CN108570103A - 一种富含色氨酸抗菌肽wk12及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种富含色氨酸抗菌肽WK12及其制备方法和应用。其序列如序列表SEQ ID No.2所示。制备方法：通过对猪源抗菌肽PMAP‑36中特征性片段的截取和改造，得到了以WXYX为骨架序列重复三次的衍生肽WK12。采用固相化学合成法通过多肽合成仪合成多肽，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备。抗菌肽WK12在制备治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。其治疗指数高达90.46，是PMAP‑36治疗指数的35.9倍。通过该方法制备的抗菌肽在保证衍生肽高抗菌活性的前提下，降低了抗菌肽的肽链长度，提高了抗菌肽的细胞选择指数，具有成为抗生素替代物的潜质。

Description

一种富含色氨酸抗菌肽WK12及其制备方法和应用

技术领域

本项发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种富含色氨酸抗菌肽WK12及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽是普遍存在于生物体天然免疫系统中的一类小分子多肽，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能，在机体非特异性免疫应答中扮演重要角色，被认为是最具抗生素替代潜质的新型抗菌药物。抗菌肽同时具有无污染、无残留的特点，主要通过物理性破坏细胞膜的通透性发挥抗菌作用，大大降低了细菌产生耐药性的机率，具有极其广阔的应用前景。

但目前抗菌肽的应用仍受到一些因素的制约，如天然抗菌肽的体内表达量较低，抑菌活性较弱；部分抗菌肽在杀灭病原微生物的同时对机体正常细胞也产生毒性，细胞选择性差；天然抗菌肽的肽链普遍较长，人工合成成本较高，不利于开发。因此，寻找一种能够缩短抗菌肽肽链，提高抗菌肽抗菌活性和细胞选择性的方法对于抗菌肽的开发与应用具有重要意义。

Cathelicidins家族是抗菌肽中最重要的亚家族。在猪源cathelicidins家族抗菌肽中PMAP-36由36个氨基酸组成，表现出最高的正电荷性，其活性中心位于N-端，具有典型的α-螺旋二级结构。PMAP-36具有广谱抗菌活性，且抑菌机制为破坏细菌细胞膜的完整性，最终引起菌体细胞死亡。但PMAP-36的肽链较长，合成成本高，且具有细胞毒性。以高抗菌活性天然抗菌肽为模板，设计出细胞毒性低的高选择性抗菌肽是目前急需解决的问题。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种富含色氨酸抗菌肽WK12及其制备方法和应用，该抗菌肽具有高抗菌活性低细胞毒性。

本发明的目的通过如下技术实现：一种富含色氨酸抗菌肽WK12，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述的一种富含色氨酸抗菌肽WK12的方法，步骤如下：

(1)分析抗菌肽PMAP-36的N-端氨基酸序列，发现了以XXYX为骨架序列重复三次的12肽RK12，其中X为带正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸或中性氨基酸，将XXYX骨架序列中的首位带正电荷氨基酸替代为色氨酸W得到以(WXYX)₃为序列模板的抗菌肽WK12；

(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到该条多肽；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备。

2、如上所述的一种富含色氨酸抗菌肽WK12在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。

本发明抗菌肽WK12根据抑菌和溶血活性计算治疗指数发现，其治疗指数高达90.46，是PMAP-36治疗指数的35.9倍，具有较高的细胞选择性。抗菌肽WK12对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等六种菌种都具有强抑菌活性，对血细胞未产生溶血作用。综上所述，WK12是一种具有较高应用价值的抗菌肽。通过本方法制备的抗菌肽在保证衍生肽高抗菌活性的前提下，降低了抗菌肽的肽链长度，提高了抗菌肽的细胞选择指数，具有成为抗生素替代物的潜质。

附图说明

图1是抗菌肽RK12的质谱图。

图2是抗菌肽WK12的质谱图。

图3是抗菌肽的溶血活性图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽的设计

分析抗菌肽PMAP-36的N-端氨基酸序列，发现了以XXYX为骨架序列重复三次的12肽RK12，其中X为带正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸或中性氨基酸。将XXYX骨架序列中的首位带正电荷氨基酸替代为色氨酸(W)得到以(WXYX)₃为序列模板的抗菌肽WK12。

表1抗菌肽的氨基酸序列、分子量、电荷、疏水值、疏水力矩

两条肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。如表1所示，经过质谱法对分子量进行分析，理论分子量和实际分子量吻合。RK12含有带有10个正电荷，疏水值为-6.16，疏水力矩为3.68。WK12带有7个正电荷，疏水值为-1.25，疏水力矩为0.75。通过该方法缩短了肽链长度，降低了抗菌肽的抗菌活性。同时提高抗菌肽的疏水性，可有效增强抗菌肽的抗菌活性。进而提高抗菌肽的细胞选择性，具有替代抗生素的潜力。

实施例2

固相化学合成法合成抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1和图2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3：

抗菌肽抗菌和溶血活性测定

1、抗菌活性测定：将合成的多肽溶解于无菌去离子水中，配制成一定浓度的存储液。在96孔无菌细胞培养板中以MHB培养基为介质，采用二倍倍比稀释法梯度稀释抗菌肽储存液至不同浓度备用。将对数生长期的待测菌在MHB培养基中调整菌落浓度至～10⁵个/mL，等体积加入含有抗菌肽的96孔培养板，混合均匀，于37℃恒温培养18h。设置不加细菌孔为阴性对照，不加抗菌肽孔为阳性对照。以阴性和阳性对照孔的细菌生长特性为参照，无肉眼可见培养基浑浊的最低抗菌肽浓度即为该抗菌肽对测定菌的最小抑菌浓度。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性

由表2可以看出，RK12抗菌活性最弱，除在64μM对E.coli UB1005表现出抑菌活性外，对其它几种测定菌在最大测定浓度(128μM)均未表现出抑菌活性。WK12的抗菌活性显著高于RK12，与原肽PMAP-36相似，对几种测定菌的最小抑菌浓度为2或4μM。表明以(WXYX)₃为序列模板衍生的富含色氨酸抗菌肽具有高抗菌活性。

2、抗菌肽溶血活性测定和治疗指数：采集健康捐献者血液1mL于抗凝管中，1000g离心5min，收集红细胞。经10mM PBS缓冲液洗涤三次后，在PBS中重悬，定容至10mL备用。在96孔细胞培养板中加入PBS缓冲液，采用二倍倍比稀释法梯度稀释抗菌肽储存液至不同浓度。等体积加入红细胞悬液，于37℃恒温孵育1h，孵育结束后，1000g离心5min，转移上清至新的96孔培养板中，在570nm处测定吸光度值。以红细胞加PBS组作为阴性对照，以红细胞加0.1％Triton X-100作为阴性对照组，溶血率的计算公式为：溶血率(％)＝(抗菌肽处理组的吸光度值-阴性对照吸光度值)/(阳性对照吸光度值-阴性对照吸光度值)×100。最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时最低的抗菌肽浓度。

抗菌肽对不同细胞的选择性作用通过治疗指数来评价。抗菌肽的治疗指数为抗菌肽最小溶血浓度与最小抑菌浓度几何平均数的比值。如抗菌肽在最高测定浓度128μM仍未表现出抑菌活性，则256μM将用于计算抗菌肽最小抑菌浓度的几何平均数。同样，如抗菌肽在最高测定浓度128μM仍未表现出溶血活性，则256μM将作为最小溶血浓度用于计算治疗指数。治疗指数越大，表明该抗菌肽对细菌具有更高的抑菌活性，同时又保持较低的细胞毒性，说明抗菌肽具有更高的细胞选择性。溶血活性和治疗指数结果见表3。

表3抗菌肽的溶血活性和治疗指数

RK12和WK12在最大测定浓度(128μM)均未表现出溶血活性，而PMAP-36在低浓度时就引起明显的溶血。计算治疗指数发现，WK12的治疗指数分别是PMAP-36和RK12的35.9和71.8倍，说明WK12具有更高的细胞选择性。

以上结果显示，通过对天然猪源抗菌肽PMAP-36的改造得到的以(WXYX)₃为序列模板设计的抗菌肽，具有高抗菌活性、低细胞毒性，可提高抗菌肽的治疗指数，并降低肽链长度，减少合成成本，具有替代抗生素的发展潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种富含色氨酸抗菌肽WK12及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

Arg Arg Leu Arg Lys Lys Thr Arg Lys Arg Leu Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

Trp Arg Leu Arg Trp Lys Thr Arg Trp Arg Leu Lys

1 5 10

Claims (3)

1.一种富含色氨酸抗菌肽WK12，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.一种制备如权利要求1所述的一种富含色氨酸抗菌肽WK12的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分析抗菌肽PMAP-36的N-端氨基酸序列，发现了以XXYX为骨架序列重复三次的12肽RK12，其中X为带正电荷氨基酸，Y为疏水性氨基酸或中性氨基酸，将XXYX骨架序列中的首位带正电荷氨基酸替代为色氨酸W得到以(WXYX)₃为序列模板的抗菌肽WK12；

(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到该条多肽；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备。

3.根据权利要求1所述的一种富含色氨酸抗菌肽WK12在制备治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。