CN113651871A

CN113651871A - 一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽及制备方法和应用

Info

Publication number: CN113651871A
Application number: CN202110884358.5A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 菅俏; 陈虹羽
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113651871B

Abstract

本发明提供一种全碳氢侧链装订的抗酶解α‑螺旋抗菌肽及制备方法和应用。抗菌肽序列如SEQ ID No.1所示。制备方法：以α‑螺旋多肽折叠原则为基础，设计一条包含七个氨基酸残基的多肽序列，选择(S)‑2‑(4‑戊烯基)丙氨酸放置于第2位(b位)与第6位(f位)以形成全碳氢装订的侧链“订书”结构，位于“订书”结构内以及与其相邻位点可阻碍糜蛋白酶水解。本抗菌肽序列长度仅为7个氨基酸，发明了全碳氢装订侧链的植入对于线性α‑螺旋抗菌肽生物学活性和抗蛋白酶水解能力的影响，对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有较强的抑制作用，且对红细胞的溶血毒性极低，对耐蛋白酶水解的效果较好，有望成为传统抗生素的高效替代品。

Description

一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽及制备方法和应用。

背景技术

近年来，多重耐药性细菌的出现严重威胁着公众健康，它使得常规抗生素变得越来越无效，为此寻找新的抗菌策略势在必行。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是由不同物种表达的天然多肽的一个亚类，是宿主天然免疫系统的第一道防线。大多数阳离子抗菌肽主要通过膜裂解杀死细菌，这种有别于抗生素的独特作用机制及其所具有的多重生物学功能，使得AMPs成为替代传统抗生素的最有潜力的竞争者。

尽管天然抗菌肽在其生物作用中显示出高度的特异性，但它们的实际应用受到序列长、毒性高、易被蛋白酶水解等问题的严重限制，其中内源性蛋白酶，譬如胰蛋白酶与糜蛋白酶极易将AMPs降解为短肽甚至单氨基酸分子，胰蛋白酶主要切割精氨酸和赖氨酸的羧基端，糜蛋白酶主要切割大型疏水性氨基酸的羧基端，因此，纵使数以千计的天然抗菌肽被开发，却极少能够作为抗生素替代品付诸应用。

发明内容

基于以上不足之处，提供一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽stLRL，该抗菌肽序列极短，全碳氢侧链装订的侧链“订书”结构可避免位于结构内以及与其相邻的糜蛋白酶水解，并且其抗酶解能力强，毒性低。

本发明所采用的技术如下：一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽stLRL，该抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽stLRL制备方法，如下：以α-螺旋多肽折叠原则为基础，设计一条包含七个氨基酸残基的多肽序列，从N端到C端分别标记为：a、b、c、d、e、f、g位，选择(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸分别放置于b位与f位，通过Grubbs第一代催化剂闭环反应形成全碳氢装订的侧链订书结构，然后，在a位放置Leu，以消除糜蛋白酶位点的裂解，放置Arg于g位，以提供正电荷阻碍胰蛋白酶的切割；在订书结构内，放置Arg于d位，放置Leu分别于c位和e位，以提高抗菌活性，并将该肽的羧基末端酰胺化以提高稳定性，命名为抗菌肽stLRL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，最后利用固相化学合成法和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

本发明的另一目的是提供以上所述的抗菌肽stLRL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

以上所述的应用为用于胃肠道感染性疾病药物中的应用。

本发明具有如下优点及有益效果：本抗菌肽序列长度极短，二级结构稳定，对其进行抗菌活性、溶血活性和抗蛋白酶水解能力检测，发现抗菌肽stLRL对大肠杆菌，绿脓杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，粪肠球菌等多种菌株具有高效抑制作用，对红细胞的溶血毒性较低，且在胰蛋白酶或糜蛋白酶的环境中降解程度小，抗酶解能力较强。综上，抗菌肽stLRL是一种具有较高应用潜力的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽stLRL的质谱图。

图2为抗菌肽stLRL的立体结构图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

抗菌肽stLRL的氨基酸序列从N端到C端为：

Leu Xaa Leu Arg Leu Xaa Arg-NH₂

1 5 7

其中，Xaa为(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸；

参照氨基酸属性以及“订书”结构性质，同时为了规避胰蛋白酶与糜蛋白酶的酶切位点，首先，选择Arg作为阳离子氨基酸提供正电荷，其次，选择疏水性氨基酸Leu增强疏水深度，在第1位(a位)放置Leu以消除糜蛋白酶位点的裂解，“订书”结构内放置Arg和Leu以提高抗菌活性，第7位(g位)放置Arg提供正电荷，此位点可阻碍胰蛋白酶的切割，羧基末端酰胺化以提高稳定性。抗菌肽的结构式如表1所示。

表1 stLRL肽结构式

实施例2

利用固相化学合成法合成抗菌肽stLRL

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，脱去Fmoc基团得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；如上依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，加入约10倍体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末，2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤，真空干燥得到多肽，切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、Fmoc-S5-OH(1mmol)，HATU(1mmol)，HOAT(1mmol)，DIPEA将(1mmol)DMF(6mL)混合15min，然后在室温下添加到树脂中。2小时后，依次用DMF(3次)，DCM(3X，5mL)和DMF(3X，5mL)洗涤树脂。使用Grubbs的第一代催化剂在35℃下于1,2-二氯乙烷(DCE)中进行闭环易位反应。用DCM(3X，5mL)和DCE(3X，5mL)洗涤树脂，然后用10mM的Grubbs第一代催化剂在DCE中的溶液处理；

4、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；

5、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3

对抗菌肽体外抑菌活性、溶血活性进行检测：

1、抑菌活性测定：利用微量稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。将不同浓度肽添加至0.2％BSA稀释液(含0.01％乙酸)于96孔板中，随后加入等体积的终浓度为1×10⁵CFUmL^-1的细菌悬液，96孔板中的最终肽浓度范围为0.25至128μM。在37℃温育18-22小时，用酶标仪在492nm(OD＝492nm)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。

2、溶血活性测定：采集人的新鲜血液1mL于肝素钠抗凝管中，1000g离心5min收集红细胞，用PBS冲洗3遍后用10ml PBS重悬，将不同浓度肽添加至含有50μL PBS的96孔板中，随后加入等体积的红细胞悬液。用0.1％Triton X-100处理的hRBC悬浮液用作阳性对照，未处理的hRBC悬浮液用作阴性对照。在37℃培养箱内恒温孵育1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm(OD＝570nm)处测定光吸收值，溶血率使用下列公式计算：

溶血率(％)＝[(样品OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)/(阳性对照OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)]×100％

最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的浓度。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(MIC)和溶血活性

由表2可以看出，具有“订书”结构的抗菌肽stLRL对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较强的抑菌活性，并且在检测范围内未发现溶血毒性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到25.40。说明本发明具有成为抗生素替代品的潜力。

实施例4

对抗菌肽抗蛋白酶水解能力进行检测：

将不同浓度(0.25、0.5、1mg/mL)的胰蛋白酶、糜蛋白酶与肽等体积混合，在37℃下孵育1小时，对照组为未经过蛋白酶处理的组别，依照测定最小抑菌浓度的方法(如实施例3步骤所述)评定抗菌肽抗蛋白酶水解能力。检测结果见表3。

表3蛋白酶处理1h后的stLRL对E.coli ATCC 25922的最小抑菌浓度(μM)

由表3可以看出，糜蛋白酶对“订书”结构抗菌肽stLRL活性没有影响，在胰蛋白酶环境中抑菌活性略有降低，但仍旧对大肠杆菌25922具有抑制作用，说明stLRL具有较强的抗酶解能力。

综合以上结果，全碳氢侧链装订的α-螺旋抗菌stLRL具有较强的抗酶解能力，较高的生物学活性和细胞选择性，有望成为传统抗生素的高效替代品。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽及制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是(S)-2-(4 '-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是(S)-2-(4 '-戊烯基)丙氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(6)

<223> 结合

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 酰胺化

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)..(6)

<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 1

Leu Xaa Leu Arg Leu Xaa Arg

1 5

Claims

1.一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽stLRL，其特征在于，该抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽stLRL制备方法，其特征在于，方法如下：以α-螺旋多肽折叠原则为基础，设计一条包含七个氨基酸残基的多肽序列，从N端到C端分别标记为：a、b、c、d、e、f、g位，选择(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸分别放置于b位与f位，通过Grubbs第一代催化剂闭环反应形成全碳氢装订的侧链订书结构，然后，在a位放置Leu，以消除糜蛋白酶位点的裂解，放置Arg于g位，以提供正电荷阻碍胰蛋白酶的切割；在订书结构内，放置Arg于d位，放置Leu分别于c位和e位，以提高抗菌活性，并将该肽的羧基末端酰胺化以提高稳定性，命名为抗菌肽stLRL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，最后利用固相化学合成法和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

3.根据权利要求1所述的一种全碳氢侧链装订的抗酶解α-螺旋抗菌肽stLRL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：用于胃肠道感染性疾病药物中的应用。