CN107312095A - 一种抗菌肽LL‑37‑Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法 - Google Patents

一种抗菌肽LL‑37‑Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽LL‑37‑Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法，利用融合技术在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽LL‑37‑Melittin，人工设计融合基因SUMO‑LL‑37‑Melittin，在两端加入了EcoR I和BamH I酶切位点，合成的融合基因与表达载体pGJ148连接，成功构建了重组表达载体，转化至枯草芽抱杆菌WB800N中，得到表达工程菌。在培养基中，经麦芽糖诱导表达，表达产物采用Ni‑NAT亲和层析法进行纯化，利用SDS‑PAGE检测其正确性，SUMO蛋白酶酶切得到抗菌肽LL‑37‑Melittin。本发明方法在枯草芽抱杆菌中表达了抗菌肽，分离纯化简单，易操作。表达产物对多种细菌有抑菌活性，热稳定性好，适于大规模工业化生产，可应用于医药、食品、畜牧业等领域。

Description

一种抗菌肽LL-37-Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的 制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽LL-37-Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法。
背景技术
抗菌肽是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，具有广谱抗菌作用，而且对一些产生抗生素耐药性的病原菌具有杀灭作用。迄今为止，已经发现了上千种天然抗菌肽,但是具有较好的医疗选择指数的种类却比较少，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肽的设计等方式从丰富的天然抗菌肽资源中获得理想的新型人工抗菌肽。
抗菌肽的重组表达面临两个巨大的难题。首先，抗菌肽的抗菌特性使得它们对宿主菌具有潜在的致命毒性。其次，抗菌肽小分子量和高阳离子性使得它们易被蛋白水解酶降解。融合表达策略可有效的克服上述两个难题，分子伴侶可以保护抗菌肽不被细胞中的蛋白酶降解并掩盖了抗菌肽对宿主的毒性，而融合蛋白最终可以被酶或者化学物质等切割，释放抗菌肽。
枯草芽孢杆菌是一类好氧菌、内生抗逆孢子的杆状细菌。枯草芽孢杆菌自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，可以分泌α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类且具有一个较好的分泌系统，能直接将重组胞外蛋白以可溶且有生物活性的形式分泌到培养基中，有利于重组蛋白的分离纯化。近些年来，随着分子生物学和基因工程表达系统的快速发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统迅速发展，并展现出良好的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种抗菌肽LL-37-Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法，分离纯化简单、蛋白纯度高、适于大规模工业化生产。
本发明采用以下技术方案：
一种抗菌肽LL-37-Melittin，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
优选的，编码所述抗菌肽LL-37-Melittin的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
优选的，抗菌肽LL-37-Melittin在制备治疗细菌、真菌疾病药物、动物饲料添加剂中的应用。
优选的，所述的抗菌肽LL-37-Melittin为能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酿酒酵母菌的药物或添加剂。
一种在枯草芽抱杆菌中制备抗菌肽LL-37-Melittin的方法，包括以下步骤：
S1、截取人源抗菌肽LL-37第14～21位氨基酸，蜂毒素Melittin第5～12位氨基酸，设计融合基因SUMO-LL-37-Melittin；
S2、将步骤S1所述融合基因SUMO-LL-37-Melittin与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌质粒载体pGJ148进行EcoR I和BamH I双酶切，切胶回收目的基因和载体骨架，在T4DNA ligase，过夜连接，构建重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin；
S3、将步骤S2构建的重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin电转化至克隆菌株大肠杆菌DH5α中，蓝白斑筛选获得阳性菌株，提取质粒，酶切、菌落PCR鉴定；
S4、将步骤S3鉴定正确的重组菌株提取质粒后转化至表达菌株枯草芽孢杆菌WB800N中，获得重组表达工程菌pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N；
S5、将步骤S4所得重组表达工程菌株pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N以麦芽糖为诱导剂诱导，获得表达产物；
S6、将步骤S5所得表达产物进行分离纯化和SUMO蛋白酶酶切，获得抗菌肽LL-37-Melittin。
优选的，步骤S2中，酶切体系为：10×Buffer 5uL，目的片段/载体35uL，水5uL，EcoR I 2.5uL，BamH I 2.5uL，37℃孵育3h。
优选的，连接体系为：10×DNA连接buffer 1uL，酶切后载体2uL，酶切后目的基因片段6uL，T4DNA ligase 1uL，4℃过夜连接。
优选的，步骤S5中，将重组表达工程菌株pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N的阳性单菌落接入含有氯霉素的培养基中过夜培养，按1％的接种量接种至LB培养基中，37℃，220rpm，摇床培养4h，添加终浓度为5％的麦芽糖进行诱导表达24h，12000rpm，离心15min收集胞外上清液作为表达产物。
优选的，步骤S6具体为：将收集的表达产物和Binding Buffer等体积混匀后上柱；适量Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰，获得纯化后的融合蛋白SUMO-LL-37-Melittin，进行SUMO蛋白酶1酶切，冷冻干燥获得抗菌肽LL-37-Melittin。
优选的，将大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的单菌落接于各自适宜的培养基中，37℃、220rpm，培养过夜，并分别稀释至2×105～7×105CFU/ml，将步骤S6所得抗菌肽LL-37-Melittin稀释为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml和0.39μg/ml浓度梯度，将稀释好的大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌三种实验菌液分别滴加到96孔细胞培养板中，每行的1号孔到11号孔中每孔加50μL，12号孔不加实验菌液而加50μL的LB培养基作为阴性对照组，1号孔至10号孔按稀释抗菌肽浓度由大到小的顺序依次加入抗菌肽50μL，在37℃，150rpm过夜培养，波长为490nm的条件下检测其吸光度。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明以LL-37和蛙皮素Melittin为母体肽，利用融合技术与SUMO进行融合表达，在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽LL-37-Melittin，在两端加入了EcoR I和BamH I酶切位点，合成的融合基因与表达载体pGJ148连接，成功构建了重组表达载体，转化至枯草芽抱杆菌WB800N中，得到表达工程菌，在培养基中经麦芽糖诱导，获得融合蛋白，经过SUMO蛋白酶酶切，最终获得具有活性的杂合抗菌肽LL-37-Melittin，相比母体肽LL-37，杂合抗菌肽LL-37-Melittin有更高的抑菌活性，对研发新型抗菌肽具有重要意义，在枯草芽抱杆菌中表达了抗菌肽，分离纯化简单，易操作，表达产物对多种细菌有抑菌活性，热稳定性好，适于大规模工业化生产，可应用于医药、食品、畜牧业等领域。
进一步的，由于抗菌肽在宿主细胞中会产生毒性，且表达量较低，易被宿主降解，为了便于目的蛋白的分离纯化，本发明使用SUMO分子伴侣进行融合表达，采用pGJ148质粒载体，具有麦芽糖启动子，利用麦芽糖进行诱导发酵，成功表达融合蛋白。
进一步的，枯草芽孢杆菌表达系统具有宿主细胞枯草芽孢杆菌自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，可以分泌α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类且具有一个较好的分泌系统，能直接将重组胞外蛋白以可溶且有生物活性的形式分泌到培养基中，有利于重组蛋白的分离纯化。适于大规模工业化生产，对研制新型高效抗菌肽饲料添加剂，抗菌药物等具有重要价值。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明制备方法流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种在枯草芽抱杆菌中制备抗菌肽LL-37-Melittin的方法，利用融合技术在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽LL-37-Melittin，人工设计融合基因SUMO-LL-37-Melittin，在两端加入了EcoR I和BamH I酶切位点，合成的融合基因与表达载体pGJ148连接，成功构建了重组表达载体，转化至枯草芽抱杆菌WB800N中，得到表达工程菌。在培养基中，经麦芽糖诱导表达，表达产物采用Ni-NAT亲和层析法进行纯化，利用SDS-PAGE检测其正确性，SUMO蛋白酶酶切得到抗菌肽LL-37-Melittin。
请参阅图1，本发明在枯草芽抱杆菌中制备抗菌肽LL-37-Melittin的方法，包括以下步骤：
S1、抗菌肽LL-37-Melittin基因的合成和克隆载体的构建；
截取人源抗菌肽LL-37第14-21位氨基酸，蜂毒素Melittin第5-12位氨基酸，人工设计融合基因SUMO-LL-37-Melittin。
LL-37-Melittin的氨基酸序列为：
GLY LYS GLU PHE LYS ARG ILE VAL VAL LEU LYS VAL LEU THR THR GLY
按照大肠杆菌密码子进行编码得到碱基序列为：
GGCAAAGAAUUUAAACGCAUUGUGGUGCUGAAAGUGCUGACCACCGGC
将SUMO分子伴侣与LL-37-Melittin核苷酸序列进行串联，按照大肠杆菌密码子偏好性进行编码末端加上终止密码子，并在两端分别加入EcoR I和BamH I酶切位点和保护碱基，由上海生工生物有限公司进行基因合成。
S2、将合成的融合基因SUMO-LL-37-Melittin与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pGJ148进行EcoR I和BamH I双酶切；
酶切体系为：10×Buffer 5uL，目的片段/载体35uL，水5uL，EcoR I 2.5uL，BamH I2.5uL，37℃孵育3h，将双酶切后质粒骨架和目的基因片段切胶回收后，过夜连接得到重组质粒；
连接体系为：10×DNA连接buffer 1uL，酶切后载体2uL，酶切后目的基因片段6uL，T4DNA ligase 1uL，4℃过夜连接。
S3、将步骤S2获得的重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin电转化至克隆菌株大肠杆菌DH5α中，蓝白斑筛选获得阳性菌株，提取质粒，酶切、菌落PCR鉴定。
S4、将S3鉴定正确的重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin电转化至表达菌株枯草芽孢杆菌WB800N中，获得重组表达工程菌pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N。
S5、挑取获得重组表达工程菌pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N的阳性单菌落，接入含有氯霉素的培养基中过夜培养，按照1％的接种量接种至LB培养基中，37℃，220rpm，摇床培养4h，添加终浓度为5％的麦芽糖进行诱导表达24h，12000rpm，离心15min收集胞外上清液，获得表达产物。
采用SDS-PAGE检测目的蛋白的正确性。
S6、蛋白的分离纯化：Ni-NTA柱重组SUMO-LL-37-Melittin进行纯化。
将步骤S5收集的表达产物和Binding Buffer(Tris-HCl(pH7.9)20mM、咪唑5mM、NaCl 0.5M)等体积混匀后上柱；适量Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用适量Elution Buffer(Tris-HCl(pH7.9)20mM、咪唑500mM、NaCl 0.5M)洗脱，收集洗脱峰，透析去盐，获得的纯化后融合蛋白SUMO-LL-37-Melittin，将获得的纯化后融合蛋白SUMO-LL-37-Melittin进行SUMO蛋白酶1酶切，冷冻干燥获得抗菌肽LL-37-Melittin。
对得到的纯化产物进行最小抑菌浓度(MIC)测定：将大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的单菌落接于各自适宜的培养基中，37℃、220rpm，培养过夜，并分别稀释至2×105～7×105CFU/ml；将杂合抗菌肽稀释为：200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml十个浓度梯度，将稀释好的3种实验菌液分别滴加到96孔细胞培养板中，每行的1号孔到11号孔中每孔加50μL，12号孔不加实验菌液而加50μL的LB培养基作为阴性对照组，1号孔至10号孔按稀释抗菌肽浓度由大到小的顺序依次加入抗菌肽50μL，在37℃，150rpm过夜培养，波长为490nm的条件下检测其吸光度。
结果表明，纯化后的抗菌肽LL-37-Melittin对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度分别为：5.01、2.12、1.13μg/mL，相比母体肽LL-37具更好的抑菌活性。
本发明方法在枯草芽抱杆菌中表达了抗菌肽，分离纯化简单，易操作。表达产物对多种细菌有抑菌活性，热稳定性好，适于大规模工业化生产，可应用于医药、食品、畜牧业等领域。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
核苷酸及氨基酸序列表
<110> 陕西科技大学
<120>一种抗菌肽LL-37-Melittin在枯草芽抱杆菌中的表达方法
<160> 2
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly
1 5 10 15 16
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggcaaagaau uuaaacgcau uguggugcug aaagugcuga ccaccggc 48

Claims (10)

1.一种抗菌肽LL-37-Melittin，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽LL-37-Melittin，其特征在于，编码所述抗菌肽LL-37-Melittin的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽LL-37-Melittin在制备治疗细菌、真菌疾病药物、动物饲料添加剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的抗菌肽LL-37-Melittin为能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酿酒酵母菌的药物或添加剂。
5.一种在枯草芽抱杆菌中制备权利要求1所述抗菌肽LL-37-Melittin的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、截取人源抗菌肽LL-37第14～21位氨基酸，蜂毒素Melittin第5～12位氨基酸，设计融合基因SUMO-LL-37-Melittin；
S2、将步骤S1所述融合基因SUMO-LL-37-Melittin与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌质粒载体pGJ148进行EcoR I和BamH I双酶切，切胶回收目的基因和载体骨架，在T4DNA ligase，过夜连接，构建重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin；
S3、将步骤S2构建的重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin电转化至克隆菌株大肠杆菌DH5α中，蓝白斑筛选获得阳性菌株，提取质粒，酶切、菌落PCR鉴定；
S4、将步骤S3鉴定正确的重组菌株提取质粒后转化至表达菌株枯草芽孢杆菌WB800N中，获得重组表达工程菌pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N；
S5、将步骤S4所得重组表达工程菌株pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N以麦芽糖为诱导剂诱导，获得表达产物；
S6、将步骤S5所得表达产物进行分离纯化和SUMO蛋白酶酶切，获得抗菌肽LL-37-Melittin。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，酶切体系为：10×Buffer 5uL，目的片段/载体35uL，水5uL，EcoR I 2.5uL，BamH I 2.5uL，37℃孵育3h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，连接体系为：10×DNA连接buffer 1uL，酶切后载体2uL，酶切后目的基因片段6uL，T4DNA ligase 1uL，4℃过夜连接。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S5中，将重组表达工程菌株pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N的阳性单菌落接入含有氯霉素的培养基中过夜培养，按1％的接种量接种至LB培养基中，37℃，220rpm，摇床培养4h，添加终浓度为5％的麦芽糖进行诱导表达24h，12000rpm，离心15min收集胞外上清液作为表达产物。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S6具体为：将收集的表达产物和Binding Buffer等体积混匀后上柱；适量Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰，获得纯化后的融合蛋白SUMO-LL-37-Melittin，进行SUMO蛋白酶1酶切，冷冻干燥获得抗菌肽LL-37-Melittin。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的单菌落接于各自适宜的培养基中，37℃、220rpm，培养过夜，并分别稀释至2×105～7×105CFU/ml，将步骤S6所得抗菌肽LL-37-Melittin稀释为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml和0.39μg/ml浓度梯度，将稀释好的大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌三种实验菌液分别滴加到96孔细胞培养板中，每行的1号孔到11号孔中每孔加50μL，12号孔不加实验菌液而加50μL的LB培养基作为阴性对照组，1号孔至10号孔按稀释抗菌肽浓度由大到小的顺序依次加入抗菌肽50μL，在37℃，150rpm过夜培养，波长为490nm的条件下检测其吸光度。
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