CN111484546B

CN111484546B - 含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法

Info

Publication number: CN111484546B
Application number: CN202010234840.XA
Authority: CN
Inventors: 单安山; 邵长轩; 李国雨
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111484546A

Abstract

本发明提供一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法。本发明抗菌肽WRFNG，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明的制备方法以Asn‑Gly转角为转角单元，以Trp和Arg的交互作用形成两条β‑侧链的相互吸引，根据β‑发卡结构的排布原则设计出抗菌肽模板XWYRYZZXWYRY‑NH₂。X＝R，Y＝F，ZZ＝NG。本抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。本发明的抗菌肽治疗指数达到138.30，较Pro‑Gly转角的WRFPG提高了1.58倍，较D‑Pro‑Gly转角的WRFpG提高了3.55倍，具有成为绿色高效抗生素替代品的发展潜力。

Description

含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法。

背景技术

宿主免疫系统中发现的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)由于其出色的抗菌特性和独特的作用机理而引起了人们的广泛关注。特别是在过去的几十年中，抗生素的过度使用和不当使用使药物残留和细菌耐药性问题愈发严重。这些多肽是广谱的，具有针对微生物，病毒，寄生虫甚至肿瘤细胞的强大活性。此外，与抑制特定代谢途径的传统抗生素不同，大多数抗菌肽通过不可逆的细菌膜破坏发挥杀菌作用，导致重要细胞内容物的泄漏，最终导致细胞死亡。这种膜破坏的物理性质将阻止或延迟细菌对AMPs的耐药性。由于这些固有的优势， AMPs可以用作对抗病原微生物的有效武器，是新一代抗菌剂的最有希望的候选者之一。

在抗菌肽中发现的最重要的二级结构是α-螺旋和β-折叠。越来越多的证据表明，具有两亲性β-折叠结构的天然AMP具有有效的抗菌特性。相对于α-螺旋肽序列的设计和优化相比，对β-折叠肽的系统研究严重缺乏，主要是因为短肽难以形成稳固的β-结构，特别是大多数现有的β-折叠肽都需要一个或多个内部二硫键作为构象约束来稳定其生物活性构象，这在很大程度上增加了大规模生产多肽的成本。因此，开发高度简化的线性β-sheet模型是促进抗菌肽多元化发展的一个重要手段。同时，线性β-发卡模型的结构功能关系尚不明确，特别是作为主要构成成分之一的转角单元，在β-发卡模板中发挥的作用有待揭示。另外，抗菌肽的溶血活性作为评价抗菌肽体内应用安全性的指标在抗菌肽临床应用过程中非常关键，高浓度的抗菌肽在含有大量疏水性氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和正电荷氨基酸特别是精氨酸的情况下，特别容易引起高浓度的溶血活性，严重阻碍抗菌肽的临床应用与发展。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法，解决β-发卡抗菌肽的合成成本问题高和高浓度溶血的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽WRFNG，所述的抗菌肽WRFNG以Asn-Gly转角为转角单元，通过色氨酸和精氨酸的交互作用形成对两条β侧链的相互吸引，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

如上所述的一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽WRFNG的制备方法，技术特点如下：以Asn-Gly转角为转角单元，以色氨酸和精氨酸的交互作用形成两条β-侧链的相互吸引，根据β-发卡结构的排布原则，得到抗菌肽模板XWYRYZZXWYRY-NH₂，当X＝R，Y＝F，ZZ＝NG 时，抗菌肽命名为WRFNG，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的在于提供如上所述的一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽 WRFNG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

本发明的有益效果及优点：通过本方法制备的抗菌肽，序列长度短，结构稳定，实验技术简单，合成成本低廉。对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现WRFNG对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等多种菌株有高效的抑制作用。本发明利用色氨酸的芳香族侧链与精氨酸的正电性形成多肽分子内跨链的 cation-π作用，取代半胱氨酸形成的二硫键，将序列长度设定为12，以Asn-Gly转角为转角单元可以显著降低β发卡抗菌肽的溶血活性，其治疗指数达到138.30，较Pro-Gly转角的WRFPG 提高了1.58倍，较D-Pro-Gly转角的WRFpG提高了3.55倍，综上所述，WRFNG是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽WRFNG的三维结构投影图；

图2为抗菌肽WRFNG的高效液相色谱图；

图3为抗菌肽WRFNG的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计RWFRFNGRWFRF-NH₂

抗菌肽WRFNG的氨基酸序列为：

Arg Trp Phe Arg Phe Asn Gly Arg Trp Phe Arg Phe-NH₂

1 5 10 12

以Asn-Gly转角为转角单元，以色氨酸和精氨酸的交互作用形成两条β-侧链的相互吸引，根据β发卡结构的排布原则设计出抗菌肽模板XWYRYZZXWYRY-NH₂，其中X为正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸，ZZ为β-转角，当X＝R，Y＝F，ZZ＝NG时，抗菌肽命名为WRFNG。抗菌肽的序列如表1肽WRFNG所示。以Pro-Gly转角为转角单元形成的抗菌肽的序列如表1肽WRFPG所示。以D-Pro-Gly转角为转角单元形成的抗菌肽的序列如表1肽WRFpG所示。

表1衍生肽的氨基酸序列

WRFNG(图1)的序列长度为12，两个色氨酸和四个苯丙氨酸提供充足的疏水性，含四个精氨酸，将肽的C端酰胺化以提高一个正电荷，总电荷数为+5，使用不同的转角单元Asn-Gly/Pro-Gly/D-Pro-Gly转角单元，测定转角单元对其抑菌活性和毒性的影响。

实施例2

固相化学合成法合成WRFNG抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang 树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量 (如图2、3所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定

1、抗菌活性的测定：微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含 0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL 置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁶个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养 18h，用酶标仪在492nm(OD 492nm)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。测试进行3次重复，每个重复两个平行。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，WRFNG、WRFPG和WRFpG对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较高的抑菌活性，WRFPG和WRFpG的抑菌活性要略高于WRFNG。

2、溶血活性的测定：收集1mL新鲜的红细胞悬浮液，并用PBS(pH 7.4)稀释10倍。将50μL hRBCs溶液与50μL溶于PBS的倍比稀释肽在37℃孵育1小时。用0.1％Triton X-100 处理的hRBC悬浮液用作阳性对照，未处理的hRBC悬浮液用作阴性对照。离心(1000g，5 分钟，4℃)后从混合物中收集50μL上清液，并转移至新的96孔微孔板中。溶血百分比使用以下公式计算：溶血率(％)＝[(处理样品的OD570–阴性对照的OD570)/(阳性对照的 OD570–阴性对照的OD570)]×100％。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性的测定

根据表3可以看出，WRFNG的抑菌活性要略低于WRFPG和WRFpG，但在256μM浓度时仅引起8.39％的溶血，而WRFPG可以引起14.11％的溶血，WRFpG更是达到了32.13％。使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，WRFNG的治疗指数达到138.30，较WRFPG提高了1.58倍，较WRFpG提高了3.55倍。表明以Asn-Gly转角为转角单元可以显著降低β发卡抗菌肽的溶血活性。

综合以上结果显示，以Asn-Gly转角为转角单元，以色氨酸精氨酸为跨链交互作用设计出的抗菌肽WRFNG具有较高的治疗指数，表明其具有较强的替代抗生素的潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽及制备方法

<140> 202010234840X

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Trp Phe Arg Phe Asn Gly Arg Trp Phe Arg Phe-NH2

1 5 10

Claims

1.一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽WRFNG，其特征在于：所述的抗菌肽WRFNG以Asn-Gly转角为转角单元，通过色氨酸和精氨酸的交互作用形成对两条β侧链的相互吸引，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽的制备方法，其特征在于，以Asn-Gly转角为转角单元，以色氨酸和精氨酸的交互作用形成两条β-侧链的相互吸引，根据β-发卡结构的排布原则设计抗菌肽模板XWYRYZZXWYRY-NH₂，当X＝R，Y＝F,ZZ＝NG时，抗菌肽命名为WRFNG。

3.根据权利要求1所述的一种含天冬酰胺和甘氨酸转角的β发卡抗菌肽WRFNG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。