CN110437305B

CN110437305B - 一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A及制备方法和应用

Info

Publication number: CN110437305B
Application number: CN201910659907.1A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 王家俊; 宋静; 展娜; 于伟康
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: CN110437305A

Abstract

本发明公开一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A及制备方法和应用，抗菌肽GW4A其序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明以肽W4为活性中心，以肽W4为活性中心，在其尾端用丙氨酸进行锚定，在N端用甘氨酸形成帽子结构设计出抗菌肽GW4A。GW4A的治疗指数高达137.69。抗菌肽GW4A对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、金黄色葡萄球等19种革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。

Description

一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A及制备方法和应用。

背景技术

自1928年首次发现青霉素以来，抗生素已被用于保护人类和动物超过90年。然而，近年来，随着大量抗生素耐药菌株的出现，抗生素治疗常见感染的效果迅速下降，特别是新一代抗生素的开发没有得到充分的补充。因此，新型抗菌药物的开发迫在眉睫。

抗菌肽是动物机体抵御外界微生物侵害及清除体内突变细胞的一类小分子多肽，具有广谱抗菌、无毒性、无耐药性、无残留与无污染等优点，而且其热稳定性好，添加剂量小，完全符合畜产品安全的需要，适合在饲料生产过程中使用，极具有作为新一代饲料添加剂的潜质。而且抗菌肽的抑菌机理与抗生素不同，抗菌肽是通过破坏细菌的细胞膜使细胞内溶物外泄从而杀死细胞，所以细菌不易产生耐药性。更为重要的是,抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，只作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。据上述原因抗菌肽完全有可能取代抗生素而成为一类新型、高效、低毒、无残留的抗菌物质，具有广阔的应用前景。然而，许多抗菌肽抑菌活性以及血清环境中稳定性较差，这导致它们在生物体液中快速失活并限制其进一步的临床应用。抗菌肽W4是一条富含色氨酸的广谱人工合成肽，但其抗菌活性并不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A及制备方法和应用，通过疏水氨基酸尾端锚定的方式大幅度提高W4的抗菌活性，该抗菌肽对革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌抗菌活性较高，并具备较高的盐离子和血清耐受力，同时具有内毒素中和效果。

本发明的目的通过如下技术实现：一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A，序列如SEQID No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A，制备方法如下：

(1)以肽W4为活性中心，其中肽W4序列为：RWRWWWRWR，在其尾端用丙氨酸进行锚定，在N端用甘氨酸形成帽子结构设计出抗菌肽GW4A，其序列如SEQ ID No.1所示；

(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽GW4A；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽GW4A的制备。

2、如上所述的一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性疾病药物中的应用。

本发明具有如下优点及有益效果：通过本方法设计的抗菌肽的具有高度的细胞选择性，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现抗菌肽GW4A对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、金黄色葡萄球等19种革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。综上所述，GW4A是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为抗菌肽GW4A的质谱图；

图2为抗菌肽W4A的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

以W4为活性中心，其中肽W4序列为：RWRWWWRWR，在其尾端用不同疏水氨基酸(Ala,Trp,Val,Ile,Phe,Leu)进行锚定，在N端用甘氨酸形成帽子结构设计出一系列抗菌肽；当N端添加甘氨酸，尾端锚定的是丙氨酸时命名为GW4A。当仅尾端锚定甘氨酸时GW4A、W4A的氨基酸序列如表1所示。

表1 GW4A、W4A的氨基酸序列

肽	氨基酸序列	分子量(Dalton)
			GW4A	Gly Arg Trp Arg Trp Trp Trp Arg Trp Arg Ala-NH2	1700.99
W4A	Arg Trp Arg Trp Trp Trp Arg Trp Arg Ala-NH2	1643.94

GW4A和W4A的电荷数分别+5，平均疏水值均分别为0.684、0.752。将GW4A和W4A两条肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。

实施例2

固相化学合成法合成GW4A和W4A两条抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干。

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，结果如图1、图2所示。质谱图中显示的分子量与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：抗菌肽生物学活性测定

1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性

通过表2可以看出，GW4A和W4A对于革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌的总体杀菌活性要由于W4，并且GW4A的抑菌活性优于W4A，表明GW4A具有成为新一代抗菌药物的潜力。

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；lh后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性的测定

通过表3可以看出，GW4A和W4A在检测范围内均未表现出溶血活性。

以上结果显示，综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，GW4的治疗指数是W4的1.73倍，效果提升明显，表明设计得到的GW4A抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。

3稳定性测定：在BSA肽稀释液中添加不同浓度盐离子和胎牛血清，并根据上述抗菌活性测定方法测定多肽对大肠杆菌25922的MIC值变化。测定的最终盐离子浓度分为：150mM NaCl、4.5mM KCl、6mM NH₄Cl、8mM ZnCl₂、1mM MgCl₂、2.5mM CaCl₂和4mM FeCl₃；最终血清浓度为：50％、25％和12.5％。检测结果见表4。

表4多肽的盐离子和血清稳定性

从表4可以看出，GW4A在生理浓度盐离子和高浓度血清环境中依旧保持了不错的抗菌活性，表明其具有较高的盐离子和血清耐受力，具有临床应用潜质。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A及制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Arg Trp Arg Trp Trp Trp Arg Trp Arg Ala

1 5 10

Claims

1.一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A的制备方法，其特征在于，方法如下：

步骤一、以肽W4为活性中心，其中肽W4序列为：RWRWWWRWR，在其尾端用丙氨酸进行锚定，在N端用甘氨酸形成帽子结构设计出抗菌肽GW4A，其序列如SEQ ID No.1所示；

步骤二、采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽GW4A；

步骤三、经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽GW4A的制备。

3.根据权利要求1所述的一种尾端锚定的α螺旋抗菌肽GW4A在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性疾病药物中的应用。