CN115785220A - 一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽及其制备方法和应用,抗菌肽序列如SEQ ID No.1所示。选择Trp和Arg作为疏水和带电核心,并将Arg置于Trp前方,随后利用Pro对Trp和Arg进行保护,得到RPWP的序列结构单元,将该结构单元重复5遍后得到一条抗酶解短肽,将其C端酰胺化。本抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌菌种有明显的杀菌作用,且溶血活性和细胞毒性较低,抗菌活性高达6.50μM,细胞选择性指数达到39.40。在人工模拟肠胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液仍保持良好的抗菌活性,并显著降低大肠杆菌感染小鼠腹腔内的细菌负载量,在动物体内同样具备优异的抗菌功能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽是广泛存在于动植物体内的一类具有杀菌作用的小分子多肽,而Trp富集肽则是抗菌肽家族中极为重要的一个分支,其所具有的丰富的Trp和Arg不仅可以提高多肽对磷脂膜的穿透力,还可以显著增强多肽与阴离子膜表面的结合作用进而实现高效杀菌。因此,具有高抗菌活性、杀菌速率快、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点的Trp富集肽是替代抗生素的理想药物。然而,Trp富集肽的实际饲喂效果并不理想,其蛋白酶稳定性较低,易被肠道内消化蛋白酶降解,从而无法发挥抗菌作用,这无疑限制了抗菌肽作为饲用替抗药物的进一步发展。
发明内容
基于以上不足之处,本发明的目的在于提供一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽 RP5-WP5,其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,分子式如式(I)所示:
本发明的另一目的是提供以上所述的高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽RP5-WP5的制备方法,步骤如下:
(1)选择Trp和Arg作为疏水和带电核心,并将Arg置于Trp前方,随后利用Pro对Trp和Arg进行保护,得到RPWP的序列结构单元,将该结构单元重复5遍后得到一条肽,并将其C端酰胺化,序列如SEQ ID No.1所示;
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂,将得到的肽树脂经过TFA切割后,得到多肽;
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后,即完成该多肽的制备,再经过抗菌活性检测、溶血活性的测定、细胞毒性测定、杀菌动力学测定、蛋白酶抗性检测、抑菌机理测定及体内活性测定,最后将所述的多肽命名为抗菌肽RP5-WP5。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽RP5-WP5在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果及优点:本发明的抗菌肽RP5-WP5具有高度的细胞选择性和抗酶解能力。对抗菌肽RP5-WP5进行抗菌活性和生物相容性检测,发现抗菌肽RP5-WP5对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有明显的杀灭作用,对所测试的常见病原菌的平均抗菌活性高达6.50μM,与此同时,抗菌肽RP5-WP5的溶血活性和细胞毒性较低,细胞选择性指数达到39.40。此外,抗菌肽RP5-WP5在人工模拟肠胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液中仍能保持良好的抗菌活性,表明其具有较强的蛋白酶抵抗力。体内活性检测结果显示,抗菌肽RP5-WP5可以显著降低大肠杆菌感染小鼠腹腔内的细菌负载量,说明其在动物体内同样具备优异的抗菌功能,未来极有可能作为抗菌药物投入临床治疗使用。综上所述,抗菌肽RP5-WP5是一种极具发展潜能的应用价值较高的抗酶解短肽。
附图说明
图1为抗菌肽RP5-WP5的质谱图;
图2为抗菌肽RP5-WP5的色谱图;
图3为抗菌肽RP5-WP5溶血活性的测定图;
图4为抗菌肽RP5-WP5细胞毒性的测定图;
图5为抗菌肽RP5-WP5对E.coli ATCC 25922杀菌动力曲线图;
图6为经蛋白酶处理后的抗菌肽RP5-WP5的Tricine-SDS-PAGE图;
图7为抗菌肽RP5-WP5对E.coli ATCC 25922的细胞外膜透化作用图;
图8为抗菌肽RP5-WP5对E.coli ATCC 25922的质膜电势变化图;
图9为抗菌肽RP5-WP5对小鼠腹膜炎的治疗效果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
短肽的设计:选择Trp和Arg作为疏水和带电核心,并将Arg置于Trp前方,随后利用Pro对Trp和Arg进行保护,得到具有高蛋白酶稳定性的氨基酸序列模板(Arg Pro TrpPro)n,当n=5时命名为RP5-WP5,该肽的氨基酸序列如表1所示。
表1抗菌肽RP5-WP5的氨基酸序列
抗菌肽RP5-WP5的分子结构式如式(I)所示:
实施例2
固相化学合成法合成抗菌肽RP5-WP5
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行,通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂,然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂;再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y,Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸);按照这个程序依次从C端合成到N端,直至合成完毕,得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。
2、在上述得到的肽树脂中,加入切割试剂,20℃避光下反应2h,过滤;沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤,将洗液与上述滤液混合,旋转蒸发仪浓缩,再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚,-20℃沉淀3h,析出白色粉末物,以2500×g离心10min,收集沉淀,再用无水乙醚洗涤沉淀,真空干燥,得到多肽,其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷) 按照质量比95:2.5:2.5混合而成。
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH 7.5)进行柱平衡30min,用90%乙腈水溶液溶解多肽,过滤,C18反相常压柱,采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70~70:30混合),流速为1mL/min,检测波为220nm,收集主峰,冻干;再利用反相C18柱进一步纯化,洗脱液A为0.1%TFA/水溶液;洗脱液B为0.1%TFA/乙腈溶液,洗脱浓度为25%B~40%B,洗脱时间为12min,流速为1mL/min,再同上收集主峰,冻干。
4、抗菌肽的鉴定:将上述得到的抗菌肽通过电喷雾质谱法和色谱法进行分析,结果如图1、图2所示。质谱图中显示的分子量与表1中的理论分子量基本一致,色谱图结果显示抗菌肽的纯度大于95%。
实施例3:抗菌肽生物学活性测定
1、抗菌活性的测定:将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01%乙酸(含0.2%BSA)作为稀释液,使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中,然后分别添加等体积的待测菌液(~105CFU/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌肽)。37℃恒温培养24h,肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性
通过表2可以看出,抗菌肽RP5-WP5可以在较低浓度下杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌,说明抗菌肽RP5-WP5极具成为新型抗菌药物的发展潜力。
2、溶血活性的测定:采集人的新鲜血液1mL,肝素抗凝后溶解到2mL PBS溶液中,1000×g离心5min,收集红细胞;用PBS洗涤3遍,再用10mL PBS重悬;取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀,在37℃培养箱内恒温孵育 l h后取出,4℃、1000×g离心5min;取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值;每组取平均值,并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照;50μL红细胞加50 μL 0.1%Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10%溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图3及表3。
表3抗菌肽RP5-WP5的选择性指数计算
*最小溶血浓度>128μM时,用256μM计算选择性指数
通过图3及表3可以看出,抗菌肽RP5-WP5在检测范围内未表现出>10%的溶血活性。
综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性,可以通过选择性指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出,抗菌肽RP5-WP5具有极佳的选择性指数,表明设计得到的抗菌肽RP5-WP5具有成为新型替抗药物的潜能。
3、细胞毒性测定:将冻存于液氮中的细胞复苏后接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的培养基中,在37℃、5%CO2条件下传代培养。将培养好的细胞用0.25%胰酶消化,用培养基将其调整至2~4×105cells/mL。将50μL细胞悬液与50μL不同浓度的多肽混合于96孔板中,在37℃、5%CO2条件下孵育24h,随后每孔加入25μL MTT (5mg/mL),继续孵育4h。孵育结束后,弃去上清,用100μL DMSO溶解孔底结晶,用酶标仪在570nm处测定每孔吸光度值。培养基孔作为空白对照。检测结果见图4及表4。
表4经抗菌肽RP5-WP5处理后的细胞存活率
从图4及表4可以看出,抗菌肽RP5-WP5除了对RAW 264.7具有一定的毒性外,对其他三种细胞的半数致死量均超过128μM,说明抗菌肽RP5-WP5具有良好的生物相容性,具有成为抗生素替代品的潜力。
4、杀菌动力学测定:(1)菌液准备:取冻存于-20℃的E.coli ATCC 25922划线接种于MHA固体培养基,37℃过夜培养。随后挑单菌落接种于MHB中,220rpm,37℃培养至对数生长期,用PBS调整其浓度至OD600nm=0.1,最后用PBS进一步稀释1000倍至0.5~1×105CFU/mL。(2)杀菌动力曲线测定:将菌液与1×MIC浓度抗菌肽混合,于不同时间点(0s、15s、30s、45s、60s、3min、5min、10min、15min、30min)取样50μL倍比稀释,涂布于相应的固体培养基进行培养,随后计算每个时间点细菌存活率,绘制曲线。检测结果见图5。
从图5可以看出,抗菌肽RP5-WP5在1×MIC浓度下,1min内就杀灭了100%的E.coli25922菌体细胞,具有极快的杀菌速率,表明抗菌肽RP5-WP5抗菌活性较强。
5、抗菌肽的蛋白酶抗性:取适量体积抗菌肽RP5-WP5母液(2.56mM),真空干燥后加入等体积模拟人胃肠液或10mg/mL糜蛋白酶溶液,37℃条件下孵育6h后,超声震荡,取出适量体积样品直接检测其对待测菌株MIC值的变化。剩余样品100℃水浴加热 30min,13000×g离心30min后取上清,利用SDS-PAGE蛋白胶检测经模拟人胃肠液和10 mg/mL糜蛋白酶溶液处理后的抗菌肽RP5-WP5的留存情况。测试结果见表5和图6。
表5蛋白酶处理后的抗菌肽RP5-WP5对E.coli 25922的最小抑菌浓度
a人工模拟肠液配方:取磷酸二氢钾6.8g,加水500mL使其溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰酶10g,加水适量使溶解,将两液混合,加水稀释至1000 mL。
b10mg/mL
c人工模拟胃液配方:取稀盐酸16.4mL,加水约800mL,与10g胃蛋白酶混匀后,加水稀释至1000mL。
通过表5可以看出,人工模拟肠胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液对抗菌肽RP5-WP5的抑菌活性影响较小;从图6可以看出,经蛋白酶处理后的抗菌肽RP5-WP5蛋白条带与对照组蛋白条带相似,说明抗菌肽RP5-WP5在人工模拟肠胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液中没有被降解。以上结果表明,抗菌肽RP5-WP5具有较强的蛋白酶抵抗力,在临床治疗中具有显著优势。
实施例4:抗菌肽的抑菌机理测定
1、细胞外膜通透性试验:本试验采用1-N-phenylnaphthylamine(NPN)摄入试验来检测多肽对待测菌株细胞外膜的穿透性。具体步骤如下:(1)菌液准备:将处于对数生长期的E.coli ATCC 25922离心(5000×g,5min)收集,用5mM HEPES缓冲液(pH=7.2,含 5mM葡萄糖)冲洗三遍后,重悬至OD600nm=0.4,加入终浓度为10μM NPN,室温条件下避光孵育30min。(2)样品测定:将等体积菌液与不同浓度的多肽混合于黑色96孔板中,使用荧光分光光度计在激发波长350nm、发射波长420nm条件下检测样品荧光强度。检测结果见图7。
从图7可以看出,抗菌肽RP5-WP5在1-16μM时对E.coli 25922细胞外膜的破坏作用呈剂量依赖效应,肽浓度越高,荧光强度越高。
2、细胞质膜去极化性试验:本试验采用膜电势敏感染料DiSC3-5来检测抗菌肽对细菌细胞质膜电势的影响。具体步骤如下:(1)菌体准备:将处于对数生长期的E.coli ATCC25922离心(5000×g,5min)收集,用5mM HEPES缓冲液(pH=7.2,含20mM葡萄糖) 冲洗三遍后,重悬至OD600nm=0.05,加入终浓度为0.4μM DiSC3-5,室温条件下避光孵育 1.5h。再加入终浓度为100mM K+,继续孵育30min。(2)向1cm石英比色皿中加入2mL 准备好的菌液,在622nm激发光波长、670nm发射光波长条件下,使用F-4500荧光分光光度计检测菌液基础荧光值。最后向菌液中加入不同浓度的待测抗菌肽,记录荧光强度变化。检测结果见图8。
从图8可以看出,抗菌肽RP5-WP5对大肠杆菌细胞质膜的去极化作用呈剂量和时间依赖效应。抗菌肽RP5-WP5可以快速引起荧光强度上升,说明抗菌肽RP5-WP5可以通过破坏革兰氏阴性菌的细胞质膜或膜离子通道有效杀灭细菌。
实施例5:抗菌肽的体内活性测定
小鼠腹膜炎治疗试验:设定三个处理组,每个处理组8只小鼠。适应性饲养1周后,腹膜注射接种200μL的1.5×108CFU/mL E.coli ATCC 25922。在感染后0.5h、2h、4h和 8h,用生理盐水溶液(对照)、10mg/kg抗菌肽RP5-WP5或1mg/kg多粘菌素B对小鼠进行腹腔注射。监测动物痛苦迹象,并且24h前未达到安乐死标准的小鼠被定义为“存活”。 24h后对所有存活小鼠实施安乐死。向每只小鼠腹膜内注射5mL无菌生理盐水溶液,采集每只小鼠的腹膜液,脾脏和肝脏用于菌落数分析。检测结果见图9。
从图9可以发现与对照组相比,抗菌肽RP5-WP5可以显著降低各组织器官的细菌负载量,有效说明了抗菌肽RP5-WP5在动物体内同样具有不错的杀菌能力,从而有效提高腹膜炎小鼠的生存率。
Claims (3)
2.根据权利要求1所述的一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽RP5-WP5的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)选择Trp和Arg作为疏水和带电核心,并将Arg置于Trp前方,随后利用Pro对Trp和Arg进行保护,得到RPWP的序列结构单元,将该结构单元重复5遍后得到一条肽,并将其C端酰胺化,序列如SEQ ID No.1所示;
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂,将得到的肽树脂经过TFA切割后,得到多肽;
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后,即完成该多肽的制备,再经过抗菌活性检测、溶血活性的测定、细胞毒性测定、杀菌动力学测定、蛋白酶抗性检测、抑菌机理测定及体内活性测定,最后将所述的多肽命名为抗菌肽RP5-WP5。
3.根据权利要求1所述的一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽RP5-WP5在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。
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