CN108373510B - 一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法 - Google Patents

一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PhaP‑Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法，在微生物体内融合表达PHA颗粒结合蛋白PhaP和一种抗菌肽Tac(tachyplesin I,简称为Tac)所形成的一种融合蛋白PhaP‑Tac，然后利用PhaP与疏水材料表面间的疏水相互作用，将抗菌肽锚定到疏水材料表面，从而赋予疏水材料抗菌性能。其使用大肠杆菌作为表达宿主表达纯化了细菌来源的PhaP和中华鲎抗菌肽Tac的融合蛋白PhaP‑Tac，赋予PHA材料抗菌活性，经过PhaP‑Tac进行表面修饰的聚3‑羟基丁酸‑3‑羟基戊酸酯(PHBV)可有效的抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长，而且经过修饰的PHBV材料亲水性提高，有利于成纤维细胞附着生长，通过PhaP蛋白将抗菌肽对PHBV材料进行修饰赋予材料抗菌活性，对抑制局部细菌感染是一种行之有效的策略。

Description

一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法
技术领域
本发明涉及微生物医药技术领域，具体为一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法。
背景技术
聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)具有优良的生物相容性，可以作为生物支架等应用于生物医学工程领域。但是，微生物感染限制了这类材料的潜在应用。目前临床上抗生素的使用是预防和治疗生物器械所引起感染的主要方法。但是，由于全球抗生素药物的滥用，引发细菌耐药性、过敏反应和环境污染等问题日渐严重，寻找一种不易引起上述问题的抗菌物质已逐渐成为人们关注的焦点。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性，不易引起细菌耐药性，并且能够有效抑制临床上一些可导致严重感染的病原体和耐药菌株的抗菌活性物质。使用大肠杆菌作为表达宿主表达纯化了来细菌来源的PHA颗粒结合蛋白PhaP和中华鲎抗菌肽Tac的融合蛋白PhaP-Tac，通过PhaP与PHBV的疏水相互作用将PhaP-Tac结合到PHBV材料表面赋予其抗菌活性。经过PhaP-Tac表面修饰的PHBV可有效的抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长。并且经过修饰的PHBV材料亲水性提高，有利于成纤维细胞附着生长，同时，可以加快小鼠伤口的愈合。通过研究结果表明，抗菌肽对PHBV材料进行修饰赋予材料抗菌活性对抑制局部细菌感染是一种行之有效的策略。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料的修饰方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种PhaP-Tac的微生物合成，包括：
1)将PhaP蛋白和中华鲎抗菌肽Tac融合形成融合蛋白PhaP-Tac；
2)由融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料PHBV表面形成抗菌材料PhaP-Tac-PHBV；
3)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎抗菌肽融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述1)中为确保蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)成功表达，对其密码子进行优化，构建两个质粒pET28aPhaP和pET28aPhaPTac，并将构建质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)分别表达靶蛋白；
PhaP-Tac蛋白以部分可溶形式存在。
一种PhaP-Tac对疏水材料PHBV的修饰方法，由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎素融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述方法包括以下步骤：
S1：对融合蛋白PhaP-Tac的纯化；
S2：将融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料即微生物合成的聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯PHBV进行表面修饰，包括将PHBV膜裁剪成直径为15mm的圆片，浸入75％(v/v)的乙醇溶液消毒，然后将PHBV圆片浸泡在含100μg PhaP或PhaP-Tac蛋白溶液的48孔培养皿中，蛋白和膜在4℃孵育12h，最后，用磷酸盐缓冲液清洗膜5min，去除未结合的蛋白；
S3：蛋白免疫印迹分析；
S4：用接触角分析仪检测复合材料膜表面的水接触角；
S5：对PhaP-Tac修饰的PHBV膜的抗菌活性进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料的修饰方法，使用大肠杆菌作为表达宿主表达纯化了细菌来源的PHA颗粒结合蛋白PhaP和Ⅰ型中华鲎抗菌肽Tac的融合蛋白PhaP-Tac，通过PhaP与PHBV的疏水相互作用将PhaP-Tac结合到PHBV材料表面赋予PHBV材料抗菌活性，经过PhaP-Tac进行表面修饰的PHBV可有效的抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长，而且经过修饰的PHBV材料亲水性提高，有利于成纤维细胞附着生长，同时可以加快小鼠伤口的愈合，研究结果表明，通过抗菌肽对PHBV材料进行修饰赋予材料抗菌活性，对抑制局部细菌感染是一种行之有效的策略。
说明书附图
图1是重组表达质粒pET28aPTac的构建图；
图2是PhaP-Tac与PHBV膜结合后的western检测图；
图3是PhaP-Tac结合膜后的水接触角变化图；
图4是PhaP-Tac结合膜后的抑菌活性检测图；
图5是成纤维细胞在PhaP-Tac-PHBV膜上的形态图；
图6是重组表达质粒pET28aPTac的酶切电泳图谱；
图7是融合蛋白PhaP-Tac的E.coliBL21(DE3)全细胞蛋白和纯化后的PhaP-Tac的SDS-PAGE电泳图；
图8是对融合蛋白PhaP-Tac的抑菌活性检测图；
图9是PhaP-Tac-PHBV膜对小鼠皮肤感染后的抑菌效果。
具体实施方式
以下将详细说明本发明实施例，然而，本发明实施例并不以此为限。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中：提供一种PhaP-Tac的微生物合成，包括：
1)将PhaP蛋白和中华鲎抗菌肽Tac融合形成融合蛋白PhaP-Tac；
2)由融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料PHBV表面形成抗菌材料PhaP-Tac-PHBV；
3)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎抗菌肽融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述1)中为确保蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)成功表达，对其密码子进行优化，构建两个质粒pET28aPhaP和pET28aPhaPTac(如图1所示为pET28aPhaPTac的构建图)，并将构建质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)分别表达靶蛋白；
PhaP-Tac蛋白以部分可溶形式存在。
一种PhaP-Tac对疏水材料PHBV的修饰方法，由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎素融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述方法包括以下步骤：
第一步：对融合蛋白PhaP-Tac的纯化；
第二步：将融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料PHBV进行表面修饰，包括将PHBV膜裁剪成直径为15mm的圆片，浸入75％(v/v)的乙醇溶液消毒，然后将PHBV圆片浸泡在含100μg PhaP或PhaP-Tac蛋白溶液的48孔培养皿中，蛋白和膜在4℃孵育12h，最后，用磷酸盐缓冲液清洗膜5min，去除未结合的蛋白；
第三步：蛋白免疫印迹分析；
第四步：用接触角分析仪检测复合材料膜表面的水接触角；
第五步：对PhaP-Tac修饰的PHBV膜的抗菌活性进行检测。
基于上述发明提供一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法，还提供如下具体实施例：
PHBV的制备及PhaP-Tac蛋白修饰：
地中海富盐菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)利用10g/L的葡萄糖作为碳源生产PHBV；在细胞质中可见大量白色球形PHBV颗粒；纯化后，其单体组成可通过核磁共振(1H NMR)检测，其3HV的含量为8.25mol％。
将地中海富盐菌合成的PHBV成膜后与PhaP或PhaP-Tac蛋白4℃过夜孵育，充分洗脱去掉未结合的蛋白，随后利用蛋白免疫印迹实验检验。如图2所示，为PhaP-Tac与PHBV膜结合后的western检测，泳道M：蛋白marker，泳道1：PBS溶液与PHBV膜孵育后的膜表面样品(对照)，泳道2：PhaP蛋白溶液与与PHBV膜孵育后的膜表面样品，泳道3：PhaP-Tac蛋白溶液与PHBV膜孵育后的膜表面样品。一抗为小鼠抗His-tag的单克隆抗体。结果显示PhaP-Tac和PhaP蛋白高效的结合到PHBV膜上。
膜表面的亲水性是影响生物材料是否具有良好的生物相容性一个重要因素，因此，利用水接触角检验经过和未经过PhaP和PhaP-Tac蛋白修饰的PHBV膜的亲水性；未经修饰的PHBV的水接触角为82.5°±0.5，其疏水性质非常强，经PhaP和PhaP-Tac修饰的PHBV膜的水接触角分别降低到71.7°±0.3和63.5°±0.4；三种膜亲水性排序为:PhaP-Tac修饰的PHBV>PhaP修饰的PHBV>PHBV膜(如图3中A、B和C分别显示了PhaP和PhaP-Tac结合膜后的水接触角的变化)，这表明PhaP或PhaP-Tac蛋白可以结合到疏水的PHBV膜上且有效的提高PHBV膜的亲水性。
PhaP-Tac修饰的PHBV膜在体外的抗菌活性以及细胞相容性：蛋白修饰的PHBV膜和未修饰的PHBV膜的抗菌活性通过大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线检测如图4中：(A)为大肠杆菌JM109(购自天根生化科技有限公司)，(B)铜绿假单胞菌CGMCC1.1785(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，(C)金黄色葡萄球菌CGMCC 1.1361(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，其中图4中***P<0.001表示显著性差异。每种细菌在两对照组均生长良好，未受到抑制，而在PhaP-Tac蛋白修饰的PHBV膜实验组中，细菌的生长均受到抑制，生长速率明显低于对照组，因此细菌在PhaP-Tac蛋白修饰的PHBV膜实验组出现延迟的对数期，此外，培养10h后，三种细菌的细胞密度在PhaP-Tac蛋白修饰组中显著低于另外两对照组，与未修饰蛋白的PHBV膜相比，在16h时，大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌在PhaP-Tac蛋白修饰组中分别有86.2％±2.2，85.1％±2.9，和79.8％±1.7被抑制；革兰氏阴性菌大肠杆菌(P<0.001)比革兰氏阳性金黄色葡萄球菌对PhaP-Tac更敏感(P<0.05)，此结果和抑菌圈实验一致，但是在PhaP修饰的PHBV膜和未修饰的PHBV膜这两组中，细菌的生长没有明显差异，表明PhaP不能抑制细菌的生长，因此，PhaP-Tac可以赋予PHBV膜高效的抗革兰氏阴性和阳性细菌的特性。
如图5中A、B和C所示,为成纤维细胞在PhaP-Tac-PHBV膜上的形态，用成纤维细胞L929(购自中科院上海细胞库)评估PhaP修饰和PhaP-Tac修饰的PHBV膜的细胞相容性，孵育2天后，利用倒置显微镜观察细胞的生长形态，在未修饰的PHBV膜上，大量的成纤维细胞呈现圆形且少量结合到PHBV膜表面；然而，在PhaP修饰的PHBV膜上，结合到膜上的成纤维细胞数量增加且细胞呈现扁平和细长型，尤其是在PhaP-Tac修饰的PHBV膜上，大部分成纤维细胞呈梭型，说明有较强的细胞粘附性且细胞密度最大，细胞的生长状态最好。以上结果表明PhaP-Tac修饰的PHBV极大的提高成纤维细胞在膜上的附着和增殖，提高了PHBV的细胞相容性。
体内创伤修复实验和PhaP-Tac修饰的PHBV膜的抗菌效果：
利用小鼠感染铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌进行验证，将直径为8mm的小鼠圆形皮肤创面分别与未修饰的、PhaP修饰的和PhaP-Tac修饰的PHBV膜处理3天，7天和15天的结果；第3天时，所有的创面均化脓溃烂，表明铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌引发了炎症反应，第7天时，未修饰和PhaP修饰的对照组，创面仍然湿润且化脓反应更加严重；相反，PhaP-Tac-修饰的实验组，小鼠创面感染减轻，第15天时，未修饰和PhaP修饰的对照组，创面感染没有改善；相反，PhaP-Tac-修饰的实验组，创面几乎愈合，无明显的化脓，从体内的创面愈合实验可知，PhaP-Tac修饰的PHBV膜能在短时间内显著加快创面愈合过程。
通过上述实施例，其PHBV的合成及其膜的制备方法如下：
首先，共聚物PHBV是由地中海富盐菌利用葡萄糖为碳源发酵产生的；以5％(v/v)的接种量从AS-168丰富培养基中转接到容积为7L的盛有4L发酵培养基的发酵罐中，在37℃，500rpm，pH 7.0的条件下培养72h后收集细胞，利用透射显微镜观察细胞内PHBV的形态；然后用0.1％(w/v)SDS溶液和90℃热氯仿提取PHBV，溶解于氯仿中的PHBV可过滤去除杂质，进而依次加入1倍体积的冷正己烷和5倍体积的乙醇沉淀PHBV，纯化后的PHBV中的单体组成和分子量可通过核磁共振光谱测定仪和凝胶色谱检测。
其次，利用氯仿作为溶剂通过标准溶液浇铸法制备PHBV膜，简而言之，溶解有2％(w/v)PHBV的150ml氯仿溶液倒入一个直径为15cm的玻璃皿，然后，将盛有溶液的玻璃皿在室温下放入通风橱至少2周，至氯仿溶剂全部蒸发为止，获得的PHBV薄膜在真空下储存，可通过扫描电镜观察PHBV薄膜的形态。
PhaP和PhaP-Tac融合蛋白的表达和纯化方法如下：
首先，本发明中大肠杆菌JM109和BL21(DE3)分别用于质粒构建和蛋白表达，质粒pET28aP和pET28aPTac是由各自对应的片段克隆到质粒pET28a(Novagen,Denmark)上获得的，利用R.eutrophaCGMCC 1.7092(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)基因组作为模板扩增获得phaP基因片段；Tac的氨基酸序列储存在NCBI，连接序列(Gly4Ser)2被插入到PhaP的N末端和Tac的C末端形成正确折叠的PhaP-Tac融合蛋白；利用软件gene designer优化Tac和连接序列(Gly4Ser)2的密码子，所有的引物均由Invitrogen(Beijing,China)公司提供，其中PR2和TacF1，TacF1和TacR1，TacF2和TacR1，TacF2和TacR2是部分互补序列，序列表1中PhaP-linker-Tac氨基酸序列中，AGGGGSGGGGS为linker序列，抗菌肽Tac序列KWCFRVCYRGICYRRCRN；序列表2中PhaP-linker-Tac核酸序列中PhaP与Tac间的linker序列，翻译为氨基酸序列后为GGGGSGGGGS，目的是保证抗菌肽的活性；编码Tac的核酸序列AAATGGTGTTTTCGTGTTTGTTATCGTGGAATATGTTATCGTCGTTGCCGCAAC；整个融合蛋白的DNA序列通过重叠延伸PCR获得，纯化后的PCR产物插入到载体pET28a上，转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒pET28aPTac，质粒经测序验证正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达PhaP蛋白和PhaP-Tac融合蛋白；构建pET28aPTac和pET28aP(对照)所需要的引物见表1。
表1
Figure BDA0001649651240000091
Figure BDA0001649651240000101
酶切位点用下划线表示出。
如图6所示为重组表达质粒pET28aPTac的酶切电泳图谱，其中泳道1为阳性克隆所提取的质粒pET28aPTac利用BamHI和XhoI双酶切后的产物，泳道M1和M2分别为1kb和100bp的DNA marker。
其次，纯化用大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白；大肠杆菌用LB培养基在添加100μg/ml的硫酸卡那霉素，37℃，200rpm培养；蛋白表达的诱导条件为在OD600为0.6时添加浓度为0.2mM，0.5mM或者1mM IPTG进行诱导，诱导时间为4h，6h，8h，12h和24h，诱导温度为16℃和37℃；用磷酸缓冲液(PBS，pH 7.8)悬浮细胞，然后在冰上超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，收集上清液，最后，被His标记的PhaP和PhaP-Tac蛋白按照说明书指导用镍柱(GE,USA)进行纯化。
SDS-PAGE电泳实验：
大肠杆菌BL21(DE3)表达蛋白后的细胞粗提物和缓冲液(50mM Tris-HCl，2％SDS，0.1％bromophenol blue和10％glycerol，pH 6.8)混合，沸水浴加热10min，10,000rpm离心3min，取上清；用2％(w/v)SDS-PAGE凝胶分析上清液，SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝R-250进行染色，纯化后蛋白的浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒和牛血清蛋白做内参进行检测。
如图7所示，为融合蛋白PhaP-Tac的E.coli BL21(DE3)的全细胞蛋白和纯化后的PhaP-Tac的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M：蛋白marker，泳道1：E.coli BL21(DE3)(pET28a)添加IPTG诱导表达的菌体全蛋白，对照，泳道2：E.coli BL21(DE3)(pET28aP)添加IPTG诱导表达的菌体全蛋白，泳道3：E.coli BL21(DE3)(pET28aPTac)添加IPTG诱导表达的菌体全蛋白，泳道4：纯化的PhaP蛋白，泳道5：纯化的PhaP-Tac蛋白。
其PHBV膜表面修饰：
将PHBV膜切割成直径为15mm的圆片，浸入75％(v/v)的乙醇溶液消毒，然后，PHBV圆片浸泡在含100μg PhaP或PhaP-Tac蛋白溶液的48孔培养皿中，蛋白和膜在4℃孵育12h，最后，用磷酸缓冲液清洗5min膜，去除未结合的蛋白。
其蛋白免疫印迹分析：
蛋白修饰的PHBV膜在室温浸入SDS-PAGE上样缓冲液4h，然后沸水浴煮10min使蛋白变性，PhaP或PhaP-Tac从膜表面脱落。10,000rpm离心5min，收集上清液用12％SDS-PAGE凝胶检测，并转移至PVDF膜；然后，将膜放置含10％(w/v)脱脂奶粉，0.1％吐温20的TBST溶液中室温封闭3h，膜和鼠源一抗4℃过夜孵育，一抗用TBST溶液以1:1000的比例稀释；孵育结束后用TBST溶液清洗3次，每次5min，印记和辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠二抗在室温孵育2h；然后用TBST溶液洗脱，免疫印迹通过含发光氨的显影液进行可视化检测，从膜上洗脱下来的蛋白浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测。
膜表面的水接触角检测：
蛋白修饰后的PHBV膜的亲水性用接触角分析仪检测，将膜放置载玻片表面，滴入4μl的水滴，最后随机选择5个点进行检测。
细胞培养：
蛋白修饰和未修饰的PHBV膜的细胞毒性通过小鼠成纤维细胞L929和人非小细胞肺癌细胞A549检测；两细胞系购买自中科院上海细胞库；PHBV膜圆片放置在48孔聚苯乙烯板中，每孔加入2*104种子细胞，细胞在添加10％FBS的DMEM中培养；培养条件为CO2充足，37℃培养3天，每天更换新鲜培养基以保证细胞增殖足够的营养物质，最后每组实验设置3个生物学重复。
细胞形态检验：
培养3天后可观察L929和A549细胞形态的改变，利用倒置荧光显微镜观察，且用Andor EMCCD照相机随机拍摄5组照片。
抗菌活性检测试验：
利用对细菌的抑制试验检测PhaP，PhaP-Tac以及修饰的PHBV膜的抗菌活性，如图8中A、B、C和D所示，大肠杆菌JM109，铜绿假单胞菌CGMCC 1.1785，金黄色葡萄球菌CGMCC1.1361，和蜡样芽胞杆菌CGMCC 1.3760(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)在37℃.用LB培养基培养，在平板上划线过夜培养，挑取单克隆接入10ml的LB液体培养基中，200rpm过夜培养至对数生长期，抑菌圈实验的具体操作如下，取500μL上述培养至对数期的细菌至200ml培养基中并制成琼脂平板，利用金属打孔机事先在琼脂平板打孔(直径9cm)，取50ml蛋白表达的细胞破碎液倒入孔中，37℃过夜培养，通过抑菌圈的大小判断蛋白抑菌活性的强度，同样，利用生长抑制曲线评估蛋白修饰PHBV膜的抑菌活性，将制成圆片的PHBV，PhaP-修饰的PHBV和PhaP-Tac-修饰的PHBV膜放入含2ml的LB培养基中，接入细菌种子液(OD600约0.03到0.04)37℃，200rpm培养，细菌的生长可用分光光度计在600nm的吸光度表征，每组设置3个生物学重复。
体内创面感染实验：
利用小鼠皮肤创面感染模型研究PhaP-Tac修饰的PHBV膜对创面愈合的作用，所有动物实验的操作均符合中国科学院伦理委员会的指南要求，用异氟烷麻醉小鼠后并剔除小鼠背部的毛发，并用75％(v/v)的酒精消毒，然后用直径为8mm的活体组织穿孔器处理小鼠皮肤，取10μL铜绿假单胞菌(5*106CFU)和金黄色葡萄球菌(5*106CFU)的细菌混合液均匀的涂抹至小鼠背部的创面用于引起细菌感染，随后覆盖PHBV，PhaP或PhaP-Tac修饰的PHBV膜(直径1cm)，并用医用胶带固定创面，每组实验使用四只小鼠。每只小鼠单独饲养，饲养至3天，7天和15天时，让小鼠安乐死，拍照(如图9所示，图中标尺为2mm)。
综上所述：本发明提供的一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料的修饰方法，通过将PhaP蛋白和I型中华鲎抗菌肽(tachyplesin I,简称为Tac)融合形成融合蛋白(PhaP-Tac)赋予PHBV材料抗菌活性，插入(Gly4Ser)2连接蛋白使得融合蛋白可以正确折叠并结合到疏水膜表面，Tac来源于中国鲎，为确保蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)成功表达，对其密码子进行了优化，后续通过在大肠杆菌JM109中构建两个质粒pET28aPhaP和pET28aPhaPTac并转入大肠杆菌BL21(DE3)分别过表达靶蛋白，PhaP作为内参蛋白；PhaP-Tac和PhaP蛋白以部分可溶形式表达，PhaP-Tac对枯草芽孢杆菌产生明显的抑菌圈，基于蛋白可溶表达，后续通过优化表达参数(如诱导温度、诱导时间以及IPTG的浓度获得高浓度的蛋白)，以对枯草芽孢杆菌抑菌圈宽度为标准进行筛选；每组取50μL的蛋白上清液获得不同的抗菌活性，抑菌圈的直径范围从0到11mm，获得最优表达条件为37℃，1mM IPTG诱导8h，最后产生可溶的且有生物学活性的融合蛋白PhaP-Tac约16.6mg/L，利用N端和C端的His标签分别纯化得到PhaP-Tac和PhaP蛋白，经SDS-PAGE分析，胶上清楚可见PhaP-Tac和PhaP的大小分别为28KDa and 26KDa两个主带，此外，纯化后的PhaP-Tac蛋白利用MALDI-TOF/TOF MS进行证实，可获得PhaP-Tac全部氨基酸序列的得分441，覆盖率为66.7％。
利用镍柱将PhaP-Tac蛋白纯化后，利用两株革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌CGMCC1.1785和大肠杆菌JM109)和两株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌CGMCC 1.1361和蜡样芽胞杆菌CGMCC1.3760)检测其抑菌活性，PhaP蛋白作为阴性对照；PhaP-Tac蛋白对试验所用的细菌均有明显的抑菌活性，而等量的对照蛋白PhaP没有抑菌活性，革兰氏阴性细菌大肠杆菌JM109和铜绿假单胞菌CGMCC 1.1785的抑菌圈直径为19.1±0.2mm，略微大于革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌CGMCC 1.1361和蜡样芽胞杆菌CGMCC1.3760的抑菌圈直径(17.3±0.1mm)。此结果表明PhaP-Tac蛋白对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有显著的抑菌活性，尤其是对革兰氏阴性菌。
上述实施例中疏水材料并不仅限于PHBV，还可以是PLA或其它。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法
<141> 2018-05-04
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> 罗氏真养菌，中华鲎(Ralstonia eutropha，Tachypleus tridentatus)
<400> 1
Met Ile Leu Thr Pro Glu Gln Val Ala Ala Ala Gln Lys Ala Asn Leu
1 5 10 15
Glu Thr Leu Phe Gly Leu Thr Thr Lys Ala Phe Glu Gly Val Glu Lys
20 25 30
Leu Val Glu Leu Asn Leu Gln Val Val Lys Thr Ser Phe Ala Glu Gly
35 40 45
Val Asp Asn Ala Lys Lys Ala Leu Ser Ala Lys Asp Ala Gln Glu Leu
50 55 60
Leu Ala Ile Gln Ala Ala Ala Val Gln Pro Val Ala Glu Lys Thr Leu
65 70 75 80
Ala Tyr Thr Arg His Leu Tyr Glu Ile Ala Ser Glu Thr Gln Ser Glu
85 90 95
Phe Thr Lys Val Ala Glu Ala Gln Leu Ala Glu Gly Ser Lys Asn Val
100 105 110
Gln Ala Leu Val Glu Asn Leu Ala Lys Asn Ala Pro Ala Gly Ser Glu
115 120 125
Ser Thr Val Ala Ile Val Lys Ser Ala Ile Ser Ala Ala Asn Asn Ala
130 135 140
Tyr Glu Ser Val Gln Lys Ala Thr Lys Gln Ala Val Glu Ile Ala Glu
145 150 155 160
Thr Asn Phe Gln Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Lys Ala Ala Gln Gln
165 170 175
Ala Ser Ala Thr Ala Arg Thr Ala Thr Ala Lys Lys Thr Thr Ala Ala
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Trp Cys Phe Arg Val
195 200 205
Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys Arg Asn
210 215 220
<210> 2
<211> 660
<212> DNA
<213> 罗氏真养菌，中华鲎(Ralstonia eutropha，Tachypleus tridentatus)
<400> 2
atgatcctca ccccggaaca agttgcagca gcgcaaaagg ccaacctcga aacgctgttc 60
ggcctgacca ccaaggcgtt cgttcgcaga gaaaagctcg tcgagctgaa cctgcaggtc 120
gtcaagactt cgttcgcaga aggcgttgac aacgccaaga aggcgctgtc ggccaaggac 180
gcacaggaac tgctggccat ccaggccgca gccgtgcagc cggttgccga aaagaccctg 240
gcctacaccc gccacctgta tgaaatcgct tcggaaaccc agagcgagtt caccaaggta 300
gccgaggctc aactggccga aggctcgaag aacgtgcaag cgctggtcga gaacctcgcc 360
aagaacgccc cggccggttc ggaatcgacc gtggccatcg tgaagtcggc gatctccgct 420
gccaacaacg cctacgagtc ggtgcagaag gcgaccaagc aagcggtcga aatcgctgaa 480
accaacttcc aggctgcggc tacggctgcc accaaggctg cccagcaagc cagcgccacg 540
gcccgtacgg ccacggcaaa gaagacgacg gctgccggtg gcggtggcag cggcggtgga 600
gggagtaaat ggtgttttcg tgtttgttat cgtggaatat gttatcgtcg ttgccgcaac 660

Claims (7)

1.一种抗菌材料PhaP-Tac-PHBV的制备方法，其特征在于，
1)将PhaP蛋白和中华鲎抗菌肽Tac融合形成融合蛋白PhaP-Tac；
2)由融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料PHBV表面形成抗菌材料PhaP-Tac-PHBV；
3)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎抗菌肽融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述1)中为确保蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)成功表达，对其密码子进行优化，构建两个质粒pET28aPhaP和pET28aPhaPTac，并将构建质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)分别表达靶蛋白；
PhaP-Tac蛋白以部分可溶形式存在。
2.根据权利要求1所述的抗菌材料PhaP-Tac-PHBV的制备方法，其特征在于，
所述1)中质粒pET28aPhaP和pET28aPhaPTac是由各自对应的片段克隆到质粒pET28a上获得：其中质粒pET28aPhaPTac的构建包括以下步骤：
优化Tac和连接序列(Gly4Ser)2的密码子；
利用Ralstonia eutropha CGMCC 1.7092基因组作为模板扩增获得phaP基因片段；
连接序列(Gly4Ser)2插入到PhaP的N末端和Tac的C末端形成正确折叠的PhaP-Tac融合蛋白；
PhaP-linker-Tac整个融合蛋白的DNA序列通过重叠延伸获得PCR产物；
将纯化后的PCR产物插入到载体pET28a上获得质粒pET28aPTac；
质粒经测序验证正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达PhaP-Tac融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的抗菌材料PhaP-Tac-PHBV的制备方法，其特征在于，
所述PhaP-Tac部分可溶部分可对枯草芽孢杆菌产生明显的抑菌圈，通过诱导温度、诱导时间以及isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside(IPTG)的浓度表达参数获得高浓度的蛋白；
对枯草芽孢杆菌抑菌圈宽度标准进行筛选包括：以组为单位，每组取50μL的蛋白上清液获得不同的抗菌活性，抑菌圈的直径范围从0到11mm，获得最优表达条件为37℃，1mMIPTG诱导8h；最后产生可溶的且有抑菌活性的融合蛋白PhaP-Tac16.6 mg/L，利用PhaP-Tac的N末端和C末端的His标签纯化得到PhaP-Tac蛋白。
4.一种PhaP-Tac对疏水材料PHBV的修饰方法，其特征在于，由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎抗菌肽融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述方法包括以下步骤：
S1：对融合蛋白PhaP-Tac的纯化；
S2：将融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料即微生物合成的聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯PHBV进行表面修饰，包括将PHBV膜裁剪成直径为15mm的圆片，浸入75％(v/v)的乙醇溶液消毒，然后将PHBV圆片浸泡在含100μg PhaP或PhaP-Tac蛋白溶液的48孔培养皿中，蛋白和膜在4℃孵育12h，最后，用磷酸盐缓冲液清洗膜5min，去除未结合的蛋白；
S3：蛋白免疫印迹分析；
S4：用接触角分析仪检测复合材料膜表面的水接触角；
S5：对PhaP-Tac修饰的PHBV膜的抗菌活性进行检测。
5.根据权利要求4所述的PhaP-Tac对疏水材料PHBV的修饰方法，其特征在于，所述S1的具体方法如下：
S101：用大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白；
S102：大肠杆菌用LB培养基在添加100μg/ml的硫酸卡那霉素温度为37℃、200rpm的条件下培养；
S103：蛋白表达的诱导条件为在OD600为0.6时添加浓度为0.2mM，0.5mM or 1mM IPTG进行诱导，诱导时间为4h，6h，8h，12h和24h，诱导温度为16℃和37℃；
S104：将pH 7.8的PBS磷酸缓冲液悬浮细胞冰上超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，收集上清液；
S105：利用N端和C端的His标签纯化得到PhaP-Tac蛋白。
6.根据权利要求4所述的PhaP-Tac对疏水材料PHBV的修饰方法，其特征在于，所述S3的具体方法如下：
S301：蛋白修饰的PHBV膜在室温浸入SDS-PAGE上样缓冲液4h，然后沸水浴煮10min使蛋白变性，PhaP或PhaP-Tac从膜表面脱落；
S302：10,000rpm离心5min，收集上清液用12％SDS-PAGE凝胶检测，并转移至PVDF膜，然后，将膜放置含10％(w/v)脱脂奶粉，0.1％吐温20的TBST溶液中室温封闭3h；
S303：将膜和鼠源一抗4℃过夜孵育，一抗用TBST溶液以1:1000的比例稀释；
S304：孵育结束后用TBST溶液清洗3次，每次5min，与辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠二抗在室温孵育2h；
S305：用TBST溶液洗脱，免疫印P迹通过含发光氨的显影液进行可视化检测，从膜上洗脱下来的蛋白浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测。
7.根据权利要求4所述的PhaP-Tac对疏水材料PHBV的修饰方法，其特征在于，所述S5的具体方法如下：
S501：采用琼脂扩散法或者浊度法检测PhaP-Tac修饰的PHBV膜的抗菌活性；
S502：将细菌在37℃下用LB培养基培养，在平板上划线过夜培养，挑取单克隆接入10ml的LB液体培养基中，通过200rpm过夜培养至对数生长期；
S503：取500μL培养至对数期的细菌至200ml培养基中并置于设有孔径的琼脂平板；
S504：取50ml蛋白表达的细胞破碎液倒入孔中，并在温度为37℃下进行过夜培养，然后通过抑菌圈的大小判断蛋白抑菌活性的强度；
或
将制成圆片的PhaP-Tac-修饰的PHBV膜放入含2ml的LB培养基中，接入细菌种子液OD600约0.03到0.04在温度为37℃，200rpm下培养；细菌的生长用分光光度计在600nm的吸光度下测定。
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