CN106496333A - 一种利用枯草芽孢杆菌表达杂合肽及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明目的在于提供一种利用枯草芽孢杆菌表达杂合肽及制备方法和应用，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。制备方法如下：人工设计融合基因SPAmyQ‑SUMO‑PR‑FO和SPSacB‑SUMO‑PR‑FO，在两端加入了EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位点，将目的基因与表达载体pGJ148连接，利用化学方法将质粒转入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，利用麦芽糖诱导发酵产生融合表达产物。通过SUMO酶切后得到杂合肽PR‑FO。本抗菌肽PR‑FO是通过PRW4与α‑螺旋型抗菌肽Fowlicidin‑2进行杂合得到，与原肽PRW4相比表现出强烈的杀菌活性，较高的稳定性和细胞选择。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌表达杂合肽及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及到一种利用枯草芽孢杆菌表达杂合肽及制备方法和应用。
背景技术
毫无疑问，抗生素的发明和使用是人类科学史上的一个里程碑。在早期，抗生素的治疗效果是非常好的，在同一时间内也给畜牧业带来了巨大的好处。但是抗生素的滥用使得许多耐药菌株出现，同时在机体内出现残留，这些都会引起一系列的安全问题。因此，人们不得不重新审视抗生素。所以，开发一种能够替代抗生素同时不会产生这些安全问题的新型药物迫在眉睫。而抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)正是这种新型药物，由于其很少甚至是不会产生耐药性，同时不会在机体内有残留得到科学家们的关注。
抗菌肽PR-FO是一种新型杂合肽，是通过PRW4与抗菌肽α-螺旋型Fowlicidin-2进行杂合得到的肽。我们将截取的线性PMAP-36的16个N-末端氨基酸残基中的第七位和第十一位的赖氨酸用色氨酸进行替换得到PRW4。Fowlicidin-2(FO)是从鸡的骨髓源细胞中提取的一种α-螺旋型抗菌肽，在其肽链中间有一个扭结，具有抗菌活性高、稳定性强、杀菌迅速等特点。
抗菌肽做为抗生素的替代物其在医疗、食品和畜牧业中有着极大的应用前景。抗菌肽要想广泛的应用于各个领域，必须解决高产量合成问题。抗菌肽在大部分自然生物中含量很低，直接从生物体中提取难度较大、费时且对环境有害；而利用化合合成的话成本太高，价格昂贵，不适合用于大规模的工业生产。基因工程技术由于生产成本相对较低，周期较短，成为一种重要的获取抗菌肽的有效手段。在抗菌肽表达系统中，大肠杆菌表达系统占有重要地位，但也存在一些缺点，如分泌蛋白形成无活性的包涵体，分泌物中含有革兰氏阴性菌的细胞壁成分如热源性脂多糖，对后期纯化分离带来困难。
发明内容
基于以上不足之处，本发明目的在于提供一种具有抗菌活性杂合肽PR-FO及其制备方法和应用，为抗菌肽的大规模生产提供理论基础与实验依据。
本发明的目的通过如下技术实现：一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、如上所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO的制备方法如下：
(1)将PMAP-36的16个N-末端氨基酸残基中的第七位和第十一位的赖氨酸用色氨酸进行替换得到PRW4，与从是鸡的骨髓源细胞中提取Fowlicidin-2与其杂合获得杂合肽PR-FO，并在5’端加上EcoRⅠ酶切位点、信号肽SPamyQ(SPsacB)、6×His标签、SUMO，在3’端加上终止密码子和BamHⅠ酶切位点；
(2)基因工程方法构建两种质粒pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO和pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO；
(3)利用麦芽糖为诱导剂，对融合蛋白进行诱导表达；
(4)NI-NTA柱对融合蛋白进行纯化；
(5)SUMO酶切融合蛋白获得杂合肽纯品。
2、如上所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
3、如上所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO的制备方法，步骤(3)中两种质粒pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO和pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO最适发酵麦芽糖浓度分别为3％和5％。
4、如上所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO的制备方法，步骤(4)中含50mM、100mM和200mM咪唑的洗脱液都可将融合蛋白从Ni-NTA柱上洗脱下来。
本发明选用枯草芽孢杆菌做为宿主菌，因其具有非致病性、无明显密码子偏好性、能自主的向细胞外分泌功能蛋白等特点，是公认的安全微生物。宿主菌选择枯草芽孢杆菌WB800N为蛋白缺陷菌株，缺少nprE、nprB、aprE、epr、mpr、bpf、vpr、wprA八种蛋白酶基因，并含有新霉素抗性为遗传标记，一方面避免目的蛋白酶解，一方面有助于阳性菌筛选。诱导高效启动子Pglv，以麦芽糖为诱导剂，与IPTG和木糖相比价格更低廉、安全性更高，同时麦芽糖又可以做为发酵培养基里的营养物质。SUMO融合标签的使用可促进蛋白表达，增加目的蛋白的可溶性，促进目的蛋白正确折叠。本研究成功利用基因工程技术在枯草芽孢杆菌中表达了具有抗菌活性的杂合肽PR-FO，为抗菌肽的大规模生产提供理论基础与实验依据。本抗菌肽PR-FO是通过PRW4与α-螺旋型抗菌肽Fowlicidin-2进行杂合得到，与原肽PRW4相比表现出强烈的杀菌活性，较高的稳定性和细胞选择。原因在于C末端存在的扭结，更好的抵抗蛋白酶水解作用，同时其正电荷数，极性表面和疏水表面的理想分布对于其治疗指数和细胞选择性有关键作用。PR-FO具有较高的内毒素中和能力，这对于治疗由革兰氏阴性菌引起的败血症和畜禽血液传染病具有很高的潜在应用价值。
附图说明
图1为重组表达载体pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO构建测序结果图。
图2为重组表达载体pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO构建测序结果图。
图3为融合蛋白梯度洗脱结果图，
其中，a是带有质粒pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO的菌株发酵液Ni-NTA纯化后的SDS-PAGE电泳图；
B是带有质粒pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO的菌株发酵液Ni-NTA纯化后的SDS-PAGE电泳图。
图4为杂合肽Tricine-SDS-PAGE检测结果图，
其中，M为蛋白分子Maker；1为杂合肽PR-FO。
图5为重组PR-FO的溶血活性结果图。
具体实施方式
实施例1杂合肽PR-FO的基因合成
抗菌肽PR-FO是PRW4与抗菌肽α-螺旋型Fowlicidin-2进行杂合得到的肽。将截取的线性PMAP-36的16个N-末端氨基酸残基中的第七位和第十一位的赖氨酸用色氨酸进行替换得到PRW4。Fowlicidin-2(FO)是从鸡的骨髓源细胞中提取的一种α-螺旋型抗菌肽，将两段抗菌肽杂合获得杂合肽PR-FO，其氨基酸序列为RFRRLRWKTRWRLKKIRFGRFLRKIRRFRPK。人工设计编码PR-FO的基因片段，并在5’端加上EcoRⅠ酶切位点、信号肽SPamyQ(SPsacB)、6×His标签、SUMO，在3’端加上终止密码子和BamHⅠ酶切位点。基因合成由上海生工生物工程技术服务公司完成。
实施例2表达质粒的构建
将目的基因与表达载体pGJ148质粒分别用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有目的条带的凝胶切下用凝胶回收试剂盒进行回收。将回收后的目的基因和表达载体片段，用T4连接酶连接，将构建好的两种质粒pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO和pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO分别转化到事先制备好的枯草芽孢杆菌感受态细胞中。表达质粒的测序结果分别如图1、图2所示。
实施例3诱导表达
分别挑取阳性重组子单菌落分别接种于含氯霉素、新霉素各10μg/mL的10mL LB培养基中，37℃，225r/m条件下过夜振荡培养。按1％的接种量转接到50mL新鲜LB培养基中，37℃，225r/m条件下振荡培养。发酵3h后分别加入终浓度为1％、3％、5％、7％、9％的麦芽糖后进行诱导表达，48h后收集菌液上清。两种质粒pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO和pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO最适发酵麦芽糖浓度分别为3％和5％。
实施例4融合蛋白的纯化
收集菌液上清后混合5×Bindding Buffer(20mM Tris、500mM NaCl、20mM咪唑)，过NI-NTA柱，用含20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、500mM咪唑的Washing Buffer，进行梯度洗脱。结果表明含50mM、100mM和200mM咪唑的洗脱液都可将融合蛋白从Ni-NTA柱上洗脱下来。结果如图3所示。
实施例5杂合肽PR-FO的纯化
将纯化后的融合蛋白在SUMO酶切Buffer中透析后，进行4℃过夜酶切，将酶切体系过NI-NTA，重组蛋白在穿流液中获得，用去离子水透析，冻干后即获得重组蛋白纯品。结果如图4所示。
实施例6重组PR-FO抑菌活性的测定
试验采用美国美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度的方法，同时针对抗菌肽的阳离子性的特征，参考Steinberg等的改进方法。以大肠杆菌(EscherichcoliUB 1005，Escherich coliATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 28213)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis ATCC 12228)为试验菌株。具体操作如下：
(1)菌体的准备：取冻存于-20℃的待测菌，划线接种于MH(A)培养基中孵育。挑取单菌落，接种于10mL的MH(B)培养基中，220r/m、37℃过夜培养。然后再将过夜菌体接种于新鲜的培养基中，培养2～3h，直至菌体处于对数生长期，用新鲜的MH(B)培养基校正浓度使其OD600＝0.4，所得菌液的菌落数大约在105CFU/mL左右；
(2)准备重组PR-FO：将表达产物的浓度调整为256μg/mL，吸取100μL加入到96孔板的第1列孔内，其余各孔内加入50μL的MH(B)培养基，然后将第1号孔中的抗菌肽溶液吸出50μL，加入到第2号孔内，依次类推倍比稀释至第10号孔，吸出50μL弃去；
(3)接种菌：用移液枪吸取上述OD600＝0.4的50μL菌液依次加到96孔板的前11列孔中，最终接种细菌浓度为每孔5×104CFU/mL。将96孔板置微型振荡器上振荡1min，使各孔内液体混匀，96孔板加盖以减少孵育过程中的蒸发，并于37℃下孵育过夜。第11孔为阳性对照组：只加50μL的MH(B)培养基和50μL的菌液；第12孔为阴性对照(无菌对照组)：只加100μL的MH(B)培养基。这时从第1孔到第10孔抗菌肽的浓度将依次递减；
(4)判定结果：阴性对照(无菌对照组)孔在整个试验的过程中应该始终保持清亮，这表明整个试验是无菌操作。与生长对照孔中细菌生长特性(如微孔内肉汤呈混浊状、孔底出现沉淀等)相比较进行判断，无肉眼可见生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的MIC值。结果如表1所示。
表1为重组PR-FO的最小抑菌浓度
实施例7溶血活性的测定
溶血活性的测定，参照Stark等的方法进行测定。具体操作如下：
(1)使用肝素钠抗凝管采集新鲜的人的血液1mL，4℃保存备用；
(2)将上述的新鲜血液于1000×g、4℃下离心5min，弃去上清，收集红细胞；
(3)用PBS缓冲溶液将上述收集到的红细胞洗涤三遍，在1000×g条件下离心5min，弃去上清，再次收集红细胞，最后用大约10mL左右的PBS缓冲溶液重悬红细胞；
(4)重组PR-FO的稀释：向96孔板的第一排第1号内加入90μL PBS缓冲溶液，其余孔中都加入50μL PBS缓冲溶液，再向第1号孔内加入10μL重组PR-FO母液，然后将第1号孔中的多肽溶液混匀吸出50μL，加到第2号孔内，依次倍比稀释至第10号后，吸出50μL弃去；
(5)取50μL上述准备好的红细胞悬液分别加入到含有不同浓度抗菌肽溶液的各孔中，在37℃培养箱内恒温孵育1h。其中，第11孔加50μL PBS和50μL红细胞悬液作为阴性对照，第12孔加50μL 0.1％Triton X-100和50μL红细胞悬液作为阳性对照；
(6)l h后取出96孔板，在4℃条件下1000×g离心5min；
(7)吸取上述离心溶液的上清，平行转移到一个洁净的96孔板对应的孔中，用酶标仪在570nm(OD570nm)处测定光吸收值。结果如图5所示。
<110> 东北农业大学
<120>一种利用枯草芽孢杆菌表达杂合肽及制备方法和应用
<160> 1
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Phe Arg Arg Leu Arg Trp Lys Thr Arg
1 5 10
Trp Arg Leu Lys Lys Ile Arg Phe Gly Arg
11 15 20
Phe Leu Arg Lys Ile Arg Arg Phe Arg Pro Lys-NH2
21 25 30 31

Claims (5)

1.一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO，其特征在于，其序列如序列表SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO，其特征在于，制备方法如下：
(1)将PMAP-36的16个N-末端氨基酸残基中的第七位和第十一位的赖氨酸用色氨酸进行替换得到PRW4，与从是鸡的骨髓源细胞中提取Fowlicidin-2与其杂合获得杂合肽PR-FO，并在5’端加上EcoR Ⅰ酶切位点、信号肽SPamyQ(SPsacB)、6×His标签、SUMO，在3’端加上终止密码子和BamH Ⅰ酶切位点；
(2)基因工程方法构建两种质粒pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO和pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO；
(3)利用麦芽糖为诱导剂，对融合蛋白进行诱导表达；
(4)NI-NTA柱对融合蛋白进行纯化；
(5)SUMO酶切融合蛋白获得杂合肽纯品。
3.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO，其特征在于，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO的制备方法，其特征在于，步骤(3)中两种质粒pGJ148-(SPAmyQ)SUMO-PR-FO和pGJ148-(SPSacB)SUMO-PR-FO的发酵麦芽糖浓度分别为3％和5％。
5.根据权利要求2所述的一种利用枯草芽孢杆菌表达的杂合肽PR-FO的制备方法，其特征在于，步骤(4)中含50mM、100mM和200mM咪唑的洗脱液都可将融合蛋白从Ni-NTA柱上洗脱下来。
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