CN110724175B - 一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗菌肽技术领域。本发明公开了一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其包括预处理、超声匀浆粗提、固相萃取柱富集、凝胶柱和C18色谱柱分离等步骤。本发明中紫贻贝抗菌肽的制备方法工艺简单且成本较低；采用固相萃取柱、凝胶柱和C18色谱柱对紫贻贝抗菌肽进行富集、分离，操作方便且抗菌肽纯度较高、易于工业化生产，所制备的抗菌肽的抑菌效果较强。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌肽技术领域，尤其是涉及一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法。
背景技术
紫贻贝（Mytilus edulis Linnaeus）俗称“海红”、“淡菜”，在我国黄海、渤海、东海和南海北部广泛分布，是我国主要的海洋经济贝类。紫贻贝生产季节性强、产量大、鲜活易腐且不耐贮藏，因此促进了紫贻贝加工业的蓬勃发展，可加工中会产生大量的下脚料——含闭壳肌的熟贝壳、蒸煮液、受损和无商业化价值紫贻贝（<6cm，蛋白含量为10~23%）等。目前，对于该下脚料利用研究主要集中于贝壳和蒸煮液，如贝壳粉（CaCO3）/贝壳煅烧粉（CaO）作为PP塑料填充料、农残/重金属吸附剂、乙醇合成催化剂、食源性致病菌抑菌剂以及蒸煮液制备海鲜调味品与贻贝多糖等，而受损和无商业化价值紫贻贝的利用研究相对较少，笔者仅见Beaulieu等[Beaulieu L, Thibodeau J, Bonnet C, et al. Evidence of anti-proliferative activities in blue mussel (Mytilus edulis) by-products[J].Marine drugs, 2013, 11(4): 975-990.]利用复合蛋白酶水解制备抗增殖活性多肽的研究。因此需对其加以开发利用研究，开发多种产品，进一步提高和拓展其应用价值。
近年来，随着细菌对抗生素耐药性、抗生素残留等问题日益严重，亟需寻找新型抗菌活性物质，因而从自然界中获得天然抗菌活性物质引起了研究者的极大兴趣。滤食性动物贻贝长期生活在富含各种微生物水环境中（菌落总数高达6 log CFU/mL），由于贻贝缺乏特异性的免疫系统，所以其免疫防御主要通过细胞（吞噬、包囊和呼吸爆发等）和体液（凝集素、溶酶体酶、抗菌因子等）进行免疫防御。相对于其它双壳贝类来说，抗菌肽在贻贝抵御致病菌侵袭中发挥着重要作用。抗菌肽具有抑菌活性强、抑菌谱广、不产生耐药性以及无有害残留等优点，所以利用紫贻贝加工下脚料高效提取海洋生物抗菌肽，是紫贻贝加工下脚开发研究的方向。因此，开发出工艺简单可行，得率高且抑菌效果好的贻贝抗菌肽，不仅进一步拓展紫贻贝应用范围，而且也提高贻贝加工下脚料的附加值。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种紫贻贝抗菌肽的得率较高、抑菌效果好并且具有工艺简单等特点的利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用超声匀浆技术从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a）预处理：紫贻加工下脚料（受损和无商业化价值紫贻贝）半解冻后，取肉、清洗，沥干后冻藏备用；
b）粗提：将紫贻贝肉与乙酸溶液混合并煮沸，冰水浴冷却；冰水浴中超声匀浆处理，超声匀浆处理后离心处理得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；
c）固相萃取：将粗提物溶解于三氟乙酸溶液中并离心处理得到上清液B，将上清液过固相萃取柱1～2次，接着依次用三氟乙酸溶液和乙腈溶液洗脱处理，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A；
d）凝胶柱分离：将抗菌肽粗品A用水溶解，离心处理得到上清液C，然后在凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B；
e）色谱柱分离：将抗菌肽粗品B配制成多肽溶液，离心处理得到上清液D并进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥后制得紫贻贝抗菌肽。
作为优选，步骤b）中，乙酸溶液的浓度为0.5～2.0wt%。
作为优选，步骤b）具体为，将紫贻贝肉与乙酸溶液混合并煮沸10～20分钟，冰水浴冷却后，冰水浴中以转速8000～12000rpm、超声功率100~300w进行超声匀浆处理时间10~30min，超声匀浆处理后在1～5℃下以10000～12000×g相对离心力离心处理20～40分钟得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；所述紫贻贝肉与乙酸溶液按1：2～3（w：v）比例（质量体积比）（每4g紫贻贝肉与8～12mL乙酸溶液的）进行混合。
作为优选，步骤c）中，三氟乙酸溶液的浓度为0.008～0.012wt%，乙腈溶液的浓度为35～45wt%，固相萃取柱填料为C18填料。
作为优选，步骤c）具体为，粗提物溶于三氟乙酸溶液配制成8～12mg/mL浓度多肽溶液， 12000rpm离心5min获得上清液B，将等柱体积上清液B过固相萃取柱1～2次，接着依次用3～5倍柱体积的三氟乙酸溶液洗脱，再用等柱体积乙腈溶液洗脱1次，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A。
作为优选，步骤c）在固相萃取前对固相萃取柱进行以下处理，用2～3倍柱体积乙腈洗脱固相萃取柱，接着使用3～5倍柱体积的0.008～0.012wt%浓度的三氟乙酸溶液洗脱固相萃取柱，洗脱速度控制在1.5～3mL/min范围。
作为优选，步骤d）具体为，将抗菌肽粗品A用超纯水溶解制得100mg/mL抗菌肽溶液，并以10000～14000×g相对离心力离心处理5～15分钟得到上清液C，然后在SephadexG-10凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B。
作为优选，步骤d）中凝胶柱的参数为，上样量5mL、检测波长220nm、流速0.4mL/min，洗脱液为去离子水。
作为优选，步骤e）具体为，将抗菌肽粗品B用0.008～0.012wt%浓度的三氟乙酸配置成1mg/mL的溶液，以10000～14000×g相对离心力离心处理8～12分钟得到上清液D并采用C18色谱柱进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥制得紫贻贝抗菌肽。
作为优选，步骤e）中C18色谱柱参数设定为，检测段波长220nm，色谱柱温为25℃，洗脱液为乙腈和0.01%三氟乙酸溶液，流度0.4mL/min，上样体积100μL；采用梯度洗脱方法，在1h内乙腈浓度在由0提高到40%。
因此，本发明具有以下有益效果：本发明中紫贻贝抗菌肽的制备方法工艺简单且成本较低；采用固相萃取、凝胶柱分离和色谱柱分离对紫贻贝抗菌肽的富集分离，操作方便且抗菌肽纯度较高、易于工业化生产，所制备的抗菌肽的抑菌效果较强。
附图说明
图1为本发明中粗提物的抑菌活性效果图，其中A大肠杆菌、B金黄色葡萄球菌；1组织匀浆器、2超声匀浆器；
图2为温度对本发明中紫贻贝抗菌肽的抑菌效果影响图；
图3为反复冻融次数对本发明中紫贻贝抗菌肽的抑菌效果影响图；
图4为蛋白酶对本发明中紫贻贝抗菌肽的抑菌效果影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料均可从市场上购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a）预处理：紫贻加工下脚料（受损和无商业化价值紫贻贝）半解冻后，取肉、清洗，沥干后冻藏备用；
b）粗提：将紫贻贝肉与浓度为0.5wt%的乙酸溶液混合并煮沸10分钟，冰水浴冷却，于冰水浴中以转速8000rpm、超声功率100w进行超声匀浆处理时间10min，超声匀浆处理后在1℃下以10000×g相对离心力离心处理20分钟得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；所述紫贻贝肉与乙酸溶液按1：2（w：v）比例（每4g紫贻贝肉与8mL乙酸溶液的比例）进行混合；
c）固相萃取：用浓度为0.008wt%的三氟乙酸溶液将粗提物配制成8mg/mL的溶液中并离心处理得到上清液B，将等柱体积的上清液B重复过固相萃取柱1次，接着依次用3倍柱体积的浓度为0.008wt%的三氟乙酸溶液洗脱固相萃取柱，用等柱体积的浓度为35wt%的乙腈溶液洗脱固相萃取柱，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A；在固相萃取前对固相萃取柱进行以下处理，先用2倍柱体积乙腈洗脱固相萃取柱，接着使用3倍柱体积的0.008wt%浓度的三氟乙酸溶液洗脱固相萃取柱，洗脱速度为1.5mL/min。
d）凝胶柱分离：用超纯水将抗菌肽粗品A配制成100mg/mL抗菌肽溶液，并以10000×g相对离心力离心处理5分钟得到上清液C，然后在Sephadex G-10凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B；凝胶柱的参数为，上样量5mL、检测波长220nm、流速0.4mL/min，洗脱液为去离子水；
e）色谱柱分离：用浓度0.008wt%的三氟乙酸溶液将抗菌肽粗品B配制成1mg/mL抗菌肽溶液，以10000×g相对离心力离心处理8分钟得到上清液D并采用C18色谱柱进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥获得紫贻贝抗菌肽；C18色谱柱参数设定：检测段波长220nm，色谱柱温为25℃，洗脱液为乙腈和0.01%三氟乙酸溶液，流速0.4mL/min，上样体积100μL；采用梯度洗脱方法，在1h内乙腈浓度由0提高到40%。
实施例2
一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a）预处理：紫贻加工下脚料（受损和无商业化价值紫贻贝）半解冻后，取肉、清洗，沥干后冻藏备用；
b）粗提：将紫贻贝肉与浓度为2.0wt%的乙酸溶液混合并煮沸20分钟，冰水浴冷却，于冰水浴中以转速12000rpm、超声功率300w进行超声匀浆处理时间30min，超声匀浆处理后在5℃下以12000×g相对离心力离心处理40分钟得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；所述紫贻贝肉与乙酸溶液按1：3（w：v）比例（每4g紫贻贝肉与12mL乙酸溶液的比例）进行混合；
c）固相萃取：用浓度为0.012wt%的三氟乙酸溶液将粗提物溶配制成12mg/mL的溶液中并离心处理得到上清液B，将上清液B重复过固相萃取柱3次，接着依次用5倍柱体积的浓度为0.012wt%三氟乙酸溶液洗脱，用1倍柱体积的浓度为45wt%的乙腈溶液洗脱次，收集洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A；在固相萃取前对固相萃取柱进行以下处理，用3倍柱体积的乙腈洗脱，接着用5倍柱体积的浓度为0.012wt%的三氟乙酸溶液洗脱，流速控制在3mL/min；
d）凝胶柱分离：用超纯水将抗菌肽粗品A配制成100mg/mL的抗菌肽溶液，并以14000×g相对离心力离心处理15分钟得到上清液C，然后在Sephadex G-10凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品；凝胶柱的参数为，上样量5mL、检测波长220nm、流速0.4mL/min，洗脱液为去离子水；
e）色谱柱分离：用浓度为0.012wt%三氟乙酸溶液将抗菌肽粗品B配制成1mg/mL的溶液，以14000×g相对离心力离心处理12分钟得到上清液D，并采用C18色谱柱进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥制得紫贻贝抗菌肽； C18色谱柱参数设定：检测段波长220nm，色谱柱温为25℃，洗脱液为乙腈和0.01%三氟乙酸溶液，流速0.4mL/min，上样体积100μL；采用梯度洗脱方法，在1h内乙腈浓度由0提高到40%。
实施例3
一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a）预处理：紫贻加工下脚料（受损和无商业化价值紫贻贝）半解冻后，取肉、清洗，沥干后冻藏备用；
b）粗提：将紫贻贝肉与浓度为1.0wt%的乙酸溶液混合并煮沸15分钟，冰水浴冷却，于冰水浴中以转速12000rpm、超声功率300w进行超声匀浆处理时间20min，超声匀浆处理后在4℃下以11000×g相对离心力离心处理30分钟得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；所述紫贻贝肉与乙酸溶液按1：2.5（w：v）比例（每4g紫贻贝肉与10mL乙酸溶液的比例）进行混合；
c）固相萃取：用浓度为0.01wt%的三氟乙酸溶液将粗提物配制成10mg/mL的溶液中并离心处理得到上清液B，将等柱体积的上清液B重复过固相萃取柱1次，接着依次用4倍柱体积的浓度为0.01wt%三氟乙酸溶液洗脱，用等柱体积的浓度为40wt%的乙腈溶液洗脱1次，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A；在固相萃取前对固相萃取柱进行以下处理，用2倍柱体积的乙腈洗脱，接着用4倍柱体积的浓度为0.01wt%的三氟乙酸溶液洗脱，流速控制在2mL/min；
d）凝胶柱分离：用超纯水将抗菌肽粗品A配制成100mg/mL的抗菌肽溶液，并以12000×g相对离心力离心处理10分钟得到上清液C，然后在Sephadex G-10凝胶柱中分离纯化，收集并混合洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品；凝胶柱的参数为，上样量5mL、检测波长220nm、流速0.4mL/min，洗脱液为去离子水；
e）色谱柱分离：用0.01wt%浓度的三氟乙酸溶液将抗菌肽粗品B配制成1mg/mL的多肽溶液，以12000×g相对离心力离心处理10分钟得到上清液D并采用C18色谱柱进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥并制得紫贻贝抗菌肽；C18色谱柱参数设定：检测段波长220nm，色谱柱温为25℃，洗脱液为乙腈和0.01%三氟乙酸溶液，流速0.4mL/min，上样体积100μL；采用梯度洗脱方法，在1h内乙腈浓度由0提高到40%。
紫贻贝活性肽提取研究：
1 粗提物制备：
紫贻贝加工下脚料（受损紫贻贝和无商业化价值的小紫贻贝）半解冻后取肉、清洗、沥干，加入预热至80℃、1.0wt%乙酸溶液，料液比1：3（g/mL），沸水浴加热15min，冰水浴中冷却，冰水浴中以转速10000rpm、超声功率200w进行超声匀浆处理时间20min，4℃下12000×g离心30min，上清液冷冻干燥获得粗提物，粗提物用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成10mg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，上清液按3方法测定其抑菌活性。
2 粗提物的分离纯化：
2.1 固相萃取：
固相萃取使用Sep-Pak C18柱分离纯化粗提物中的多肽。将1g贻贝抗菌肽粗提物溶解于10mL 0.01wt%三氟乙酸溶液中，离心后上清液进行固相萃取。在固相萃取前先对萃取柱进行活化与平衡，先用2倍柱体积的100%乙腈进行洗脱，接着用4倍柱体积的浓度为0.01wt%的三氟乙酸溶液进行洗脱，流速控制在2mL/min。取1倍柱体积的浓度约为100mg/mL粗提物溶液的上清液，重复过萃取柱1遍，接着用4倍柱体积的浓度0.01wt%三氟乙酸洗进行洗脱，再用1倍柱体积的浓度为40wt%乙腈溶解进行洗脱，分别收集合并各洗脱液，冷冻干燥后用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成1mg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，上清液吸取100μl 的按照3方法测定其抑菌活性。
2.2 凝胶柱分离：
Sephadex G-10凝胶柱层析固相萃取制备的多肽，用超纯水将2.1中冻干抑菌多肽配制成浓度为100mg/mL多肽液，12000×g离心10min，上清液于凝胶色谱柱（Ø1.0×60cm）中分离纯化。色谱条件为：上样量5mL、检测波长220nm、流速1.0mL/min，洗脱液为去离子水。重复分离多次，收集合并各洗脱峰，冷冻干燥后用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成1mg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，上清液吸取100μl 的按照3方法测定其抑菌活性。
2.3 色谱柱分离：
RP-HPLC色谱分离凝胶柱分离的抗菌肽，用浓度为0.01wt%的三氟乙酸溶液将2.2中冻干抑菌多肽配制成1mg/mL多肽溶液，12000×g离心10分钟，上清液进行RP-HPLC色谱分离。色谱条件为：检测波长220nm，柱温25℃，洗脱液为乙腈和0.01wt%三氟乙酸溶液，流速度1.0mL/min，上样体积100μL；采用梯度洗脱，在1h内乙腈浓度由0%提高到40%。重复分离多次，收集合并各洗脱峰，冷冻干燥后用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成200μg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，上清液吸取100μl 的按照3方法测定其抑菌活性。
3 抑菌试验：
采用琼脂打孔法，取100μL 8.0log CFU/mL麦氏比浊法稀释的菌悬液均匀涂布于营养琼脂平板中，用灭菌打孔器（Ø10mm）打孔，每孔分别加入100μL抗菌肽溶液，4℃放置60min，37℃培养16～18h后，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈直径。分别以0.1mol/LpH 4.0无菌乙酸-乙酸钠缓冲液为阴性对照，根据抑菌圈直径大小判断多肽对受试菌的抑菌效果。
4 抗菌肽的稳定性测定：
4.1热稳定性：
将HPLC纯化获得抑菌活性最高的紫贻贝抗菌肽用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成200μg/mL多肽溶液，800μL多肽溶液分装于离心管内，分别在40℃、60℃、80℃、100℃条件下处理30min，冰水冷却后12000×g离心10min，按3方法考察上清液（100μL）的抑菌活性。以未经热处理抗菌肽为对照组，将其抑菌活性定为100%。
4.2对反复冻融稳定性
将HPLC纯化获得抑菌活性最高的紫贻贝抗菌肽用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成200μg/mL多肽溶液，多肽溶液置于-20℃冰箱中反复冻融1、2、4、8、16次，12000×g离心10min，按3方法考察上清液的抑菌活性。以未经冻融处理的抗菌肽为对照组，将其抑菌活性定为100%。
4.3对蛋白酶稳定性
将HPLC纯化获得抑菌活性最高的紫贻贝抗菌肽用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成200μg/mL多肽溶液，多肽溶液经胰蛋白酶和胃蛋白酶进行处理，蛋白酶终浓度为1mg/mL、酶解温度37℃、酶解时间2h、酶最适pH值，酶解结束后沸水浴10min，12000×g离心10min，按3方法考察上清液的抑菌活性。以未经酶处理的抗菌肽为对照组，将其抑菌活性定为100%。
紫贻贝活性肽提取研究结果与分析：
1 粗提物抑菌活性：
经超声匀浆器和组织匀浆器所获得的粗提物均呈微黄色粉末，经计算其抗菌肽粗品的提取率分别为3.34%和1.92%，其抑菌效果见图1。图1表明，两种提取方式获得的紫贻贝粗提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌活性，表明其具有广谱的抑菌活性，紫贻贝粗提物对大肠杆菌的抑菌效果更好，且超声匀浆器制备的粗提物比组织匀浆器制备的粗提物对细菌抑菌效果要好。综上所述，超声匀浆器不仅粗提物的提取率高且抑菌效果也好。
2 稳定性分析：
2.1 温度：
图2显示了不同温度处理后紫贻贝抗菌肽抑菌圈大小的影响。由图可知，随着处理温度升高，其抑菌圈直径逐渐减小，其中，40℃～80℃处理的抗菌肽，其抑菌圈直径无显著变化（P>0.05）；进一步升高温度，其抑菌圈直径有着显著减小（P<0.05），相比于对照组，100℃处理的抗菌肽的抑菌圈直径减小了9.07～11.95%之间，表明紫贻贝抗菌肽分子结构相对较稳定，具有较强的抗热性能。
2.2反复冻融：
图3反映了在-80℃条件下反复冻融对紫贻贝抗菌肽抑菌圈大小变化情况，结果显示，随着反复冻融次数的增加，紫贻贝抗菌肽的抑菌圈直径也逐渐减少，而当反复冻融次数>4时，其抑菌圈直径有着显著的减少（P<0.05），在反复冻融16次时，相比于对照组，其抑菌圈减小了14.94～16.13%，表明紫贻贝抗菌肽具有相对稳定的结构。
2.3蛋白酶：
图4为经胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后的紫贻贝抗菌肽抑菌圈大小变化情况，结果表明，经蛋白酶处理后的紫贻贝抗菌肽的抑菌圈直径均有不同程度的减小，且胃蛋白酶比胰蛋白酶对其抑菌效果的影响更大；相比于对照组，经胰蛋白酶处理后的紫贻贝抗菌肽抑菌圈直径减小了12.41～15.48%，而经胃蛋白酶处理后的抗菌肽抑菌圈直径减小了18.96～19.97%。上述结果表明该抗菌肽具有一定的酶水解稳定性。
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a）预处理：紫贻加工下脚料半解冻后，取肉、清洗，沥干后冻藏备用；
b）粗提：将紫贻贝肉与乙酸溶液混合并煮沸，冰水浴冷却；冰水浴中超声匀浆处理，超声匀浆处理后离心处理得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；
c）固相萃取：将粗提物溶解于三氟乙酸溶液中并离心处理得到上清液B，将上清液过固相萃取柱1～2次，接着依次用三氟乙酸溶液和乙腈溶液洗脱处理，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A；三氟乙酸溶液的浓度为0.008～0.012wt%，乙腈溶液的浓度为35～45wt%，固相萃取柱填料为C18填料；
d）凝胶柱分离：将抗菌肽粗品A用水溶解，离心处理得到上清液C，然后在凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B，所述凝胶柱为Sephadex G-10凝胶柱，洗脱液为去离子水；
e）色谱柱分离：将抗菌肽粗品B配制成多肽溶液，离心处理得到上清液D并进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥后制得紫贻贝抗菌肽；所述色谱柱为C18色谱柱；洗脱液为乙腈和0.01%三氟乙酸溶液；采用梯度洗脱方法，在1h内乙腈浓度在由0提高到40%。
2.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤b）中，乙酸溶液的浓度为0.5～2.0wt%。
3.根据权利要求1或2任一所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤b）具体为，将紫贻贝肉与乙酸溶液混合并煮沸10～20分钟，冰水浴冷却后，冰水浴中以转速8000～12000rpm、超声功率100～300w进行超声匀浆处理时间10～30min，超声匀浆处理后在1～5℃下以10000～12000×g相对离心力离心处理20～40分钟得到上清液A，将上清液A冷冻干燥得到粗提物；所述紫贻贝肉与乙酸溶液按1：2～3比例进行混合。
4.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤c）具体为，粗提物溶于三氟乙酸溶液配制成8～12mg/mL浓度多肽溶液，12000rpm离心5min获得上清液B，将等柱体积上清液B过固相萃取柱1～2次，接着依次用等柱体积三氟乙酸溶液洗脱3～5次，再用等柱体积乙腈溶液洗脱1次，收集乙腈洗脱液并冷冻干燥制得抗菌肽粗品A。
5.根据权利要求4所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤c）在固相萃取前对固相萃取柱进行以下处理，用2～3倍柱体积乙腈洗脱固相萃取柱，接着使用3～5倍柱体积的0.008～0.012wt%浓度的三氟乙酸溶液洗脱固相萃取柱，洗脱速度控制在1.5～3mL/min范围。
6.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）具体为，将抗菌肽粗品A用超纯水溶解制得100mg/mL抗菌肽溶液，并以10000～14000×g相对离心力离心处理5～15分钟得到上清液C，然后在Sephadex G-10凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱峰并冷冻干燥制得抗菌肽粗品B。
7.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）中凝胶柱的参数为，上样量100μL、检测波长220nm、流速0.4mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤e）具体为，将抗菌肽粗品B用0.008～0.012wt%浓度的三氟乙酸配置成1mg/mL的溶液，以10000～14000×g相对离心力离心处理8～12分钟得到上清液D并采用C18色谱柱进行色谱柱分离处理，收集合并洗脱峰，冷冻干燥制得紫贻贝抗菌肽。
9.根据权利要求1所述的一种利用超声匀浆从紫贻贝加工下脚料中提取抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤e）中C18色谱柱参数设定为，检测段波长220nm，色谱柱温为25℃，流度0.4mL/min，上样体积100μL。
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| GR01 | Patent grant | ||
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