CN117946222A - 一种抗菌肽Temporin-PF及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗菌肽Temporin-PF及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽Temporin‑PF及其制备方法，具有生物安全性高、抗菌谱广和制备成本较低等优点，可广泛应用于抗菌、抑菌类食品、药品、保健品、化妆品等产品的开发，应用前景广阔。抗菌肽相较于传统抗生素不易产生耐药性，适合长期使用，可产生长期的经济效益。

Description

一种抗菌肽Temporin-PF及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽Temporin-PF及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素的出现为治疗细菌感染提供了有力保障，然而由于抗生素的滥用导致细菌耐药问题逐渐加剧。由于抗生素的研发速率远远不及细菌对其产生耐药的速度，导致人类健康面临重大威胁，正在逐渐走向后抗生素时代。相较于传统抗生素，抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)具有广谱抗菌活性和低细胞毒性的特点，由于主要作用于细菌细胞膜，不易产生耐药性，因此抗菌肽逐渐成为国内外研究的热点，有望开发成为新型抗菌药。
抗菌肽是多细胞生物免疫防御的重要组成部分，在动物、植物、微生物等生物体内广泛存在，可以从天然来源中提取或者通过化学方法合成。与其他小剂量化学药物相比，抗菌肽生产成本是相对高昂的。抗菌肽在生物体内含量极微，从天然生物资源中提取抗菌肽的工艺繁琐、费时长、费用昂贵且得率低，无法实现大规模生产。考虑到这些方面，抗菌肽的生产应当从昂贵繁琐的天然肽类提取，转变为更加廉价的化学合成，这也是当今肽类产品、药品生产过程中的迫切需求。
目前抗菌肽的开发与应用仍然存在很多限制，如生物体内的抗菌肽提取困难，生产成本高；部分抗菌肽具有全身毒性、体内不稳定性、抗菌活性低等问题。因此，研究者们常以天然抗菌肽为模板，进行衍生肽设计优化，以期开发出新的强效低毒抗菌肽。本发明运用多肽固相合成法进行抗菌肽的制备，可以有效降低抗菌肽的获得成本。同时，本发明以天然抗菌肽Temporin-PF为模板，创新性的引入了源自人免疫缺陷病毒(HIV-1)中的细胞穿膜肽TAT片段，借助TAT片段穿透细胞膜的能力，在保留了Temporin-PF原有生物安全性的同时，增强了其抑菌杀菌的能力和对细菌生物膜清除的能力。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种抗菌肽Temporin-PF及其制备方法，具有生物安全性高、抗菌谱广和制备成本较低等优点，可广泛应用于抗菌、抑菌类食品、药品、保健品、化妆品等产品的开发，应用前景广阔。抗菌肽相较于传统抗生素不易产生耐药性，适合长期使用，可产生长期的经济效益。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种抗菌肽Temporin-PF，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明还提供一种抗菌肽Temporin-PF的制备方法，制备步骤为：
(1)将合成剂装入洗净干燥的合成管中，根据抗菌肽Temporin-PF序列加入氨基酸；
(2)称取树脂装入合成管中并将合成管上Tribute双通道多肽合成仪，得到结合多肽的干燥树脂；
(3)等待合成完毕后裂解、冻干得到粗肽；
(4)通过反相高效液相色谱和质谱鉴定进行提纯，获得纯肽样品。
作为本发明的一种改进，所述步骤(1)中合成剂为HBTU，氨基酸为甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。
作为本发明的一种改进，所述步骤(2)中树脂为Wang Resin或RinkAmide Resin。
作为本发明的一种改进，所述步骤(2)具体步骤为：
S1.根据肽链C端，挑选合适的树脂装入反应容器中并将反应容器装上Tribute双通道多肽合成仪，负载氨基酸的树脂使用DMF浸泡除去杂质，再用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，用DMF洗涤树脂以去除哌啶和Fmoc基团，得到脱保护的树脂；
S2.使用比例为11:89的N-甲基吗啉的DMF溶液将肽链C端第二个氨基酸与S1得到的脱保护的树脂进行缩合反应，再用DMF洗涤后执行Fmoc基团的脱保护程序并重复；
S3.按此过程依次从C端向N端逐个合成，直至完成最后一个氨基酸的脱保护程序，之后用DMF洗涤，再用DCM洗涤以去除环境中的DMF，最后排出液体执行干燥程序，得到结合多肽的干燥树脂。
作为本发明的一种改进，所述步骤(3)的具体步骤为：
S1.将步骤(2)得到的干燥树脂从反应容器中取出转移到带有搅拌器的圆底烧瓶中，加入裂解液混合，于室温下搅拌反应；
S2.反应完成后过滤，通过旋转蒸发将滤液浓缩至至接近干燥；
S3.将浓缩液转移至离心管中加入冰乙醚震荡后于冰箱静置过夜完成肽的析出沉淀；
S4.取出离心管离心弃去上清液；
S5.使用ddH2O溶解肽沉淀后将离心管在液氮中速冻，然后冻干得到粗肽粉末。
作为本发明的一种改进，所述裂解液为三氟乙酸、EDT、三异丙基硅烷、水的混合溶液，三氟乙酸、EDT、三异丙基硅烷、水的体积比为94:2:2:2。
本发明还提供一种抗菌肽Temporin-PF在制备抑菌类产品的应用。
本发明的有益效果为：
本发明选择了一种具有很强细胞穿透能力的多肽片段TAT，与Temporin-PF的N端通过两个甘氨酸连接后形成新肽，设计的新型Temporin-PF在保留了原肽对革兰氏阳性菌和真菌的卓越抗菌能力的同时，可大幅度提高其对革兰氏阴性菌的杀伤效果，显著优化了抗菌肽Temporin-PF的广谱性；本发明制备的新Temporin-PF共25个氨基酸，制备成本较低；目前国内外尚无Temporin-PF引入TAT提高广谱性的研究及相关报道。要提供对应的实验结果验证。具有生物安全性高、抗菌谱广和制备成本较低等优点，可广泛应用于抗菌、抑菌类食品、药品、保健品、化妆品等产品的开发，应用前景广阔。抗菌肽相较于传统抗生素不易产生耐药性，适合长期使用，可产生长期的经济效益。
附图说明
图1为Temporin-PF质谱图。
图2为本发明的实施例产品抗菌肽Temporin-PF质谱图。
图3为实施例产品对S.aureus(S)与E.coli(E)生物膜的MBIC(最低生物膜抑制浓度)和MBEC(最低生物膜去除浓度)。
图4为实施例产品的溶血活性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一抗菌肽Temporin-PF的合成
抗菌肽Temporin-PF，其序列如序列表1所示：
表1抗菌肽Temporin-PF的氨基酸序列和分子量
其合成使用Protein Technologies公司推出Tribute双通道多肽合成仪(Tributepeptide synthesizer)进行合成，采用Fmoc保护合成法，合成方向从C端到N端逐一进行，具体步骤如下：
1.氨基酸的计算与称量：Tribute peptide synthesiser每次合成的多肽量为0.3mmol，每个氨基酸应至少是所需量4倍。此外，活化剂催化偶联的比例为1:1，因此，活化剂(HBTU)也需称4倍于多肽的量。
具体操作如下：
(1)清水清洗合成管三次，甲醇润洗一遍后烘干。
(2)称取1.2mmol HBTU装入洗净干燥的合成管中。
(3)每种氨基酸称取1.2mmol后装入含HBTU的合成管中并封管。
2.根据肽链C端，挑选合适的Wang Resin或RinkAmide Resin，称取0.3mmol树脂装入30mL的反应容器中并将反应容器装上固相合成仪。Wang Resin与目标合成序列C端的最后一个氨基酸结合，而RinkAmide Resin则适用于C末端有酰胺的多肽序列。负载氨基酸的树脂(Resin)使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡10分钟以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应150秒，抽干并重复3次；用DMF洗涤树脂以去除哌啶和Fmoc基团，每次清洗30秒，抽干并重复4次。
3.使用比例为11:89的NMM(N-甲基吗啉):DMF溶液将肽链C端第二个氨基酸与上述得到的脱保护的树脂进行缩合反应，反应25分钟后用DMF洗涤4次，每次30秒。然后再执行Fmoc基团的脱保护程序并重复。
4.按此过程依次从C端向N端逐个合成，直至完成最后一个氨基酸的脱保护程序，之后用DMF洗涤4次，再用二氯甲烷(DCM)洗涤4次以去除环境中的DMF。最后排出液体执行干燥程序，得到结合多肽的干燥树脂。
5.通过裂解反应将树脂和多肽分离，具体操作如下：
(1)将干燥的树脂从反应容器中取出称重，然后将其转移到带有搅拌器的100mL圆底烧瓶中。
(2)根据树脂的重量，以25mL/g计算所需裂解液总体积。按照比例配置裂解液：94％三氟乙酸(TFA)+2％(EDT)+2％三异丙基硅烷(Tips)+2％H2O。
(3)将裂解液与树脂混合，室温下磁力搅拌反应6-8小时。
(4)完成裂解反应后，使用布氏漏斗过滤裂解混合物，然后通过旋转蒸发将滤液浓缩至接近干燥(水浴锅温度不超过40℃)。
6.洗涤多肽并冻干，具体操作如下：
(1)将浓缩液转移至于50mL离心管中并加入45mL冰乙醚(Et2O)，震荡后置于-20℃冰箱静置过夜完成肽的析出沉淀。
(2)第二天取出离心管5000xg离心5分钟，弃去上清液，然后再次向管中加入45mLEt2O。
(3)离心过程重复3次，最后一次上清应尽可能弃干净。
(4)使用10-20mL ddH2O溶解肽沉淀后将离心管在液氮中速冻15分钟。然后将离心管(去盖换有孔锡纸)放于冷冻干燥机中冻干约60小时后即可得到粗肽粉末。使用质谱MALDI-TOF MS(Voyager DE，PerSeptive Biosystems，Framingham，MA，USA)测定合成产物的分子量以判断固相合成是否成功。
7.多肽的纯化：将上述粗肽使用90％乙腈水溶液溶解，反相高效液相色谱(Phenomenex C-5column，0.46cm×25cm)进行纯化。洗脱液A为含有0.05％ TFA的水溶液，洗脱液B为含有0.05％ TFA的乙腈水溶液0.05％TFA(80％ACN/19.95％水/0.05％ TFA)；流动相梯度设置为：0-10分钟，0％-30％洗脱液B；10-60分钟，30％-95％洗脱液B。检测波长为214nm，流速0.2mL/min。
8.多肽的质谱鉴定：将上述得到的多肽再经过MALDI-TOF MS进行分析，质谱图中显示的分子量与理论分子量一致。如附图(图1、图2)所示。使用高效液相色谱进行纯化，使得抗菌肽的纯度大于95％。
实施例二抗菌肽Temporin-PF对金黄色葡萄球菌S.aureus与大肠杆菌E.coli生物膜形成的影响
将上述的抗菌肽Temporin-PF纯肽样品用去离子水配置成100～12800μM两倍梯度的肽溶液备用。
实验用菌株为：革兰氏阳性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus NCTC10788)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA NCTC 12493)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis NCTC 12697)；真菌：白色念珠菌(Candida albicans NCYC 1467)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichia coli NCTC 10418)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosaATCC 27853)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC 43816)。所有菌株均在灭菌后的M-H培养基(Mueller Hinton Broth,pH 7.4)中生长至稳定期后取出进行二次孵育，再培养至相应对数生长期后统一稀释至5×105CFU/mL菌液样品。统一浓度的各菌液样品与肽的梯度样品溶液以99:1的比例混合配置成1～128μM终浓度的测试溶液，以M-H培养基加水(99:1)作空白对照组，菌液样品加水(99:1)作生长对照组，测试溶液及对照均设三组重复。
菌种生长情况观察：24小时后观察样品组、空白对照组和生长对照组溶液的浑浊度，测得在550nm的吸光度值。取10μL各样品滴在M-H琼脂培养基上，设三组重复，24小时后再次观察M-H琼脂培养基上菌落生长情况。
筛选出最小抑菌浓度和最小杀菌浓度：根据测得的吸光度值可筛选出抗菌肽Temporin-PF对各菌株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)；根据M-H琼脂培养基上菌落生长情况可以筛选出抗菌肽Temporin-PF对各菌株的最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)。结果见表2。
表2 Temporin-PF(T-1434)与抗菌肽Temporin-PF(T-2927)的抑菌活性
表3 Temporin-PF的氨基酸序列和分子量
实施例三抗菌肽对金黄色葡萄球菌S.aureus与大肠杆菌E.coli生物膜形成的影响
如图3所示，过夜培养的细菌培养液用新鲜培养基稀释至5×105CFU/mL。
最低生物膜抑制浓度(MBIC)测定：将1μL肽溶液与99μL稀释菌液混合，使最终浓度为512～1μM。37℃下孵育24h，将96孔板的孔用100μLPBS洗涤3次。等干燥后用100μL甲醇固定30分钟，风干。然后用0.1％(w/v)结晶紫染色30分钟，再用PBS洗涤3次，风干过夜。此后将结晶紫溶解在100μL 30～33％乙酸中并用Synergy HT酶标仪测量各孔在595nm的吸光度。
最低生物膜去除浓度(MBEC)测定：96孔板的每个孔加100μL稀释菌液并在37℃培养24～48h以形成成熟的生物膜。然后用PBS洗涤成熟生物膜3次以去除浮游细菌。与浓度范围512～1μM的肽溶液在37℃下孵育24h。然后用100μLPBS洗孔3次，干燥后用100μL甲醇固定30分钟，风干。然后用0.1％(w/v)结晶紫染色30分钟，再用PBS洗涤3次并风干过夜。此后将结晶紫溶解在100μL 30～33％乙酸中并用Synergy HT酶标仪测量其在595nm处的吸光度。
实施例四抗菌肽溶血活性分析
将2mL新鲜马血与30mL无菌PBS在50mL离心管中混合，以100xg离心5分钟，确保红细胞结构不被破坏。弃上清后，将30mL无菌PBS轻轻加入50mL管中，用定轨摇床轻轻摇动管子，使红细胞悬浮，直至底部观察不到团块。然后重复此步骤直至上清液澄清无色。洗涤后，将50mLPBS轻轻加入管中以重悬红细胞。肽的溶血活性是通过梯度浓度的肽溶液与2％马红细胞悬浮液共同孵育后的在550nm的吸光度(OD)来测量的。将200μL每种浓度的肽溶液与200μL制备的红细胞悬液混合。将5μL Triton X-100添加到195μLPBS中作为阳性对照，并将其与200μL红细胞悬液混合。阴性对照设为200μLPBS与200μL红细胞悬液混合。每组样品设置3个重复。孵育2小时后，每个样品取100μL上清液转移至96孔板，并使用Synergy HT酶标仪在550nm测各孔的吸光度，结果见图4。
需要说明的是，上述仅仅是本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，在上述实施例的基础上还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗菌肽Temporin-PF，其特征在于：其序列如序列表SEQ ID No .1所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽Temporin-PF的制备方法，其特征在于，制备步骤为：
（1）将合成剂装入洗净干燥的合成管中，根据抗菌肽Temporin-PF序列加入氨基酸；
（2）称取树脂装入合成管中并将合成管上Tribute双通道多肽合成仪，得到结合多肽的干燥树脂；
（3）等待合成完毕后裂解、冻干得到粗肽；
（4）通过反相高效液相色谱和质谱鉴定进行提纯，获得纯肽样品。
3.根据权利要求2所述的一种抗菌肽Temporin-PF的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中合成剂为HBTU，氨基酸为甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。
4.根据权利要求2所述的一种抗菌肽Temporin-PF的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中树脂为 Wang Resin或Rink Amide Resin。
5.根据权利要求3所述的一种抗菌肽Temporin-PF的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）具体步骤为：
S1.根据肽链C端，挑选合适的树脂装入反应容器中并将反应容器装上Tribute双通道多肽合成仪，负载氨基酸的树脂使用DMF浸泡除去杂质，再用含有20%哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，用DMF洗涤树脂以去除哌啶和Fmoc基团，得到脱保护的树脂；
S2.使用比例为11:89的N-甲基吗啉的DMF溶液将肽链C端第二个氨基酸与S1得到的脱保护的树脂进行缩合反应，再用DMF洗涤后执行Fmoc基团的脱保护程序并重复；
S3.按此过程依次从C端向N端逐个合成，直至完成最后一个氨基酸的脱保护程序，之后用DMF洗涤，再用DCM洗涤以去除环境中的DMF，最后排出液体执行干燥程序，得到结合多肽的干燥树脂。
6.根据权利要求2所述的一种抗菌肽Temporin-PF的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体步骤为：
S1.将步骤（2）得到的干燥树脂从反应容器中取出转移到带有搅拌器的圆底烧瓶中，加入裂解液混合，于室温下搅拌反应；
S2.反应完成后过滤，通过旋转蒸发将滤液浓缩至至接近干燥；
S3.将浓缩液转移至离心管中加入冰乙醚震荡后于冰箱静置过夜完成肽的析出沉淀；
S4.取出离心管离心弃去上清液；
S5.使用ddH2O溶解肽沉淀后将离心管在液氮中速冻，然后冻干得到粗肽粉末。
7.根据权利要求6所述的一种抗菌肽Temporin-PF的制备方法，其特征在于：所述裂解液为三氟乙酸、EDT、三异丙基硅烷、水的混合溶液，三氟乙酸、EDT、三异丙基硅烷、水的体积比为94:2:2:2。
8.根据权利要求1所述的抗菌肽Temporin-PF在制备抑菌类产品的应用。
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