CN114989260B - 一种抗酶解抗真菌肽ir2及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物领域，公开一种抗酶解抗真菌肽IR2及其制备方法和应用，抗酶解抗真菌肽IR2的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在避开胰蛋白酶，糜蛋白酶以及蛋白酶K酶切位点的基础上，用简单的天然氨基酸和少量的D型氨基酸进行了合理的排布，设计出抗酶解抗菌肽模板(IIRdRHnII)n‑NH2，当重复单元数n＝2时，设计得到的抗酶解肽命名为IR2。IR2对白色念珠球菌及临床分离的耐氟康唑真菌菌等11种真菌有明显的抑制作用，且在检测范围内几乎没有溶血活性，并对胰蛋白酶、糜蛋白酶及蛋白酶K有较强的抗酶解能力。IR2具有成为更安全，环保新型抗真菌感染药物的发展潜力。

Description

一种抗酶解抗真菌肽IR2及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗酶解抗真菌肽IR2及其制备方法和应用。
背景技术
侵袭性真菌感染每年在全世界造成150万人死亡，其中30-40％为念珠菌感染，20-30％为隐球菌病。真菌和哺乳动物细胞都是真核生物，很难找到高选择性或低毒的抗真菌药物。目前，只有几类抗真菌药物可用，并通常具有高毒性和副作用。此外，耐药病原真菌的迅速出现已经严重威胁到人类健康。因此迫切需要开发具有良好治疗潜力的、高效无毒的抗真菌药物。
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是非特异性先天免疫系统的一部分，是免疫防御第一道防线。由于其广谱活性、对人体细胞低毒性、选择性靶向性以及多种作用模式，AMPs具有巨大的潜力。然而大多数AMPs的临床应用受到稳定性差的限制，容易被蛋白酶容降解，使其降低甚至失去生物学活性，存在于人体消化道内部，血浆，皮肤表面的内源性蛋白酶，以及感染处微生物分泌的外源性蛋白酶都被认为是对AMPs巨大的威胁。为了提高AMPs的蛋白酶稳定性，人们提出了许多化学修饰策略，包括多聚肽、环化以及使用氨基酸类似物或非天然氨基酸，然而这些策略不仅增加了生产成本，也带来了较高的毒性。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种抗酶解抗真菌肽IR2，其序列如SEQID NO.1所示，本发明的抗酶解抗真菌肽IR2对真菌有明显的抑制作用和较强的抗酶解能力，并且几乎没有溶血活性。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗酶解抗真菌肽IR2的制备方法，方法步骤如下：
步骤(1)、选择高阳离子度的Arg作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷；为了避免胰蛋白酶对Arg的裂解，同时又增强稳定性，分别在Arg的N端侧放置D型Arg，C端侧放置His；为了避免糜蛋白酶和蛋白酶K的裂解，选择脂肪族侧链较长的Ile作为疏水性氨基酸；放置在D型Arg的C端侧和His的N端侧，以提供必要的疏水性，由此设计出抗酶解抗菌肽模板为：(IIRdRHII)n-NH2，当重复单元数n＝2时，设计得到的肽序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(2)、采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽；
步骤(3)、经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，再经过抗真菌活性的测定、溶血活性的测定和抗菌肽抗酶解能力的测定，即完成多肽的制备，命名为抗酶解抗真菌肽IR2。
本发明的另一目的是提供一种抗酶解抗真菌肽IR2在制备治疗真菌感染性疾病的药物中的应用。
进一步的，所述的真菌为白色念珠菌。
进一步的，所述的白色念珠菌为耐氟康唑白色念珠菌。
本发明的优点及有益效果：本发明的抗酶解抗真菌肽IR2对白色念珠球菌及临床分离的耐氟康唑真菌菌等11种真菌有明显的抑制作用，且在检测范围内几乎没有溶血活性，且对胰蛋白酶、糜蛋白酶及蛋白酶K有较强的抗酶解能力。本发明不使用昂贵的氨基酸类似物和复杂的化学修饰，仅用简单的天然氨基酸和少量的D型氨基酸进行合理重排来达到抗酶解的作用，综上所述，IR2是一种具有较高应用价值的抗酶解抗真菌肽。
附图说明
图1为抗菌肽IR2的质谱图；
图2为抗菌肽IR2的反相高效液相色谱图；
图3为抗菌肽IR2的溶血活性图；
图4为抗菌肽IR2的蛋白酶稳定性图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗酶解抗真菌肽的设计
(1)选择高阳离子度的Arg作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷。为了避免胰蛋白酶对Arg的裂解，同时又增强稳定性，分别在Arg的N端侧放置D型Arg，C端侧放置His。
(2)为了避免糜蛋白酶和蛋白酶K的裂解，选择脂肪族侧链较长的Ile作为疏水性氨基酸，放置在D型Arg的C端侧和His的N端侧，以提供必要的疏水性。
(3)为了提高肽的稳定性，C末端被酰胺化。
由此设计出的肽模板为：(IIRdRHII)n-NH2，当重复单元数n＝2时，设计得到的肽命名为IR2。IR2的氨基酸序列如表1所示。
表1IR2的氨基酸序列
实施例2
固相化学合成法合成多肽
1.多肽的合成通过多肽合成仪从C端到N端逐一进行。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2.在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，然后将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、H2O和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3.使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4.多肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1所示)与表1中的理论分子量基本一致，且抗菌肽的纯度大于95％(如图2所示)。
实施例3
抗酶解肽的生物学活性测定
1.抗真菌活性的测定
取冻存于-20℃的菌种划线接种于YPD固体培养基，28℃过夜培养。然后挑选真菌菌落在去离子水中，调节菌体浓度稀释直至OD600吸光度约为0.4。然后，将真菌悬浮液用RPMI-1640生长培养基进一步稀释1000倍。将50μL的真菌悬浮液添加到50μL肽稀释溶液中(肽的终浓度为1至64μM)。设定第11号孔为阳性对照，即只加稀释液和菌液。12号孔为阴性对照，即只加稀释液和培养基。然后将96孔板置于28℃恒温培养箱48小时。用酶标仪在492nm(OD492)处测定吸光度值，确定最小抑菌浓度。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表2。
表2IR2的抗真菌活性(μM)
注：C.albicans 56214、C.albicans 56452、C.albicans 3876、C.albicans 17546是临床分离的耐氟康唑真菌。
通过表2可以看出，IR2对白色念珠球菌及临床分离的耐氟康唑真菌菌都有明显的抑制作用。
2.溶血活性的测定：收集新鲜的人全血红细胞，并将其在4℃下以1000g离心5分钟，弃血清，收集红细胞。用PBS(pH＝7.4)洗涤3遍，并用PBS稀释10倍。将50μL人全血红细胞稀释液添加到等体积含不同浓度肽(终浓度为0.25至128μM)的PBS中，其中第11列50μL红细胞加50μL PBS作为阴性对照；第12列50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心10min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值。检测结果见图3。由图3可以看出，IR2在检测范围内未表现出溶血活性。
实施例4
抗菌肽抗酶解能力的测定
为了检测肽的抗酶解能力，用16.5％tricine-SDS-PAGE评估与酶孵育不同时间对肽的影响。分别用0.5mg/ml、2mg/ml的胰蛋白酶、糜蛋白酶和蛋白酶K与肽混合，在37℃下孵育1、2、4、8小时，用未经过蛋白酶处理的肽作为对照。结果见图4，Marker从上到下的分子量依次为40，25，15，10，4.6，1.7KDa。由图4可以看出，不管是用0.5mg/ml的酶，还是用2mg/ml的酶孵育，即使是孵育8小时后，IR2仍能保持完整的分子条带，这说明IR2具有较强的抗酶解能力。
以上结果显示，综合分析抗菌肽的抗真菌活性、溶血活性、以及抗酶解能力，设计得到的IR2抗菌肽不仅对真菌有较高的抑制作用，安全无毒，还具有较强的抗酶解能力，表明其具有成为高效抗真菌药物的发展潜力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明权利要求保护的范围。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种抗酶解抗真菌肽IR2及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (10)..(10)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> NH2酰胺化
<400> 1
Ile Ile Arg Arg His Ile Ile Ile Ile Arg Arg His Ile Ile
1 5 10

Claims (5)

1.一种抗酶解抗真菌肽IR2，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗酶解抗真菌肽IR2的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：步骤(1)、选择高阳离子度的Arg作为阳离子氨基酸来提供必要的净正电荷；为了避免胰蛋白酶对Arg的裂解，同时又增强稳定性，分别在Arg的N端侧放置D型Arg，C端侧放置His；为了避免糜蛋白酶和蛋白酶K的裂解，选择脂肪族侧链较长的Ile作为疏水性氨基酸；放置在D型Arg的C端侧和His的N端侧，以提供必要的疏水性，由此设计出抗酶解抗菌肽模板为：(IIRdRHII)n-NH2，当重复单元数n＝2时，设计得到的肽序列如SEQ ID NO.1所示；步骤(2)、采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽；
步骤(3)、经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，再经过抗真菌活性的测定、溶血活性的测定和抗菌肽抗酶解能力的测定，即完成多肽的制备，命名为抗酶解抗真菌肽IR2。
3.根据权利要求1所述的一种抗酶解抗真菌肽IR2在制备治疗念珠菌感染性疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的念珠菌为白色念珠菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的白色念珠菌为耐氟康唑白色念珠菌。
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