CN114805495A - 一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal‑CRKP及其制备方法和应用。该分枝状抗菌肽Pal‑CRKP的氨基酸序列为：Pal‑GGGK(CRKPCRKP)CRKPCRKP，Pal为正十六烷酸。制备方法通过利用赖氨酸侧链的特点，利用赖氨酸将正十六烷酸与抗酶解肽序列单元结合形成分枝状抗菌大分子，设计出具有高抗菌活性，低毒性和高稳定性的分枝状抗菌肽。抗酶解分枝状抗菌肽Pal‑CRKP不但对革兰氏阴性菌表现出高效的抑菌活性，而且对革兰氏阳性菌有高效的抑制作用，同时具有较低的溶血毒性，高浓度的蛋白酶对分枝状抗菌肽Pal‑CRKP的降解程度很弱，本发明的抗酶解分枝状抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。

Description

一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌药物被使用的那一刻，细菌就开始进化多种耐药途径进行反击，耐药细菌的出现是一个重大威胁，危及强效抗生素的疗效，导致死亡风险增加，因此，迫切需要新的方法来对抗这些耐药菌株。抗菌肽(AMPs)是一种低分子量蛋白质，在过去四十年的抗菌肽研究中，人们发现这些分子具有多种生物学活性，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、抗癌和免疫调节的作用。AMPs最初通过静电相互作用与革兰氏阳性细菌膜上的脂磷壁酸或革兰氏阴性细菌膜上的脂多糖结合。由于抗菌肽的疏水性，抗菌肽可进一步渗透并插入细菌膜的疏水核心，并穿过内膜破坏细菌膜，导致细胞死亡，独特的作用机制使其不易产生耐药性，使其成为最具潜力替代抗生素的物质之一。

虽然抗菌肽具有高抗菌活性、低毒性及独特得杀菌机制等诸多优点，但是大多数的抗菌肽有许多待解决的问题，目前为止，有几个原因限制了AMPs的临床应用，首先就是对内源和微生物源蛋白酶的高度敏感性，其次是由于抑制细菌所需的高浓度而产生的毒性，最后就是由于体液复杂环境导致体内半衰期短，改善这些问题成为抗菌肽应用的关键。

发明内容

基于以上的不足之处，本发明的目的是提供一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP，利用正十六烷酸及赖氨酸侧链链接抗酶解肽序列单元结合形成分枝状多肽抗菌大分子，尽可能避免蛋白酶酶切位点，提高所设计肽稳定性，增加抗菌肽体内半衰期，为提高抗菌肽的稳定性提供一个新的途径。

本发明所采用的技术方案如下；一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP，氨基酸序列为： Pal-GGGK(CRKPCRKP)CRKPCRKP，Pal为正十六烷酸；分子结构式为：

本发明的另一目的是提供一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP的制作方法，方法步骤如下：

步骤一：将赖氨酸Lys作为链接正十六烷酸和抗酶解序列的位点，利用赖氨酸Lys的羧基和 R基上的-NH₂分别链接两个抗酶解序列：CRKPCRKP，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG链接正十六烷酸和赖氨酸Lys，形成具有两个抗酶解序列分枝的分枝状多肽，其氨基酸序列和分子结构式如权利要求1所述，其中，所述的抗酶解序列是利用合理规避酶切位点的原则，将半胱氨酸 Cys和赖氨酸Lys分别放置在精氨酸Arg的N端和C端，并且在赖氨酸Lys的C端连接脯氨酸 Pro，形成空间位阻以避免蛋白酶对赖氨酸Lys和精氨酸Arg的酶解，所述的正十六烷酸为其发挥抗菌活性提供疏水性；

步骤二：将所述的多肽采用固相化学合成法合；

步骤三：经质谱鉴定、体外抑菌活性检测、溶血活性检测及蛋白酶稳定性检测，最终命名为抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP。

本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。

进一步的，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌和沙门氏菌。

进一步的，所述的革兰氏阳性菌为葡萄球菌和粪肠球菌。

本发明的优点及有益效果：本发明通过利用赖氨酸的侧链将抗酶解序列与正十六烷酸连接起来，形成有空间位阻的抗酶解分枝状抗菌肽，肽链之间的空间位阻与合理规避酶切位点的抗酶解单元可以进一步提高抗菌肽的稳定性。对得到抗酶解分枝状抗菌肽的进行抗菌活性、溶血活性和抗蛋白酶水解能力检测，发现抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP不但对革兰氏阴性菌有明显的抑制作用，对革兰氏阳性菌有高效的抑制作用，同时具有较低的溶血毒性；并且能抵挡住高浓度的胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶的降解，因而，综合来看，抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP 是一种具有较高实际应用潜力的抗菌肽。

附图说明

图1为抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP的质谱图。

图2为抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP高效液相色谱图。

图3为抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP的溶血活性图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

分枝状抗菌肽的设计：

分枝状抗菌肽Pal-CRKP的氨基酸序列为：

C₁₆-Gly Gly Gly Lys(Cys Arg Lys Pro Cys Arg Lys Pro)Cys Arg Lys ProCys Arg Lys Pro

本设计利用赖氨酸侧链的特点，将赖氨酸Lys作为链接正十六烷酸和抗酶解序列的位点，利用赖氨酸Lys的羧基和R基上的-NH₂均链接两个抗酶解序列：Cys Arg Lys ProCys Arg Lys Pro，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG链接正十六烷酸和赖氨酸Lys，形成具有两个抗酶解序列分枝的分枝状抗菌肽，抗酶解序列是利用合理规避酶切位点的原则，避免胰蛋白酶，糜蛋白酶等蛋白酶的酶切，将半胱氨酸Cys和赖氨酸Lys分别放置在精氨酸Arg的N端和C端，并且在赖氨酸 Lys的C端连接脯氨酸Pro，形成空间位阻以避免蛋白酶对赖氨酸Lys和精氨酸Arg的酶解。正十六烷酸为其发挥抗菌活性提供疏水性，命名为Pal-CRKP。抗菌肽的序列如表1所示。

表1抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP的主要参数

Pal-CRKP为抗酶解分枝状抗菌肽，正电荷数为4，分子量为2493.50。

其分子结构式为：

实施例2

将上述树状抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：

步骤1、多肽主链的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X 是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

步骤2、使用水合肼脱去Fmoc-Lys(Dde)-OH侧链Dde保护基团，重复步骤1，完成支链氨基酸链接。

步骤3、在上述得到的多肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚， -20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5 混合而成；

步骤4、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18 柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％ B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；

步骤5、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图1)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％(见附图2)。

实施例3

对制备完成的抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP通过体外抑菌活性、溶血活性检测；

1、抗菌活性的测定：测量肽的最小抑菌浓度(MIC)就是将菌接种到Mueller-Hinton broth (MHB)中37℃培养过夜后，转移至新的培养基中，直到对数生长期，将细菌培养液稀释至1×10⁵ CFU/ml，将50μl含有不同浓度肽的BSA(pH＝6.0)分别加入到上述的96孔板中，96孔板中的最终肽浓度范围为0.125至64μM。将肽溶液和细菌培养液等体积1：1在96孔板中混合均匀，培养18h，用酶标仪(Tecan GENios F129004,Austria)492nm处测量混合物的光密度(OD)，确定最小抑菌浓度，检测结果见表2。

表2抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌表现出高效的抑菌活性。

2、溶血活性的测定：取新鲜人血液用PBS(pH＝7.4)稀释10倍后离心，1000g离心5min，获取人新鲜红细胞(hRBCs)，再用PBS离心洗涤三次。并重新悬浮在PBS中，取50μL洗涤后的hRBCs 与50μL含不同肽浓度的PBS溶液在96孔板中等体积混合，0.1％Triton X-100作为阳性对照，洗涤后的hRBCs作为阴性对照，在37℃培养箱内恒温孵育1h，然后将平板在4℃下以1000离心5分钟，抽取上层清液50μl至新的96孔板中，在570nm处测量其吸光度值。每组取平均值，并比较分析溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率是抗菌肽的浓度。

溶血率(％)＝[(样品OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)/(阳性对照OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)]×100％

多肽溶血活性检测结果见附图3。虽然在128μM的溶血毒性较高，但是在32μM浓度及以下的浓度溶血率越低。通过附图3可以看出，抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP在16μM以下的浓度检测范围内没有明显的溶血活性。溶血活性高于抑菌活性，表明抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP 具有极高的实际应用潜力。

实施例3

对制备完成的抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP通过蛋白酶稳定性；

蛋白酶稳定性：为了检验抗菌肽对抗蛋白酶水解的能力，我们测定了抗菌肽经过不同类型蛋白酶处理后的抑菌活性。在37℃条件下，用不同反应浓度为的胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K溶液分别处理Pal-CRKP，时间为2h，然后按照抗菌活性的测定中的方法，将这些处理后的多肽倍比至不同浓度后与菌液混合于96孔培养板的孔中，最后测定多肽经过蛋白酶处理后的最小抑菌浓度是否发生了变化。结果见表3

表3蛋白酶处理后的Pal-CRKP对大肠杆菌25922的最小抑菌浓度

通过表3可以看出，胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶对Pal-CRKP均没有明显影响，蛋白酶 K对其MIC稍有影响，这表明全新设计的抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP具有较优异的抵抗高浓度蛋白酶水解的能力。

综合结果显示，抗酶解单元与正十六烷酸相连形成的抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌表现出高效的抑菌活性，最小抑菌浓度可达微摩尔级别。同时Cap-CRKP 的溶血毒性在32μM浓度以下的溶血毒性很低，并且具有极高的蛋白酶稳定性，表明全新设计出的抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP具有较高的替代抗生素治疗革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌感染得的潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，以本发明权利要求保护的范围为准。

Claims (5)

1.一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP，其特征在于，氨基酸序列为：Pal-GGGK(CRKPCRKP)CRKPCRKP，Pal为正十六烷酸；分子结构式为：

2.一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP的制作方法，其特征在于，方法步骤如下：

步骤一：将赖氨酸Lys作为链接正十六烷酸和抗酶解序列的位点，利用赖氨酸Lys的羧基和R基上的-NH₂分别链接两个抗酶解序列：CRKPCRKP，进一步使用柔性氨基酸连接体GGG链接正十六烷酸和赖氨酸Lys，形成具有两个抗酶解序列分枝的分枝状多肽，其氨基酸序列和分子结构式如权利要求1所述，其中，所述的抗酶解序列是利用合理规避酶切位点的原则，将半胱氨酸Cys和赖氨酸Lys分别放置在精氨酸Arg的N端和C端，并且在赖氨酸Lys的C端连接脯氨酸Pro，形成空间位阻以避免蛋白酶对赖氨酸Lys和精氨酸Arg的酶解，所述的正十六烷酸为其发挥抗菌活性提供疏水性；

步骤二：将所述的多肽采用固相化学合成法合；

步骤三：经质谱鉴定、体外抑菌活性检测、溶血活性检测及蛋白酶稳定性检测，最终命名为抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP。

3.如权利要求1所述的一种抗酶解分枝状抗菌肽Pal-CRKP在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌和沙门氏菌。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阳性菌为葡萄球菌和粪肠球菌。

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