CN117924422A - 色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents
色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117924422A CN117924422A CN202311716671.3A CN202311716671A CN117924422A CN 117924422 A CN117924422 A CN 117924422A CN 202311716671 A CN202311716671 A CN 202311716671A CN 117924422 A CN117924422 A CN 117924422A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tryptophan
- antibacterial peptide
- wwl
- hairpin
- beta
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 54
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 title claims abstract description 34
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 claims description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 3
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 claims description 3
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 claims description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 108010045269 tryptophyltryptophan Proteins 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 11
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 abstract description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 4
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 abstract description 3
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 6
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- KQIADDMXRMTWHZ-UHFFFAOYSA-N chloro-tri(propan-2-yl)silane Chemical compound CC(C)[Si](Cl)(C(C)C)C(C)C KQIADDMXRMTWHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000003345 AMP group Chemical group 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009880 aromatic-aromatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002390 cell membrane structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229920006227 ethylene-grafted-maleic anhydride Polymers 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开一种色氨酸和色氨酸跨链交互β‑发卡抗菌肽及制备方法和应用,属于生物工程领域。抗菌肽WWL的序列如SEQ ID No.1所示。制备方法:以PG为转角单元,通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用,稳定β‑发夹结构,得到抗菌肽模板XWRYRPGRWRYX‑NH2,X为疏水性氨基酸,Y为色氨酸,当X=L,Y=W时,抗菌肽的命名为WWL。本发明的抗菌肽在取代二硫键的前提下,既保持较好的稳定性,又降低抗菌肽的毒性,在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到90%以上。在保持较好的抑菌活性前提下,检测范围内没有发现溶血现象,治疗指数高达95.52。综上所述,抗菌肽WWL具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用。
技术背景
近些年来人们对抗生素无节制的滥用导致了很多细菌微生物都产生了耐药性,这使得抗生素的作用效果大大的降低。所以,寻找出一种全新的抗生素替代品已经成为了当前最需要并且也是最急切的问题。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是参与机体免疫防御的第一道屏障,能够帮助机体对抗病原微生物的侵袭。虽然抗菌肽的抗菌机制还有待进一步阐明,但大多数抗菌肽通过直接作用于细菌细胞膜发挥抗菌作用,这与传统抗生素主要作用于细菌细胞的靶点不同。抗菌肽特异的膜裂解机制不易诱发耐药性,因为突变细菌细胞膜结构非常困难,而抗菌肽的多靶点作用是对抗耐药性的另一个重要武器。因此,抗菌肽被认为是最有前途的候选抗生素。
抗菌肽二级结构主要包含α-螺旋肽和β-折叠肽。α-螺旋折叠抗菌肽通常通过阳离子和疏水氨基酸进行修饰,以形成完美的两亲螺旋结构。然而,最近的研究表明,α-螺旋完美的两亲性常常导致杀菌活性和细胞毒性同时增加。β-发卡是最简单的反平行双链肽,由两条平行链和一个β-转角组成。一些研究表明,与具有相等电荷和疏水性的α-螺旋肽相比,β-折叠肽具有更高的选择性。许多天然的β-发卡抗菌肽通过半硫氨酸残基形成二硫键从而稳定其结构,但由于二硫键的固相合成比较复杂、毒性较大而且合成成本较高。因此,在设计抗菌肽时,最大程度地提高抗菌活性的同时使抗菌肽的细胞毒性最小化是当前急需解决的问题,这也成为了目前抗菌肽发展的一大重点。
发明内容
基于以上不足,本发明提供了一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL,解决了现有的抗菌肽毒性大且溶血高的问题。
本发明所采用的技术方案如下:一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其C端采用氨基酰胺化,含有PG转角单元。
进一步的,如上所述的抗菌肽WWL的分子式如式(I)所示,
本发明的另一目的是提供如上所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL的制备方法,如下:肽链采用PG转角单元,通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用,并且能够用于稳定β-发夹结构,得到的多肽模板为:XWRYRPGRWRYX-NH2,X为疏水性氨基酸,Y为色氨酸,当X=L,Y=W时,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;采用固相化学合成法合成多肽,经质谱鉴定后,即完成多肽的制备;再经过抑菌活性测定、细胞毒性测定和溶血活性测定,最终命名为抗菌肽WWL。
本发明的另一个目的在于提供如上所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的应用。
进一步的,如上所述的革兰氏阴性菌包括:大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。
进一步的,如上所述的革兰氏阳性菌包括:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌。
本发明具有以下优点和有益效果:本方法设计的抗菌肽WWL含有12个氨基酸,序列较短,合成成本较低。对抗菌肽WWL进行抑菌活性检测、毒性检测和溶血活性检测,发现抗菌肽WWL对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等具有较高的抑制作用。本发明通过色氨酸和色氨酸跨链交互作用稳定抗菌肽结构,取代传统二硫键,毒性较小,在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到90%以上。在128uM内没有发现溶血现象,治疗指数可以达到95.52。综上所述,抗菌肽WWL具有较高的应用价值。
附图说明
图1为抗菌肽WWL的高效液相色谱图;
图2为抗菌肽WWL的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗菌肽WWL的设计
由于色氨酸具有疏水性并且是氨基酸中体积最大的,因此色氨酸在蛋白质疏水核心内提供了较大的范德华相互作用。芳香-芳香相互作用是蛋白质稳定的一种众所周知的机制。
本实施例通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用,也可以极大的稳定β-发夹结构,含有PG转角单元,得到抗菌肽模板XWRYRPGRWRYX-NH2,X为疏水性氨基酸,Y为色氨酸,当X=L,Y=W时,得到的序列如表1所示。
表1抗菌肽WWL氨基酸序列
分子式如式(I)所示:
抗菌肽WWL的序列长度为12,含有PG转角单元,含有4个精氨酸,将抗菌肽WWL的C端采用氨基酰胺化以提高一个正电荷,总电荷数为+5。该方法设计的抗菌肽最大程度地提高抗菌活性的同时使抗菌肽的细胞毒性最小化,具有较低的溶血活性。
实施例2
1.多肽通过合成仪器从C端到N端逐一合成。第一步是把Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端的第一个氨基酸)接入Wang树脂,接下来脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂;然后将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y,Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸),依照这个过程从C端到N端,直至合成结束,获得脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂;
2.在上述得到的多肽树脂中,添加切割剂,在20℃条件下避光反应2h,过滤,使用FA(三氟乙酸)洗涤沉淀,将上述滤液与洗液混合均匀,使用旋转蒸发仪进行浓缩,然后加入10倍体积的预先冷却的无水乙醚,-20℃条件下沉淀3h,析出白色粉末,在2500g离心10min,然后收集沉淀,再用无水乙醚冲洗沉淀,在真空条件下干燥,最终得到多肽。其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成;
3.使用0.2mol/L硫酸钠(使用磷酸调节至pH=7.5)进行柱平衡30min,多肽使用90%的乙腈水溶液进行溶解,过滤,C18反相常压柱,进行梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70~70:30混合),流速为1mL/min,检测波为220nm,然后收集主峰,进行冻干。
4.多肽的鉴定:使用电喷雾质谱法对得到的多肽进行分析,质谱图(见附图1)中得到的分子量与表1中的理论分子量基本一致,且抗菌肽的纯度大于95%(见附图2)。
实施例3
抗菌肽的生物活性测定
1.抑菌活性测定
在37℃,220g摇床条件下,将细菌在阳离子调节的MHB肉汤培养基中培养至对数生长期,并稀释至OD600nm=0.4(3×108-9×108CFU mL-1)。使用前将细菌溶液稀释1000倍。等体积(50μL)的细菌悬液和含有不同浓度两亲物(0.25×10-6-128×10-6M)的牛血清白蛋白溶液(BSA,0.2%;乙酸,0.01%)加入圆底透明的聚丙烯96孔板中。含有细菌的MHB培养基用作阳性对照,未接种细菌的MHB用作阴性对照。将96孔板在37℃恒温培养箱孵育18-24h。最低抑菌浓度是用肉眼和酶标仪OD492 nm的光密度下观察不到细菌生长的最小浓度。每项测定在三个独立平行,每个平行两次重复。检测结果见表2。
表2抗菌肽的最小抑菌浓度(uM)
通过表2可以看出抗菌肽WWL对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性。
2.细胞毒性测定:
(1)细胞悬液的准备:将冻存于液氮中的猪小肠上皮细胞IPEC-J2进行复苏,然后转移至5mL含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37℃条件下恒温培养。当细胞铺满25cm2培养瓶底约70%时说明细胞进入到快速生长期,进行传代。用无菌PBS润洗细胞两次,加入0.25%胰蛋白酶2mL对细胞进行消化。同时,在消化期间对细胞形态进行观测,当细胞间隙增大并且大部分变圆时,吸走消化液,加入5mL DMEM培养基(含10%小牛血清),轻轻吹打,混匀,使其形成单细胞悬液。调整细胞浓度,然后将50μL细胞悬液加入到96孔板每行的第1号至11号孔中,终浓度约为2×104细胞/孔,第12号孔加50μL培养基;
(2)抗菌肽处理:吸取用培养基倍比稀释的抗菌肽50μL加入到96孔板的第1号至10号孔中,在37℃条件下,培养16-18h。第12号孔仅含培养基为阴性对照,第11号孔含有细胞但无抗菌肽为阳性对照,第1至10号孔为测定孔;
(3)结果判断:培养结束后,吸取5mg/mL的MTT 50μL加入到96孔板的每个孔中,37℃下培养4h。然后再加入150μL的DMSO,振荡10min以溶解晶体。用酶标仪测定OD492吸光度。
(4)每个试验重复3次以上,根据下面公式来计算细胞存活率:
细胞存活率(100%)=(OD测定值/OD阳性对照)×100%
在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到90%以上。结果见表3。
表3抗菌肽细胞毒性的测定
通过表3可以看出,抗菌肽WWL对猪小肠上皮细胞毒性较小,在检测范围内细胞存活率均达到90%以上。
3.溶血活性测定
(1)采集健康的人血液1mL,保存于肝素钠抗凝管;
(2)在3000g条件下低温离心5-10min,弃除上清,收集红细胞;
(3)用PBS溶液将已收集到的红细胞冲洗3遍,然后再用10倍体积的PBS溶液使红细胞重悬;
(4)在96孔板中的每行第1号孔中都加入80μL PBS溶液,其余孔中加入50μL PBS溶液。将20μL抗菌肽储备液(2.56mM)加入到第1号孔内,充分混匀,然后吸取50μL加入到第2号孔内,充分混匀,依次类推,直到第10号孔,混匀后吸取50μL,弃去;
(5)在96孔板的第1至11号孔中加50μL红细胞悬液,第12号孔加入50μL 0.2%Triton X-100,混匀。这样第11号孔作为阴性对照,而第12号孔为阳性对照;
(6)放入培养箱中37℃孵育1h,然后在3000g条件下离心5-10min;
(7)吸取上清,转入到新的96孔板中,在OD570条件下用酶标仪测定吸光度值;
(8)溶血活性依据下面公式进行计算:
溶血率(%)=[(样品OD570-阴性对照OD570)/(阳性对照OD570-阴性对照OD570)]×100%
最小溶血浓度是抗菌肽引起10%溶血率时的浓度。结果见表4。
表4抗菌肽溶血活性的测定
通过表4表明抗菌肽WWL在检测范围内并未发现溶血活性。使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值算为治疗指数,治疗指数为95.52。
Claims (6)
1.一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL,其特征在于:氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其C端采用氨基酰胺化,含有PG转角单元。
2.根据权利要求1所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL,其特征在于:其分子式如式(I)所示,
3.根据权利要求1或2所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL的制备方法,其特征在于,方法如下:肽链采用PG转角单元,通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用,并且能够用于稳定β-发夹结构,得到的多肽模板为:
XWRYRPGRWRYX-NH2,当X=L,Y=W时,其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;采用固相化学合成法合成多肽,经质谱鉴定后,即完成多肽的制备;再经过抑菌活性测定、细胞毒性测定和溶血活性测定,最终命名为抗菌肽WWL。
4.根据权利要求1或2所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,所述的革兰氏阴性菌包括:大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。
6.根据权利要求4所述的应用,所述的革兰氏阳性菌包括:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311716671.3A CN117924422B (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311716671.3A CN117924422B (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117924422A true CN117924422A (zh) | 2024-04-26 |
CN117924422B CN117924422B (zh) | 2024-07-02 |
Family
ID=90754606
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311716671.3A Active CN117924422B (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117924422B (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100316643A1 (en) * | 2009-02-05 | 2010-12-16 | The Regents Of The University Of California | Targeted antimicrobial moieties |
CN111533786A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-08-14 | 东北农业大学 | 色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法 |
CN115947788A (zh) * | 2022-10-12 | 2023-04-11 | 东北农业大学 | 色氨酸和亮氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WLF及制备方法和应用 |
CN115960261A (zh) * | 2022-10-12 | 2023-04-14 | 东北农业大学 | 色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用 |
WO2023241675A1 (zh) * | 2022-06-17 | 2023-12-21 | 中山大学 | 一种多肽及其设计方法和在制备抑制具核梭杆菌产品或预防结直肠癌药物中的应用 |
-
2023
- 2023-12-14 CN CN202311716671.3A patent/CN117924422B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100316643A1 (en) * | 2009-02-05 | 2010-12-16 | The Regents Of The University Of California | Targeted antimicrobial moieties |
CN111533786A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-08-14 | 东北农业大学 | 色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法 |
WO2023241675A1 (zh) * | 2022-06-17 | 2023-12-21 | 中山大学 | 一种多肽及其设计方法和在制备抑制具核梭杆菌产品或预防结直肠癌药物中的应用 |
CN115947788A (zh) * | 2022-10-12 | 2023-04-11 | 东北农业大学 | 色氨酸和亮氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WLF及制备方法和应用 |
CN115960261A (zh) * | 2022-10-12 | 2023-04-14 | 东北农业大学 | 色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
CHANGXUAN SHAO 等: ""Central β-turn increases the cell selectivity of imperfectly amphipathic α-helical peptides"", 《ACTA BIOMATER》, vol. 69, 31 January 2018 (2018-01-31), pages 243 - 255 * |
CHANGXUAN SHAO 等: ""Novel design of simplified β-hairpin antimicrobial peptide as a potential food preservative based on Trp-pocket backbone"", 《FOOD CHEM》, vol. 448, 23 March 2024 (2024-03-23), pages 10 * |
徐林 等: ""抗菌肽的生物学功能与作用机制研究进展"", 《饲料博览》, no. 3, 30 June 2023 (2023-06-30), pages 9 - 13 * |
邵长轩 等: ""β-折叠抗菌肽的研发及应用策略"", 《畜牧兽医学报》, vol. 53, no. 8, 14 June 2022 (2022-06-14), pages 2490 - 2501 * |
邵长轩 等: ""人源Cathelicidins家族抗菌肽LL-37生物学功能和分子修饰研发进展"", 《东北农业大学学报》, vol. 54, no. 7, 31 July 2023 (2023-07-31), pages 80 - 90 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117924422B (zh) | 2024-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN115960261B (zh) | 色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用 | |
CN111533786B (zh) | 色氨酸和精氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法 | |
CN115947788B (zh) | 色氨酸和亮氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WLF及制备方法和应用 | |
CN111518168B (zh) | 一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽及其制备方法和应用 | |
CN111533789B (zh) | 色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法 | |
CN111423501B (zh) | 一种衍生自蝎毒的抗菌肽及制备方法和应用 | |
CN109553657B (zh) | 一种非完美两亲性肽w4及其制备方法和应用 | |
CN113754784B (zh) | 一种细胞穿透抗菌肽及其应用 | |
CN116874614A (zh) | 一种具有高活性低裂解效果的抗菌多肽aph171及其制备方法和应用 | |
CN117924423B (zh) | 色氨酸和异亮氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 | |
CN112778401B (zh) | 一种辛酸酰化修饰抗菌肽及其应用 | |
CN111647044B (zh) | 一种富含苯丙氨酸抗菌肽及其制备方法和应用 | |
CN111253474B (zh) | 一种抗菌肽rg-27及其应用 | |
CN110294809B (zh) | 靶向金黄色葡萄球菌抗菌肽s2及其制备方法和应用 | |
CN117924422B (zh) | 色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 | |
CN109553677B (zh) | 基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽w8及其制备方法和应用 | |
CN113603748B (zh) | 一种β-折叠抗菌肽HINGE-RV及其制备方法和应用 | |
CN114891068B (zh) | 一种抗菌肽gk18及其应用 | |
CN111484546B (zh) | 含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法 | |
CN116041476B (zh) | 一种衍生自猪肝脏表达抗菌肽malk及其制备方法和应用 | |
CN116143877B (zh) | 基于cation-π跨链交互作用的β发卡抗菌肽及其制备方法和应用 | |
CN115925814B (zh) | 一种抗菌肽rmr26及其制备方法和应用 | |
CN115819517B (zh) | 一种衍生自嗜中性细胞趋化因子的抗菌肽及其制备方法和应用 | |
CN115925990B (zh) | 一种衍生自猪导管素的抗菌肽及其制备方法和应用 | |
CN118005739B (zh) | 一种抗耐药菌株的多肽aph229及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |