CN111363010A - 一类对称短序列抗菌肽类似物及其应用 - Google Patents
一类对称短序列抗菌肽类似物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明设计合成了一类对称短序列抗菌肽类似物，其以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，两侧分别引入正电荷性的精氨酸和疏水性氨基酸，然后进行C末端酰胺化得到，其结构通式为：XYWWWYX‑NH2、XWYWWWYWX‑NH2、XYYWWWYYX‑NH2，其中X＝G、I、L、F、W、V、A，Y＝R。该类抗菌肽类似物结构设计简单、制造成本低。体外抑菌、溶血实验和诱导耐药实验表明，该类对称短序列抗菌肽类似物对常见革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细菌菌株均具有强的抗菌活性，并且具有低溶血毒性、不易诱导细菌产生耐药性，在制备临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一类对称短序列抗菌肽类似物，本发明同时还涉及该类抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
背景技术
抗生素的滥用和过度使用，以及新型小分子抗生素的未能及时发现，导致抗生素危机的爆发，出现了对几乎所有可用抗生素都具有耐药性的“超级细菌”(Lancet InfectDis.2013Dec；13(12):1057-98)。目前，全世界每年约有70万人死于抗生素耐药。预计未来几年这一现象将越发严重，抗生素耐药将成为世界范围内的主要死亡原因，到2050年估计每年约有1000万人死于抗生素耐药。
抗菌肽(AMPs，Antimicrobial peptides)作为一种小分子活性肽，广泛存在于昆虫、动物、微生物等有机生物体中。抗菌肽具有较强的广谱抗菌活性，例如早期发现的抗菌肽Melittin，Cecropin和Magainin，均能够有效的对抗细菌(Biophys J.2016Jul 12；111(1):132-9；PLoS Comput Biol.2016Jan 4；12(1):e1004570；PLoS One.2017Nov 29；12(11):e0187914)。相比于通过单一的、特殊的分子靶标作用的抗生素，抗菌肽由于其非受体介导的膜机制，同时具有例如与细菌DNA、RNA、核酸结合，影响蛋白质的合成等多种作用机制，而表现出较低的耐药发生性，且抗菌肽在对抗正常菌株的同时，对耐药性菌株也表现出很好的抗菌活性(Curr Med Chem.2014；21(20):2299-321)。
虽然抗菌肽作为一种新型抗菌药物，为对抗细菌耐药提供了希望和机会，但由于系统毒性、抗菌活性欠佳，由于复杂的设计导致的高生产成本等问题，使其在临床的应用与发展受到了限制(Nat Biotechnol.2005Aug；23(8):1008-12)。
与复杂的常见多肽修饰方法不同，“镜面对称设计”作为一种新的多肽设计策略，近年来获得了一定成效。2005年，Sung-Tae Yang等人采用色氨酸(W)富集肽Tritrpticin(VRRFPWWWPFLRR-COOH)的中心片段WWW，采用镜像对称设计理念，设计得到了具有理想抗菌活性的抗菌肽类似物PST11-RK(KKFPWWWPFKK-NH2)和PST13-RK(KKKFPWWWPFKKK-NH2)(Int JAntimicrob Agents.2006Apr；27(4):325-30)。东北农业大学一课题组曾报道了镜面对称抗菌肽KL4A6，其序列组成为LLKAAAKAAAKLL-NH2，具有较好的细菌选择性，但抗菌谱较窄；接着，该课题组以KAAAKAAAK为镜面中心，将序列的两端同时引入其他氨基酸，并以色氨酸做末端，得到了一系列类似物WXKAAAKAAAKXW，其中X＝V、I、F或W，显著提高了抗菌活性、扩大了抗菌谱(Amino Acids.2016Feb；48(2):403-17.；Int J Mol Sci.2019Mar 20；20(6))。以上关于抗菌肽类似物的研究虽然收效显著，但仍然存在因序列长、设计复杂而造成制造成本高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一类设计简单、制造成本低、抗菌活性强、低溶血毒性和低耐药发生性的对称短序列抗菌肽类似物。
本发明的另一目的是提供上述对称短序列抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一、一类对称短序列抗菌肽类似物的结构设计
本发明涉及的一类对称短序列抗菌肽类似物，是以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，在其两侧分别引入正电荷氨基酸Y和疏水性氨基酸X，然后进行C末端酰胺化得到，其结构通式为：
XYWWWYX-NH2，标记为XYW；
或XWYWWWYWX-NH2，标记为XWYW；
或XYYWWWYYX-NH2，标记为XYYW；
其中X＝G、I、L、F、W、V、A；Y＝R。
具体地，本发明所述的一类对称短序列抗菌肽类似物，其结构式如下：
X-Y-Trp-Trp-Trp-Y-X-NH2，标记为XYW；
X-Trp-Y-Trp-Trp-Trp-Y-Trp-X-NH2，标记为XWYW；
X-Y-Y-Trp-Trp-Trp-Y-Y-X-NH2，标记为XYYW；
其中，X＝Gly，Leu，Ile，Phe，Trp，Val，Ala，Y＝Arg；
作为本发明技术方案的优选，上述抗菌肽类似物包括WRW，GWRW，IWRW，AWRW，VWRW，LRRW和FRRW，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示。
上述对称短序列抗菌肽类似物均采用经典固相合成法制备得到。
二、一类对称短序列抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用
1、体外抗菌实验
采用微量二倍稀释法测定上述对称短序列抗菌肽类似物对实验菌株的最低抑菌浓度(MIC)，评估其抗菌活性。所选用的实验菌株包括：革兰氏阴性菌(E.coli ATCC 25922，P.aeruginos ATCC 27853，A.baumannii ATCC 19606)，革兰氏阳性菌(S.aureus ATCC25923，S.epidermidis ATCC 12228,B.subtilis ATCC 23857)。具体实验方法为：用MH肉汤培养基将生长至对数中期的实验细菌稀释成1×106CFU/mL的细菌悬浮液；将抗菌肽类似物溶解于无菌水，经二倍稀释法用培养基配制成一系列不同浓度的抗菌肽类似物溶液，再将其与等体积细菌悬浮液混合，加于96孔培养板中37℃孵育18-24h观察，无明显细菌生长的最小浓度即为抗菌肽类似物的最低抑菌浓度(MIC)。上述实验以抗生素Gentamicin作阳性对照平行重复三次，结果如表1。
表1本发明抗菌肽类似物对抗标准菌株的最低抑菌浓度
表1结果表明，本发明对称短序列抗菌肽类似物对常见实验菌株均具有较强的抗菌活性。
2、溶血实验
取健康的新鲜小鼠血液，1000g离心10min(4℃)，弃去上层血清，用PBS(10mM，pH7.4)清洗下层血细胞后，将其配制成含有8％血细胞的悬浮液，加于96孔板中；将抗菌肽类似物溶解于PBS中，用二倍稀释法配制成256-2μmol/L不同浓度的肽溶液，将其等体积加于已加入血细胞悬浮液的96孔板中，37℃孵育1h；共孵物1200g离心15min后，将上清液转移至新的96孔板，酶标仪检测其490nm处的吸光值；PBS空白溶液作阴性对照，1％TritonX-100作阳性对照，根据公式：Hemolysis rate(％)＝[(OD490nm peptides-OD490nm negative control)/(OD490nm positive control-OD490nm negative control)]×100％，计算溶血率，结果如图8。
图8结果表明，本发明对称短序列抗菌肽类似物具有低的溶血毒性，除了抗菌肽类似物IWRW、AWRW和VWRW在较高检测浓度表现出溶血毒性，但其溶血发生浓度远大于发挥抗菌活性的有效浓度；其他类似物均无明显的溶血毒性，甚至在最高检测浓度，其溶血率均低于10％。
3、诱导细菌耐药实验
选取最佳抗菌肽类似物，采用E.coli ATCC 25922、A.baumannii ATCC19606细菌菌株，与上述抑菌实验方法相似，测定抗菌肽类似物的最小抑菌浓度MIC，然后将其1/2×MIC组分别再接种于MH培养基中培养至对数期，测定抗菌肽类似物在该菌液中的MIC，以此类推，以相同的方法重复15次，观察最低抑菌浓度MIC值的变化，反应抗菌肽类似物诱导细菌产生耐药特性的能力。抗生素Gentamicin做对照药，结果如图9。
图9结果表明，抗生素对照药Gentamicin容易诱导细菌产生耐药性，而本发明对称短序列抗菌肽类似物不易诱导细菌产生耐药性。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
1、本发明对称短序列抗菌肽类似物是以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，两侧分别引入正电荷氨基酸(R)和疏水性氨基酸(G、I、L、F、W、V、A)，然后进行C末端酰胺化得到。其设计策略新颖，且因序列较短而设计简单、制造成本低。
2、正电荷性和疏水性作为抗菌肽的两大显著特征，是影响其抗菌活性的关键因素。正电荷性能够促进抗菌肽与阴离子性细菌细胞膜发生静电结合，而疏水性则促进其插入细菌细胞膜，引起细胞膜的破损，致使细菌内容物泄露，从而导致细菌死亡。而生理条件下带正电荷的精氨酸，由于其独特的胍基侧链结构(能够促进其与细菌细胞膜表面形成更强的氢键，促进肽与阴离子细菌细胞膜的静电作用)，在抗菌潜力上优于同样正电荷性的赖氨酸；疏水性氨基酸位于序列末端，最大限度地将序列的疏水核心渗透到细菌脂质膜中，同时保留主要序列，而不需要额外的合成修饰，能够提高序列的抗菌活性和稳定性，并且可以限制其毒性。因此，本发明对称短序列抗菌肽类似物对常见菌株具有强的抗菌活性，且表现出低溶血毒性和低耐药发生性，在制备临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明抗菌肽类似物WRW的质谱图；
图2为本发明抗菌肽类似物GWRW的质谱图；
图3为本发明抗菌肽类似物IWRW的质谱图；
图4为本发明抗菌肽类似物AWRW的质谱图；
图5为本发明抗菌肽类似物VWRW的质谱图；
图6为本发明抗菌肽类似物LRRW的质谱图；
图7为本发明抗菌肽类似物FRRW的质谱图；
图8为本发明抗菌肽类似物溶血实验结果图；
图9为本发明抗菌肽类似物诱导耐药结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明一类对称短序列抗菌肽类似物的合成方法及其体外抗菌活性进行详细说明。
实施例1：WRW的合成及其体外抗菌活性与溶血毒性研究
(1)WRW的合成
①树脂的活化及预处理
准确称取0.69g的MBHA树脂(取代值0.44mmol/g)置于合成仪中，经DCM溶液溶胀30min后，茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明树脂正常。
②WRW-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；将Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Trp-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Trp-resin，即Fmoc-WRW-resin；同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-WRW-resin末端Fmoc保护基，得到WRW-resin。
③多肽切割
以TFA、三异丙基硅烷和水体积比9.5:0.25:0.25的混合溶液为切割试剂将IRW-resin进行切割，经冰乙醚和水萃取后，冷冻干燥，得到粗肽冻干粉末。
④多肽纯化
将上述得到的粗肽冻干粉末经RP-HPLC分离纯化，收集流出液，再冷冻干燥，经质谱鉴定得WRW，分子量为1260Da，质谱图见图1，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；其中，RP-HPLC纯化条件：流动相A：0.05％TFA/水；流动相B：0.05％TFA/乙腈；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
(2)WRW的体外抑菌活性研究
将生长至对数期的细菌用MH肉汤培养基稀释成1×10^6CFU/mL的细菌悬浮液；将WRW溶解于无菌水中，经二倍稀释法配成一系列不同浓度的IRW溶液，与上述细菌悬浮液等体积混合，于96孔培养板中37℃孵育18-24h后观察，无明显细菌生长的最小浓度即为WRW的最低抑菌浓度MIC。
结果如表1，WRW对常见细菌菌株具有明显的抗菌活性。
(3)WRW的溶血毒性研究
取健康的新鲜小鼠血液，1000g离心10min(4℃)，弃去上层血清，用PBS(10mM，pH7.4)清洗下层血细胞后，将其配制成含有8％血细胞的悬浮液，加于96孔板中；将WRW溶解于PBS中，用二倍稀释法配制成256-2μmol/L不同浓度的肽溶液，将其等体积加于已加入血细胞悬浮液的96孔板中，37℃孵育1h；共孵物1200g离心15min后，将上清液转移至新的96孔板，酶标仪检测其490nm处的吸光值；PBS空白溶液作阴性对照，1％TritonX-100作阳性对照，根据公式：Hemolysis rate(％)＝[(OD490nm peptides-OD490nm negative control)/(OD490nm positive control-OD490nm negative control)]×100％，计算溶血率。
结果如图8，WRW在检测浓度范围内，无明显的溶血毒性。
实施例2：GWRW的合成及其体外抗菌活性与溶血毒性研究
(1)GWRW的合成
①树脂的活化及预处理
同实施例1。
②GWRW-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；将Fmoc-Gly-OH(267mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Gly-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Gly-OH(267mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Gly-Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Trp-Gly-resin，即Fmoc-GWRW-resin；同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-GWRW-resin末端Fmoc保护基，得到GWRW-resin。
③多肽切割
同实施例1。
④多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得GWRW，分子量为1374Da，质谱图见图2，氨基酸序列如SEQID No.2所示。
(2)GWRW的体外抑菌活性研究
同实施例1。
结果如表1，GWRW对常见细菌菌株具有明显的抗菌活性。
(3)GWRW的溶血毒性研究
同实施例1。
结果如图8，GWRW在检测浓度范围内，无明显的溶血毒性。
实施例3：IWRW的合成及其体外抗菌活性与溶血毒性研究
(1)IWRW的合成
①树脂的活化及预处理
同实施例1。
②IWRW-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；将Fmoc-Ile-OH(399mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，，得到Fmoc-Ile-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Ile-OH(399mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Ile-Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Trp-Ile-resin，即Fmoc-IWRW-resin；同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-IWRW-resin末端Fmoc保护基，得到IWRW-resin。
③多肽切割
同实施例1。
④多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得IWRW，分子量为1486Da，质谱图见图3，氨基酸序列如SEQID No.3所示。
(2)IWRW的体外抑菌活性研究
同实施例1。
结果如表1，IWRW对常见细菌菌株具有明显的抗菌活性。
(3)IWRW的溶血毒性研究
同实施例1。
结果如图8，IWRW在高浓度条件下，表现出明显的溶血毒性。
实施例4：AWRW的合成及其体外抗菌活性与溶血毒性研究
(1)AWRW的合成
①树脂的活化及预处理
同实施例1。
②AWRW-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；将Fmoc-Ala-OH(280mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Ala-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Ala-OH(280mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Ala-Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Trp-Ala-resin，即Fmoc-AWRW-resin；同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-AWRW-resin末端Fmoc保护基，得到AWRW-resin。
③多肽切割
同实施例1。
④多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得AWRW，分子量为1402Da，质谱图见图4，氨基酸序列如SEQID No.4所示。
(2)AWRW的体外抑菌活性研究
同实施例1。
结果如表1，AWRW对常见细菌菌株具有明显的抗菌活性。
(3)AWRW的溶血毒性研究
同实施例1。
结果如图8，AWRW仅在最高浓度表现出明显的溶血毒性。
实施例5：VWRW的合成及其体外抗菌活性与溶血毒性研究
(1)VWRW的合成
①树脂的活化及预处理
同实施例1。
②VWRW-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；将Fmoc-Val-OH(406mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Val-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Val-OH(406mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Val-Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Trp-Val-resin，即Fmoc-VWRW-resin；同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-VWRW-resin末端Fmoc保护基，得到VWRW-resin。
③多肽切割
同实施例1。
④多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得VWRW，分子量为1458Da，质谱图见图5，氨基酸序列如SEQID No.5所示。
(2)VWRW的体外抑菌活性研究
同实施例1。
结果如表1，VWRW对常见细菌菌株具有明显的抗菌活性，其中，对革兰氏阳性菌的抗菌活性优于对革兰氏阴性菌。
(3)VWRW的溶血毒性研究
同实施例1。
结果如图8，VWRW在高浓度条件下，表现出明显的溶血毒性。
实施例6：LRRW的合成及其体外抗菌活性与溶血毒性研究
(1)LRRW的合成
①树脂的活化及预处理
同实施例1。
②LRRW-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；将Fmoc-Leu-OH(399mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Leu-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Leu-OH(399mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Leu-Arg-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Arg-Leu-resin，即Fmoc-IRRW-resin；同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-LRRW-resin末端Fmoc保护基，得到LRRW-resin。
③多肽切割
同实施例1。
④多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得LRRW，分子量为1426Da，质谱图见图6，氨基酸序列如SEQID No.6所示。
(2)LRRW的体外抑菌活性研究
同实施例1。
结果如表1，LRRW对常见细菌菌株具有明显抗菌活性。
(3)LRRW的溶血毒性研究
同实施例1。
结果如图8，LRRW在检测浓度范围内，无明显的溶血毒性。
实施例7：FRRW的合成及其体外抗菌活性与溶血毒性研究
(1)FRRW的合成
①树脂的活化及预处理
同实施例1。
②FRRW-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；将Fmoc-Phe-OH(464mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Phe-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(390mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(585mg)、Fmoc-Phe-OH(464mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Phe-Arg-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Arg-Phe-resin，即Fmoc-FRRW-resin；同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-FRRW-resin末端Fmoc保护基，得到FRRW-resin。
③多肽切割
同实施例1。
④多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得FRRW，分子量为1494Da，质谱图见图7，氨基酸序列如SEQID No.7所示。
(2)FRRW的体外抑菌活性研究
同实施例1。
结果如表1，FRRW对常见细菌菌株具有明显的抗菌活性。
(3)FRRW的溶血毒性研究
同实施例1。
结果如图8，FRRW在检测浓度范围内，无明显的溶血毒性。
序列表
<110> 倪京满，王锐
<120> 一类对称短序列抗菌肽类似物及其应用
<160> 7
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Arg Trp Trp Trp Arg Trp
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Trp Arg Trp Trp Trp Arg Trp Gly
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Trp Arg Trp Trp Trp Arg Trp Ile
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Trp Arg Trp Trp Trp Arg Trp Ala
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Val Arg Arg Trp Trp Trp Arg Arg Val
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Leu Arg Arg Trp Trp Trp Arg Arg Leu
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Phe Arg Arg Trp Trp Trp Arg Arg Phe
1 5
Claims (3)
1.一类对称短序列抗菌肽类似物，其特征是，所述抗菌肽类似物是以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，在其两侧分别引入正电荷氨基酸Y和疏水性氨基酸X，然后进行C末端酰胺化得到，其结构通式为：
XYWWWYX-NH2，标记为XYW；
或XWYWWWYWX-NH2，标记为XWYW；
或XYYWWWYYX-NH2，标记为XYYW；
其中X＝G、I、L、F、W、V、A；Y＝R。
2.如权利要求1所述的一类对称短序列抗菌肽类似物，其特征是，所述抗菌肽类似物包括WRW，GWRW，IWRW，AWRW，VWRW，LRRW和FRRW，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.7所示。
3.如权利要求1或2所述的一类对称短序列抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
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