CN116854785A - 位点特异性修饰和标记的抗病毒肽氰病毒素n - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种抗病毒肽氰病毒素N类似物，在氰病毒素N的Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89作为突变位点进行修饰，其中，修饰基团来自含有氨基酸的叠氮化物，或者含有氨基酸的叠氮化物和炔烃之间点击化学反应产生的共价产物基团。本申请选择了Gln14X、Asn26X、Ser38X、Ser52X、Gln62X、Ser66X、Asp89X等作为突变位点，可用于测试位点特异性的PEG化等。
Description
技术领域
本发明涉及一种位点特异性修饰和标记的抗病毒肽氰病毒素N及其类似物，以及含有它的组合物，以及使用和获得他们的方法，特别是在临床和诊断中的应用，如在抗病毒治疗和预防中的应用。
背景技术
点击化学(Click Chemistry)是叠氮化物和炔烃之间的反应，产生共价产物：1,5-二取代-1,2,3-三唑。该过程也被称为CuAAC-Cu催化炔叠氮化物环加成，如图1所示。
点击化学是基于铜催化，该催化剂通常作为Cu-TBTA配合物被使用，在各种各样的有机反应中，点击化学因为其如下优点而被选择作为共轭化学反应，点击化学因此成为一种通用的修饰DNA、蛋白质、配合物制备、以及荧光标记的工具：
1)具有良好的选择性。点击化学反应只发生在叠氮化物和炔烃组分之间。它不会干扰DNA和被标记的蛋白质中存在的大多数其他有机基团，如氨基和羧基。2)在天然生物分子中不存在叠氮化物和炔烃。这些基团被特定地引入到DNA和蛋白质中，在标准低聚物合成过程中，可以用炔磷酰胺制备含炔的DNA，用叠氮化物活化酯和炔烃活化酯可以制备出用叠氮化物和炔烃标记的蛋白质。
3)点击化学在水中进行。水性DMSO、DMF、乙腈、醇类或纯水和缓冲液均可用于反应。该反应具有生物相容性，可以发生在活细胞中。
4)反应是快速和定量的。点击化学是一个工具，允许制备纳米摩尔的共轭物在稀释的溶液中。
5)该反应对pH值不敏感。与NHS酯与胺和其他一些偶轭化学的反应不同，不需要在反应混合物中控制pH值。不需要添加任何特殊的缓冲液，酸或碱-点击化学在4-11的pH值范围内工作良好。
6)反应原理简单。
已知的可以并入肽链的含氨基酸的叠氮化物(例如，酰基叠氮法)如下所示：
等。Fmoc-或者Boc-保护的氨基酸构成单元(aminoacid building blocks)可以在市场上买到。
如下市售的含炔试剂，包括荧光染料，可以在水介质中温和条件下通过点击化学偶联到含有叠氮基团的肽化合物上：
科学界在抗病毒研究和抗病毒化合物的发现和开发方面取得了发展。抗病毒肽在提供有效的治疗和预防选择方面发挥着重要作用。因此，获得抗病毒肽，对于COVID-19等病毒的抑制，具有重要的意义。
氰病毒素N(CVN)是一种培养蓝藻(Nostoc ellipsosporumwith)的组成部分，具有强大的抗HIV活性，是一种独特的环肽，有101个氨基酸，长11kDa。一级氨基酸结构与任何已知的蛋白质具有<20％的同源性，因此提供了一个独特的三维结构和序列。CVN的晶体结构显示了一个结构域交换二聚体。它主要是一种具有内部双伪对称性的β-片状蛋白(β-sheetprotein)。这两个序列重复(1-50残基和51-101残基)共享32％的序列同一性，但没有形成单独的结构域，因为整体折叠依赖于它们之间的大量接触。相反，两个对称相关的结构域是由两个重复序列之间的链交换形成的。氰病毒素N的序列结构如下：LGKFSQTCYNSAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQ PSNFIETCRN TQLAGSSELAAECKTRAQQFVSTKINLDDH IANIDGTLKYE(SEQ ID NO:1)。
CVN的一级结构包含101个残基，分为两个结构域A(残基1-50)和B(残基51-101)，两个结构域具有高度的内部序列和结构相似性。我们发现，在晶体学实验条件下(低pH和26％异丙醇)，两个对称相关的单体通过结构域交换形成二聚体，这样一个单体的结构域A与其晶体学对称伴侣的结构域B0相互作用，反之亦然。由于两个交换的域彼此距离较远，域交换不会导致额外的分子内相互作用。尽管其中一种用于结晶的蛋白质样品溶液明显含有100％的CVN分子，但根据各种方法判断，我们只能获得含有结构域交换二聚体的晶体。
CVN对所有免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-1的M-和T型毒株、HIV-2、SIV(猿类)、FIV(猫))以及其他包膜病毒：包括流感病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒6和麻疹病毒，具有强活性。
因此，强大的抗病毒活性、无毒副作用、耐物理化变性以及对耐药性的超高遗传屏障，表明CVN及其类似物是一种很有前途的抗HIV分子，可用作局部杀微生物剂。具有生物活性的CVN能有效地、不可逆地使多种HIV-1初级毒株失活，包括参与艾滋病毒性传播的嗜CVN型病毒；CVN还能阻止艾滋病毒感染的细胞间传播。由于CVN直接杀灭病毒，因此CVN及其类似物的使用可能导致一种全新的抗HIV(人类免疫缺陷病毒)药物。
CVN对各种理化降解(physicochemical degradation)均表现出高度的抗性，用变性剂、洗涤剂、有机溶剂、多次冻融循环和热处理对其抗病毒活性没有影响。因此，CVN及其功能类似物可能被证明是一种很好的候选药物，用于各种治疗和预防用途。
在赖氨酸残基上的无规PEG化(PEGylation)导致了抗病毒活性的不良保留。因此，需要确定定点突变体被用来测试位点特异性的PEG化。CVN其中一个突变体中，谷氨酰胺62被半胱氨酸取代(CVN(Q62C))取代，并被马来酰亚胺激活的PEG化，在体外保留了显著的抗HIV活性(H.Zappe,et al.,Advanced Drug Delivery Reviews,60(2008):79–87)。因此，CVN的位点特异性、选择性修饰和衍生化能提供更多样化的分子，为治疗目的和需要提供不同的化学/物理/生物/药理特性。
发明内容
本发明提供了一种位点特异性修饰和标记的抗病毒肽氰病毒素N及其类似物，以及含有它的组合物，以及使用和获得他们的方法，特别是在临床和诊断中的应用，如在抗病毒治疗和预防中的应用。
本申请第一个方面是提供一种抗病毒肽氰病毒素N类似物I，所述类似物I为在氰病毒素N的Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89作为突变位点进行修饰，其中，修饰基团来自含有氨基酸的叠氮化物和炔烃之间点击化学反应产生的共价产物基团，
本申请第二个方面是提供一种抗病毒肽氰病毒素N类似物II，所述类似物II为在氰病毒素N的Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89作为突变位点进行修饰，其中，修饰基团来自含有氨基酸的叠氮化物。
其中，含有氨基酸的叠氮化合物选自：
或者/>n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
其中，所述炔烃选自：
在一种优选实施例中，所述含有氨基酸的叠氮化合物可以是选自：
等、
更优选地，所述含有氨基酸的叠氮化合物可以是Fmoc-保护或者Boc-保护的化合物。
本申请还提供了一种合成所述抗病毒肽氰病毒素N类似物I的方法，包括将含有氨基酸的叠氮化合物链接到抗病毒肽氰病毒素N的肽链Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89中的至少一个位点上。
其中，含有氨基酸的叠氮化合物可以是通过酰基叠氮法等现有技术链接抗病毒肽氰病毒素N的肽链的Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89位点上。
本申请还提供了一种合成所述抗病毒肽氰病毒素N类似物II的方法，通过点击化学反应，将炔烃化合物链接到抗病毒肽氰病毒素N类似物I上(即叠氮化合物的基团上)。
本申请选择了Gln14X、Asn26X、Ser38X、Ser52X、Gln62X、Ser66X、Asp89X等作为突变位点，可用于测试位点特异性的PEG化等。
附图说明
图1为CuAAC-Cu催化炔叠氮化物环加成反应流程示意图。
具体实施方式
本发明提供一种抗病毒肽氰病毒素N的位点特异性修饰和标记方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换。此外，术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
以下的例子并不以任何方式限制本发明。本申请的所有肽可以通过固相合成方法或溶液相合成，或两者与固相上的肽链组装和环化或溶液中的其他修饰相结合。以下列出了几本关于肽合成化学的主要参考书：John Jones，The Chemical Synthesis ofPeptides；克拉伦登出版社，牛津，1994年；Steven A Kates，Fernando Alberticio(Eds.)，Solid-Phase Synthesis,A Practical Guide.；Marcel Dekker公司，纽约，2000年；WengC.Chan、Peter D.White(Eds.)，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,A PracticalApproach；牛津大学出版社，纽约，2000年。
C端酰胺，如肽酰胺，通常使用Rink Amide树脂制备；C端酸，如肽酸，使用三丁基氯树脂或Wang树脂制备。尤其是，组装的肽链仍然附着在树脂载体上时，可以在固相上形成二硫键；也可以通过本领域已知的各种方法在溶液中形成二硫键。具有完全或部分保护侧链的肽片段的溶解缩合/连接，在适当的偶联剂和催化剂存在下，在与完全或部分保护侧链的肽片段的溶液中进行。那些用于天然化学连接的肽硫酯片段是根据已知的技术制备(如：Dey B,Lerner DL,Lusso P,Boyd MR,Elder JH,Berger EA.2000.J.Virol.74:4562–4569。Lagenaur LA,Sanders-Beer BE,Brichacek B,Pal R,Liu X,Liu Y,Yu R,Venzon D,LeePP,Hamer DH.2011.Mucosal Immunol.4:648–657)。
实施例1：两片段合成方法(two-fragment process)，通过树脂上形成二硫键(on-resin disulfide bond formation)
第一个片段，含有45个氨基酸残基(固相形成二硫键)：LGKFSQTCYN SAIQGSVLTSTCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDG-acid
第二个片段，含有56个氨基酸残基(固相形成二硫键)：SLKWQPSNFIETCRNTQLAGSSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE
合成肽为LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQPSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE-amide
实施例2：两片段合成方法(two-fragment process)，通过树脂上形成二硫键(on-resin disulfide bond formation)，带有P51G突变
第一个片段，含有51个氨基酸残基(固相形成二硫键)：LGKFSQTCYN SAIQGSVLTSTCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQG–acid
第二个片段，含有50个氨基酸残基(固相形成二硫键)：SNFIETCRN TQLAGSSELAAECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE
合成肽为Ac-LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQPSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE-amide
实施例3：两片段自然化学连接和折叠
第一个片段，含有57个氨基酸残基，C端为硫酯(thioester)：LGKFSQTCYNSAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQ PSNFIET–thioester
第二个片段，含有44个氨基酸残基，C端为半胱氨酸：CRN TQLAGSSELA AECKTRAQQFVSTKINLDDH IANIDGTLKYE
连接过程之后，在自然氧化还原作用下进行折叠。所得产物为：LGKFSQTCYNSAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQ PSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQFVSTKINLDDH IANIDGTLKYE-amide
实施例4：三片段缩合制备方法
第一个片段含有27个氨基酸残基：Fmoc-LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNG-acid；
第二个片段含有38个氨基酸残基：Fmoc-GYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQ PSNFIETCRN TQLAG；
第三个片段含有36个氨基酸残基：SSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE-amide；
合成的肽为：Ac-LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQGSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE-amide
通过两步缩合获得完整长度的线性肽，所述线形肽然后在氧化还原反应条件下折叠为自然构型。
在合成上面这7个片段来组装整个CVN蛋白分子的过程中，分别进行了以下位点特异性突变体(如氨基酸残基置换)：Gln14X、Asn26X、Ser38X、Ser52X、Gln62X、Ser66X、Asp89X(数字代表位点)。
其中，X为：n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或者X为
相应的氨基酸构成单元的例子包括：
等。而且Fmoc-和Boc-保护的氨基酸构成单元是可以市场上买到的。
最终产物通过反相HPLC纯化，并通过分析和质谱进一步表征。从反相HPLC中纯化的多肽通常是三氟乙酸(TFA)的形式。这种盐通常被转化为更具有药物友好性的盐形式，如醋酸或盐酸盐形式。将TFA盐中的肽转化为盐酸盐可以通过在稀盐酸溶液中在TFA盐中反复冻干来实现。对于将TFA盐中的肽转化为醋酸盐，最简单的方法是使用如下方法制备的阴离子交换树脂：
强阴离子交换树脂(氯离子形式，取代量3mmole/g，含水量50％，每克肽使用2克树脂)首先用milli Q水洗涤三次，然后用1N氢氧化钠溶液洗涤3次，5分钟/次，然后用milli Q水洗涤5次，5分钟/次。用75％乙醇水清洗树脂，直到pH达到7.4。这种树脂用10％的醋酸溶液处理3次，每次5分钟。然后用1％的醋酸溶液清洗树脂3次，每次5分钟。该树脂可以用于纯化肽的盐转化。
将纯化的冻干肽溶解在1％醋酸溶液中，并添加到上述制备的树脂中。将混合物在室温下搅拌或磁性搅拌1小时。上清液分离。该树脂用1％的醋酸溶液洗涤三次。将上清液和洗涤液结合，通过0.22μm的膜过滤并冻干，在醋酸盐中生成一种肽。
那些具有位点特异性叠氮基基团的合成CVN类似物可以在温和的点击化学条件下进一步选择性地与达因、PEGs(PEG：聚乙二醇)、聚氨基酸、蛋白质、肽或带有炔官能团的放射性试剂衍生，如下商业上可获得的含炔的试剂，包括荧光染料，可以在温和的水介质条件下通过点击化学偶联到含有叠氮化物基团的肽化合物上。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种抗病毒肽氰病毒素N类似物，其特征在于，所述类似物为在氰病毒素N的Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89作为突变位点进行修饰，其中，修饰基团来自含有氨基酸的叠氮化物。
2.根据权利要求1所述的抗病毒肽氰病毒素N类似物，其特征在于，含有氨基酸的叠氮化合物选自：
或者/>n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
3.根据权利要求2所述的抗病毒肽氰病毒素N类似物，其特征在于，含有氨基酸的叠氮化合物选自：
4.一种抗病毒肽氰病毒素N类似物，其特征在于，所述类似物为在氰病毒素N的Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89作为突变位点进行修饰，其中，修饰基团来自含有氨基酸的叠氮化物和炔烃之间点击化学反应产生的共价产物基团。
5.根据权利要求4所述的抗病毒肽氰病毒素N类似物，其特征在于，含有氨基酸的叠氮化合物选自：
或者/>n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中，所述炔烃选自：
6.根据权利要求5所述的抗病毒肽氰病毒素N类似物，其特征在于，含有氨基酸的叠氮化合物选自： 等。
7.根据权利要求6所述的抗病毒肽氰病毒素N类似物，其特征在于，含有氨基酸的叠氮化合物所述叠氮化合物是Fmoc-保护或者Boc-保护的化合物。
8.一种合成权利要求1所述抗病毒肽氰病毒素N类似物的方法，其特征在于，
包括将含有氨基酸的叠氮化合物链接到抗病毒肽氰病毒素N的肽链Gln14、Asn26、Ser38、Ser52、Gln62、Ser66、Asp89中的至少一个位点上。
9.一种合成权利要求4所述抗病毒肽氰病毒素N类似物的方法，其特征在于，
通过点击化学反应，将炔烃化合物链接到叠氮化合物的基团上。
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