JP5601437B2 - コラーゲン様構造を有するポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、コラーゲン様の３本らせん構造を有するポリペプチド、このようなポリペプチドを製造するためのペプチド３量体、ならびにポリペプチドおよびペプチド３量体の製造方法に関する。
コラーゲンは、医薬品や化粧品の基材、再生医学やドラッグデリバリーシステム用の生体適合性材料、組織培養用の支持体などとして広く用いられている。現在利用されているコラーゲンは、主としてブタ、ウシなどの動物から得たコラーゲンを精製したものである。しかし、家畜由来コラーゲンをヒトに利用する場合には、ＢＳＥの原因となるプリオン感染の危険性が問題となっている。また、植物や魚皮由来コラーゲンも利用されるようになってきたが、異種コラーゲンの摂取によるゼラチンアレルギーの危険性が伴う。したがって、安全なコラーゲン代替品の供給が求められている。最近、さまざまなホスト生物を利用した遺伝子組み換えヒト型コラーゲン産生系の構築が試みられているが、まだ実用化には至っていない。
コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖が長い３本らせんを形成している構造を有する。コラーゲン様配列を有する３本の化学合成ペプチドが自己集合してコラーゲンと同じ３本らせん構造をとることはよく知られており、コラーゲンの構造研究に利用されている。コラーゲン様ポリペプチドとしては、例えば、ペプチドユニット[-(Pro-Y-Gly)n-]a（式中、ＹはProまたはHypを表し、ｎは１−２０の整数を表す）と、ペプチドユニット[-(Z)r-]b（式中、Ｚは１−１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、ｒは１−２０の整数を表す）とを含む繰り返し単位で構成されたポリペプチドが開示されている（特開２００３−３２１５００）。また、コラーゲン様ペプチド配列からなる超分子としては、これまでに、Martinらのコラーゲントリブロックペプチド：(Glu)5(Gly-X-Hyp-Gly-Pro-Hyp)6(Glu)5(Martin, R. et al. Biopolymers 70, 435-444, 2003)や、Fieldsによる"peptide-amphiphile" (Fields, GB, Bioorg. Med. Chem. 7, 75-81, 1999)が報告されている。
しかし、これまでに、分子間での相補的３本らせん形成により、３本らせん軸方向に伸長した超分子を作成した例は報告されていない。
本発明は、コラーゲン様の３本らせん構造を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドを製造するためのペプチドユニットを提供することを目的とする。
本発明は、式：
-(-Gly-X-Y-)-
［式中、XおよびYは任意のアミノ酸残基を表す］
の繰り返し単位を基本構造として有する同一鎖長の３個のペプチドが、主鎖方向に互いにずれて結合されているペプチド３量体を提供する。好ましくは、前記３個のペプチドは、ジスルフィド結合により互いに結合されている。
-(-Gly-X-Y-)-
［式中、XおよびYは任意のアミノ酸残基を表す］
の繰り返し単位を基本構造として有する同一鎖長の３個のペプチドが、主鎖方向に互いにずれて結合されているペプチド３量体を提供する。好ましくは、前記３個のペプチドは、ジスルフィド結合により互いに結合されている。
別の態様においては、本発明は、上述の本発明のペプチド３量体を製造する方法を提供する。この方法は、
１個のCysを有する第１のペプチド、２個のCysを有し、その一方のＳＨ基が保護されている第２のペプチドおよび１個のCysを有する第３のペプチドを用意し、
第１のペプチドと第２のペプチドとをジスルフィド結合により結合させてペプチド２量体を形成し、
第２のペプチドの保護されたＳＨを保護基変換により活性化し、そして
前記ペプチド２量体と第３のペプチドとをジスルフィド結合により結合させる、
の各工程を含む。
１個のCysを有する第１のペプチド、２個のCysを有し、その一方のＳＨ基が保護されている第２のペプチドおよび１個のCysを有する第３のペプチドを用意し、
第１のペプチドと第２のペプチドとをジスルフィド結合により結合させてペプチド２量体を形成し、
第２のペプチドの保護されたＳＨを保護基変換により活性化し、そして
前記ペプチド２量体と第３のペプチドとをジスルフィド結合により結合させる、
の各工程を含む。
また別の態様においては、本発明は、上述の本発明のペプチド３量体を構成成分とする３本らせん構造を有する分子集合体を提供する。本発明はさらに、上述の本発明の分子集合体を製造する方法であって、ペプチド３量体の溶液を０℃−４０℃の範囲の温度で１時間以上放置することを特徴とする方法を提供する。
本発明は、コラーゲン様配列を有する合成ペプチドを位置選択的架橋形成により３量体化させて形成したペプチド３量体ユニットを提供する。本発明はまた、このペプチド３量体ユニットを構成単位とし、３本らせん構造を有する超分子を作成する方法を提供する。本発明の概要は図１に示される。
ペプチド３量体ユニットの構造
本発明のペプチド３量体ユニットは、式：
-(-Gly-X-Y-)-
［式中、XおよびYは任意のアミノ酸残基を表す］
の繰り返し単位を基本構造として有する。天然のコラーゲンを構成するポリペプチド鎖は、-(-Gly-Pro-Pro-)-または-(-Gly-Pro-Hyp-)-の繰り返し単位をその基本構造として有しており、長い左巻きらせんを形成する。３本のポリペプチド鎖は互いに巻き合って、鎖間の水素結合により長く伸びた右巻きらせん構造を形成することができる。また、-(-Gly-Pro-Pro-)-または-(-Gly-Pro-Hyp-)-の繰り返し単位を有する鎖長１５−３０程度のペプチドの溶液を放置しておくと、天然のコラーゲンと同様の安定な３本らせん構造をとることが知られている。本明細書においては、このような３本らせん構造を「コラーゲン様構造」と称する。
本発明のペプチド３量体ユニットは、式：
-(-Gly-X-Y-)-
［式中、XおよびYは任意のアミノ酸残基を表す］
の繰り返し単位を基本構造として有する。天然のコラーゲンを構成するポリペプチド鎖は、-(-Gly-Pro-Pro-)-または-(-Gly-Pro-Hyp-)-の繰り返し単位をその基本構造として有しており、長い左巻きらせんを形成する。３本のポリペプチド鎖は互いに巻き合って、鎖間の水素結合により長く伸びた右巻きらせん構造を形成することができる。また、-(-Gly-Pro-Pro-)-または-(-Gly-Pro-Hyp-)-の繰り返し単位を有する鎖長１５−３０程度のペプチドの溶液を放置しておくと、天然のコラーゲンと同様の安定な３本らせん構造をとることが知られている。本明細書においては、このような３本らせん構造を「コラーゲン様構造」と称する。
本発明のペプチド３量体ユニットは、３個のペプチドから構成され、それぞれのペプチドは、-(-Gly-X-Y-)-［式中、XおよびYは任意のアミノ酸残基を表す］の繰り返し単位からなる基本構造を有する。ここで、XおよびYは、天然のアミノ酸残基でもよく、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基でもよく、Ｌ体でもＤ体でもよい。好ましくは、本発明のペプチド３量体は、天然のコラーゲンに見いだされる-(-Gly-Pro-Pro-)-または-(-Gly-Pro-Hyp-)-の繰り返し単位を多く含み、例えば、ペプチド３量体分子全体で、Xの３０％以上がProであり、Yの３０％以上がProまたはHypである。しかし、（Gly-Glu-Arg）n（Mechling, DE. et al, J. Biol. Chem. 275, 14352-14356, 2000）、(Gly-Pro-Nleu)n (Nleu= N-イソブチルグリシン; Goodman, M. et al, J. Am. Chem. Soc. 118, 10928-10929, 1996)なども安定な３本らせん構造を形成することが知られており、本発明のペプチド３量体はこのような繰り返し単位を有していてもよい。ペプチドが、「-(-Gly-X-Y-)-の繰り返し単位からなる基本構造を有する」とは、ペプチドのすべてのアミノ酸配列が-(-Gly-X-Y-)-の繰り返し単位を有する（すなわち３番目ごとにGlyを有する）必要はなく、このような繰り返し単位を有しない部分を含んでいてもよいことを意味する。ただし、安定な３本らせん構造をとるためには、ペプチド３量体分子中の８０％以上、好ましくは９０％以上のアミノ酸配列が-(-Gly-X-Y-)-の繰り返し単位を有していることが必要である。
本発明のペプチド３量体ユニットは、同一鎖長の３個のペプチドが主鎖方向に互いにずれてアミノ酸側鎖どうしが結合されている構造を有する。ここで、「主鎖方向に互いにずれて」いるとは、３個のペプチドが完全に重なり合わないように結合されていることを意味し、例えば図２に示される種々の構造が考えられる。３個のペプチドを主鎖方向に互いにずれるように結合させることにより、３個のペプチドどうしが短い安定な３本らせん構造をとることを防止し、ペプチド３量体をユニットとする長い３本らせん構造を形成させることができる。このとき、ペプチド３量体中の１本鎖または２本鎖の部分は、複数のペプチド３量体を水素結合により安定に保持するのりしろの役割をはたす。したがって、本発明においては、図２に示される構造のうち、１本鎖または２本鎖の領域が長く、３本鎖の領域が短い構造がより好ましい。
本発明のペプチド３量体ユニットを構成する各ペプチドは同一の鎖長を有する。このことにより、ペプチド３量体が集合して３本らせん構造を形成するときに、ギャップのない安定な構造をとることができる。各ペプチドは、公知のペプチド合成法（液相法あるいは固相法）によって合成することができる。鎖長は１０−６０アミノ酸残基、好ましくは１５−４０残基、より好ましくは２０−３０残基である。鎖長が短いと形成される３本らせん構造の安定性が低くなり、鎖長が長いとペプチド合成のコストが高くなる。
本発明のペプチド３量体ユニットにおいては、好ましくは３個のペプチドのアミノ酸側鎖どうしが結合されている。好ましくは、３個のペプチドは適切な位置にCysを有しており、これらのペプチドはジスルフィド結合により互いに結合されている。あるいは、アミド結合、スルフィド結合、シッフ塩基結合などによりアミノ酸側鎖どうしを共有結合により結合させてもよい。
ペプチド３量体ユニットの合成法
本発明のペプチド３量体ユニットは、部位特異的ジスルフィド結合形成法（Ottl, J et
al., FEBS Lett, 398, 31-36, 1996; Ottl, J. and Moroder, L. , J. Am. Chem. Soc. 121, 653-661, 1999; Koide, T. et al. Bioorg Med Chem Lett. 14, 125-128, 2004）により鎖間ジスルフィド結合を形成させることにより製造することができる。簡単には、ペプチド３量体を構成する３個のペプチド鎖のうち、２個は１残基のCys残基を、１個は２残基のCys残基を有するように設計し、Cys側鎖をジスルフィド結合によって他の鎖のCysと結合させる。
本発明のペプチド３量体ユニットは、部位特異的ジスルフィド結合形成法（Ottl, J et
al., FEBS Lett, 398, 31-36, 1996; Ottl, J. and Moroder, L. , J. Am. Chem. Soc. 121, 653-661, 1999; Koide, T. et al. Bioorg Med Chem Lett. 14, 125-128, 2004）により鎖間ジスルフィド結合を形成させることにより製造することができる。簡単には、ペプチド３量体を構成する３個のペプチド鎖のうち、２個は１残基のCys残基を、１個は２残基のCys残基を有するように設計し、Cys側鎖をジスルフィド結合によって他の鎖のCysと結合させる。
この方法では、まず、１個のCysを有する第１のペプチド、２個のCysを有し、その一方のＳＨ基が保護されている第２のペプチドおよび１個のCysを有する第３のペプチドを合成する。ＳＨ基の保護基としては、ペプチド合成の分野において知られる保護基のいずれを用いてもよいが、例えば、アセトアミドメチルを用いることができる。次に、第１のペプチドと第２のペプチドとをジスルフィド結合により結合させてペプチド２量体を形成する。CysのＳＨ基どうしをジスルフィド結合により結合させる方法は当該技術分野において一般に知られており、例えば、一方のペプチド鎖上のＳＨ基をピリジンスルフェニル化またはニトロピリジンスルフェニル化した後に、両方のペプチドを反応させることにより、Cys残基が互いにジスルフィド結合したペプチド２量体を形成することができる。次に、ペプチド２量体の第２のペプチドの保護されたＳＨを保護基変換により活性化し、そして前記ペプチド２量体と第３のペプチドとを同様にしてジスルフィド結合により結合させることにより、本発明のペプチド３量体を得ることができる。本発明のペプチド３量体は、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により精製することができる。
コラーゲン様分子集合体の構造および生成
本発明のコラーゲン様分子集合体（超分子）は、本発明のペプチド３量体ユニットをその構造単位とし、コラーゲンと同様の３本らせん構造を有する線維状の構造を持つ（図１、３）。上述の本発明のペプチド３量体ユニットの溶液を低温で放置すると、３本らせん形成を駆動力とする相補的自己集合がおこる。すなわち、本発明の分子集合体は、上述の本発明のペプチド３量体ユニットを含む溶液を０℃−４０℃、好ましくは０℃−１０℃で、１時間以上、好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは４８時間以上放置することにより形成することができる。溶液としては水溶液が好ましいが、コラーゲン３本らせん構造には他の多くのタンパク質に存在する疎水的コアが存在しないため、有機溶媒の使用も可能である。
本発明のコラーゲン様分子集合体（超分子）は、本発明のペプチド３量体ユニットをその構造単位とし、コラーゲンと同様の３本らせん構造を有する線維状の構造を持つ（図１、３）。上述の本発明のペプチド３量体ユニットの溶液を低温で放置すると、３本らせん形成を駆動力とする相補的自己集合がおこる。すなわち、本発明の分子集合体は、上述の本発明のペプチド３量体ユニットを含む溶液を０℃−４０℃、好ましくは０℃−１０℃で、１時間以上、好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは４８時間以上放置することにより形成することができる。溶液としては水溶液が好ましいが、コラーゲン３本らせん構造には他の多くのタンパク質に存在する疎水的コアが存在しないため、有機溶媒の使用も可能である。
コラーゲン様３本らせん構造を有する分子集合体が生じているか否かは、円二色性スペクトル測定による生成物の構造解析、分子量の測定、電子顕微鏡による直接観察などにより確認することができる。
本発明のコラーゲン様分子集合体は、現在天然コラーゲンが利用されているあらゆる分野において利用することができる。例えば、細胞培養基剤、ドラッグデリバリーシステム、その他の生体適合性材料として使用することができる。本発明のコラーゲン様分子集合体は、現在天然コラーゲンの使用において問題となっている、BSEの原因となるプリオン感染の危険やゼラチンアレルギーの危険がないという利点を有する。
さらに、本発明のペプチド３量体を適切に設計することにより、天然のコラーゲンに存在する特定の機能性配列を本発明のコラーゲン様分子集合体中に容易に人工的に組み込むことができる。このため、本発明のコラーゲン様分子集合体は、コラーゲンの機能解析や、機能性人工コラーゲンの開発に利用することができる。また、特定の機能（特定のタンパク質結合に対する結合能）を有するコラーゲン様超分子、例えば、COIDE法（Yasui, N. and Koide, T., J. Am. Chem. Soc. 125, 15728-15729, 2003）によって同定される色素上皮由来因子(PEDF)結合配列をもつコラーゲン様超分子などの作成が可能である。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
以下の実施例においては、アミノ酸は全てL-体を使用した。最終生成物および合成中間体の精製には、全て高速液体クロマトグラフィーを用いた。条件は以下の通りである：
カラム：Cosmosil 5C18-AR
溶媒：A, 0.05％トリフルオロ酢酸／水
B, 0.05％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
温度：42℃
溶出はAからBへの直線グラジエントによりおこなった。また、最終生成物および合成中間体はMALDI-TOF MSにより同定した。
カラム：Cosmosil 5C18-AR
溶媒：A, 0.05％トリフルオロ酢酸／水
B, 0.05％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
温度：42℃
溶出はAからBへの直線グラジエントによりおこなった。また、最終生成物および合成中間体はMALDI-TOF MSにより同定した。
Pro-Hyp-Gly繰り返しを基本配列とするペプチドユニットの合成（図３）
１）ペプチド鎖の構築
N-ペプチド（SH体）：H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Cys(SH)-OH （配列番号１）
M-ペプチド（Acm, SH体）：H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-Cys(SH)-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-OH（配列番号２）
C-ペプチド（SH体）：H-Cys(SH)-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-OH （配列番号３）
１）ペプチド鎖の構築
N-ペプチド（SH体）：H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Cys(SH)-OH （配列番号１）
M-ペプチド（Acm, SH体）：H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-Cys(SH)-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-OH（配列番号２）
C-ペプチド（SH体）：H-Cys(SH)-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-OH （配列番号３）
上記3種のペプチド鎖は、TrtA-PEG-樹脂（渡辺化学工業）上、通常のFmoc型固相合成法により構築した。側鎖官能基保護アミノ酸として、Fmoc-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OHおよびFmoc-Cys(Trt)-OHを使用した（略号：HypまたはO, 4-ヒドロキシプロリン; Acm, アセトアミドメチル; Trt, トリチル）。
２）ペプチドの樹脂からの切り出しと脱保護
それぞれのペプチド-樹脂（約0.1mmol）を、氷冷下、水、m-クレゾール, チオアニソール（各0.25 ml）、1,2-エタンジチオール（0.125 ml）、トリフルオロ酢酸（4.125 ml）と混合し、室温で1時間撹拌した。切り出されたペプチドは、約５倍容のエーテルを加えることにより沈澱した。凍結乾燥したペプチドは、0.05％トリフルオロ酢酸／水に溶解し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製し、凍結乾燥した。
それぞれのペプチド-樹脂（約0.1mmol）を、氷冷下、水、m-クレゾール, チオアニソール（各0.25 ml）、1,2-エタンジチオール（0.125 ml）、トリフルオロ酢酸（4.125 ml）と混合し、室温で1時間撹拌した。切り出されたペプチドは、約５倍容のエーテルを加えることにより沈澱した。凍結乾燥したペプチドは、0.05％トリフルオロ酢酸／水に溶解し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製し、凍結乾燥した。
選択的ジスルフィド架橋によるペプチド３量体ユニットの合成
１）M-ペプチドのピリジンスルフェニル化：M-ペプチド（Acm, SPy体）の合成
M-ペプチド（Acm, SH体）25mg (11.2 μmol)を2 mM EDTAを含む50 mM酢酸ナトリウム(pH 5.4)［バッファー A］に溶解し、2,2'-ジピリジルジスルフィド(49.5 mg, 225 μmol)を溶解した2-プロパノールと窒素雰囲気下、室温で混合し、1時間反応させた。生成した目的物は、HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
１）M-ペプチドのピリジンスルフェニル化：M-ペプチド（Acm, SPy体）の合成
M-ペプチド（Acm, SH体）25mg (11.2 μmol)を2 mM EDTAを含む50 mM酢酸ナトリウム(pH 5.4)［バッファー A］に溶解し、2,2'-ジピリジルジスルフィド(49.5 mg, 225 μmol)を溶解した2-プロパノールと窒素雰囲気下、室温で混合し、1時間反応させた。生成した目的物は、HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
２）M-ペプチド（Acm, SPy体）とC-ペプチド（SH体）とのヘテロ２量体化によるM-Cダイマー（Acm, SS体）の合成
13.2 mg (5.66 μmol)のM-ペプチド（Acm, SPy体）を0.66 mlのバッファー Aに溶解し、これを14.7 mg (6.79 μmol)のC-ペプチド（SH体）を溶解した0.735 mlのバッファー Aに室温、窒素雰囲気下で滴下した。反応液は遮光し、80分撹拌した。生成した目的物は、HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
13.2 mg (5.66 μmol)のM-ペプチド（Acm, SPy体）を0.66 mlのバッファー Aに溶解し、これを14.7 mg (6.79 μmol)のC-ペプチド（SH体）を溶解した0.735 mlのバッファー Aに室温、窒素雰囲気下で滴下した。反応液は遮光し、80分撹拌した。生成した目的物は、HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
３）M-Cダイマー（Acm, SS体）の選択的S-ニトロピリジンスルフェニル化：M-Cダイマー（Npys, SS体）の合成
10.3 mg (2.35 μmol)のM-Cダイマー（Acm, SS体）を0.412 mlのトリフルオロ酢酸／酢酸(1:2, v/v)に溶解する。3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニルクロリド(1.1 mg, 5.87 μmol)も同様に0.6 mlのトリフルオロ酢酸／酢酸(1:2, v/v)に溶解し、ペプチド溶液に室温、窒素雰囲気下滴下した。反応液は遮光し、45分間撹拌した。生成した目的物は、HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
10.3 mg (2.35 μmol)のM-Cダイマー（Acm, SS体）を0.412 mlのトリフルオロ酢酸／酢酸(1:2, v/v)に溶解する。3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニルクロリド(1.1 mg, 5.87 μmol)も同様に0.6 mlのトリフルオロ酢酸／酢酸(1:2, v/v)に溶解し、ペプチド溶液に室温、窒素雰囲気下滴下した。反応液は遮光し、45分間撹拌した。生成した目的物は、HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
４）M-Cダイマー（Npys, SS体）とN-ペプチド（SH体）間での選択的ジスルフィド架橋形成による、ペプチド３量体ユニットの合成
3.9 mg (1.81 μmol)のN-ペプチド（SH体）を0.39 mlのBuffer Aに溶解し、これを8.1 mg (1.81 μmol)のM-Cダイマー（Npys, SS体）を溶解した0.81 mlのBuffer Aに室温、窒素雰囲気下で滴下した。反応液は遮光し、90分撹拌した。生成した目的物は、HPLC（4.6 id x 250 mm）にて精製し、凍結乾燥した。合成したペプチド３量体ユニットはMALDI-TOF MSにより目的物であることを確認した。実測値(M+H)+ 6458, 理論値(M+H)+ 6458。
3.9 mg (1.81 μmol)のN-ペプチド（SH体）を0.39 mlのBuffer Aに溶解し、これを8.1 mg (1.81 μmol)のM-Cダイマー（Npys, SS体）を溶解した0.81 mlのBuffer Aに室温、窒素雰囲気下で滴下した。反応液は遮光し、90分撹拌した。生成した目的物は、HPLC（4.6 id x 250 mm）にて精製し、凍結乾燥した。合成したペプチド３量体ユニットはMALDI-TOF MSにより目的物であることを確認した。実測値(M+H)+ 6458, 理論値(M+H)+ 6458。
自己集合による超分子形成
ペプチド３量体ユニットを10 mg/mlの濃度で水に溶解し、４℃にて14日間放置した（ストック溶液）。
１）円二色性スペクトル測定による構造解析
上記ストック溶液を、４℃にて水で5倍に希釈し、測定に用いた。
測定条件は以下の通りである：
装置：JASCO J-820装置に PTC-423L 温度制御装置を装着して使用
セル長：0.5 mm
測定波長：210-260 nm
データ取り込み：0.2 nm毎
スキャン速度：50 nm/min
レスポンス：2秒
データ積算：3回
感度：100 mdeg
測定温度、4、30、40、50、60、70℃
ペプチド３量体ユニットを10 mg/mlの濃度で水に溶解し、４℃にて14日間放置した（ストック溶液）。
１）円二色性スペクトル測定による構造解析
上記ストック溶液を、４℃にて水で5倍に希釈し、測定に用いた。
測定条件は以下の通りである：
装置：JASCO J-820装置に PTC-423L 温度制御装置を装着して使用
セル長：0.5 mm
測定波長：210-260 nm
データ取り込み：0.2 nm毎
スキャン速度：50 nm/min
レスポンス：2秒
データ積算：3回
感度：100 mdeg
測定温度、4、30、40、50、60、70℃
結果を図４に示す。超分子の低温におけるスペクトルは、225 nmに正のシグナルをもち、典型的なコラーゲン３本らせん構造のスペクトルパターンを示した。ペプチドユニットのデザイン上、ユニット単分子では、３本らせん構造を取り得ないため、この結果は、ユニット分子間での３本らせん形成（=超分子形成）が起こっていると解釈される。また、225 nmにおける残基平均モル楕円率([Θ]mrw)の値が、天然のコラーゲンおよびコラーゲンモデルペプチド３本らせんのそれと同等であることから、超分子中の３本らせん含有率は極めて高いことが示唆される。この３本らせん構造は熱により変性し、ランダムコイル構造となる。
２）限外濾過による超分子の解析
超分子ストック溶液あるいは、コントロールとして同様に４℃にて３本らせん形成させた(Pro-Hyp-Gly)8-アミドを４℃にて水で20倍に希釈した。これらをMicrocon YM-100（分子量100,000カット）を用いて４℃にて限外濾過をおこなった。濾液をHPLCで分析し、そのピーク面積より限外濾過膜透過率をもとめた。また、同じ溶液を95℃、5分間処理することにより３本らせんを熱変性させた直後のサンプルについても、同様に透過率を求めた。結果を図５に示す。
超分子ストック溶液あるいは、コントロールとして同様に４℃にて３本らせん形成させた(Pro-Hyp-Gly)8-アミドを４℃にて水で20倍に希釈した。これらをMicrocon YM-100（分子量100,000カット）を用いて４℃にて限外濾過をおこなった。濾液をHPLCで分析し、そのピーク面積より限外濾過膜透過率をもとめた。また、同じ溶液を95℃、5分間処理することにより３本らせんを熱変性させた直後のサンプルについても、同様に透過率を求めた。結果を図５に示す。
超分子形成させたペプチドのほとんど（6％）は限外濾過膜を通過しなかった。一方同
じペプチド鎖長とほぼ同様のアミノ酸構成からなる、(Pro-Hyp-Gly)8-アミドはその56％が膜を通過した。また、超分子溶液を熱変性することにより、91％が膜を通過できるようになった。このことから、超分子溶液中では、分子間の相互作用（３本らせん形成）による大きな構造体が生じていると解釈される。
じペプチド鎖長とほぼ同様のアミノ酸構成からなる、(Pro-Hyp-Gly)8-アミドはその56％が膜を通過した。また、超分子溶液を熱変性することにより、91％が膜を通過できるようになった。このことから、超分子溶液中では、分子間の相互作用（３本らせん形成）による大きな構造体が生じていると解釈される。
スタガー３量体の合成および特性決定
実施例１のペプチド３量体ユニットと同じPro-Hyp-Gly繰り返しを基本配列とする分子デザインであって、ただしジスルフィド架橋の位置が異なるペプチド３量体（スタガー３量体）を合成した。図６にその構造を示す。
実施例１のペプチド３量体ユニットと同じPro-Hyp-Gly繰り返しを基本配列とする分子デザインであって、ただしジスルフィド架橋の位置が異なるペプチド３量体（スタガー３量体）を合成した。図６にその構造を示す。
ペプチド単量体として、以下の３種類のペプチドを用いた：H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Cys(SH)-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-OH （配列番号４）
H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Cys(SH)-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-OH （配列番号５）
H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Cys(SH)-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-OH （配列番号６）
H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Cys(SH)-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-OH （配列番号５）
H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Cys(SH)-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-OH （配列番号６）
実施例１と同じ方法により３量体を合成し、質量分析により目的物が合成されたことを確認した。このスタガー３量体を実施例２と同様に低温下で超分子化し、円二色性スペクトルを測定したところ、実施例２（図４）とほぼ同じ結果が得られた。
次に、スタガー３量体のストック水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を４℃の水で１２倍に希釈したのち、４℃で１時間放置したサンプルについて、粒度分布を測定した。測定は、島津レーザ回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−７００）を用い、４℃でレーザ波長４０５ｎｍで行った。結果を図７に示す。約０．５および約１０ミクロンの粒径をあたえる超分子構造体が検出された。
Claims (4)
- 式：
-(-Gly-X-Y-)-
［式中、XおよびYは任意のアミノ酸残基を表す］
の繰り返し単位を基本構造として有する同一鎖長の３個のペプチドが、ジスルフィド結合により主鎖方向に互いにずれて結合されているペプチド３量体であって、
前記３個のペプチドのうち、２個がそれぞれ１つのCys残基を有し、他の１個が２つのCys残基を有し、
前記ペプチド３量体の１本鎖または２本鎖の領域が３本鎖の領域より長く、かつ
前記ペプチド３量体分子全体で、Xの３０％以上がProであり、Yの３０％以上がProまたはHypであることを特徴とするペプチド３量体。 - 請求項１記載のペプチド３量体を製造する方法であって、
１個のCysを有する第１のペプチド、２個のCysを有し、その一方のＳＨ基が保護されている第２のペプチドおよび１個のCysを有する第３のペプチドを用意し、
第１のペプチドと第２のペプチドとをジスルフィド結合により結合させてペプチド２量体を形成し、
第２のペプチドの保護されているＳＨを保護基変換により活性化し、そして
前記ペプチド２量体と第３のペプチドとをジスルフィド結合により結合させる、
の各工程を含む方法。 - 請求項１に記載のペプチド３量体を構成成分とし、３本らせん構造を有する分子集合体。
- 請求項３に記載の分子集合体を製造する方法であって、請求項１に記載のペプチド３量体の溶液を０℃−４０℃の温度で１時間以上放置することを特徴とする方法。
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