CN113185577B - 具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽及其应用 - Google Patents

具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽及其应用。该低毒广谱抗菌肽是将抗菌肽L1GA5K的肽链重新进行电荷排列和/或带电氨基酸修饰得到。抗菌活性实验表明，本发明合成的抗菌肽具有广谱抗菌活性，能够有效对抗革兰阴性菌和革兰阳性菌，其中K‑1的活性强于L1GA5K。溶血活性和细胞毒性实验表明，电荷聚集于肽链N端的K‑1和K‑2的毒性均低于电荷分散的L1GA5K和K‑R。另外，酶解稳定性实验结果表明，K‑1在糜蛋白酶中的稳定性与L1GA5K相比基本不变，但在胰蛋白酶中，K‑1的稳定性比L1GA5K提高了10倍。诱导耐药实验表明，本发明的抗菌肽均具有低耐药发生性特点。因此，本发明的抗菌肽在制备临床抗菌药物方面具有很好的应用前景。

Description

具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽及 其应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一组具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，本发明同时还涉及该抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
背景技术
随着抗生素的广泛使用甚至滥用，耐药菌的增加和传播是目前世界上最为紧迫的公共卫生威胁之一，而新的抗菌药物的发现和开发速度正在放缓，特别是在抗生素领域。因此，确定和设计具有新型作用模式的抗菌药物，以有效地消除耐药细菌感染是当务之急(Journal of Medicinal Chemistry.2017,Vol.60(No.6):2257-2270)。抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)是天然存在的生物分子，其分布遍及各种生物的先天免疫系统。由于AMPs具有多种作用方式，且难以产生耐药性，因此被认为是治疗细菌感染的抗生素候选药物(ACS Infectious Diseases.2020,Vol.6(No.6):1413-1426.)。它们存在于大多数生物体内，如单细胞微生物、昆虫、蛛形纲动物、植物、两栖动物和哺乳动物等(European Journal of Pharmaceutical Sciences.2019:104952.)。关于AMPs的作用机制，通常认为是带正电荷的AMPs与细菌细胞膜结合，而细菌细胞膜由带负电荷的脂质组成，导致细胞膜渗透。另外，大量的研究结果表明，AMPs还具有细胞内靶标。在这种情况下，诱导细胞死亡的机制还可能涉及与DNA/RNA的相互作用，从而对蛋白质的合成和细胞内酶的活性产生负面影响，或抑制细胞壁/膜的形成(Applied Microbiology&Biotechnology.2019,Vol.103(No.16):6593-6604.)。
尽管抗菌肽具有明显的作为新型抗菌药物的潜力，但在进一步开发AMPs作为抗菌药物之前，必须解决AMPs的系统毒性、体内稳定性和生产成本等问题(ActaBiomaterialia.2014,Vol.10(No.1):244-257.)，而降低疏水性、多肽杂合、联合用药、截短肽链、调整电荷、降低α-螺旋含量等都是降低多肽毒性常用的方法和手段。如Yinfeng Lyu等人通过截短多肽PMAP-36设计了一系列修饰的PMAP-36类似物，得到具有良好抗菌活性和低毒性的类似物RI18(Scientific Reports.2016:27258)；ChangxuanShao等人在阳离子α-螺旋肽中心位置插入β-转角结构(特别是D-Pro-Gly)显著提高了合成的多肽类似物的细胞选择性(Acta Biomaterialia.2018:243-255)；T Wieprecht等人设计和合成了一系列疏水性不同的magainin 2类似物，该类似物抗菌活性和细胞毒性随着疏水性的增强而增强，表明疏水性是控制多肽类似物活性和毒性的重要参数(Biochemistry.1997)；Yang Yang等人通过将多肽cecropin A(1-8)与其他多肽杂合的方式降低其毒性(International Journalof Molecular Sciences.2020,Vol.21(No.4):1470.)。除此之外，有研究表明，电荷的排列以及带电氨基酸的种类对多肽毒性也会有明显的影响。如Tracy A Stone等人研究了多肽6K-F17不同的电荷排列模式，结果显示，电荷聚集在肽链N端比电荷自然分散于整个肽链具有更低的毒性和更高的酶解稳定性，但其抗菌活性只对部分微生物有效，抗菌谱较窄，不利于其在制备临床抗菌药物中的应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一组具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽。
本发明的目的之二是提供上述抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
(一)具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽的设计
本发明一组具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，是将抗菌肽L1GA5K的肽链重新进行电荷排列和/或不同带电氨基酸修饰得到，记为K-X；
所述抗菌肽L1GA5K的氨基酸序列如下：
Gly-Asn-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Ala-Val-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-NH2；
所述电荷排列是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸全部聚集在N端、或全部聚集在肽链中间、或全部聚集在C端、或在N端和C端对称排列、或均匀分散；
所述不同带电氨基酸修饰是利用精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)或鸟氨酸(Orn)或2,4-二氨基丁酸(Dab)或2,3-二氨基丙酸(Dap)或高精氨酸(Har)替换L1GA5K肽链中的所有赖氨酸(Lys，K)。
作为本发明的一个优选技术方案，所述低毒广谱抗菌肽由精氨酸(Arg，R)替换L1GA5K肽链中的所有赖氨酸(Lys，K)得到，记为K-R，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸全部聚集于N端得到，记为K-1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸全部聚集于肽链中间得到，记为K-M，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸全部聚集于C端得到，记为K-C，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸在N端和C端对称排列得到，记为K-S，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸在肽链中均匀分散得到，记为K-B，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
所述低毒广谱抗菌肽是由精氨酸(Arg，R)替换L1GA5K肽链中的所有赖氨酸(Lys，K)，并将肽链中的带电氨基酸全部聚集于N端得到，也就是将K-R肽链中的带电氨基酸全部聚集于N端得到，记为K-2，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
(二)具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽的合成
本发明具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，是以Rink-MBHA Resin为原料，采用经典的多肽Fmoc固相合成方法合成的。在多肽合成过程中以HOBt/HBTU为缩合剂进行氨基酸耦合，采用茚三酮显色法检定二级胺，按照多肽序列依次耦合即得连有MBHA树脂的多肽，多肽切割及HPLC纯化后得到所述电荷聚集型抗菌肽。
其中，图1为抗菌肽L1GA5K的质谱图。L1GA5K的分子量理论计算结果为1508，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
(三)具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽的应用
1、体外抑菌实验
采用经典的微量连续二倍稀释法测定抗菌肽对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。以抗生素Gentamicin、Rifampin、Vancomycin、Penicillin、Polymyxin B作为阳性对照，结果见表1。
表1本发明抗菌肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度
Figure SMS_1
表1结果显示，母肽L1GA5K及本发明抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较强抑制作用，表现为广谱抗菌活性。另外，电荷聚集于肽链N端的抗菌肽K-1和K-2并没有丧失其活性，分别保留了L1GA5K和K-R的绝大部分抗菌活性，且K-1的整体抗菌活性甚至略强于L1GA5K，表明电荷聚集于肽链N端的方式不会导致多肽的抗菌活性丧失，还能保留其抗菌活性。
2、溶血活性实验
为了考察本发明合成的抗菌肽对正常哺乳动物细胞的毒性，我们测定了母肽L1GA5K及抗菌肽代表K-R、K-1、K-2与小鼠红细胞孵育1h后的溶血情况，结果见图9。
图9结果显示，L1GA5K和K-1均没有表现出溶血活性，即使在最高测试浓度256μM时，其溶血活性仍可忽略不计。而K-R和K-2均表现出明显的溶血活性，导致10％溶血的浓度均在128μM左右，表明精氨酸与赖氨酸相比具有更高的溶血倾向。值得一提的是，K-2的溶血活性相比K-R来说有明显的降低，说明电荷聚集于肽链N端的抗菌肽毒性更低，用药更安全。
3、细胞毒性实验
由于多肽抗菌药物通常对肾脏具有较大的毒性，为了进一步考察本发明合成的抗菌肽对正常肾细胞的毒性，我们测定了母肽L1GA5K及抗菌肽代表K-R、K-1、K-2分别与肾小球系膜细胞(见图10)和人肾皮质近曲小管上皮细胞(见图11)孵育1h后的细胞毒性。
图9和图10结果显示，电荷聚集在肽链N端的K-1即使在最高测试浓度128μM仍然表现出很低的细胞毒性，与母肽L1GA5K具有更高的安全性；电荷聚集在肽链N端的K-12的毒性同样具有较低细胞毒性，且与K-6相比，K-12的细胞毒性显著降低。因此，电荷聚集在肽链N端的K-1和K-12与其对应的L1GA5K和K-R相比，均表现出明显的毒性降低的趋势，说明电荷聚集可降低多肽毒性，电荷聚集于肽链N端的抗菌肽毒性更低，用药更安全。
4、酶解稳定性实验
多肽药物稳定性差，容易被各种蛋白酶水解是阻碍多肽抗生素临床应用的一个重要因素。为了研究不同电荷排列模式和不同种类带电氨基酸对抗菌肽酶解稳定性的影响，我们测定了母肽L1GA5K及抗菌肽代表K-R、K-1、K-2分别与糜蛋白酶(见图12)和胰蛋白酶(见图13)1:1孵育1h后对大肠杆菌E.coli ATCC 25922的抑制活性。
糜蛋白酶一般攻击多肽中的疏水性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸等；而胰蛋白酶容易攻击多肽中的带电氨基酸，如赖氨酸、精氨酸等。如图12所示，新型抗菌肽在糜蛋白酶中的稳定性与母肽L1GA5K相比没有明显变化。这是因为新型抗菌肽只改变了母肽L1GA5K中带电氨基酸的排列和种类，其疏水性氨基酸并没有改变，因此其稳定性变化不大。而在胰蛋白酶中则变化明显，如图13所示，K-1较母肽L1GA5K稳定性提高10倍，提示电荷聚集于肽链N端可能会提高酶解稳定性。但是，K-R和K-2的稳定性相比母肽不升反降，且K-2比K-R的稳定性更差。这可能与其序列中的带电氨基酸是精氨酸有关，精氨酸具有比赖氨酸更高的与膜结合的能力，而且其带正电荷数实际上略高于赖氨酸，可能更容易被蛋白酶识别和攻击。
5、诱导耐药实验
抗菌肽与传统抗生素相比，最突出的优势是难以产生耐药性。由于其膜溶解作用机制，细菌很难改变细胞膜成分从而产生耐药。因此，为了研究本发明抗菌肽是否具有不易产生耐药性的特质，我们测定了母肽L1GA5K及抗菌肽代表K-R、K-1、K-2对大肠杆菌E.coliATCC 25922连续作用12天的抗菌活性(见图14)。
一般而言，MIC在1-4倍范围内波动属于正常情况，若MIC大于4倍，表明抗生素已产生耐药。如图10所示，传统抗生素庆大霉素在连续作用第5天时就已产生耐药，在连续作用12天后，MIC已提高了32倍。而母肽L1GA5K及抗菌肽K-R、K-1、K-2，还有多肽抗生素polymyxinB均没有产生耐药性，说明多肽抗菌药物相比传统抗生素，在耐药性方面有明显的优势。
本发明在电荷数目确定不变的前提下，系统的研究了电荷的排列模式和带电氨基酸种类对抗菌肽L1GA5K活性和毒性的影响，得到了一系列新型的不同电荷排列模式及不同电荷种类修饰的的抗菌肽。其相较于现有技术的有益效果为：
本发明的抗菌肽K-X是在母肽L1GA5K的基础上进行不同电荷排列和/或不同带电氨基酸修饰得到的，其体外抗菌实验、溶血活性实验、细胞毒性实验和诱导耐药实验表明，抗菌肽K-X具有广谱抗菌活性，毒性低，且无诱导耐药性。酶解稳定性实验表明，抗菌肽K-X具有明显优于抗生素的抗蛋白酶水解稳定性。因此，本发明的抗菌肽在制备临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为母肽L1GA5K的质谱图；
图2为本发明抗菌肽K-R的质谱图；
图3为本发明抗菌肽K-1的质谱图；
图4为本发明抗菌肽K-2的质谱图；
图5为本发明抗菌肽K-M的质谱图；
图6为本发明抗菌肽K-C的质谱图；
图7为本发明抗菌肽K-S的质谱图；
图8为本发明抗菌肽K-B的质谱图；
图9为本发明抗菌肽与小鼠红细胞孵育1h后对红细胞的溶血活性结果；
图10为本发明抗菌肽与肾小球系膜细胞(GMC)孵育1h后的细胞毒性；
图11为本发明抗菌肽与人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)孵育1h后的细胞毒性；
图12为本发明抗菌肽与糜蛋白酶1:1孵育1h后对大肠杆菌E.coli ATCC 25922的抑制活性；
图13为本发明抗菌肽与胰蛋白酶1:1孵育1h后对大肠杆菌E.coli ATCC 25922的抑制活性；
图14为本发明抗菌肽对大肠杆菌E.coli ATCC 25922连续作用12天的抗菌活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽的合成作进一步说明。
实施例1：抗菌肽K-R的合成
(1)树脂的活化
称取0.47g的MBHA树脂(0.43mmol/g)，放入固相合成仪底部，加入DCM溶胀30min，抽干，DMF洗涤3遍，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂无色表明可正常使用。
(2)Fmoc-K-1-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液将上述溶胀后的树脂洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若呈深蓝紫色表明Fmoc保护基团已脱去。将3倍过量的Leu、HOBt、HBTU和6倍过量的DIEA经DMF溶解加入到合成仪中，在氩气保护下室温搅拌1h，反应到时间后，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈无色透明表明Leu缩合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA。
按照上述方法依次缩合Ile、Arg、Arg、Ala、Val、Ala、Leu、Leu、Arg、Arg、Leu、Asn、Gly，得到Fmoc-Gly-Asn-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Val-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-MBHA。
(3)多肽切割
将上述所得Fmoc-Gly-Asn-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Val-Ala-Arg-Arg-Ile-Leu-MBHA用含有20％哌啶的DMF溶液洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈深蓝紫色，表明Fmoc保护基团已脱去。树脂经DCM、甲醇交替洗涤3遍后，用真空泵抽1h。待树脂被抽干成干燥颗粒后，加入10mL切割试剂(TFA:Tris:水＝9.5:0.25:0.25(v:v:v))反应3h，每20min慢速搅拌一次。反应到时间后，收集切割试剂，并经乙醚萃取后冷冻干燥。
(4)多肽纯化
用RP-HPLC对上述冷冻干燥后的多肽进行纯化。RP-HPLC纯化条件为流动相A：0.05％TFA/水，流动相B：0.05％TFA/乙腈，采用线性梯度洗脱，收集目标峰流出液，冻干，得到抗菌肽K-R，其质谱图如图2所示。
K-R的分子量理论计算结果为1620，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
实施例2：抗菌肽K-1的合成
(1)树脂的活化
同实施例1。
(2)Fmoc-K-1-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液将上述溶胀后的树脂洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若呈深蓝紫色表明Fmoc保护基团已脱去。将3倍过量的Leu、HOBt、HBTU和6倍过量的DIEA经DMF溶解加入到合成仪中，在氩气保护下室温搅拌1h，反应到时间后，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈无色透明表明Leu缩合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA。
按照上述方法依次缩合Ile、Ala、Val、Ala、Leu、Leu、Leu、Asn、Gly、Lys、Lys、Lys、Lys，得到Fmoc-Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Asn-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Ala-Ile-Leu-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽K-1。其质谱图如图3所示。
K-1的分子量理论计算结果为1508，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
实施例3：抗菌肽K-2的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-K-2-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液将上述溶胀后的树脂洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若呈深蓝紫色表明Fmoc保护基团已脱去。将3倍过量的Leu、HOBt、HBTU和6倍过量的DIEA经DMF溶解加入到合成仪中，在氩气保护下室温搅拌1h，反应到时间后，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈无色透明表明Leu缩合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA。
按照上述方法依次缩合Ile、Ala、Val、Ala、Leu、Leu、Leu、Asn、Gly、Arg、Arg、Arg、Arg，得到Fmoc-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Asn-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Ala-Ile-Leu-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽K-2。其质谱图如图4所示。
K-2的分子量理论计算结果为1620，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
实施例4：抗菌肽K-M的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-K-M-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液将上述溶胀后的树脂洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若呈深蓝紫色表明Fmoc保护基团已脱去。将3倍过量的Leu、HOBt、HBTU和6倍过量的DIEA经DMF溶解加入到合成仪中，在氩气保护下室温搅拌1h，反应到时间后，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈无色透明表明Leu缩合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA。
按照上述方法依次缩合Ile、Ala、Val、Ala、Lys、Lys、Lys、Lys、Leu、Leu、Leu、Asn、Gly，得到Fmoc-Gly-Asn-Leu-Leu-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Val-Ala-Ile-Leu-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽K-M。其质谱图如图5所示。
K-M的分子量理论计算结果为1508，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
实施例5：抗菌肽K-C的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-K-C-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液将上述溶胀后的树脂洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若呈深蓝紫色表明Fmoc保护基团已脱去。将3倍过量的Lys、HOBt、HBTU和6倍过量的DIEA经DMF溶解加入到合成仪中，在氩气保护下室温搅拌1h，反应到时间后，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈无色透明表明Lys缩合成功，得到Fmoc-Lys-MBHA。
按照上述方法依次缩合Lys、Lys、Lys、Leu、Ile、Ala、Val、Ala、Leu、Leu、Leu、Asn、Gly，得到Fmoc-Gly-Asn-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Ala-Ile-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽K-C。其质谱图如图6所示。
K-C的分子量理论计算结果为1508，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
实施例6：抗菌肽K-S的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-K-S-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液将上述溶胀后的树脂洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若呈深蓝紫色表明Fmoc保护基团已脱去。将3倍过量的Lys、HOBt、HBTU和6倍过量的DIEA经DMF溶解加入到合成仪中，在氩气保护下室温搅拌1h，反应到时间后，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈无色透明表明Lys缩合成功，得到Fmoc-Lys-MBHA。
按照上述方法依次缩合Lys、Leu、Ile、Ala、Val、Ala、Leu、Leu、Leu、Asn、Gly、Lys、Lys，得到Fmoc-Lys-Lys-Gly-Asn-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Ala-Ile-Leu-Lys-Lys-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽K-S。其质谱图如图7所示。
K-S的分子量理论计算结果为1508，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
实施例7：抗菌肽K-B的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-K-B-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液将上述溶胀后的树脂洗涤3遍，抽干，DMF洗涤3遍后，抽干，用茚三酮显色法鉴定树脂，若呈深蓝紫色表明Fmoc保护基团已脱去。将3倍过量的Leu、HOBt、HBTU和6倍过量的DIEA经DMF溶解加入到合成仪中，在氩气保护下室温搅拌1h，反应到时间后，茚三酮显色法鉴定树脂，若树脂呈无色透明表明Leu缩合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA。
按照上述方法依次缩合Ile、Lys、Ala、Val、Lys、Ala、Leu、Lys、Leu、Leu、Lys、Asn、Gly，得到Fmoc-Gly-Asn-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Ala-Lys-Val-Ala-Lys-Ile-Leu-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽K-B。其质谱图如图8所示。
K-B的分子量理论计算结果为1508，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌肽结构正确。
序列表
<110> 倪京满
<120> 具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Asn Leu Arg Arg Leu Leu Ala Val Ala Arg Arg Ile Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Lys Lys Lys Gly Asn Leu Leu Leu Ala Val Ala Ile Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Asn Leu Leu Leu Lys Lys Lys Lys Ala Val Ala Ile Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Asn Leu Leu Leu Ala Val Ala Ile Leu Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Lys Gly Asn Leu Leu Leu Ala Val Ala Ile Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Asn Lys Leu Leu Lys Leu Ala Lys Val Ala Lys Ile Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Arg Arg Arg Gly Asn Leu Leu Leu Ala Val Ala Ile Leu
1 5 10

Claims (8)

1.具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述低毒广谱抗菌肽是由精氨酸替换L1GA5K肽链中的所有赖氨酸得到，记为K-R，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸全部聚集于N端得到，记为K-1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸全部聚集于肽链中间得到，记为K-M，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸全部聚集于C端得到，记为K-C，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸在N端和C端对称排列得到，记为K-S，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
6.具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述低毒广谱抗菌肽是将L1GA5K肽链中的带电氨基酸在肽链中均匀分散得到，记为K-B，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
7.具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述低毒广谱抗菌肽是将K-R肽链中的带电氨基酸全部聚集于N端得到，记为K-2，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
8.如权利要求1-7任一项所述的具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
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