CN109796523B - 一种用于抗白色念珠菌的环状多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗菌剂技术领域,具体涉及一种用于抗白色念珠菌的环状多肽及其制备方法。所述环状多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,为分子内环状多肽,通过其氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间形成分子内二硫键,形成具有分子内环状结构,其中,C端末尾由8个精氨酸组成,序列中含有两个非天然氨基酸,多肽位于β转角处的脯氨酸替换成DPRO‑LPRO来增加β‑转弯的稳定性。本发明环状多肽其氨基酸序列结构简单、合成方便、用于白色念珠菌引起的疾病的预防与治疗,其抗菌活性高。
Description
技术领域
本发明属于抗菌剂技术领域,具体涉及一种用于抗白色念珠菌的环状多肽及其制备方法。
背景技术
白色念珠菌(canidia Albicans),是一种真菌,通常存在于正常人口腔,上呼吸道,肠道及阴道,一般在正常机体中数量少,不引起疾病,当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调,则该菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。
近年来随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用,以及器官移植术的开展,其发病率渐趋增高,并可危及生命造成严重后果。目前,抗生素是治疗白色念珠菌的主要手段,但是长期大量使用抗生素导致致病菌产生顽强的耐药性,对患者的生命健康造成严重的危害。抗菌肽是一种小分子活性多肽,不易产生细菌耐药性,是替代抗生素理想的潜在物质。通过分子设计和改造是发现新的抗菌肽的有效途径。
发明内容
本发明提供了一种新型环状抗菌肽,该抗菌肽对白色念珠菌具有抗菌活性。
本发明提供的一种新型环状多肽,为分子内环状多肽,成环结构由CRDPPFRC7个氨基酸组成,通过其氨基酸序列中的2个半胱氨酸残基形成分子内二硫键,形成环状,其中,C端末尾由8个精氨酸组成,序列中含有两个非天然氨基酸。其氨基酸序列为如序列表SEQ IDNo.1的氨基酸序列所示。
具体的,所述多肽通过位于β转角处的两个脯氨酸DPRO-LPRO来增加β-转弯的稳定性,通过其氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间成分子内二硫键,进一步加强其稳定性。
第9位点、第20位点的氨基酸为非天然氨基酸L-1-奈丙氨酸(L-1-Nal,缩写E46),从而增加整个环状多肽的两亲性。
多肽序列C端由8个精氨酸组成,可以增加抗菌肽的水溶性且能够增加抗菌肽穿透细菌膜的能力。
本发明多肽的序列特征:多肽结构中半胱氨酸中的巯基形成分子内二硫键;拓扑结构:环状;结构特点:富含碱性氨基酸。
此外,本发明还提供了上述环状多肽的制备方法,包括以下步骤:
(1)采用固相合成法合成多肽序列;
(2)对步骤(1)制备得到的多肽进行环化;
(3)纯化步骤(2)制备得到的多肽。
其中,步骤(2)环化方法优选为氧化法;具体为:冻干后用NaHCO3和Na2CO3来做巯基脱氢反应,使两个半胱氨酸的巯基形成二硫键,从而整个多肽成环状。
步骤(3)所述纯化方法优选采用HPLC进行纯化。
本发明制备得到的环状多肽用作白色念珠菌感染的广谱抗菌药物。
本发明的有益效果是:本发明制备得到的环状多肽对白色念珠菌具有显著的抑制作用,其抗菌效果好,MIC值低;本发明多肽的环状结构有利于提高多肽稳定性。
附图说明
图1为实施例1-实施例3合成的抗菌肽AM-50、AM-66、AM-68的结构图。
图2为对比实施例1合成的抗菌肽AM-69的结构图。
图3为对比实施例2合成的抗菌肽AM-65的结构图。
具体实施方式
本发明将就以下实施例作进一步说明,但应了解的是,这些实施例仅为例示说明之用,而不应被解释为对本发明实施的限制。
实施例1
本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法,即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基,通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键,从而将氨基酸连接到树脂上,使肽链从C端向N端延伸。
1、基本材料:
(1)树脂与连接分子:固相Fmoc法选择的树脂为Rink Amide-树脂。这种树脂具有非常好的溶胀性,可以使肽链之间更好地进行缩合反应,且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子,将多肽分子固定到树脂上。
(2)单体:合成所用单体为经化学修饰的α-氨基酸。
2、反应步骤:
第一步,将第一个氨基酸共价连接到树脂上
加入适当的缩合剂如HBTU和HOBt,使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定;
第二步,去保护
采用碱性溶剂20%哌啶去除氨基上的Fmoc,暴露出氨基。
第三步,激活和交联
采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基,与树脂上的氨基交联,形成肽键。
第四步,重复第二步和第三步,反复循环添加单体氨基酸,按照KWKWHLLRE46RCRDPPFRCWRE46RRRRRRRR序列的顺序从右到左合成,直到合成完成。
3、合成后处理:
(1)洗脱和脱保护:用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上切割下来,并脱除保护基。
(2)HPLC分析纯化,冻干。
(3)冻干后用NaHCO3和Na2CO3来做巯基脱氢反应,使两个半胱氨酸的巯基形成二硫键,从而整个多肽成环状。将5mg多肽溶于5mL缓冲液(0.1mol/L NaHCO3,4mL;0.1mol/LNa2CO3,1mL;pH 9.4),震荡4h后用HPLC纯化,冻干保存。
通过上述方法,合成环状多肽序列AM-50(图1)。
4、最小抑菌浓度检测
通过测定抗菌肽AM-50最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)来反映其抗菌效果,最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。参照美国国家临床实验室标准化委员会M27-A的研究方案,首先将被测多肽溶到100μl PBS缓冲液中,然后加入96孔板中两倍稀释,再加入2000个/ml菌体的悬液100ml,37℃培养48小时,以无菌生长的最小稀释浓度作为该多肽的MIC。低的MIC值表明多肽药物的杀菌活性更高,经检测AM-50的MIC低至1.77μM。
实施例2
第四步,重复第二步和第三步,反复循环添加单体氨基酸,按照LE46RRCRDPPFRCWE46RRRRRRRR序列的顺序从右到左合成,直到合成完成。
其他步骤同实施例1,通过上述方法,合成多肽序列AM-66(图1)。
合成的该环状多肽的MIC值4.46。
实施例3
第四步,重复第二步和第三步,反复循环添加单体氨基酸,按照RRE46RCRDPPFRCWRE46RRRRRRRR序列的顺序从右到左合成,直到合成完成。
其他步骤同实施例1,通过上述方法,合成多肽序列AM-68(图1)。
合成的该环状多肽的MIC值4.21。
对比实施例1
第四步,重复第二步和第三步,反复循环添加单体氨基酸,按照LWRRCRDPPFRCWE46RRRRRRRR序列的顺序从右到左合成,直到合成完成。
其他步骤同实施例1,通过上述方法,合成多肽序列AM-69(图2)。
合成的该环状多肽的MIC值17.91。
对比实施例2
第四步,重复第二步和第三步,反复循环添加单体氨基酸,按照RRE46RCRDPPFRCWRE46R序列的顺序从右到左合成,直到合成完成。
其他步骤同实施例1,通过上述方法,合成多肽序列AM-65(图3)。
合成的该环状多肽MIC值为24.32。
以上述依据本发明的理想实施例为启示,通过上述的说明内容,相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内,进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容,必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。
序列表
<110> 常州大学
<120> 一种用于抗白色念珠菌的环状多肽及其制备方法
<141> 2019-03-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> Candida atlantica
<400> 1
Lys Trp Lys Trp His Leu Leu Arg Xaa Arg Cys Arg Xaa Pro Phe Arg
1 5 10 15
Cys Trp Arg Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
20 25
Claims (3)
1.一种环状多肽,其特征在于:所述环状多肽为由氨基酸组成的分子内环状多肽,成环结构由CRDPPFRC 7个氨基酸组成,通过其氨基酸序列中的2个半胱氨酸残基形成分子内二硫键,形成环状,所述环状多肽C端由8个精氨酸组成,其氨基酸序列为:KWKWHLLRE46RCRDPPFRCWRE46RRRRRRRR;
E46为L-1-奈丙氨酸;DP为DPRO。
2.一种如权利要求1所述的环状多肽的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)采用固相合成法合成多肽序列;
(2)对步骤(1)制备得到的多肽进行环化;
(3)纯化步骤(2)制备得到的多肽。
3.如权利要求2所述的环状多肽的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述环化方法为氧化法;步骤(3)所述纯化方法采用HPLC进行纯化。
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CN102079777A (zh) * | 2009-11-26 | 2011-06-01 | 浙江海洋学院 | 一种人工合成抗菌肽、制备方法及其应用 |
CN105566452A (zh) * | 2016-01-22 | 2016-05-11 | 北京农学院 | 一种具有环状结构的抗菌肽及其制备方法和应用 |
CN107021999A (zh) * | 2016-02-02 | 2017-08-08 | 香港中文大学深圳研究院 | 一种抗念珠菌的多肽及其用途、抗念珠菌的药物 |
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