CN111454330B

CN111454330B - 色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

Info

Publication number: CN111454330B
Application number: CN202010234588.2A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 邵长轩; 谭鹏
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111454330A

Abstract

本发明提供一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β‑发卡抗菌肽及制备方法。抗菌肽WHFPG，其序列如SEQ ID No.1所示。制备方法利用β‑发卡结构的排布原则，以色氨酸和组氨酸的交互作用形成两条β‑侧链的相互吸引，以PG转角作为中心转角单元，得出稳定的β‑发卡两亲性抗菌肽模板XWYHYPGXWYHY‑NH₂，X＝R，Y＝F。本抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。本抗菌在中性pH条件和酸性pH条件下都可以发挥作用，在酸性pH条件下可以更强有力的抑制革兰氏阴性菌，治疗指数达到211.68，具有更广泛的临床应用潜力。

Description

色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法。

背景技术

抗生素滥用导致大量耐药细菌出现，尤其是超级细菌，已经对多种抗生素产生耐药性，因此，迫切的需要发掘和开发替代性抗菌材料。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)几乎存在于所有生命形式中，对微生物病原体具有广泛的活性。通常认为，AMP对病原体起作用的主要过程是通过静电相互作用结合细胞膜，并通过物理渗透形成多种类型的裂解，从而导致内容物外排。这种特殊的作用机制使微生物难以产生抗药性。对于包罗万象的生物医学和生物工程应用，基于多肽类的生物材料的利用已通过多种来源和方法进行，包括再生医学，抗菌剂，仿生材料等等。

尽管从天然来源中早期分离出许多AMP，如蜂毒肽，magainin和Cathelicidins有望替代抗生素，但天然AMP仍需要解决一些障碍，包括长序列，高毒性和较差的抗菌效力。因此，有许多方法，例如从头设计，序列修饰(截短/取代/杂交)，合成组合文库和模板建立已开发用于肽设计，以解决和补偿先天缺陷。这些方法都是基于对肽的共同特征的分析或系统筛选(例如阳离子性，序列，疏水性，两亲性和结构)来获得的。β发卡结构作为β折叠结构的基本和简化形式，常通过1-4对不等的半胱氨酸形成二硫键以固定发卡结构，是天然抗菌肽重要的组成部分，但多对二硫键的制备方法和合成成本都是β抗菌肽发展过程中需要迫切克服的阻碍。同时在一些炎症反应和疾病发展过程中，常常会伴随局部环境pH的下降，例如：细菌性脓肿，真菌性阴道炎等。抗菌肽在这些局部环境中的活性常常会出现抑菌活性下降、结构稳定性不强等问题。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法，能够应对局部的酸性pH环境，达到缩短序列长度，解决制备困难、合成成本高的二硫键的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WHFPG，所述的抗菌肽WHFPG以PG转角作为中心转角单元，通过色氨酸和组氨酸的交互作用形成两条β侧链的相互吸引，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

如上所述的一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WHFPG的制备方法，技术方案特点如下：利用β发卡结构的排布原则，以色氨酸和组氨酸的交互作用形成两条β侧链的相互吸引，以PG转角作为中心转角单元，得到含色氨酸组氨酸跨链交互作用的抗菌肽模板XWYHYPGXWYHY-NH₂，当X＝R，Y＝F时，抗菌肽命名为WHFPG，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明的另一目的在于提供如上所述的一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WHFPG在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

并且以上所述的应用特别用于制备治疗在酸性环境下革兰氏阴性菌引起的感染性疾病药物中的应用。

本发明的有益效果及优点：通过本方法制备的抗菌肽，序列长度短、合成方法简单、制备成本低廉，同时利用氨基酸的化学特性和结构特性，在不含有二硫键的前提下，形成稳定的β发卡两亲结构。本发明利用色氨酸的芳香族侧链与组氨酸的芳族环相互作用提供多肽分子内跨链作用力，取代往常两条侧链中半胱氨酸之间形成的二硫键所扮演的角色，在促进发卡形成折叠的同时，色氨酸可以提供充足的疏水性，能够应对局部的酸性pH环境。对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现抗菌肽WHFPG在中性pH环境下(pH＝7.4)对包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等多种菌株表现出抑制作用，在酸性pH环境下(pH＝6.0)，虽然对革兰氏阳性菌活性丢失，但对革兰氏阴性菌表现出极强的抑制作用，效力提升了3-16倍，同时综合WHFPG很低的溶血活性，表明其具备较强的临床应用价值。

附图说明

图1为抗菌肽WHFPG的三维结构投影图

图2为抗菌肽WHFPG的高效液相色谱图；

图3为抗菌肽WHFPG的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

抗菌肽WHFPG的氨基酸序列为：

Arg Trp Phe His Phe Pro Gly Arg Trp Phe His Phe-NH₂

1 5 10 12

利用β发卡结构的排布原则，以色氨酸和组氨酸的交互作用形成两条β侧链的相互吸引，以PG转角作为中心转角单元，设计出含色氨酸组氨酸跨链交互作用的抗菌肽模板XWYHYPGXWYHY-NH₂，其中X为正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸，当X＝R，Y＝F时，抗菌肽命名为WHFPG。抗菌肽的序列如表1所示。

表1衍生肽的氨基酸序列

WHFPG的序列长度为12，两个色氨酸和四个苯丙氨酸提供充足的疏水性，转角单元为PG单元。含两个精氨酸两个组氨酸，将肽的C端酰胺化以提高一个正电荷，在中性pH环境下(pH＝7.4)总电荷数为+3，在酸性pH环境下(pH＝6.0)总电荷数为+5。该方法使多肽形成稳定的β发卡结构(图1)，在酸性环境下具有高效抑制革兰氏阴性菌的功能同时具有较低的溶血活性。

实施例2

固相化学合成法合成WHFPG抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图2、3所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定

1、抗菌活性的测定：测定方法采用微量肉汤稀释法。细菌菌株在220rpm恒定摇动下于37℃孵育过夜，然后转移至新的MHB直至生长对数期。肽溶液加入含有0.01％乙酸的0.2％牛血清白蛋白中，并进行倍比稀释。将50μL的细菌

与50μL含有不同浓度肽的牛血清白蛋白(pH＝7.4或6.0)中37℃孵育18-24小时。每个测试3次重复，每个重复2个平行。只含有和不含菌的MHB分别用作阳性对照和阴性对照。通过测量492nm处的OD，将MIC计算为在肉眼和分光光度法下未观察到微生物生长的肽的最低浓度。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，WHFPG在在中性pH环境下(pH＝7.4)对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出抑菌活性，在酸性pH环境下(pH＝6.0)，对革兰氏阳性菌活性丢失，但对革兰氏阴性菌表现出极强的抑制作用，效力较中性环境中提升了3-16倍。

2、溶血活性的测定：收集1mL新鲜的红细胞悬浮液，并用PBS(pH 7.4)稀释10倍。将50μL hRBCs溶液与50μL溶于PBS的倍比稀释肽在37℃孵育1小时。用0.1％Triton X-100处理的hRBC悬浮液用作阳性对照，未处理的hRBC悬浮液用作阴性对照。离心(1000g，5分钟，4℃)后从混合物中收集50μL上清液，并转移至新的96孔微孔板中。溶血百分比使用以下公式计算：溶血率(％)＝[(处理样品的OD570–阴性对照的OD570)/(阳性对照的OD570–阴性对照的OD570)]×100％。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。

表3抗菌肽溶血活性的测定

使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，WHFPG在酸性pH环境下(pH＝6.0)治疗指数达到211.68，是中性pH环境下(pH＝7.4)的6.58倍。

综合以上结果显示，以色氨酸组氨酸为跨链交互作用，PG为转角单元设计出的抗菌肽WHFPG在中性pH条件和酸性pH条件下都可以发挥作用，在酸性pH条件下可以更强有力的抑制革兰氏阴性菌，具有更广泛的临床应用潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽及制备方法

<140> 2020102345882

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Trp Phe His Phe Pro Gly Arg Trp Phe His Phe-NH2

1 5 10

Claims

1.一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WHFPG，其特征在于，所述的抗菌肽WHFPG以PG转角作为中心转角单元，通过色氨酸和组氨酸的交互作用形成两条β侧链的相互吸引，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WHFPG的制备方法，其特征在于，利用β发卡结构的排布原则，得到含色氨酸、组氨酸跨链交互作用和PG转角单元的抗菌肽模板XWYHYPGXWYHY-NH₂，当X＝R，Y＝F时，抗菌肽命名为WHFPG，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WHFPG在制备治疗在pH＝7.4环境下革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的一种色氨酸和组氨酸跨链交互作用的β发卡抗菌肽WHFPG在制备治疗在pH＝6.0环境下革兰氏阴性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。