CN111533789B

CN111533789B - 色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

Info

Publication number: CN111533789B
Application number: CN202010234622.6A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 邵长轩; 朱永杰
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111533789A

Abstract

本发明提供一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β‑发卡抗菌肽及制备方法。抗菌肽WKFPG，其序列如SEQ ID No.1所示。制备方法以β‑发卡侧链的排布原则，以色氨酸和赖氨酸的交互作用作为辅助PG转角单元形成发卡结构的力，形成化学结构稳定和生物学功能稳定的β‑发卡结构的抗菌肽。本抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。本抗菌肽序列长度12，含5个正电荷和50％的疏水性氨基酸，在高效抑菌的基础上具有很低的溶血活性和盐粒子、血清、酸碱稳定性，治疗指数达到135.20，具有成为绿色高效抗生素替代品的发展潜力。

Description

色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法。

背景技术

传染类疾病对全世界范围的挑战目前仍极为突出，并且由于抗生素抗性细菌的增多而变得更加令人不安，这是社会，经济和公共卫生问题的主要诱因之一。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)在所有多细胞生物中均起着重要的宿主防御作用。与传统的抗生素通过作用于特定的细胞靶标而导致微生物死亡不同，大多数AMPs通过非受体介导的膜通透性杀灭病原微生物。膜的物理破坏作用机制导致细菌对其耐药性发展的可能性很小，因为细菌膜成分的根本变化被认为是一个缓慢的过程。因此，AMPs对抗生素敏感菌株和耐药菌株都同样有效，有望成为传统抗生素的绿色高效替代品。

然而，由于AMPs的长肽序列，低功效，不稳定，高毒性以及潜在损害先天宿主防御免疫的问题，其作为治疗药物的使用受到了一些限制，这阻碍了AMPs的开发和临床应用。在设计类似肽时，已经开发出许多方法来克服这些障碍，例如通过基序杂交来提高抗菌功效和功能性，截短/取代以降低毒性，以及从头设计以缩短肽长度并消除宿主防御免疫原性。然而，这些综合策略仅代表促进AMPs发展的现有方法的一小部分。其中，β-发夹结构作为β-折叠结构的单片层形式，由两条平行侧链和一个β-转角组成，但这种结构构成简单、无毒高效的模版尚未成熟的应用于抗菌肽的全新设计中，造成这种情况的原因包括结构特征不易明确、侧链之间交互需要的二硫键合成困难、成本较高等等，而且在这些设计中往往仅考虑抗菌肽结构功能参数的某一单一选项，使开发出的抗菌肽在其他方面比如盐粒子耐受性、血清、酸碱稳定性依然存在许多问题。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法，解决抗菌肽制备过程中考虑因素单一、序列过长、合成困难、合成成本高等问题，且非氢键位点的色氨酸与赖氨酸交互作用有效解决了抗菌肽的构效稳定性，使本发明的抗菌肽在生理盐粒子浓度、血清和极值酸碱下活性稳定。

本发明所采用的技术方案如下：一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WKFPG，所述的抗菌肽WKFPG以PG为转角单元，通过色氨酸和赖氨酸的交互作用形成β发卡结构的力，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还公开如上所述的一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WKFPG的制备方法，技术特点如下：以色氨酸和赖氨酸的交互作用作为辅助PG转角单元形成发卡结构的力，得到含色氨酸精氨酸跨链交互作用的抗菌肽模板XWYKYPGXWYKY-NH₂，当X＝R，Y＝F时，抗菌肽命名为WKFPG，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的在于提供如上所述的一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WKFPG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

本发明的原理是：首先综合考虑抗菌肽改造和设计时所需要的各种结构功能参数，将序列长度定为12个氨基酸残基，设有超过4个正电荷和50％的疏水性氨基酸，根据β-发卡结构的基本构成，使用PG刚性转角连接两个β侧链，同时创新性的利用赖氨酸的ε-亚甲基基团和色氨酸的π-电子云相互作用，替代在抗菌肽制造过程中难以合成的二硫键，提供两条平行β侧链相互吸引的力，解决抗菌肽制备过程中考虑因素单一、序列过长、合成困难、合成成本高等问题，且非氢键位点的色氨酸与赖氨酸交互作用有效解决了抗菌肽的构效稳定性，使本发明的抗菌肽在生理盐粒子浓度、血清和极值酸碱下活性稳定。

本发明的有益效果及优点：通过本方法制备的抗菌肽，序列长度短，功能参数明确，结构特征清晰，合成技术便捷，在综合考虑多肽蛋白类药物化学参数的前提下，形成稳定的β-发卡两亲性结构，对得到的抗菌肽进行抗菌、溶血和稳定性活性检测，发现WKFPG对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等多种菌株有高效的抑制作用，在检测范围内未表现出溶血活性，其治疗指数达到135.20，且在生理盐离子浓度、高浓度血清和极酸极碱环境下依旧活性良好。综上所述，WKFPG是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽WKFPG的三维结构投影图。

图2为抗菌肽WKFPG的高效液相色谱图；

图3为抗菌肽WKFPG的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

抗菌肽WKFPG的氨基酸序列为：

以β-发卡侧链的排布原则，以PG为转角单元，通过色氨酸和赖氨酸的交互作用作为辅助PG转角单元形成β发卡结构的力，设计出含色氨酸精氨酸跨链交互作用的抗菌肽模板XWYKYPGXWYKY-NH₂，其中X为正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸，当X＝R，Y＝F，时，抗菌肽命名为WKFPG。抗菌肽的序列如表1所示。

表1衍生肽的氨基酸序列

WKFPG的序列长度为12个氨基酸，两个色氨酸和四个苯丙氨酸提供充足的疏水性，转角单元为PG单元。含两个精氨酸两个赖氨酸，将肽的C端酰胺化以增加一个正电荷，总电荷数为+5。该方法使多肽具有高效抑菌活性的同时具有较低的溶血活性。

实施例2

固相化学合成法合成WKFPG抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3

抗菌肽生物学活性的测定

1、抗菌活性的测定：微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.2％BSA(含0.01％乙酸)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁶个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，用酶标仪在492nm(OD₄₉₂)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。测试进行3次独立重复，每次重复两个平行。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，WKFPG对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较高的抑菌活性。

2、溶血活性的测定：收集1mL新鲜的红细胞悬浮液，并用PBS(pH 7.4)稀释10倍。将50μL hRBCs溶液与50μL溶于PBS的倍比稀释肽置于96孔微孔板中，在37℃恒温培养箱中孵育1小时。用0.1％Triton X-100处理的hRBC悬浮液用作阳性对照，未处理的hRBC悬浮液用作阴性对照。离心(1000g，5分钟，4℃)后从混合物中收集50μL上清液，并转移至新的96孔微孔板中。溶血百分比使用以下公式计算：溶血率(％)＝[(处理样品的OD₅₇₀–阴性对照的OD₅₇₀)/(阳性对照的OD₅₇₀–阴性对照的OD₅₇₀)]×100％。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性的测定

WKFPG在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到135.20。

3、稳定性的测定：将每种浓度(300mM NaCl，9mM KCl，2mM MgCl₂、16μM ZnCl₂、12μMNH₄Cl和6μM FeCl₃)的盐粉末溶解在聚合物的BSA储备溶液中，后续步骤与抗菌活性的测定方法一致。评估血清，酸性和碱性条件对抗菌活性的影响，肽在不同浓度的血清水平(50％，25％)和不同pH水平(2、12)下孵育4小时，测定抑菌活性。检测结果见表4。

表4抗菌肽WKFPG在生理盐浓度、血清和不同pH条件下对大肠杆菌25922和金黄色葡萄球菌29213的抑菌活性(μM)

根据实验结果可以看出，WKFPG在生理浓度的盐粒子水平下、50％和25％血清及极酸极碱环境中依旧保持着良好的抑菌活性。

综合以上结果显示，以色氨酸赖氨酸为跨链交互作用，以PG为转角单元设计出的抗菌肽WKFPG具有较高的治疗指数和生物学功能稳定性，表明其具有较强的替代抗生素的潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

<140> 2020102346226

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Trp Phe Lys Phe Pro Gly Arg Trp Phe Lys Phe-NH2

1 5 10

Claims

1.一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WKFPG，其特征在于，所述的抗菌肽WKFPG以PG为转角单元，通过色氨酸和赖氨酸的交互作用形成β发卡结构的力，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WKFPG的制备方法，其特征在于，以β-发卡侧链的排布原则，以色氨酸和赖氨酸的交互作用作为辅助PG转角单元形成发卡结构的力，得到含色氨酸精氨酸跨链交互作用的抗菌肽模板XWYKYPGXWYKY-NH₂，当X＝R，Y＝F时，抗菌肽命名为WKFPG，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种色氨酸和赖氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WKFPG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。