CN101565462A

CN101565462A - 大黄鱼bpi-bn蛋白质、引物及其在制备抗生素药物中的应用

Info

Publication number: CN101565462A
Application number: CNA2009100990405A
Authority: CN
Inventors: 吴信忠; 黄艳青
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2009-10-28
Anticipated expiration: 2029-06-04
Also published as: CN101565462B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供大黄鱼体内的Pc－BPI蛋白质中的重组载体的构建和表达技术及其重组蛋白质在制备抗生素药物中的应用。该大黄鱼BPI－BN蛋白质具有SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。本发明利用基因工程技术，对大黄鱼Pc－BPI蛋白质的N末端结构域进行重组载体的构建和表达，获得重组BPI蛋白质。该重组BPI蛋白质具有极高效的杀灭弧菌的作用，可以作为绿色抗生素而在渔药开发以及人类医学中应用。

Description

大黄鱼BPI-BN蛋白质、引物及其在制备抗生素药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域中的蛋白质表达及应用，特别涉及大黄鱼体内的Pc-BPI(Pc代表大黄鱼；BPI是杀菌通透性增强蛋白质)蛋白质中的重组载体的构建和表达技术及其重组蛋白质在制备抗生素药物中的应用。

背景技术

杀菌通透性增强蛋白质(Bactericidal permeability increasing protein，BPI)是一种普遍存在于人及哺乳动物中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中的大小为55000Da阳离子蛋白质，是中性粒细胞内多种抗菌成分中唯一能够直接对革兰阴性菌发挥毒性作用，并对游离的脂多糖(lipopolysaccharide，简称LPS)具有中和作用的物质。BPI对大多数革兰氏阴性菌(G-菌)具有杀伤作用，但对哺乳动物细胞无作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素D得以穿过，因而称之为杀菌通透性增强蛋白。自BPI在人及兔的中性粒细胞中被分离鉴定并被证明其具有多种生物学功能后，BPI的同源类似物也从牛、猪、鱼类甚至低等无脊椎动物牡蛎中被克隆出来。随着对BPI研究的深入，研究者发现，BPI除具有杀灭革兰阴性菌作用外，还具有中和内毒素的功能，近年来更有研究指出BPI还有抗革兰阳性菌、真菌、中和肝素、发挥调理作用、抗血管生成和调节免疫等多种生物学活性，也因其独特的杀菌机制和多重的生物学效应被成为“超级抗生素”，且这种“超级抗生素”来自于生物体，没有环境污染，而成为一种绿色抗生素。为了更好的研究和开发这一既能杀菌又能灭活内毒素的抗微生物多肽蛋白，研究者们着重对人源BPI蛋白的重组表达载体的构建、表达产物的生物学活性研究进行了深入的研究。众多体外观察和动物实验显示完整BPI及其活性片段对小鼠、大鼠、家兔、猪和狒狒等G-菌感染或内毒素攻击均可产生良好的防护效应，在人类G-菌脓毒症及相关疾病的治疗中具有广阔的应用前景。

目前在水生生物中，对BPI的研究还比较少，水生动物BPI蛋白的重组蛋白产物生物学活性分析仅见于牡蛎中。但目前，尚未获得有生物活性的鱼类的BPI蛋白质，而对鱼类BPI蛋白质表达产物的抗菌生物学活性的功能研究也尚未见相关报道。

大黄鱼(Pseudosciaena crocea Richardson)是我国传统的海产经济鱼类，素有″国鱼″之称，曾是我国重要的四大捕捞对象之一。现已成为我国特有的、重要的海水网箱养殖的主要经济鱼类之一。目前，关于大黄鱼的病理、病害等研究多集中在病原生物的分离鉴定及简单流行病学的研究，对涉及病理、病害免疫方面的重要的分子生物学和分子机制则鲜有研究。基于研究，发明人首次在大黄鱼中获得了哺乳类动物BPI的类似物的基因的全长序列(简称：Pc-BPI-L)并予以公开。(文章题目：Characterization of the BPI-like gene froma subtracted cDNA library of large yellow croaker(Pseudosciaena crocea)and inducedexpression by formalin-inactivated Vibrio alginolyticus and Nocardia seriolaevaccine challenges。发表在Fish＆Shellfish Immunology，Volume 25，Issue 6，2008，Pages 740-750)。在此研究成果的基础上，我们进一步对氨基酸结构进行分析，针对该基因的表达产物就是大黄鱼的杀菌通透性增强蛋白(简称Pc-BPI)的重组构建及在抗菌生物学活性方面的功能展开研究。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种大黄鱼BPI-BN蛋白质、引物及其在制备抗生素药物中的应用。

为达到以上目的，本发明是通过这样的技术方案来实现的：

提供一种大黄鱼BPI-BN蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种寡聚核苷酸引物，用于扩增前述蛋白质的基因时，构建Pc-BPI基因的N末端结构域的原核表达载体，其结构为：

BN-F(Hind III)：5’-GCAAGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3’(SEQ ID NO：2)；

BN-R(XhoI)：5’-GGCTCGAGATGTTTAATACTGTAGA-3’(SEQ ID NO：3)。

本发明还提供了前述蛋白质在制备抗生素药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明利用基因工程技术，对大黄鱼Pc-BPI蛋白质的N末端结构域进行重组载体的构建和表达，获得重组BPI蛋白质。该重组BPI蛋白质具有极高效的杀灭弧菌的作用，可以作为绿色抗生素而在渔药开发以及人类医学中应用。

具体实施方式

本发明的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。

本发明的实现步骤包括：

一、在对已公开的大黄鱼Pc-BPI基因的核苷酸全序列和氨基酸序列分析的基础上，设计带酶切位点的引物，即：

BN-F(Hind III)：5’-GCAAGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3’

BN-R(XhoI)：5’-GGCTCGAGATGTTTAATACTGTAGA-3’

此引物对用于Pc-BPI的N端原核表达载体(pGEX4T2)构建。

二、将Pc-BPI基因的2个结构域和全蛋白分别在大肠杆菌和昆虫细胞中进行表达，即：

构建Pc-BPI基因的N末端结构域的原核表达载体(pET-BN)，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，大连宝生物工程公司，中国)诱导表达，并纯化该重组蛋白质产物(BN)(大黄鱼BPI蛋白的N末端结构域)。

培养受试菌，进行重组蛋白产物(BN)的抗菌活性试验。

具体详细的步骤如下：

1、利用PCR技术，以大黄鱼头肾BPI全长cDNA为模板扩增Pc-BPI基因的N末端结构域片段，PCR扩增BN片段的反应条件为：95℃ 2分钟；94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 45秒，35个循环；72℃ 5分钟。利用DNA重组技术将扩增到的序列片段克隆到合适的pMD19-T(大连宝生物工程公司，中国)载体中，转化大肠杆菌TG I(天根生物技术有限公司，中国)，涂布含氨卞青霉素(上海生物工程有限公司，中国)的LB筛选平板，挑选若干个克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，将PCR阳性克隆产物用Hind III和Xho I(大连宝生物工程公司，中国)限制性内切酶双酶切，与经同样酶切的pET-32(a)(Novagen公司，德国)原核表达载体连接，转化大肠杆菌TG I。PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET-BN。将阳性重组质粒pET-BN转化到表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)(北京全式金生物技术有限公司，中国)，在IPTG的诱导下进行表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒(Novagen公司，德国)分离纯化重组蛋白质。

2、重组蛋白质(BN)的表达、纯化、鉴定及定量

将阳性重组质粒pET-BN转化表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)感受态细胞，涂布LB平板(含氨卞青霉素和氯霉素)，37℃培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LBA培养液，37℃振摇培养过夜。取适量菌液，按1∶100扩大培养至OD₆₀₀为0.4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入IPTG，使其终浓度在0-1.0mmol/L，继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后(300W，20分钟，超声3秒，间隔2秒)离心分离上清液和沉淀，分别上样，进行SDS-PAGE电泳。将阳性表达质粒扩大培养，利用Ni-NTA亲和层析柱(Novagen公司，德国)对表达产物进行分离纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳将纯化鉴定过的蛋白质按Brad-ford法进行定量(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding。Anal Biochem.1976，72：248-254)。

3、杀菌试验中受试菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，副溶血弧菌(Vibrio parahamolyticus)接种于海水培养基中，30℃振荡培养过夜，次日以1/100的比例转接新鲜的液体海水培养基中，30℃继续培养3小时至对数生长期，用新鲜的无菌海水培养基调整各细菌悬液OD₆₀₀值达到0。3备用。

4、分别采用菌落计数法和比浊法测试重组表达产物BN蛋白的抗菌活性。

实验组I每个Eppendorf管中加入5μl哈维氏弧菌菌液(OD₆₀₀＝0.3)，重组蛋白10μl；实验组II每个Eppendorf管中加入5μl溶藻弧菌菌液(OD₆₀₀＝0.3)，重组蛋白10μl；实验组III每个Eppendorf管中加入5μl副溶血弧菌菌液(D₆₀₀＝0.3)，重组蛋白10μl。

同时每实验组设置无菌水，无菌PBS，1x Elute buffer代替重组蛋白作为阴性对照。

(1)菌落计数法：当所有样品加完后轻轻混匀，做好标记后，放入4℃冰箱作用2小时，每管加入400μl无菌海水培养基，30℃继续培养2小时后，取经上述孵育后的样品1μl，加无菌海水培养基进行稀释后，均匀涂布在海水培养基琼脂平板上，每个处理组涂3块平板。待菌液吸收干后，放入30℃培养箱中倒置培养过夜(12-18小时)。次日计数平板上的菌落数来评价重组蛋白对三种弧菌生长的影响。(2)比浊法：同时，取经上述孵育后的样品100μl接种到10ml无菌海水培养基中，175rpm摇床继续培养，在接种后的3.5小时、7.5小时和11.5小时取样并用分光光度计测定OD₆₀₀值。每组设3个平行管。

具体的实施例子：

1、大黄鱼BPI蛋白质的结构域的克隆

提取大黄鱼头肾总RNA，根据RT-PCR kit(Promega公司)，利用引物对进行PCR扩增并测序。

2、BN的原核表达、纯化和鉴定

将阳性重组质粒pET-BN转化到表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)感受态细胞，涂布LBA平板，37℃培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LBA培养液，37℃振摇培养过夜。取适量菌液，按1∶100扩大培养至OD₆₀₀为0.4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入IPTG，使其终浓度在0-1.0mmol/L，继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后(300W，20分钟，超声3秒钟，间隔2秒钟)离心分离上清液和沉淀，分别上样，进行SDS-PAGE电泳。将阳性表达质粒扩大培养，利用Ni-NTA亲和层析柱对表达产物进行分离纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳并进一步利用高效液相色谱-质谱联用技术鉴定纯化的蛋白质产物。

3、BN重组蛋白质的抗菌作用

将三种弧菌接种培养在海水培养基中，待生长到对数期后，用新的无菌海水培养基将其调整至OD₆₀₀＝0.3。将重组蛋白BN加入三种弧菌(OD₆₀₀＝0.3)中，对照组为1倍洗脱液和无菌PBS。用菌落计数法和比浊法检测重组蛋白质BN处理后三种弧菌细胞生长情况。结果表明：重组的大黄鱼的BN蛋白质能够高效杀灭三种弧菌，在制备新型绿色渔用抗生素和人类医药中具有很好的应用前景。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干具体实施例框架。显然，本发明不限于以上实施例，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

15 Met Phe Pro Ser Ile Ile Ala Leu Leu The Leu Ile Ser Val Ala

30 Cys Gly Gln Ser Pro Gly Leu Gln Val Ile Leu The Asn Lys Gly

45 Leu Gln Tyr Gly Lys His Val Gly Ala Gly Trp Ile Gln Asp Arg

60 Leu Asn Asn Ile The Phe Pro Asp Ile Ser Gly Lys Val LGA Ile

75 His Phe The Leu The Gly Ile The Ile The Lys Cys Asp Phe Prp

90 Glu Pro Ser Val Glu Phe Tyr Gln Asp ATG Phe Lys The Ser Met

105 Ser Gly Leu Ser Val Ala Leu Ala Gly Trp Trp Lys The Gln Phe

120 Gly Ile Ile His Asp Gly Gly Pro Phe Asn Leu Ala Ile Phe Ser

135 Val Asp Val The Ser Val Val Gly Leu Gly Lys Asp Ala Asp Gly

150 Arg Leu Ser Val The Ser Val Ser Cys Asp Ala Asn Val Gly Asp

165 Val Asp Met Gln Phe Tyr Gly Gly Ala Ser Ala Ile Phe Lys Pro

180 Phe Val Lys Tyr Phe Lys Gly Arg Ile Arg Gly Glu Ile Gln The

195 His Ile Cys Pro Lys Leu Glu Glu Ala Ile Val Met Ile Glu Glu

210 Gln Leu Gln Ala Met Asn Val Ser Phe Asp Val Asp Gln Asp Val

225 The Leu Glu Phe Pro Leu The Asp Leu Pro Val Val Asn Ala Ser

240 Ser Met Asn Leu Gly Leu Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Ile Lys His

SEQ ID NO：2

gcaagcttcc atgctgacca acaaag 26

SEQ ID NO：3

ggctcgagat gtttaatact gtaga 25

Claims

1、一种大黄鱼BPI-BN蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2、一种寡聚核苷酸引物，用于扩增权利要求1所述蛋白质的基因时，构建Pc-BPI基因的N末端结构域的原核表达载体，其结构为：

BN-F：5’-GCAAGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3’

BN-R：5’-GGCTCGAGATGTTTAATACTGTAGA-3’。

3、如权利要求书1所述的蛋白质在制备杀灭弧菌的抗生素药物中的应用。