CN102079777A - 一种人工合成抗菌肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工合成抗菌肽，属于生物制药技术领域，其氨基酸序列为Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys；或者为Cys-Ile-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cys。本发明还公开了一种人工合成抗菌肽的方法及其人合成抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌感染的药物开发或饲料添加剂中的应用。本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果：本发明采用人工合成的方法，人工合成肽跟天然抗菌肽比具有分子量小、结构稳定、抗菌活性强、序列短、二硫键数目少、成本低等优点。

Description

一种人工合成抗菌肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其是涉人工合成抗菌肽及其应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides)作为先天免疫系统的重要部分对于保护生物机体具有不可或缺的作用。至今，已经有超过800个抗菌肽被分离和鉴定。根据它们的氨基酸组成和空间结构可分为(i)α-螺旋阳离子线性抗菌肽、(ii)含二硫键的抗菌肽、(iii)富含某种氨基酸残基的抗菌肽和(iv)阴离子抗菌肽。抗菌肽的抗菌活性具有选择性高、杀菌快速、作用广谱和难以形成抗性的特点，使其成为研究和开发新型抗生素的理想候选。

贻贝抗菌肽是海洋生物抗菌肽研究中的一个重要内容，其特殊的结构与广谱的抗菌功能使其具有重要的理论研究价值，同时也具有开发成为新型生物抗生素的潜力。Mytilin是贻贝抗菌肽家族中的一类重要成员，目前已从不同种的贻贝中分离纯化到5种mytilin分子，分别为mytilinA，B，C，D和G1，是目前贻贝抗菌肽研究中发现成员最多的家族。鉴于其在贻贝血清中的高丰度以及在体外抗菌实验中表现出的广谱抗菌功能，mytilin被认为是贻贝防御机制中最重要的一类抗菌肽分子。

抗菌肽的抗菌功能与其空间结构具有密切关系，因此，针对抗菌肽的结构研究一直受到人们的关注，也是深入了解抗菌肽结构与功能的关系及其抗菌机制的关键所在。Roch等人最近对来自地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)的mytilin B进行了核磁共振研究，结果表明，mytilin B的结构属于典型的二硫键稳定的α/β结构(Cysteine-stabilized-α/β)，分子中包含有一段α-螺旋和两段β-折叠片，由四对二硫键稳定整个结构。该结构类型既不属于抗菌肽常见的α-螺旋结构，也不属于β-折叠型抗菌肽结构，是一类比较特殊的空间结构，且该结构类似于Yang等人早期对贻贝防御素MGD-1的空间结构研究结果。而之前通过对MGD-1的结构与功能的研究，Romestand等认为由两段β-折叠片及连接这两段β-折叠片的环(loop)上的带正电荷的氨基酸残基是贻贝抗菌肽发挥抗菌活性的关键部位。

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是我国具有重要经济价值的养殖贻贝之一，在前期的研究中，我们已从厚壳贻贝血清中分离纯化到一种mytilin，命名为mytilin-1(Genebank：FJ973154)，该抗菌肽分子量为3885.3Da，含34个氨基酸残基，其中包括8个半胱氨酸并形成4对二硫键。体外抗菌实验中，mytilin-1对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有显著的抑制作用。厚壳贻贝mytilin-1与地中海贻贝的mytilin B具有较高的序列相似性(64％)。

目前，从生物体内提取天然抗菌肽是抗菌肽产品开发的主要思路，但天然抗菌肽因其属于蛋白质，具有结构不稳定，易失活等缺点。

发明内容

本发明目的在于针对现有抗菌肽结构不稳定、易失活、现有生物体内抗菌肽含量极低、通过基因重组表达的方法表达含有多对二硫键、采取人工合成的方法因天然抗菌肽序列较长和二硫键较多使得合成成本太高的缺陷，根据厚壳贻贝mytilin的活性区域设计出一种新型抗菌肽，具有分子量小、结构稳定、抗菌活性强、序列短、二硫键数目少、成本低等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人工合成抗菌肽，其氨基酸序列为Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys；或者为Cys-Ile-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cys。

优选的方案是：所述抗菌肽氨基酸序列中包含两对二硫键，所述的抗菌肽具有β-发夹结构。

更优的方案是：所述抗菌肽为前两种方案中所述的抗菌肽氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的被取代，或者环化，或者L-型氨基酸变为D-型氨基酸，或者缺失，或加入而得到的功能同等物多肽。

更优的方案是：所述的抗菌肽氨基酸序列中前端、中部或者末端含有前面几种方案任一种所述的抗菌肽氨基酸序列。

本发明的目的之二在于还公开了一种人工抗菌肽的合成工艺，采用如下技术方案：

一种人工合成抗菌肽的方法，包括如下步骤：

1)以地中海贻贝的mytilin B为模板，对厚壳贻贝mytilin-1进行空间结构模拟；根据mytilin-1的空间结构，选择20号丙氨酸(Ala20)到29号半胱氨酸(Cys29)之间的十肽片段，并将Ala20及Ser22分别替换成Cys，获得一条新的多肽，命名为MDP-1；及其反向序列，命名为MDP-2；

2)采用固相合成法，利用Fmoc-Cys(trt)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH分别作为一对要形成二硫键的Cys合成出所需线性多肽；

3)对获得的粗制品分别以碘/甲醇/DMF中的一种或者几种混合溶液及抗坏血酸进行复性处理以形成正确的二硫键；

4)对复性后的多肽样品用反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化至少2次，获得纯品。

优选的是：所述步骤1)中MDP-1或者MDP-2多肽的N端设计为乙酰化，C端设计为酰胺化以去除末端电荷。

更为优选的是：所述步骤2)中固相合成法工艺为：

21)Fmoc-Rink-AM-Resin树脂以二氯甲烷(DCM)进行充分溶胀；取第一个9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸于DCM中溶解；再加入二异丙基乙胺(DIEA)混合后加入反应容器中，吹N₂反应2hr；

22)将反应液过滤除去并加入甲醇，封闭反应1hr后分别用DCM、异丙醇及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂；之后用20％哌啶脱Fmoc，经DMF充分洗涤后，加第二个氨基酸与1-羰基苯并四唑(HOBt)及DIEA混合后进行偶联，反应一小时后，用茚三酮检测，树脂无色透明为反应完全，然后以DMF充分洗涤；

23)重复上述步骤直到最后一个氨基酸反应完全；

24)利用K试剂(K-Reagent，含82.5％的三氟乙酸，5％的苯酚，5％的苯甲硫醚，以及2.5％的巯基乙醇的水溶液)对合成后的多肽进行侧链去保护以及从树脂上切割。

本发明的目的之三在于公开了将人工合成抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌感染的药物开发或饲料添加剂中的应用。

Cys表示英文名称为Cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸相应残基，简称为C。

Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸相应残基，简称为V。

Phe表示英文名称为Phenylalanine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸相应残基，简称为F。

Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸相应残基，简称为G。

Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸相应残基，简称为R。

Ile表示英文名称为Isoleucine，中文名称为异亮氨酸的氨基酸相应残基，简称为I。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果：本发明采用人工合成的方法，合成抗菌肽跟天然抗菌肽相比具有分子量小、结构稳定、抗菌活性强、序列短、二硫键数目少、成本低等优点。

附图说明

附图1：M根据厚壳贻贝抗菌肽mytilin-1的活性区域设计的MDP-1以及MDP-2的序列图。

附图2：MDP-1和MDP-2固相合成后的高效液相检测图谱。

附图3：MDP-1和MDP-2固相合成后的质谱检测图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明：

实施例一：抗菌肽的固相化学合成、分离纯化及鉴定

1.新型抗菌肽的人工设计

利用结构模拟软件ESyPred3D(Lambert C，Leonard N，De Bolle X，Depiereux E.ESyPred3D：Prediction of proteins 3D structures.Bioinformatics.2002 Sep；18(9)：1250-1256.)，以地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)的mytilin B(蛋白质结构数据库编号：2EEM)为模板，对厚壳贻贝mytilin-1进行空间结构模拟。根据结构模拟结果，我们发现，厚壳贻贝mytilin-1同样具有由两段β-折叠片及连接这两段β-折叠片的环，且环上分布有碱性氨基酸残基，根据mytilin-1的空间结构，选择20号丙氨酸(Ala20)到29号半胱氨酸(Cys29)之间的十肽片段，并将Ala20及Ser22分别替换成Cys，获得一条新的多肽，命名为MDP-1，该多肽的N端设计为乙酰化，C端设计为酰胺化以去除末端电荷，如图1所示其序列为Ac-Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys-NH2；同时，我们另外设计了一条反向序列，命名为MDP-2，其序列为Ac-Cys-Ile-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cys-NH2。

2.新型抗菌肽的固相合成

本发明应用固相合成法(solid-phase peptide synthesis，SPPS)，利用Fmoc-Cys(trt)-OH(CysI和Cys III)和Fmoc-Cys(Acm)-OH(Cys II和Cys IV)的不同性质，分别作为一对要形成二硫键的Cys合成出所需线性多肽，以便于二硫键的正确配对。

固相多肽合成在Tetras多肽合成仪(美国ThuraMed公司)上进行，基本流程为：Fmoc-Rink-AM-Resin树脂以二氯甲烷(DCM)进行充分溶胀；取第一个9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸于DCM中溶解，再加入二异丙基乙胺(DIEA)混合后加入反应容器中，吹N₂反应2hr，将反应液过滤除去加入甲醇，封闭反应1hr后分别用DCM、异丙醇及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂；之后用20％哌啶脱Fmoc，经DMF充分洗涤后，加第二个氨基酸与1-羰基苯并四唑(HOBt)及DIEA混合后进行偶联，反应一小时后，用茚三酮检测，树脂无色透明为反应完全，然后以DMF充分洗涤；重复上述步骤直到最后一个氨基酸反应完全。利用K试剂(K-Reagent，含82.5％的三氟乙酸，5％的苯酚，5％的苯甲硫醚，以及2.5％的巯基乙醇的水溶液)对合成后的多肽进行侧链去保护以及从树脂上切割。

3.新型抗菌肽的复性、纯化及鉴定

获得的合成粗品分别以碘/甲醇/DMF混合溶液及抗坏血酸进行复性处理以形成正确的二硫键(Cys I-Cys III，Cys II-Cys IV)。

复性后的多肽样品用反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化2次。第一次纯化：Waters Sunfire C18柱(10mm×250mm)，洗脱梯度：0～40min，5％～30％乙腈(含0.1％TFA)；第二次纯化：Vydac C18柱(4.6mm×250mm)，洗脱梯度：0～40min，5％～20％乙腈(含0.1％TFA)。MDP的高效液相检测图谱见附图2，经两步纯化后MDP-1和MDP-2的纯度均大于95％。

用Waters ZQ2000质谱仪分析目的峰的精确分子量，检测结果见附图3。质谱检测条件为毛细管电压：3.50KV；锥孔电压：35V；干燥气流速：500L/h；离子源温度：120℃；辅助气温度：380℃；离子检测方式：选择性离子检测(SIM)；离子极性：正离子(positive)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)。经质谱分析，MDP-1和MDP-2的单同位素分子量([M+H]+)分别为1197.34Da和1197.46Da。与理论推导的分子量一致，表明合成及复性的成功的。

实施例二：抗菌肽的功能检测

1.新型抗菌肽的抗菌实验及抗菌谱

采用培养基倍比稀释法测定MDP-1和MDP-2抗菌活性。细菌用LB液体培养基培养至对数生长期(A_630nm为0.001)，在96孔板每个孔加入90μL菌液。多肽预先用PBS溶解，最高浓度为1mM，然后倍比稀释，最低浓度为6.25μM。并将各浓度多肽溶液加入96孔板中，10μL/孔，PBS作为阴性对照。

将96孔板在振荡器上轻柔的振荡使样品和菌液充分混合，然后放入37℃培养16-24h。采用酶标仪测定每个孔的OD值以衡量多肽对于细菌生长的抑制作用。多肽的最低抑制浓度(Minimal inhibitory concentrations，MIC)用[a]-[b]表示，其中[a]代表细菌继续生长的最大浓度，而[b]代表细菌完全被杀灭的最低浓度。抗真菌试验与上述基本相同，只是真菌在Sabourand液体培养基中30℃培养48h后检测。结果如表1所示。

表1MDP-1和MDP-2对于各种细菌和真菌的最低抑菌浓度(MIC)

2.MDP的稳定性试验

以纯水分别溶解MDP-1及MDP-2，浓度均为100微摩尔，置于37℃恒温箱中保存，每24小时取样一次，分别进行质谱鉴定及抗菌活性测试，并与-20℃保存的干粉状MDP-1和MDP-2做比较，以检验新型抗菌肽的结构和功能的稳定性。实验结果表明，在37℃，纯水保存条件下，MDP-1和MDP-2在保存20天后仍具有较强的抑菌作用，与对照组(-20℃保存的干粉状MDP-1和MDP-2)相比，其抗菌效果下降不到5％，质谱检测仍为单一质量峰，这表明，MDP-1和MDP-2均具有较好的结构及功能稳定性。

3.体外溶血活性检测

本实施例用于检测合成抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性。检测步骤如下：

采集正常人血液约0.5mL至5mL PBS溶液中，由于血液被充分稀释，因而即使没有使用肝素处理仍不会发生凝集。在4℃，3000rpm离心5min，重复3次可以充分的洗涤红细胞。估计沉淀的体积，加入PBS重悬红细胞，红细胞终浓度约为1％。将稀释的红细胞PBS溶液加入1.5mL EP管，50μL/管；然后每个EP管加入预先倍比稀释的抗菌肽PBS溶液，50μL/管，则总体积为100μL，抗菌肽样品的终浓度为1000μM，阴性对照加入50μL PBS溶液，完全溶血的阳性对照加入50μL 0.1％的TritonX-100。37℃孵育1hr后12000rpm离心5min，将上清小心取至96孔板，利用酶标仪测定上清在570nm时的OD值。通过以下公式计算红细胞的溶血活性：溶血％＝(A_样品-A_阴性)/(A_阳性-A_阴性)。

实验结果表明，在1000μM浓度下，MDP-1和MDP-2能诱导约10％的红细胞出现溶血，说明MDP对红细胞的溶血效应比较低，这也表明MDP对哺乳动物细胞的毒性较低。

一种人工合成多肽及其序列表

<110>浙江海洋学院海洋科学学院

<120>两种抗菌肽的人工设计，固相化学合成以及应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>10

<212>MDP-1 peptide

<213>人工序列

<400>1

Cys Val Cys Phe Gly Arg Arg Cys Ile Cys

<110>浙江海洋学院海洋科学学院

<120>两种抗菌肽的人工设计，固相化学合成以及应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>2

<211>10

<212>MDP-2peptide

<213>人工序列

<400>2

Cys Ile Cys Arg Arg Gly Phe Cys Val Cys

Claims (8)

1.一种人工合成抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽氨基酸序列为Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys；或者为Cys-Ile-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cys。

2.如权利要求1所述的人工合成抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽氨基酸序列中包含两对二硫键，所述的抗菌肽具有β-发夹结构。

3.一种人工合成抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽为权利要求1或者2所述的抗菌肽氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的被取代，或者环化，或者L-型氨基酸变为D-型氨基酸，或者缺失，或加入而得到的功能同等物多肽。

4.一种人工合成抗菌肽，其特征在于：所述的抗菌肽氨基酸序列中前端、中部或者末端含有权利要求1-3任一项所述的抗菌肽氨基酸序列。

5.一种人工合成抗菌肽的方法，包括如下步骤：

1)以地中海贻贝的mytilin B为模板，对厚壳贻贝mytilin-1进行空间结构模拟；根据mytilin-1的空间结构，选择20号丙氨酸(Ala20)到29号半胱氨酸(Cys29)之间的十肽片段，并将Ala20及Ser22分别替换成Cys，获得一条新的多肽，命名为MDP-1；及其反向序列，命名为MDP-2；

2)采用固相合成法，利用Fmoc-Cys(trt)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH分别作为一对要形成二硫键的Cys合成出所需线性多肽；

3)对获得的粗制品分别以碘/甲醇/DMF中的一种或者几种混合溶液及抗坏血酸进行复性处理以形成正确的二硫键；

4)对复性后的多肽样品用反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化至少2次，获得纯品。

6.如权利要求5所述的人工合成抗菌肽的方法，其特征是：所述步骤1)中MDP-1或者MDP-2多肽的N端设计为乙酰化，C端设计为酰胺化。

7.如权利要求5或者6所述的人工合成抗菌肽的方法，其特征是：所述步骤2)中固相合成法工艺为：

21)Fmoc-Rink-AM-Resin树脂以二氯甲烷(DCM)进行充分溶胀；取第一个9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸于DCM中溶解；再加入二异丙基乙胺(DIEA)混合后加入反应容器中，吹N2反应2hr；

22)将反应液过滤除去并加入甲醇，封闭反应1hr后分别用DCM、异丙醇及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂；之后用20％哌啶脱Fmoc，经DMF充分洗涤后，加第二个氨基酸与1-羰基苯并四唑(HOBt)及DIEA混合后进行偶联，反应一小时后，用茚三酮检测，树脂无色透明为反应完全，然后以DMF充分洗涤；

23)重复上述步骤直到最后一个氨基酸反应完全；

24)利用K试剂对合成后的多肽进行侧链去保护以及从树脂上切割。

8.权利要求1-4任一项所述的人工合成抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌感染的药物开发或饲料添加剂中的应用。

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