CN111423493B - 一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用。抗菌肽B₃C₁₆的序列为C₁₆‑GGGK(PRPR)K(PRPR)RPRP，其中C₁₆为棕榈酸，每个赖氨酸的侧链通过酰胺键各链接一个多肽支链PRPR，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻，进一步的使用棕榈酸作为抗菌肽序列的主要疏水性来源，完美规避了所有蛋白酶对疏水性氨基酸的水解，最后使用柔性氨基酸连接体GGG将棕榈酸与分支肽链接，形成完美两亲结构。该抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等标准菌和耐药菌均有高效的抑制作用，同时具有很低的溶血毒性，高浓度的蛋白酶对B₃C₁₆的水解程度很弱。

Description

一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

目前使用的大多数抗生素都是在20世纪40年代到60年代从天然微生物中提取的，近几十年缺乏对抗生素有效的更新。近些年来细菌通过靶位点的改变、增加外排或减少细胞内流、药物灭活和增加存活耐受性等途径逐渐增加对现有抗生素的抗性。由耐药细菌引起的感染事件在全球范围内逐渐增加，预计到2050年每年将导致1000万人死亡。因此，迫切需要对现有抗性机制不敏感的新型抗感染药物，以对抗日益增加的耐药菌感染。抗菌肽(Antimicrobial peptides)是一类重要的宿主防御因子，具有广泛的抗细菌，抗病毒和抗真菌活性。目前发现的大多数抗菌肽通过膜破坏来杀死细菌，这一过程需要跨膜孔形成，随后的细胞质内容物泄漏以及最终的细胞死亡。最近的研究表明抗菌肽如人类α-防御素和β-防御素3也通过抑制细菌细胞壁合成来杀死革兰氏阳性细菌。这些作用模式使抗菌肽具有逃避已知的耐药菌抗性机制的能力，使它们具有成为优于传统抗生素的新型抗感染药物。

目前，已经从动植物及微生物提取出来3000多种天然抗菌肽，但天然抗菌肽仅表现出有限的治疗功效。并且在全身给药后易于在生理条件下丧失活性。之所以出现这种现象是因为抗菌肽容易在体内发生蛋白水解降解，而抗菌肽需要保持分子的完整性才能保持其生物学活性，所以新型抗酶解抗菌肽的设计势在必行。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆，该抗菌肽B₃C₁₆抗酶解能力强，生物学活性和细胞选择性较高。

本发明所采用的技术方案如下：一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆，序列为C₁₆-GGGK(PRPR)K(PRPR)RPRP，其中C₁₆为棕榈酸，在每个赖氨酸的侧链通过酰胺键各链接一个多肽支链PRPR，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻。

本发明的另一目的在于提供如上所述的一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的制备方法，其特点是：使用脯氨酸Pro放置在每个精氨酸Arg的羧基端，形成氨基酸之间的空间位阻，同时利用赖氨酸Lys在多肽主链上添加两个分支肽链，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻，进一步的使用棕榈酸作为抗菌肽序列的疏水性来源，最后使用柔性氨基酸连接体GGG将棕榈酸与分支肽链接，形成完美两亲结构，将该分支型棕榈酸化抗酶解抗菌肽命名为B₃C₁₆，序列为C₁₆-GGGK(PRPR)K(PRPR)RPRP。

本发明的另一目的在于提供如上所述的一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病药物中的应用。

其优选在于：

1、如上所述的革兰氏阴性菌包括耐环丙沙星绿脓杆菌。

2、如上所述的革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

本发明通过使用棕榈酸替代传统抗菌肽中的疏水性氨基酸，同时根据蛋白酶学合理排列氨基酸顺序，从而有效地规避酶切位点，进一步的在多肽部分添加分支肽序列，使蛋白酶难以识别从而达到抗酶解的目的。对得到的抗菌肽进行抗菌活性、溶血活性和抗蛋白酶水解能力检测，发现棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆不但对大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌等革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，而且对耐环丙沙星绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等耐药菌有高效的抑制作用，同时具有很低的溶血毒性；并且高浓度的胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白酶K，对B₃C₁₆的降解程度很弱，因而，综合来看，B₃C₁₆是一种具有较高实际应用潜力的抗菌肽。

附图说明

图1为棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的溶血活性图。

图2为棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的质谱图。

图3为棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的高效液相色谱图。

图4为棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的3D结构图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计：

棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的序列为：

C₁₆-GGGK(PRPR)K(PRPR)RPRP

通过空间位阻的方法规避胰蛋白酶的水解作用，即使用保护氨基酸脯氨酸(Pro)放置在每个正电荷氨基酸精氨酸(Arg)的羧基端，形成氨基酸之间的空间位阻，同时利用赖氨酸(Lys)在多肽主链上添加两个分支肽链，如图4所示，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻，进一步的使用棕榈酸作为抗菌肽序列的主要疏水性来源，完美规避了所有蛋白酶对疏水性氨基酸的水解，最后使用柔性氨基酸连接体GGG将棕榈酸与分支肽链接，形成完美两亲结构，将全新设计出的分支型棕榈酸化抗酶解抗菌肽命名为B₃C₁₆，序列为C₁₆-GGGK(PRPR)K(PRPR)RPRP。抗菌肽的序列如表1所示。

表1棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的主要参数

B₃C₁₆为棕榈酸化的分支型抗菌肽，正电荷数为6，分子量为2203.77。

其结构式为：

实施例2

将上述抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：

1、多肽主链的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、使用水合肼脱去Fmoc-Lys(Dde)-OH侧链Dde保护基团，重复步骤1，完成支链氨基酸链接。

3、在上述得到的多肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

4、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；

5、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图2)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％(见附图3)。

实施例3

对设计并合成得到的抗菌肽通过体外抑菌活性、溶血活性以及蛋白酶水解的能力进行检测；

1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。挑取细菌单菌落在MHB培养基中培养过夜，并转移至新的MHB中生长到对数中期。然后将上述细菌溶液离心并重悬于MHB中至终浓度为1×10⁵CFU ml^-1，并将其转移到96孔板中，每孔50μl。将50μl含有不同浓度肽的BSA分别加入到上述的96孔板中，96孔板中的最终肽浓度范围为0.125至64μM。在37℃温育22-24小时后，用酶标仪在492nm(OD＝492nm)处测定光吸收值,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。

表2棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的抑菌活性

注：^a GM为几何平均数。

通过表2可以看出，B₃C₁₆对于革兰氏阴性、革兰氏阳性菌和耐药菌均表现出高效的抑菌活性。

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2ml PBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μL PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。多肽溶血活性检测结果见图1。溶血率越低，表明多肽越安全。通过图1可以看出，B₃C₁₆在64μM以下的浓度检测范围内没有明显的溶血活性。溶血活性远高于抑菌活性，表明B₃C₁₆具有极高的实际应用潜力。

3、蛋白酶抗性：为了检验抗菌肽对抗蛋白酶水解的能力，我们测定了抗菌肽经过不同类型蛋白酶处理后的抑菌活性。在37℃水浴条件下，用不同反应浓度为的胰蛋白酶、胃蛋白酶、靡蛋白酶和蛋白酶K溶液分别处理抗菌肽，时间为1h，然后按照抗菌活性的测定中的方法，将这些处理后的多肽与菌液混合于96孔培养板的孔中，以此来测定多肽经过蛋白酶处理后的最小抑菌浓度是否发生了变化。对照组为没有经过蛋白酶处理的组别，测试结果见表3。

表3蛋白酶处理后的B₃C₁₆对E.coli ATCC25922的最小抑菌浓度

注：^a蛋白酶浓度均为8mg/mL。

通过表3可以看出，糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K对B₃C₁₆的抑菌活性均没有明显影响，这表明全新设计的棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆具有优异的抵抗高浓度蛋白酶水解的能力。

以上结果显示，通过分支化与棕榈酸化相结合，氨基酸之间空间位阻与肽链之间空间位阻相结合的方法，全新设计出的棕榈酸化抗酶解抗菌肽可以有效提高多肽类抗菌素的抗酶解能力。综合分析上述结果，抗菌肽B₃C₁₆对包括耐药菌在内的多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度可达微摩尔级别，展现了高效的抑制能力；同时B₃C₁₆具有极高的安全性和蛋白酶稳定性，表明全新设计出的棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆具有较高的替代抗生素的发展潜力。

Claims (5)

1.一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆,其特征在于，抗菌肽B₃C₁₆的序列为C₁₆-GGGK(PRPR)K(PRPR)RPRP，其中C₁₆为棕榈酸，每个赖氨酸的侧链通过酰胺键各链接一个多肽支链PRPR，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻。

2.根据权利要求1所述的一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆的制备方法，其特征在于：使用脯氨酸Pro放置在每个精氨酸Arg的羧基端，形成氨基酸之间的空间位阻，同时利用赖氨酸Lys在多肽主链上添加两个分支肽链，形成树枝状结构和肽链之间的空间位阻，进一步的使用棕榈酸作为抗菌肽序列的疏水性来源，最后使用柔性氨基酸连接体GGG将棕榈酸与分支肽链接，形成完美两亲结构，将该分支型棕榈酸化抗酶解抗菌肽命名为B₃C₁₆，其序列为C₁₆-GGGK(PRPR)K(PRPR)RPRP。

3.如权利要求1所述的一种棕榈酸化抗酶解抗菌肽B₃C₁₆在制备治疗革兰氏阴性菌和葡萄球菌感染性疾病的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阴性菌为耐环丙沙星绿脓杆菌。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

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