CN115960261A

CN115960261A - 色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115960261A
Application number: CN202211245843.9A
Authority: CN
Inventors: 邵长轩; 关红蕊; 王袁梦雪; 康靖童; 单安山
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-10-12
Filing date: 2022-10-12
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-10-12
Also published as: CN115960261B

Abstract

本发明公开一种色氨酸和苯丙氨酸跨链交互作用β‑发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用。抗菌肽WFL的序列如SEQ ID No.1所示，本发明以PG为转角单元，通过色氨酸和苯丙氨酸形成的对跨链之间的相互作用，稳定β‑发夹结构，得到多肽模板XWRYRPGRWRYX‑NH₂，X为疏水性氨基酸，Y为苯丙氨酸，当X＝L,Y＝F时，抗菌肽的命名为WFL。并公开了抗菌肽WFL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中应用。本发明在取代二硫键的前提下，既保持较好的稳定性，又降低抗菌肽的毒性，在检测范围内没有发现溶血现象，治疗指数高达155.62。综上所述，抗菌肽WFL具有较高的应用价值。

Description

色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用。

技术背景

抗生素的广泛使用以及抗生素向食物链中的渗透，增大了细菌病原体对人们的威胁。由于自然进化，细菌病原体几乎对所有抗生素都产生耐药性，细菌中抗生素耐药性的迅速上升对医学和公共卫生构成严重的威胁。毫无疑问，迫切需要新型有效的抗生素替代物来对抗加速自然进化的细菌病原体。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)广泛存在动植物体内，是抵抗细菌病原体入侵防御系统的重要组成部分。抗菌肽是具有阳离子性和两亲性的短肽，其特点是具有广泛的抗菌活性，其作用机制与传统抗生素不同，它可以选择性的破坏细菌细胞膜，这是由于它本身的膜分解作用机制，使细菌产生低耐药性。因此，抗菌肽具有成为新一代抗菌药物的潜力。

抗菌肽作为一种新型抗菌物质，它们的结构和功能之间的关系仍然没有十分清楚，特别是缺乏设计新型抗菌肽的固定模板。已知抗菌肽主要的二级结构包括α-螺旋和β-折叠。目前对α-螺旋抗菌肽的研究十分广泛，但有研究表明，与具有相同疏水性和电荷数的α-螺旋肽对应物相比，β-折叠肽已被证明对细菌具有更高的选择性，同时保留了相似的抗菌活性。β-发卡肽是β-折叠肽的简化模式，通常通过二硫键来维持其稳定性，但二硫键的缺点在于它会通过与游离硫醇基团反应在体内裂解，同时二硫键具有许多旋转自由度，在没有其他稳定剂相互作用的情况下，会使其难以稳定离散的发夹构象。此外，二硫键合成复杂、成本较高、毒性较大，高毒性和不良抗菌活性是药物开发的主要问题。因此，在设计抗菌肽时，最大程度地提高抗菌活性的同时使抗菌肽的细胞毒性最小化是当前急需解决的问题。另外，溶血活性也是评估抗菌肽安全性的重要指标，特别在含有疏水性氨基酸以及苯丙氨酸时，高浓度下极易引起溶血，这也成为了目前抗菌肽发展的一大阻碍。

发明内容

基于以上不足，本发明提供了一种关于色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-抗菌肽WFL，解决了抗菌肽毒性大、溶血高的问题。

本发明所采用的技术如下：一种色氨酸和苯丙氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WFL，所述抗菌肽WFL以PG为转角单元，通过色氨酸和苯丙氨酸之间的跨链交互作用来维持抗菌肽的稳定，所述抗菌肽WFL的C端采用-NH₂酰胺化，所述抗菌肽WFL的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明的另一目的是提供一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WKFPG的制备方法，以β-发卡侧链的排布原则，以色氨酸和赖氨酸的交互作用作为辅助PG转角单元形成发卡结构的力，得到含色氨酸精氨酸跨链交互作用的多肽模板XWYKYPGXWYKY-NH₂，当X＝R，Y＝F时，得到该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，采用固相化学合成法合成该多肽，对该多肽进行抑菌活性检测、细胞毒性检测以及溶血活性检测，最后命名为抗菌肽WFL。

本发明的另一个目的在于提供如上所述的一种色氨酸和苯丙氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WFL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中应用。

本发明的原理如下：当色氨酸与另一个大小和芳香度不同的芳香环相互作用时，其边对面和面对边相互作用是不同的，而对于色氨酸-苯丙氨酸对，面对边方向最稳定，因此，在本发明中，通过色氨酸和苯丙氨酸形成的对跨链之间的相互作用，也可以极大的稳定β-发夹结构，取代传统二硫键，毒性较小。

本发明具有以下优点和有益效果：本发明的抗菌肽序列长度短，造价低，对抗菌肽进行抑菌活性检测、毒性检测以及溶血活性检测，发现抗菌肽WFL对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等具有较高的抑制作用。本发明通过色氨酸和苯丙氨酸跨链交互作用稳定抗菌肽结构，取代传统二硫键，毒性较小，在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到85％以上。在检测范围内没有发现溶血现象，治疗指数高达155.62。综上所述，抗菌肽WFL具有较高的应用价值。

附图说明

图1为抗菌肽WFL的高效液相色谱图；

图2为抗菌肽WFL的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

多肽WFL的设计

抗菌肽WFL的氨基酸序列如下：

通过色氨酸和苯丙氨酸形成的对跨链之间的相互作用，也可以极大的稳定β-发夹结构，以PG为转角单元，得到抗菌肽模板XWRYRPGRWRYX-NH₂，X为疏水性氨基酸，Y为苯丙氨酸，当X＝L,Y＝F时，多肽的命名为WFL。多肽的序列如表1所示。

表1多肽的氨基酸序列

其分子式如式(Ⅰ)所示：

多肽WFL的序列长度为12，以PG为转角单元，含有4个精氨酸，将肽的C端酰胺化以提高一个正电荷，总电荷数为+5。该方法设计的抗菌肽最大程度地提高抗菌活性的同时使抗菌肽的细胞毒性最小化，同时具有较低的溶血活性。

实施例2

1.多肽通过合成仪器从C端到N端逐一合成。第一步是把Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端的第一个氨基酸)接入Wang树脂，接下来脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；然后将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)，依照这个过程从C端到N端，直至合成结束，获得脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2.在上述得到的多肽树脂中，添加切割剂，在20℃条件下避光反应2h，过滤，使用FA(三氟乙酸)洗涤沉淀，将上述滤液与洗液混合均匀，使用旋转蒸发仪进行浓缩，然后加入10倍体积的预先冷却的无水乙醚，-20℃条件下沉淀3h，析出白色粉末，在2500g离心10min，然后收集沉淀，再用无水乙醚冲洗沉淀，在真空条件下干燥，最终得到多肽。其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3.使用0.2mol/L硫酸钠(使用磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，多肽使用90％的乙腈水溶液进行溶解，过滤，C18反相常压柱，进行梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，然后收集主峰，进行冻干。

4.多肽的鉴定：使用电喷雾质谱法对得到的多肽进行分析，质谱图(见附图1)中得到的分子量与表1中的理论分子量基本一致，且多肽的纯度大于95％(见附图2)。

实施例3

抗菌肽WFL的生物活性测定

1.抑菌活性测定

在37℃，220g摇床条件下，将细菌在阳离子调节的MHB肉汤培养基中培养至对数生长期，并稀释至OD_600nm＝0.4(3×10⁸-9×10⁸CFU mL^-1)。使用前将细菌溶液稀释1000倍。等体积(50μL)的细菌悬液和含有不同浓度两亲物(0.25×10^-6-128×10^-6M)的牛血清白蛋白溶液(BSA，0.2％；乙酸，0.01％)加入圆底透明的聚丙烯96孔板中。含有细菌的MHB培养基用作阳性对照，未接种细菌的MHB用作阴性对照。将96孔板在37℃恒温培养箱孵育18-24h。最低抑菌浓度是用肉眼和酶标仪OD₄₉₂ _nm的光密度下观察不到细菌生长的最小多肽浓度。每项测定在三个独立平行，每个平行两次重复。检测结果见表2。

表2抗菌肽WFL的抑菌活性(uM)

通过表2可以看出抗菌肽WFL对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性。

2.细胞毒性测定：

(1)细胞悬液的准备：将冻存于液氮中的猪小肠上皮细胞IPEC-J2进行复苏，然后转移至5mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃条件下恒温培养。当细胞铺满25cm²培养瓶底约70％时说明细胞进入到快速生长期，进行传代。用无菌PBS润洗细胞两次，加入0.25％胰蛋白酶2mL对细胞进行消化。同时，在消化期间对细胞形态进行观测，当细胞间隙增大并且大部分变圆时，吸走消化液，加入5mL DMEM培养基(含10％小牛血清)，轻轻吹打，混匀，使其形成单细胞悬液。调整细胞浓度，然后将50μL细胞悬液加入到96孔板每行的第1号至11号孔中，终浓度约为2×10⁴细胞/孔，第12号孔加50μL培养基；

(2)抗菌肽处理：吸取用培养基倍比稀释的抗菌肽50μL加入到96孔板的第1号至10号孔中，在37℃条件下，培养16-18h。第12号孔仅含培养基为阴性对照，第11号孔含有细胞但无抗菌肽为阳性对照，第1至10号孔为测定孔；

(3)结果判断：培养结束后，吸取5mg/mL的MTT 50μL加入到96孔板的每个孔中，37℃下培养4h。然后再加入150μL的DMSO，振荡10min以溶解晶体。用酶标仪测定OD₄₉₂吸光度。

(4)每个试验重复3次以上，根据下面公式来计算细胞存活率：

细胞存活率(100％)＝(OD_测定值/OD_阳性对照)×100％

在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到80％以上。结果见表3。

表3抗菌肽WFL细胞毒性的测定

通过表3可以看出，抗菌肽WFL对猪小肠上皮细胞毒性较小，在检测范围内细胞存活率均达到85％以上。

2.溶血活性测定

(1)采集健康的人血液1mL，保存于肝素钠抗凝管；

(2)在3000g条件下低温离心5-10min，弃除上清，收集红细胞；

(3)用PBS溶液将已收集到的红细胞冲洗3遍，然后再用10倍体积的PBS溶液使红细胞重悬；

(4)在96孔板中的每行第1号孔中都加入80μL PBS溶液，其余孔中加入50μL PBS溶液。将20μL抗菌肽储备液(2.56mM)加入到第1号孔内，充分混匀，然后吸取50μL加入到第2号孔内，充分混匀，依次类推，直到第10号孔，混匀后吸取50μL，弃去；

(5)在96孔板的第1至11号孔中加50μL红细胞悬液，第12号孔加入50μL 0.2％Triton X-100，混匀。这样第11号孔作为阴性对照，而第12号孔为阳性对照；

(6)放入培养箱中37℃孵育1h，然后在3000g条件下离心5-10min；

(7)吸取上清，转入到新的96孔板中，在OD₅₇₀条件下用酶标仪测定吸光度值；

(8)溶血活性依据下面公式进行计算：

溶血率(％)＝[(样品OD₅₇₀-阴性对照OD₅₇₀)/(阳性对照OD₅₇₀-阴性对照OD₅₇₀)]×100％

最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的浓度。结果见表4。

表4抗菌肽溶血活性的测定

通过表4表明抗菌肽WFL在检测范围内并未发现溶血活性。使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值算为治疗指数，治疗指数为155.62。

Claims

1.一种色氨酸和苯丙氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WFL，其特征在于，所述抗菌肽WFL以PG为转角单元，通过色氨酸和苯丙氨酸之间的跨链交互作用来维持抗菌肽的稳定，所述抗菌肽WFL的C端采用-NH₂酰胺化，所述抗菌肽WFL的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种色氨酸和苯丙氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WFL的制备方法，其特征在于，制备方法如下：以β-发卡侧链的排布原则，以色氨酸和赖氨酸的交互作用作为辅助PG转角单元形成发卡结构的力，得到含色氨酸精氨酸跨链交互作用的多模板XWYKYPGXWYKY-NH₂，当X＝R，Y＝F时，得到该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，然后采用固相化学合成法合成该多肽，对该多肽进行抑菌活性检测、细胞毒性检测以及溶血活性检测，最后命名为抗菌肽WFL。

3.根据权利要求1所述的一种色氨酸和苯丙氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WFL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中应用。