CN109897091B

CN109897091B - 一种含非天然氨基酸的环状抗菌肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109897091B
Application number: CN201910246769.4A
Authority: CN
Inventors: 王建浩; 邱琳; 滕一万; 贾文静; 郭倩倩; 王佳炜; 夏智龙; 王菲; 陈星羽
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Changzhou University
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109897091A

Abstract

本发明属于抗菌剂技术领域，具体涉及一种含非天然氨基酸的环状抗菌肽及其制备方法和应用。所述环状抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，为分子内环状多肽，通过非天然氨基酸Dap的侧链与半胱氨酸残基之间成环，形成具有分子内环状结构，其中，序列中含有一个非天然氨基酸Dap，多肽位于β转角处的脯氨酸替换成_DPRO‑_LPRO来增加β‑转弯的稳定性。本发明抗菌肽其氨基酸序列结构简单、合成方便、抗菌活性高，可用于白色念珠菌引起的疾病的预防与治疗。

Description

一种含非天然氨基酸的环状抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗菌剂技术领域，具体涉及一种含非天然氨基酸的环状抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

目前，抗生素是治疗细菌感染的主要手段，但是长期大量使用抗生素会导致耐药性，对患者的生命健康造成严重的危害。抗菌肽是一种小分子化合物，不容易产生细菌耐药性，是抗生素的理想替代品。而非天然氨基酸是人工合成的具有类似氨基酸结构的小分子化合物，利用非天然氨基酸取代氨基酸有可能会获得更好的抗菌效果。

发明内容

本发明提供了一种新型抗菌肽，该抗菌肽对白色念珠菌具有抗菌活性。

本发明提供的一种新型环状抗菌肽，为分子内环状多肽，通过非天然氨基酸Dap的侧链与半胱氨酸残基之间成环。其氨基酸序列为如序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列所示。

具体的，所述多肽通过位于β转角处的两个脯氨酸_DPRO-_LPRO来增加β-转弯的稳定性，通过非天然氨基酸Dap的侧链与半胱氨酸残基之间成环，非天然氨基酸Dap的侧链脱保护后与溴己酸反应，然后通过溴与巯基偶联，进一步加强其稳定性。

第11位点的氨基酸为非天然氨基酸Dap，从而增加整个环状多肽的两亲性。

本发明的抗菌肽全序列包括但不限于：

(抗菌肽AM-83)。

本发明多肽的序列特征：多肽结构中非天然氨基酸Dap的侧链与半胱氨酸残基之间成环；拓扑结构：环状；结构特点：富含碱性氨基酸。

此外，本发明还提供了上述环状多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用固相合成法合成多肽序列；

(2)对步骤(1)制备得到的多肽进行环化；

(3)纯化步骤(2)制备得到的多肽。

其中，步骤(2)所述环化方法为取代法，其具体方法为：将多肽树脂先用10％的乙酸二氯甲烷溶液清洗6次，每次3分钟；然后用1％TFA，5％TIS的二氯甲烷溶液清洗9次，每次5分钟；再用DMF和DIEA清洗，去除Dap的侧链Mtt。然后加入溴己酸，HBTU和HOBT，反应半小时后，用DMF清洗。将多肽用切割液从树脂上切割下来，HPLC纯化后，配置成稀溶液，在碱性条件下过夜成环。

步骤(3)所述纯化方法优选采用HPLC进行纯化。

本发明制备得到的环状多肽用作白色念珠菌感染的抗菌药物。

本发明的有益效果是：本发明制备得到的环状多肽对白色念珠菌具有显著的抑制作用，其抗菌效果好，MIC值低；本发明多肽的环状结构稳定，方法简便，在稀溶液中不容易发生分子间成环，有利于提高多肽的纯度和稳定性。

附图说明

图1为实施例1合成的抗菌肽AM-83的结构图。

具体实施方式

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。

实施例1

本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸。

1、基本材料：

(1)树脂与连接分子：固相Fmoc法选择的树脂为Rink Amide-

树脂。这种树脂具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上。

(2)单体：合成所用单体为经化学修饰的α-氨基酸。

2、反应步骤：

第一步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上

加入适当的缩合剂如HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；

第二步，去保护

采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。

第三步，激活和交联

采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键。

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照KWKWYLLRWRXR_DPPFRCWRWR序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。

3、合成后处理：

(1)将多肽树脂先用10％的乙酸二氯甲烷溶液清洗6次，每次3分钟；然后用1％TFA，5％TIS的二氯甲烷溶液清洗9次，每次5分钟；再用DMF和DIEA清洗，去除Dap的侧链Mtt。然后加入溴己酸，HBTU和HOBT，反应半小时后，用DMF清洗。

(2)洗脱和脱保护：用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上切割下来，并脱除保护基。

(3)HPLC分析纯化，冻干。

(4)配置成稀溶液，在碱性条件下过夜成环。

将5mg多肽溶于5mL缓冲液(0.1mol/L NaHCO₃,4mL；0.1mol/L Na₂CO₃,1mL；pH9.4)，震荡过夜后用HPLC纯化，冻干保存。

通过上述方法，合成环状多肽序列AM-83(图1)。

4、最小抑菌浓度检测

通过测定抗菌肽AM-50最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。参照美国国家临床实验室标准化委员会M27-A的研究方案，首先将被测多肽溶到100μl PBS缓冲液中，然后加入96孔板中两倍稀释，再加入2000个/ml菌体的悬液100ml,37℃培养48小时，以无菌生长的最小稀释浓度作为该多肽的MIC。低的MIC值表明多肽药物的杀菌活性更高，经检测AM-83的MIC低至7.81μg/ml。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

序列表

<110> 常州大学

<120> 一种含非天然氨基酸的环状抗菌肽及其制备方法和应用

<141> 2019-03-29

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 白色念珠菌(Candida albicans)

<400> 1

Lys Trp Lys Trp Tyr Leu Leu Arg Trp Arg Xaa Arg Xaa Pro Phe Arg

1 5 10 15

Cys Trp Arg Trp Arg

20

Claims

1.一种含非天然氨基酸的环状抗菌肽，其特征在于：所述环状抗菌肽为由氨基酸组成的分子内环状多肽，通过非天然氨基酸Dap的侧链与半胱氨酸残基之间成环，其氨基酸序列为

；

其中，X为Dap，_DP为_DPRO；

所述的环状抗菌肽的制备方法步骤如下：

（1）采用固相合成法合成多肽序列；

（2）对步骤（1）制备得到的多肽进行环化；

其中，步骤（2）所述环化方法为取代法，其具体方法为：将多肽树脂先用10％的乙酸二氯甲烷溶液清洗6次，每次3分钟；然后用1％TFA，5％TIS的二氯甲烷溶液清洗9次，每次5分钟；再用DMF和DIEA清洗，去除Dap的侧链Mtt，然后加入溴己酸，HBTU和HOBT，反应半小时后，用DMF清洗，将多肽用切割液从树脂上切割下来，HPLC纯化后，配制成稀溶液，在碱性条件下过夜成环；

（3）纯化步骤（2）制备得到的多肽；

步骤（3）所述纯化方法采用HPLC进行纯化。