CN102268390A - 一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用，其步骤：A、解淀粉芽胞杆菌的筛选分离：采集分蘖期的水稻，将水稻根部冲洗，以乙醇浸泡消毒，将水稻根部切块，置于培养基上培养，获得单菌落；B、检测细菌的抑菌活性：将分离得到的细菌以PD液体培养，检测抗菌活性；C、细菌的分类鉴定：对检测到显著抗真菌活性的细菌进行形态鉴定；D、细菌培养和保存：培养解淀粉芽胞杆菌的条件为PD培养基，菌株于低温保存。该菌在制备治疗或预防油茶炭疽病药物中的应用：方法易行，操作简便，脂肽以其抗菌谱广、抗菌作用强、稳定性好，防治效果稳定，其产生的抗菌物质-脂肽活性稳定，抗高温、抗蛋白酶解，是一种高效稳定的抗菌物质。

Description

一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌，同时还涉及一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，还涉及一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的用途。 

背景技术

很多芽胞杆菌可以通过产生脂肽抑制真菌的生长。脂肽之所以能够抑制真菌的生长，是由于其两亲的结构决定的，脂肽与细胞膜相互作用可以导致膜穿孔造成原生质泄露，使得菌丝体断裂；脂肽还可以通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等从而抑制孢子萌发，见参考文献(祁高富；赵秀云；朱发银；文凯；张世超；喻子牛。一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及由该菌制备的脂肽与应用。专利号：CN200810197403.4)。 

申请人所在单位从水稻根部分离到一株解淀粉芽胞杆菌CH1，经过发酵可以产生脂肽类表面活性素，该脂肽对水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉病、棉花炭疽病菌、杨树溃疡病菌、灰霉菌等多种植物病原真菌具有显著的拮抗效果。进一步研究发现，该脂肽对真菌的抑制作用原理不但包括使真菌菌丝发生坏死，而且包括在浓度较低时诱导真菌发生细胞凋亡，见参考文献(Qi，G.F.，Zhu，F.Y.，Du，P，et al.Lipopeptide induces apoptosis in fungal cells by a mitochondria-dependent pathway.020Peptides，2010，31：1978-1986和林福呈，李德葆，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S9对植物病原真菌的溶菌作用，植物病理学报，2003，33：174-177)。 

在载玻片上分别接种CH1和水稻纹枯病菌进行对峙实验，结果发现在载玻片上受到抑制的水稻纹枯病菌出现了明显的细胞凋亡现象，却没有检测到相应的细胞坏死特征，推测在自然环境下芽胞杆菌类的拮抗细菌，如枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌等，产生的脂肽浓度不足以使病原真菌坏死，通常是通过诱导真菌细胞凋亡的形式来抑制病原真菌的生长。 

当前，化学农药的使用已经在全球造成了严重的生态破坏和环境污染，使用高效低毒的生物农药是农业发展的必然趋势。本实验中对CH1的发酵优化首先采用Plackett-Burman设计筛选出对脂肽产量有显著影响的因素，然后用田口设计得到了培养基各组分的最优组合。发酵液后处理采用喷雾干燥方式进行，喷雾干燥中，高压气流使发酵液形成超细液滴，使发酵液瞬时干燥，最大限度的降低了高温对发酵液中活性成分的伤害，保留了抑菌活性。 

本研究还通过田间苗圃实验对CH1粉末的药效进行了检测，并与常用的化学杀菌剂进行了比较，为脂肽类生物农药的研究和使用提供了参考。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，本发明的目的是在于提供了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌，该菌能产生促真菌凋亡的一种脂肽，可作为抗植物病原菌的有效成分。该菌对Rhizoctonia solani，Helminthosporium maydis，Fusarium oxysporium，Botrytis cinereapers，Gibberella zeae，Dothiorella gregaria，Colletotrichum gossypii等植物病原真菌都有明显的抗菌效果。发酵液对油茶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)抑制效果显著。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，对该菌的发酵培养基、发酵条件和发酵液的后处理方法进行了摸索和优化，对发酵液进行低压浓缩和喷雾干燥后处理，喷雾干燥后得到的粉末药效存留率为86.2％。该粉剂使用方便，可长期储存于室温，药效稳定，兑水稀释后喷雾施用，可用于田间大面积防治油茶炭疽病等真菌病害。 

本发明的还有一个的目的是在于提供了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌在制备治疗或预防油茶炭疽病药物中的应用。苗圃实验证明，喷雾干燥粉末能够很好的防治油茶炭疽病。粉剂稀释1000倍后用于田间苗圃实验，防治油茶炭疽病菌，解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)CH1粉剂的防效高于常用的化学农药，防效高达74.4％；70％甲基托布津可湿性粉剂，防效达59.0％，50％多菌灵可湿性粉剂仅为48.7％。表明该菌可有效防治油茶炭疽病菌，且与化学农药相比，对环境无污染，对人畜不会造成伤害。该菌可用于防治油茶炭疽病，有利于生产高品质的无公害植物油。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，其步骤是： 

1.解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的筛选分离：从水稻田采集分蘖期的中花11水稻，将水稻根部外表面以自来水冲洗干净，再以无菌水冲洗2-4次，然后以70％(v/v)乙醇浸泡消毒28-32s，以无菌水冲洗2-4次后，将水稻根部切成约1mm大小的碎块，置于PDA培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)上于28℃培养46-50h，获得单菌落。 

2.检测细菌的抑菌活性：将分离得到的细菌以PD液体培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水至1L)于28℃，振荡培养，发酵上清液以0.22μm滤膜过滤后，与PDA培养基按体积比混合倒平皿接种水稻纹枯病菌(华中农业大学植保系植物病理教研室)，见参考文献(云月利，徐冠军.斑蝥素对植物病原菌抑制作用的研究.湖北大学学报：自然科学版，2003，25(4)：342-345)，检测抗菌活性。 

3.细菌的分类鉴定：对检测到显著抗真菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。用常规方法提取细菌的基因组DNA，见参考文献(萨姆布鲁克等著，金冬雁等译.分子克隆实验指南第二版.北京：科学出版社，1999)，以16SrRNA的通用引物进行PCR。扩增产物进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。 

4.细菌培养和保存方法：培养解淀粉芽胞杆菌的条件为PD培养基或者LB培养基，28℃-37℃培养。 菌株保存方法：取培养好的Bacillus.amyloliquefaciens CH1菌液添加灭菌甘油至终浓度25％于-80℃保存。 

申请人通过对湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的一株解淀粉芽胞杆菌(保藏编号为CCTCC NO：M208127)进行发酵优化和发酵放大，并对发酵液进行低压浓缩和喷雾干燥后处理，发现喷雾干燥后保留了大部分抑菌活性，苗圃实验证明，喷雾干燥粉末能够很好的防治油茶炭疽病。一株分离的产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌菌株，解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CH1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC：M208127，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2008年9月5日。 

解淀粉芽胞杆菌CH1(Bacillus.amyloliquefaciens CH1)的菌学特征： 

解淀粉芽胞杆菌CH1革兰氏阳性，菌体杆状，菌体大小1-1.4μm×2.3-3.5μm，在PDA(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)平板上能快速扩散，不形成特定的菌落形态，边缘不规则，呈灰白色，粘稠有荚膜，培养48h后表面有小皱褶。在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直径3-5mm，表面干燥有皱褶，中间塌陷，边缘波状。37℃生长明显快于28℃。芽胞近端生，鞭毛周生。对多种植物病原菌有显著抑菌活性，检测72h时的抑菌率，对油菜灰霉病菌(Botryotini fuckeliana)的抑菌率为96.9％，对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)为77.0％，对杨树烂皮病菌(Cytospora chrysosperma)为57.0％，对甘蔗凤梨病菌(Thielaviopsis paradoxa)为65.1％，对苹果轮纹病菌(Dothiorella gregaria)为62.0％，对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)为65.8％，对油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)为85.3％，对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)为93.4％，对油茶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)为100％。PDB以及豆粕培养基培养的CH1培养液对植物病原菌都具有较好的抑菌效果，但2％豆粕培养基(20g豆粕粉，蒸馏水定容至1L)发酵产物的抑菌效果明显优于PDB培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1L)的发酵产物。 

解淀粉芽胞杆菌CH1可产生一种Surfactin类的环状脂肽，命名为WH1fungin，脂肽能明显抑制真菌细胞的葡聚糖合成酶活性，经WH1fungin处理后，水稻纹枯病菌和假丝酵母的某些细胞能被依文思蓝染色，表现出细胞膜穿孔、细胞质渗漏等现象。脂肽序列如下： 

一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌在制备治疗或预防油茶炭疽病药物中的应用，其应用步骤是： 

1.CH1的发酵优化：以对油茶炭疽病的抑菌率为相应量，通过Plackett-Burman设计得到所筛选的培养基成分中对相应量有显著影响的因子，然后通过单因素实验对得到的因子分别进行优化，最后通过田口设计得到培养基各因子的最佳水平组合。 

2.发酵放大与发酵液后处理：成功完成了250mL摇瓶到500L罐的放大。对发酵液进行浓缩和喷雾干燥后得到的粉末药效存留率为86.2％。 

3.CH1喷雾干燥粉末的制备：发酵过程的放大依次在3L、20L、500L发酵罐中进行，初始搅拌转数 200rpm，培养温度30℃，发酵完成后，用减压浓缩罐经65℃，0.09MPa对发酵液进行浓缩，然后用喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理，获得喷雾干燥粉末。 

4.CH1对油茶炭疽病的抗性：申请者通过平板抑制试验发现，CH1发酵液能够使油茶炭疽病菌丝畸形，从而抑制油茶炭疽病的生长。离体叶片防治实验显示，稀释至原体积50倍的发酵液对离体油茶叶片上的炭疽病防效仍然非常显著。 

5.通过田间苗圃实验比较了CH1粉剂和两种常用化学杀菌剂对油茶炭疽病的防效：解淀粉芽胞杆菌CH1可湿性粉剂用水稀释1000倍，在油茶发病初期进行喷雾处理，以后每隔10d进行施药一次，连续用药5次。在用药15d后进行第一次调查，末次用药后10d进行第二次调查。调查发病率和病情指数。 

实施结果： 

CH1发酵液中的脂肽可以使油茶炭疽病菌丝畸形，从而抑制油茶炭疽病的生长，在离体叶片上喷洒稀释的发酵液，同样能够有效的抑制油茶炭疽病菌斑的蔓延，保护油茶不被病菌侵染。 

发酵优化的结果：Plackett-Burman结果显示，在P＜0.05范围内，豆粕粉、NH₄NO₃、Na₂HPO₄和温度是影响脂肽产量的主要因素，由于温度对脂肽产量为负影响，所以发酵温度选取30℃，其他3个培养基因子通过单因素实验得到最适浓度分别为Na₂HPO₄ 4g/L、NH₄NO₃ 4g/L、豆粕粉12g/L；最后结合田口设计结果和生产成本等因素确定最终培养基组合为豆粕粉12g/L，NH₄NO₃ 2g/L，Na₂HPO₄ 2g/L，淀粉15g/L。 

发酵放大及后处理结果：在发酵放大过程中，抑菌活性降低30％。喷雾干燥的粉末成品产量为6.5g/L，平板抑制实验表明，粉剂药效与喷雾干燥前发酵液相比存留率为86.2％，粉末常温保存一年后活性无任何降低。喷雾干燥所得粉末可溶性好，性质稳定，可长期保存，同时保留了益生芽胞，可在施药过程中直接回接到油茶叶片上和土壤中，增强药效。 

苗圃实验结果：第一次调查结果显示，解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)CH1粉剂的防效最好，高达74.4％，其次为70％甲基托布津可湿性粉剂，防效达59.0％，50％多菌灵可湿性粉剂效果最差，防效仅为48.7％；第二次调查结果显示，CH1粉剂防效依然领先，为53.5％，其次为70％甲基托布津，防效为44.2％，50％多菌灵可湿性粉剂效果最差，防效仅为39.5％。 

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 

油茶炭疽病是油茶上的主要病害，历年来病情严重，发病范围广，显著降低了油茶产量，危害了茶农的利益。对于油茶炭疽病防治技术的研究，目前仍主要是采用农业和化学药剂防治，对于油茶炭疽病生物防治技术研究还处在起步阶段。 

生产上，主要使用化学农药(百菌清、波尔多液、甲基托布津、退菌特、三环唑等)来防止油茶炭疽病的蔓延，然而化学防治容易引起病菌的抗药性，同时也加大了对油茶果实和环境的污染，不利于生产高品质的无公害植物油。长期使用杀菌剂已造成一系列严重的后果，如污染环境、危害人类健康、破坏生态平衡以及病原体耐药性增加等。化学农药带来的药物残留问题把人民的饮食健康问题提高到一个新的高度，所以无公害、环保的生物绿色农药越来越受到人们的关注。不断地寻找低毒高效的生物农药是农业类科研工作者迫在眉睫的任务。生物源农药的主要成分为微生物本身和其代谢产物，这些有效成分一般都具有在自然界中容易降解的优点，对人畜不会造成伤害。 

芽胞杆菌是目前应用最为成功的微生物杀菌剂和杀虫剂之一，芽胞杆菌产生的抑菌物质种类多，抑菌谱广，一直是拮抗病原细菌和病原真菌的主力军。芽胞杆菌产生的抗真菌物质主要为次级代谢产物脂肽和基因编码蛋白。脂肽以其抗菌谱广、抗菌作用强、稳定性好的优点被广泛的开发。脂肽类化合物是由芽胞杆菌代谢产生的一类生物表面活性剂。其结构一般是由1个β-羟基脂肪酸与7-10个氨基酸以酰胺键形式连接的环，具有抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗支原体的特性，具有潜在的抗植物真菌病害价值和医学应用价值。脂肽之所以能够抑制真菌的生长，是由于其两亲的结构，与细胞膜相互作用造成原生质泄露，使得菌丝体断裂；或者是产生的抗菌物质通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等现象从而抑制孢子萌发。 

从水稻根部分离到一种解淀粉芽胞杆菌CH1，可以通过产生脂肽类表面活性剂类WH1 fungin抑制真菌的生长。WH1 fungin之所以能够高效的抑制真菌，是因为它能够在不同的浓度，通过不同的机制发挥抗菌作用：在高浓度时，诱导细胞膜穿孔，导致细胞质泄露，造成真菌细胞破裂而死亡，而在低浓度时可以通过诱导真菌细胞发生程序性凋亡，使真菌出现核断裂、ROS积累、磷脂酰丝氨酸外翻、caspase酶活性上升等典型的细胞凋亡特征，而且这种方式可能为产脂肽类芽胞杆菌在自然界中抑制真菌的主要方式，见参考文献。解淀粉芽胞杆菌CH1为报道能高效防治油茶炭疽病的芽胞杆菌，其防治效果稳定，优于常用的化学杀菌剂(甲基托、多菌灵)。 

而解淀粉芽胞杆菌CH1对油茶炭疽病有良好的防治效果，有潜力被开发成防治油茶炭疽病的生物农药，并对CH1的抑菌效果和发酵生产工艺进行了进一步的探索，通过培养基和发酵条件的优化，提高抗菌脂肽的产量，并且将发酵产物进一步进行浓缩和喷雾干燥处理，以作为运输方便、可长期保存，专门针对油茶 炭疽病的可湿性粉剂。喷雾干燥粉末含菌量高，达0.5亿个芽胞/克，芽胞可耐受高温、干燥、辐射等不良环境条件，其产生的抗菌物质-脂肽活性稳定，抗高温、抗蛋白酶解，是一种高效稳定的抗菌物质。该研究一方面顺应了开发绿色新兴生物农药的趋势，另一方面也将为我国的生物农药开发注入新的力量。 

附图说明

图1为一种解淀粉芽胞杆菌对油茶炭疽病的抑制作用示意图。 

图1A：油茶炭疽病孢子在PDA平板上生长24h的状态； 

图1B，C，D：油茶炭疽病孢子在含1/50、1/20、1/10发酵液的PDA平板上生长24h的状态。在培养基中加入CH1发酵液能够显著的抑制油茶炭疽病菌丝的生长。 

图2为一种解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽对油茶炭疽病菌丝的致畸作用。 

图2A：在含1/10发酵液的PDA平板上生长24h的油茶炭疽病菌丝； 

图2B：在PDA平板上生长24h的油茶炭疽病菌丝。从图中可以看到脂肽能够使油茶炭疽病菌丝膨大畸形，从而抑制其生长。 

图3是一种解淀粉芽胞杆菌CH1在油茶离体叶片上对油茶炭疽病的防治效果示意图。 

图3A为喷洒稀释50倍的CH1发酵液后，接入油茶炭疽病，培养5d情况；图3B为喷洒蒸馏水后，接入油茶炭疽病，培养5d的情况。可以看到CH1能够比较显著的抑制油茶炭疽病在叶片上的扩散。 

具体实施方式

实施例1： 

一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，其步骤是： 

1、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的筛选分离： 

从中国湖北省武汉市华中农业大学水稻田取分蘖期的中花11水稻数株，洗净后分离根部。将水稻根部外表面以自来水冲洗干净后，再以无菌水冲洗三次，然后以70％(v/v)乙醇浸泡消毒30s，以无菌水冲洗3次后，用无菌剪刀将水稻根部切成约1mm大小的碎块，然后置于PDA培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)上于28℃培养48h。将分离得到的细菌以PD液体培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水至1L)于28℃，180rpm摇床中振荡培养48h，离心，收集上清液并以0.22μm滤膜过滤后，与PDA培养基按体积比分别为10％，5％，2.5％混合倒平皿接种水稻纹枯病菌(华中农业大学植保系植物病理教研室)，见参考文献(云月利，徐冠军.斑蝥素对植物病原菌抑制作用的研究.湖北大学学报：自然科学版，2003，25(4)：342-345)，检测抗菌活性。 

2、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的分类鉴定： 

对检测到显著抗真菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。以PD液体培养基过夜培养分离到的细菌，用常规方法提取细菌的基因组DNA，见参考文献(Qi，G.F.，Zhu，F.Y.，Du，P.，et al.Lipopeptide induces apoptosis in fungal cells by a mitochondria-dependent pathway.Peptides，2010，31：1978-1986)， 以测定16SrRNA  的通用引物(primerF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；primerR：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA，由上海生工生物工程技术有限公司合成)进行PCR(PCR反应体系为：双蒸水18.3μl，10×PCR缓冲液2.5μl，通用正反引物，dNTP各1μl，Taq酶0.2μl(PCR反应试剂均为广东东盛生物科技有限公司产品)。反应程序：94℃ 4min，30循环的94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 90s，再72℃ 10min)，1％琼脂糖电泳检测成功扩增到大小大约为1.5kb的DNA片段，由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)。 

培养解淀粉芽胞杆菌的条件为PD培养基或者LB培养基，28℃-37℃培养。菌株保存方法：取培养好的Bacillus.amyloliquefaciens CH1菌液添加灭菌甘油至终浓度25％于-80℃保存。 

3、解淀粉芽胞杆菌CH1的发酵条件优化： 

发酵条件优化时，先采用Plackett-Burman设计从11个因子中选出对脂肽产量有显著性影响的因子，再分别对选出的重要因子做单因素实验进行优化，最后利用田口设计确定最终的培养基成分和各因子水平。以对油茶炭疽病的抑菌率为发酵试验的唯一响应量。 

抑菌率计算：种子液在PD培养基中培养12h后，以5％接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，发酵48h，8000rmp，离心5min，收集上清液并以0.22μm滤膜过滤除菌后，与PDA培养基以1∶50体积比混合倒置平板备用。将在PDA平板中培养好的油茶炭疽病菌，用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，将菌饼接种到上述含CH1过滤除菌发酵液的PDA平板中，以菌饼接种在不含CH1发酵液的PDA平板上做对照。28℃倒置培养，待对照平皿中菌丝快要长满平皿时，测量试验组和对照组的菌落直径，计算抑菌率。 

抑菌率(％)＝(对照组直径-实验组直径)/(对照组直径-0.5)×100％ 

(1)Plackett-Burman设计： 

把有可能影响脂肽产量的9个培养基成分(豆粕粉、玉米粉、淀粉、NH₄NO₃、MgSO₄、酵母粉、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、CaCl₂)，连同发酵温度(30℃，37℃)和发酵pH值(pH6.0，pH7.5)作为试验因子进行Plackett-Burman设计。菌体的生长和脂肽的产生需要碳源、氮源、无机盐和微量元素等营养物质，在本设计中，供试碳源包括玉米粉、淀粉、酵母粉；氮源包含有机氮源豆粕粉和无机氮源硝酸铵；还添加了镁元素、钠元素、磷元素和钙元素等生物生长代谢过程必须的营养物质(NH₄NO₃，MgSO₄，KH₂PO₄，Na₂HPO₄，CaCl₂)；由于初始培养基含有大量的有机物且溶解介质为自来水，没有考虑额外添加微量元素(Fe、Cu、Zn、Mn、Co等)。 

(2)单因素实验： 

根据Plackett-Burman设计的结果，删除对脂肽产量无显著影响且用量较少的培养基成分，选择对脂肽产量有显著影响的因子分别用单因素实验进行优化，单因素优化过程中，根据响应量的变化，不断缩小培养基浓度的优化范围，以找到最优的培养基浓度，最后对Na₂HPO₄、NH₄NO₃和豆粕粉分别用以下浓度进 行优化。 

Na₂HPO₄产量对脂肽产量的影响：在Plackett-Burman设计的筛选基础上，固定其它成分不变，以不同的Na₂HPO₄浓度：0g/L，4g/L，8g/L，12g/L进行实验，计算发酵液抑菌率，确定Na₂HPO₄的合适浓度(4g/L)。 

NH₄NO₃浓度对脂肽产量的影响：在Plackett-Burman设计的筛选基础上，固定其它成分不变，以不同的NH₄NO₃浓度：0g/L，4g/L，8g/L，12g/L，16g/L进行实验，计算发酵液抑菌率，确定NH₄NO₃的合适浓度(4g/L)。 

豆粕粉浓度对脂肽产量的影响：在Plackett-Burman设计的筛选基础上，固定其它成分不变，以不同的豆粕粉浓度：4g/L，8g/L，12g/L，16g/L，20g/L，24g/L进行实验，计算发酵液抑菌率，确定豆粕粉的合适浓度(12g/L)。 

(3)田口实验设计 

根据单因素实验的优化结果，选择Na₂HPO₄，NH₄NO₃，豆粕粉和用量较大的淀粉共4个因素，各设3个水平，进行L9(3)⁴田口试验。根据田口试验结果对产量较高的培养基组合进行验证。 

实施例2： 

一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌在制备治疗或预防油茶炭疽病药物中的应用，其应用步骤是： 

1、解淀粉芽胞杆菌CH1对油茶炭疽病的抑制活性： 

(1)无菌发酵液获取： 

接种保存的解淀粉芽胞杆菌CH1菌种(分离至水稻根部)10μL到10mL灭菌的PD培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h。然后接种5mL新鲜培养物到含100mL新鲜PD培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡培养48h，8000g离心10min收集上清，上清液经0.22μm滤膜过滤灭菌后-20℃保存备用。 

(2)CH1发酵液对油茶炭疽病菌丝的抑制： 

将CH1无菌发酵液与PDA培养基分别按体积比为1∶50、1∶20、1∶10的比例混合倒平板备用，以不添加发酵液的PDA培养基作为对照。将油茶炭疽病孢子用无菌水稀释到1×10⁵/mL，取200μL涂布平板，37℃倒置培养24h。取菌丝压片，显微镜下观察菌丝形态。 

(3)CH1发酵液在离体叶片上对油茶炭疽病的抑制： 

采集大小一致的新鲜油茶嫩叶，用蒸馏水冲洗干净后放置在铺有1层湿滤纸的培养皿中，在叶柄处盖上用蒸馏水湿润的脱脂棉。试验组用蒸馏水稀释50倍的无菌发酵液喷洒叶片，室温(20-25℃，以下相同)自然干燥后接种1个油茶炭疽病菌饼；对照组的叶片喷洒蒸馏水干燥后接种1个油茶炭疽病菌饼，2组同时置于温度为26℃，湿度为95％的光照培养箱中培养，每24h观察1次并添加适量蒸馏水至脱脂棉上保湿。 

2、解淀粉芽胞杆菌CH1喷雾干燥粉末的制备： 

发酵过程的放大依次在3L、20L、500L发酵罐中进行，溶氧值由溶氧电极测定，pH值采用培养基自然pH值(pH7.0)。发酵期间主要控制溶氧和搅拌转数，通气比0.5～1.5vvm，初始搅拌转数200rpm，发酵过程中保持溶氧10％以上，培养温度恒定在30℃，当泡沫形成之后加消泡剂消除泡沫。 

使用3L发酵罐进行发酵时，50mL种子液接入装有1.5L培养基的3L发酵罐中进行发酵，发酵超过12h以后，每3h取样一次。样品经过离心和无菌滤膜过滤去除菌体和发酵残渣，分别检测其对油茶炭疽病的抑制作用，以了解脂肽的产生时段。 

发酵完成后，用减压浓缩罐经65℃，0.09MPa对发酵液进行浓缩，将发酵液浓缩为原体积的25％。浓缩后的发酵液用喷雾干燥塔以进风口温度160℃，出风口温度80℃，进液量10mL/min的条件进行喷雾干燥处理。对喷雾干燥粉末进行称量，计算粉末产量。 

根据喷雾干燥粉末产量，用CH1粉末配制成与未经喷雾的发酵液相同浓度的溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌后，检测溶液抑菌率。同样的方法检测室温保存一年的CH1粉末抑菌效果。 

3、CH1喷雾干燥粉末防治油茶炭疽病苗圃实验： 

试验基地位于江夏郑店林果基地，油茶苗为两年生扦插苗。试验共设3个处理：解淀粉芽胞杆菌CH1可湿性粉剂1000倍液；50％(w/w)多菌灵可湿性粉剂600倍液；70％(w/w)甲基托布津可湿性粉剂1000倍液；另设喷施清水作为空白对照。每个处理设4次重复，共16个处理。 

油茶发病初期进行喷雾处理，以后每隔10d进行施药一次，连续用药5次。在用药15d后进行第一次调查，末次用药后10d进行第二次调查。 

茶苗发病情况的调查，以植株为单位，每小区随机取样，记录所抽查的总株数和病株数，计算发病率。根据病害分级标准，在所调查发病株上调查油茶叶片发病情况，记录叶片总数和叶片发病程度，计算病情指数。 

分级标准： 

0级：叶片无病斑； 

1级：病斑占叶片总面积小于5％； 

3级：病斑占叶片总面积6-10％； 

5级：病斑占叶片总面积11-25％； 

7级：病斑占叶片总面积26-50％； 

9级：病斑占叶片总面积50％以上。 

药效计算方法： 

发病率＝发病株树/调查总株数×100％ 

病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总数×9)×100％。 

Claims (3)

1.一株分离的产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌菌株，其特征在于：解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CH1，CCTCC：M208127。

2.权利要求1所述的一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，其步骤是：

A、解淀粉芽胞杆菌的筛选分离：从水稻田采集分蘖期的水稻，将水稻根部外表面以自来水冲洗干净，再以无菌水冲洗2-4次，然后以70%v/v乙醇浸泡消毒28-32s，以无菌水冲洗2-4次后，将水稻根部切成1mm大小的碎块，置于PDA培养基：含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L，上于28℃培养46-50h，获得单菌落；

B、检测细菌的抑菌活性：将分离得到的细菌以PD液体培养基：含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水至1L，于28℃, 振荡培养，发酵上清液以0.22μm滤膜过滤后, 与PDA培养基按体积比混合倒平皿接种水稻纹枯病菌，检测抗菌活性；

C、细菌的分类鉴定：对检测到显著抗真菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定；

用常规方法提取细菌的基因组DNA，以16SrRNA的通用引物进行PCR，扩增产物进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为解淀粉芽胞杆菌；

D、细菌培养和保存方法：培养解淀粉芽胞杆菌的条件为PD培养基或者LB培养基，28℃-37℃培养，菌株保存：取培养好的Bacillus. amyloliquefaciens CH1菌液添加灭菌甘油至终浓度25%于-80℃保存。

3.权利要求1所述的一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌在制备治疗或预防油茶炭疽病药物中的应用。

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