的防治。
因此，如何通过改变培养条件，让菌株同时产生三类脂肽，进一步提高脂肽的生物防效，减少农药使用，是目前农业生产中亟待解决的问题。
发明内容
为了解决植物病原菌的防治问题，发明人提供了一种对病原菌具有很强抑制作用的抗菌脂肽。技术方案如下：
一种抗菌脂肽，包括伊枯草菌素iturin、丰原素fengycin和表面活性素surfactin。
所述的伊枯草菌素由C14–C17iturin A组成；所述的丰原素由C14/C16fengycin A、C14fengycin B2、C16fengycin A2/B2、C16–C17fengycin B、C15fengycin A衍生物和C15fengycin B衍生物组成；所述的表面活性素由C12–C16surfactin A组成。
所述的伊枯草菌素、丰原素和表面活性素的相对含量范围分别是49.7％–74.6％、13.3％–27.0％和10.4％–21.9％，均为质量百分数。
一种抗菌脂肽的制备方法，包括以下步骤：
解淀粉芽胞杆菌接种至营养培养基中，培养温度20-40℃，振荡培养12-36h，作为种子液；
按1-2％接种量接种种子液至发酵培养基中，相同条件振荡培养36-60h；
发酵液离心弃去菌体得上清液，上清液加盐酸至pH<2，2-8℃静置12-36h后，离心得沉淀，沉淀经低温冷冻干燥后得到抗菌脂肽粉末。
其中，所述的营养培养基为不含琼脂的NA液体培养基；所述的发酵培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基，具体成分为马铃薯浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖15g/L。培养温度优选为25℃。
进一步的，所述的抗菌脂肽在植物病原菌防治中的应用。
进一步的，所述的抗菌脂肽在番茄青枯病防治中的应用。
进一步的，所述的抗菌脂肽在果实保鲜防腐中的应用。
区别于现有技术，上述技术方案的优点在于：
(1)本发明能同时产生三种脂肽，其中iturin的相对含量很高，能达到50％以上。
(2)本发明的抗菌脂肽对细菌和真菌都具有很好的抑制效果，尤其是对青枯雷尔氏菌抑制效果明显。生物防治以菌治菌、无毒、无污染、无残留，可提高防治植物病害的能力。
(3)本发明的抗菌脂肽对番茄青枯病的盆栽防效可高达97.5％，且防治时间长，在植物病原菌的防治方面具有广阔的应用前景。
(4)本发明的抗菌脂肽能抑制龙眼、枇杷等果实采摘后腐烂菌，延长果实的保存期，在防腐保鲜领域具有很高的应用价值。
附图说明
图1为解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349脂肽组成总离子流图。
图2为解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349脂肽盆栽防效图，A为对照组接种第12天效果，B为处理组接种第12天的防效，C为处理组接种第30天的防效。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1
1.脂肽的制备
解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349保存于福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库(刘国红等.芽胞杆菌分类与应用研究进展.微生物学通报，2017，44(4):949-958)。福建省农业科学院芽胞杆菌研究团队长期从事芽胞杆菌样品收集和分类工作，引进模式菌株260余种，收集保存了17个国家、中国30个省份土壤15800余份，从中分离保存芽胞杆菌34892株，发现芽胞杆菌潜在新种60个，形成了全国最大的芽胞杆菌专业资源库，建立芽胞杆菌资源保藏中心。同时，向国内企业、科研单位和教学单位提供菌株2000多株。
解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349(刘程程等.产木聚糖酶芽胞杆菌的筛选及产酶条件优化.福建农业学报，2014，8:757-767)接种至50mL不含琼脂的NA液体培养基中，20-40℃、170r/min振荡培养24h，作为种子液。
按1％接种量接种种子液至50mL不同的液体培养基中，培养基成分见表1，相同条件振荡培养48h。各培养基购买于北京奥博星生物技术有限责任公司。
发酵液离心弃去菌体得上清液，上清液加2mol/L盐酸至pH<2，4℃静置24h后，离心得沉淀，沉淀经低温冷冻干燥后得到脂肽粉末。
表1 培养基成分组成表
2.脂肽的液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS/MS)检测
液相色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱(2.1×150mm，1.8-Micron)，流速为0.3mL/min；流动相A为0.1％甲酸水；流动相B为甲醇；洗脱程序0，60％B；60min，100％B；65min，60％B。
质谱条件：ESI(+/–)、干燥气温度350℃、干燥气流速8L/min、雾化气压力(nebulizer)30psig、Fragmentor 175V、Collision Energy 100V、Skimmer 65V、扫描方式auto MS/MS；离子扫描范围：100–3000m/z。
3.拮抗物质抑菌活性检测
采用抑菌圈法测定解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349上清液及脂肽对青枯雷尔氏菌的抑制作用。青枯雷尔氏菌FJAT-91(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10692)在30℃、170r/min下培养2天后，吸取青枯雷尔氏菌液0.5mL，加入到熔化并冷却到50℃的80mL0.9％琼脂的NA固体培养基中，混匀后作为上层培养基，倾覆在预先已凝固的NA下层培养基上。待上层培养基凝固，平板冷却后在平板中间打直径7mm孔，分别注入脂肽溶液(用甲醇配成终浓度为10mg/mL)80μL，以无菌甲醇溶液为空白对照，以0.16mg/mL的链霉素为阳性对照，每个处理3次重复，30℃培养2天后，测抑菌圈直径。
4.实验结果
(1)解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349抑菌脂肽组成与结构鉴定
利用LC-QTOF-MS/MS技术对解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349的脂肽成分组成进行了测定，总离子流图如图1所示。保留时间在10.5–24.5min时间段的组分为iturin类脂肽，保留时间在25.5–38.5min时间段的组分为fengycin类脂肽，保留时间在45.0–53.0min为surfactin类脂肽。
结合一级母离子、二级离子碎片和相关文献，解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349的脂肽成分鉴定如表2所示。Iturin类脂肽由C14–C17iturin A化合物组成；Fengycin类脂肽由C14–C15fengycin A、C14fengycin B2、C16fengycin A2/B2、C16–C17fengycin B、C14fengycin A衍生物和C15fengycin B衍生物组成；Surfactin类脂肽由C12–C16surfactin A组成。
表2 LC-QTOF-MS/MS测定解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349抑菌脂肽组成
(2)培养基组成和培养温度对解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349脂肽组成的影响
选择A、B、C、D、E和F六种不同培养基在30℃条件下，进行解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349培养。利用LC-QTOF-MS/MS测定了不同培养基培养的解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349脂肽组成，如表3所示。结果表明，采用各培养基菌株FJAT-2349均能够代谢产生脂肽，产生的脂肽均由iturin、fengycin和surfactin组成，其相对含量范围分别是49.7％–74.6％、13.3％–27.0％和10.4％–21.9％，最大差异接近2倍，说明培养基组分对解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349脂肽组成产生很大影响。
表3 不同培养基下解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349发酵产生的脂肽组成及含量
选择E培养基进行不同培养温度实验，不同温度培养的解淀粉芽孢杆菌FJAT-2349脂肽组成如表4所示。结果表明，解淀粉芽孢杆菌FJAT-2349在20-40℃范围内发酵培养均能产生脂肽，脂肽均由iturin、fengycin和surfactin组成，其相对含量范围分别是2.0％–54.7％、13.1％–19.9％和27.4％–83.7％。研究发现温度对脂肽中iturin和surfactin比例产生显著的影响，而对fengycin的比例影响较小。当温度≥35℃时，脂肽中iturin比例急剧下降，相应的surfactin比例极大上升。
表4 不同培养温度下解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349发酵产生的脂肽组成及含量
(3)培养基组成和培养温度对解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349上清液和脂肽抑菌效果的影响
培养基和温度对解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349上清液和脂肽对青枯雷尔氏菌FJAT-91抑菌效果的影响，如表5所示。结果表明，采用C和E培养基培养FJAT-2349得到的上清液有抑菌效果，它们的抑菌能力无显著差异，而采用A、B、D和F培养得到的上清液无抑菌效果；采用A和F培养基培养得到的脂肽无抑菌效果，而采用B、C、D和E培养得到的脂肽有抑菌效果。只有采用C和E培养基培养得到的上清液和脂肽有抑菌效果，其中采用E培养基培养得到的脂肽抑菌效果最强。
采用E培养基培养解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349，当培养温度达40℃时，上清液无抑菌效果，而采用25℃培养得到的上清和脂肽抑菌效果最强。
表5 不同条件下的发酵上清液和脂肽对青枯雷尔氏菌FJAT-91的抑菌效果
注：字母表示在P<0.05水平上差异显著。
因此，采用马铃薯浸粉作为解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349的碳源时，发酵产生的脂肽具有最好的抑菌效果；并且iturin、fengycin、surfactin的最佳含量为48.7％、19.7％、31.6％时，抑菌效果最好，并非某种脂肽含量越多效果越好。
实施例2
1.脂肽的制备
解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349接种至50mL NA液体培养基中，25℃、170r/min振荡培养36h，作为种子液。按1％接种量接种种子液至50mL PDA液体培养基中，相同条件振荡培养36h。发酵液离心弃去菌体得上清液，上清液加2mol/L盐酸至pH<2，4℃静置36h后，离心得沉淀，沉淀经低温冷冻干燥后得到脂肽粉末。
2.番茄青枯病盆栽试验
对照组：以只接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91的4～5叶龄番茄苗做阳性对照，每盆4株。
处理组：4～5叶龄的番茄盆栽苗用1mg/mL脂肽(用甲醇配制)浸根处理1h后，移栽到钵盆中，每盆4株；3天后再伤根接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91(接种浓度3×108CFU/mL)，接种量为100mL/盆。
接种后每2天观察番茄植株的发病情况，共观察30天。于接种后第12天和30天分别统计不同处理番茄植株的发病率，并计算解淀粉芽孢杆菌FJAT-2349产生的脂肽对番茄青枯病的防效。
3.实验结果
解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349产生的脂肽对青枯雷尔氏菌有很强的抑制作用，因而进一步结合盆栽实验评估解淀粉芽孢杆菌FJAT-2349产生的脂肽对番茄青枯病的防效。对照组和处理组的番茄植株生长情况见图2。对照组在接种青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91后第7天开始发病，番茄植株出现萎蔫症状，并随着时间的推移日益严重，至第12天番茄植株全部出现萎蔫症状，发病率为100％。脂肽浸根处理组的番茄推迟6天发病，接种FJAT-91后，第12天仅小部分番茄植株开始出现萎蔫症状，发病率仅为2.3％，防效达97.5％；第30天脂肽浸根处理组一半以上番茄植株出现萎蔫症状，发病率为61.4％，防效仍有38.6％，发病率和防效详见表6。
表6 解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349脂肽盆栽防效
实施例3
1.脂肽的制备
解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349接种至50mL NA液体培养基中，20℃、170r/min振荡培养12h，作为种子液。按2％接种量接种种子液至50mL PDA液体培养基中，相同条件振荡培养60h。发酵液离心弃去菌体得上清液，上清液加2mol/L盐酸至pH<2，4℃静置12h后，离心得沉淀，沉淀经低温冷冻干燥后得到脂肽粉末。
2.脂肽对多种病原菌的平板拮抗试验
预先在平板上培养病原菌，包括香蕉尖孢镰刀菌FJAT-370、甜瓜尖孢镰刀菌FJAT-9230、龙眼致腐菌小新壳梭孢菌FJAT-3531、枇杷炭疽病菌FJAT-30256，各菌株保存于福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库。
在30℃、170rpm下，病原菌FJAT-370、FJAT-9230、FJAT-3531在NA固体平板上培养2天，病原菌FJAT-30256在PDA固体平板上培养3天后，加入无菌水将孢子洗脱下来，为孢子悬浮液；吸取病原菌液0.5mL，加入到熔化并冷却到50℃的80mL含0.9％琼脂的半固体PDA培养基中，混匀后作为上层培养基，倾覆在预先已凝固的含1.8％琼脂的PDA下层培养基。待上层培养基凝固，平板冷却后在平板中间打直径7mm孔，分别注入不同浓度脂肽的溶液80μL，以无菌甲醇溶液为空白对照，每个处理3次重复，30℃培养2-5天后，测抑菌圈直径。
3.实验结果
采用抑菌圈法测定不同浓度的解淀粉芽孢杆菌FJAT-2349产生的脂肽对几种真菌的抑制作用，见表7。结果表明，该菌产生的脂肽对几种尖孢镰刀菌、小新壳梭孢菌、枇杷炭疽病菌等多种真菌均具有较强的抑制效果，且呈剂量效应，浓度越高，抑菌效果越好。
表7 不同浓度的脂肽对真菌的抑制作用
注：字母表示在P<0.05水平上差异显著。
实施例4
1.脂肽的制备
解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349接种至50mL NA液体培养基中，20℃、170r/min振荡培养24h，作为种子液。按1％接种量接种种子液至50mL PDA液体培养基中，相同条件振荡培养48h。发酵液离心弃去菌体得上清液，上清液加2mol/L盐酸至pH<2，4℃静置24h后，离心得沉淀，沉淀经低温冷冻干燥后得到脂肽粉末。
2.枇杷炭疽孢子悬浮液制备
枇杷炭疽病原菌FJAT-30256在PDA固体平板上培养3天后，加入无菌水将孢子洗脱下来，调整孢子浓度为1.0×104CFU/mL，待用。
3.脂肽对枇杷采后炭疽病害的防治实验
供试枇杷品种为“解放钟”，产地为莆田，挑选果形端正、无机械伤、无裂果，无病虫斑的枇杷作为试材。所用枇杷经酒精表面消毒后，用无菌水洗涤，晾干待用。
治愈性对照组：每个枇杷果实腰部用消毒的枪头刺伤一个点，深度为1.5mm。每个刺伤点的枇杷炭疽孢子悬浮液用量5μL，孢子浓度为1.0×104CFU/mL。24h后，刺伤口加入5μL的清水。
治愈性处理组：每个枇杷果实腰部用消毒的枪头刺伤一个点，深度为1.5mm。每个刺伤点的枇杷炭疽孢子悬浮液用量5μL，孢子浓度为1.0×104CFU/mL。24h后，刺伤口加入浓度为50mg/mL的脂肽溶液5μL。
预防性对照组：每个枇杷果实腰部用消毒的枪头刺伤一个点，深度为1.5mm。每个刺伤点加入清水5μL，24h后加入枇杷炭疽孢子悬浮液5μL，孢子浓度为1.0×104CFU/mL。
预防性处理组：每个枇杷果实腰部用消毒的枪头刺伤一个点，深度为1.5mm。每个刺伤口加入浓度为50mg/mL的脂肽溶液5μL，24h后加入枇杷炭疽孢子悬浮液5μL，孢子浓度为1.0×104CFU/mL。
每个实验组枇杷个数为24个，为了加快发病速度，枇杷储存温度为28℃～30℃，湿度为75％～80％；每天观察发病情况，统计发病率和病斑直径。
4.实验结果
脂肽对枇杷炭疽病害治愈性试验结果如表8所示。
表8 脂肽对枇杷炭疽病害治愈性试验结果
脂肽对枇杷炭疽病害预防性试验结果如表9所示。
表9 脂肽对枇杷炭疽病害预防性试验结果
上述结果表明，本发明的抗菌脂肽能够推迟枇杷炭疽发病，降低枇杷炭疽病害的发病率，减轻炭疽病发病程度。利用本发明的抗菌脂肽可以在一定程度上预防或者治疗枇杷采后炭疽病害。
综上，本发明得到的脂肽由iturin、fengycin和surfactin组成，不仅可抑制细菌，还可以抑制真菌，不仅可用于番茄青枯病的防治，还可以用于香蕉、甜瓜等植物病原菌的防治，以及抑制龙眼和枇杷采摘后腐烂菌，延长龙眼和枇杷果实的保存期，因此，本发明得到的脂肽在农业生产上具有广阔的应用前景。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (3)
1.一种抗菌脂肽，其特征在于：所述的脂肽由解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349菌株产生，其制备方法为将解淀粉芽胞杆菌FJAT-2349接种至NA液体培养基中，25℃、170r/min振荡培养24h，作为种子液，所述的NA液体培养基成份为牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L；按1％接种量接种种子液至PDA液体培养基中，相同条件振荡培养48h，所述的PDA液体培养基成份为马铃薯浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖15g/L；发酵液离心弃去菌体得上清液，上清液加2mol/L盐酸至pH<2，4℃静置24h后，离心得沉淀，沉淀经低温冷冻干燥后得到脂肽粉末；所述的脂肽组成包括伊枯草菌素iturin、丰原素fengycin和表面活性素surfactin；所述的伊枯草菌素由C14–C17iturin A组成；所述的丰原素由C14/C16fengycin A、C14fengycin B2、C16fengycin A2/B2、C16–C17fengycin B、C15fengycin A衍生物和C15fengycin B衍生物组成；所述的表面活性素由C12–C16 surfactin A组成；所述的伊枯草菌素、丰原素和表面活性素的相对含量分别是48.7%、19.7%和31.6%，均为质量百分数。
2.一种如权利要求1所述的抗菌脂肽在植物病原菌防治中的应用，其特征在于：所述的病原菌包括番茄青枯雷尔氏菌、香蕉尖孢镰刀菌、甜瓜尖孢镰刀菌、龙眼致腐菌小新壳梭孢菌、枇杷炭疽病菌中的一种或多种。
3.一种如权利要求1所述的抗菌脂肽在枇杷或龙眼果实保鲜防腐中的应用，其特征在于：所述的应用方法为在果实的腰部用消毒的枪头刺伤一个点，深度为1.5mm，刺伤口加入浓度为50mg/mL的抗菌脂肽溶液5μL，延长龙眼或枇杷果实的保存期。
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Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (3)
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| "产抗菌脂肽GD菌株筛选及脂肽分离、鉴定与应用研究";庄国宏;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20150115(第1期);表4 * |
| "芽胞杆菌几种重要酶的酶学特性分析";刘程程;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20180415(第4期);全文 * |
| "芽胞杆菌分类与应用研究进展";刘国军等;《微生物学通报》;20160907;第44卷(第4期);全文 * |
Also Published As
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