CN111304209A

CN111304209A - 香港巨牡蛎bpi基因、编码蛋白及克隆方法和重组香港巨牡蛎bpi基因工程菌构建方法

Info

Publication number: CN111304209A
Application number: CN201911349175.2A
Authority: CN
Inventors: 张虹; 朱鹏; 曾达; 许尤厚; 龚斌; 宋静静; 方怀义; 邹起庭; 彭富强; 钟慧镁
Original assignee: Beibu Gulf University
Current assignee: Beibu Gulf University
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明公开一种香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌构建方法及其重组蛋白的应用。本发明香港巨牡蛎BPI基因序列如ESQ ID NO：1所示，其克隆方法为根据与BPI基因同源的保守序列设计特异引物扩增基因；香港巨牡蛎BPI蛋白序列如SEQIDNO.2所示；用分别含有NdeI位点和XbaI位点的引物扩增香港巨牡蛎BPI成熟蛋白；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是对溶藻弧菌和副溶血弧菌具有明显的杀菌作用。

Description

香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及克隆方法和重组香港巨牡蛎 BPI基因工程菌构建方法

【技术领域】

本发明涉及生物分子标记技术领域，具体涉及香港巨牡蛎Ch-BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和香港巨牡蛎Ch-BPI基因工程菌构建方法。

【背景技术】

杀菌通透性增强蛋白(Bactericidal permeability-increasing protein，BPI)是脂质转移/脂多糖结合蛋白大家族的成员，在先天免疫系统中起着至关重要的作用。BPI最初分别从兔粒细胞和血清中分离出来，随后在人、牛和兔等多种动物中进行了克隆并鉴定。BPI具有抗菌杀菌、中和内毒素、免疫调理等多种作用。BPI的重要好处在于其是中性粒细胞的嗜天青颗粒成分,为动物本身抗菌成份，不存在耐药性问题，同时对机体不产生任何损害。BPI与抗菌素合用，效应增强，在体液中不影响其生物活性的发挥，因此BPI存在着广阔的应用前景。

对BPI生物学功能研究主要集中在人和其它哺乳动物，在低等脊椎动物和无脊椎动物中研究相对较少。而无脊椎动物缺乏适应性免疫，以天然免疫为主，同时为开放式体循环，直接跟病原菌接触，研究BPI对理解其免疫机制，防治疾病具有重要意义。目前BPI蛋白活性仅在太平洋牡蛎、三角帆蚌、魁蚶等少数贝类中开展初步研究。然而，香港巨牡蛎BPI蛋白的分子特征及功能尚不清楚。

香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)，又称近江牡蛎、大蚝、白肉蚝、生蚝,属巨牡蛎属(Crassostrea)，是暖水性双壳类软体动物，以滤食海水浮游生物为主,其肉质鲜美，营养丰富，被誉为“海底牛奶”,是我国华南沿岸的重要养殖资源和最主要的养殖种类之一。但随着养殖历史的延长和大规模、高密度养殖的发展，以及养殖环境的日益恶化，养殖病害已成为海洋贝类养殖产业发展的重要制约因素。其中细菌性疾病是目前发病率最高、造成损失最大的疾病之一。盲目和滥用抗生素，不但不能有效控制疾病，还会破坏水环境，同时危害生态安全。而长期用药会导致病原菌对药物产生耐药性，并带来环境污染和药物在贝类体内残留等一系列问题。因此，构建抗菌肽基因表达工程菌，进而产业化生产高效而廉价的天然抗菌药物迫在眉睫。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是提供一种香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌构建方法，表达的重组蛋白对溶藻弧菌、副溶血弧菌具有明显的杀菌作用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种香港巨牡蛎BPI基因，该基因具有ESQ ID NO：1所示的cDNA序列。

一种香港巨牡蛎BPI基因的克隆方法，具体步骤是：根据BPI基因同源序列保守区域设计引物，引物名称和序列为：ChBPI-F1：TGTTGTGTGAAAAGCCACA；ChBPI-R1：TATATCCGTCTTCTGTGAAAAA。PCR反应体系为：总体积25ul，包括10×PCR缓冲液2.5ul、dNTP(2.5mmol/L)2.0ul、两种引物(25mmol/L)各1ul、水17.3ul、Taq聚合酶(中国大连Takara)0.2ul和cDNA模板1ul。PCR反应条件：94℃5min，35个循环；94℃30s，55℃45s，72℃1min，然后72℃10min，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体(中国大连TaKaRa)中，转化到大肠杆菌中，在含氨苄的LB培养基平板上涂板，挑阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，测序所得基因序列如ESQ ID NO：1。

一种如上所述的香港巨牡蛎BPI基因的编码蛋白，该编码蛋白具有ESQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该蛋白分子质量为52.21kDa，等电点为9.26，编码序列的1-19位为信号肽序列，编码序列的27-252位为N端结构域，编码序列的267-471位为C端结构域，两个半胱氨酸(Cys 152位和Cys 194位)形成一个分子内二硫键。

一种利用上所述的香港巨牡蛎BPI基因的编码蛋白编码基因构建重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌的方法，具体步骤如下：

(1)pCznI-bpi测序验证

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，

Ch-BPI-F2：ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGAAGACCCCGGGCCTGCAGACCCGC；

Ch-BPI-R2：GATTCTGTGCTTTTAAGCAGAGATTACCTATCTAGATTAGCCACTATATTTCAGATCGGT；

酶切位点NdeI和XbaI，将获得的重组质粒pCznI-bpi转入TOP10克隆菌株；

(2)pCznI-bpi载体转化至大肠杆菌Rosseta

将重组质粒1μL加入100μL感受态细菌中，置冰上20min。42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μL LB培养液；37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mL Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜；

(3)IPTG诱导pCznI-bpi载体融合蛋白的表达

挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL Amp的3mL LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；次日按1：100接种于50μg/mL Amp的30mL LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，进行12％SDS-PAGE检测分析，目标蛋白取沉淀；

(4)包涵体蛋白的变复性

1)将菌体沉淀重悬于20mL裂解液，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；

2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀；

3)使用包涵体洗涤液洗涤包涵体3次；

4)用溶解缓冲液，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min；

5)将30mL上述溶液逐步滴加到30mL 20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0缓冲液中，缓慢搅拌，滴加速度在1mL/1min，再将稀释蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0溶液中透析过夜；

(5)融合蛋白Ni柱纯化

a)利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱；

b)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

c)用Ni-IDA Washing-Buffer以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

d)用Ni-IDA ELution-Buffer以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

e)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜，12％SDS-PAGE检测分析。

进一步说明，所述裂解液的配方是：20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF andbacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0；包涵体洗涤液的配方是：20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0；溶解缓冲液的配方是：20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0；Ni-IDA Washing-Buffer的配方是：20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0。

一种重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌的应用，其表达的重组杀菌通透性增强蛋白具有明显的抑制溶藻弧菌和副溶血弧菌生长的功能，具有制备抑制溶藻弧菌和副溶血弧菌抗菌药物的用途。

与现有技术相比较，本发明的有益效果是：

本发明首先公开了香港巨牡蛎Ch-BPI基因、编码蛋白及香港巨牡蛎Ch-BPI基因工程菌构建方法，其利用基因工程技术，首次从香港巨牡蛎中克隆了BPI基因cDNA序列，并对香港巨牡蛎BPI蛋白进行重组质粒的构建和表达，获得了一株具有杀菌活性的重组杀菌/渗透性增强蛋白基因工程菌，表达产物经体外活性检测，发现香港巨牡蛎BPI重组蛋白具有高效的杀灭水产动物革兰氏阴性致病菌弧菌属溶藻弧菌、副溶血弧菌的作用，对研制新型高效抗生素替代药物具有重要价值，可以作为绿色疾病制剂在水产动物病害防治中发挥作用。

【附图说明】

图1—香港巨牡蛎BPI蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析；其中M：蛋白质分子质量标准1：未诱导重组蛋白包涵体2：IPTG诱导4h重组蛋白包涵体3：超声波诱导破碎后上清4：超声波诱导破碎后沉淀。箭头处是指香港巨牡蛎BPI蛋白。

图2—香港巨牡蛎BPI重组蛋白纯化SDS-PAGE分析；其中M：蛋白质分子质量标准1：破碎后处理样品2：流出样品3：洗脱样品。箭头处是指香港巨牡蛎BPI重组蛋白。

图3—香港巨牡蛎BPI重组蛋白对溶藻弧菌的抑菌对比实验；其中，A：加BPI蛋白B：加等量培养液作为对照。

图4—香港巨牡蛎BPI重组蛋白对副溶血弧菌的抑菌实验对比图；其中，A：加BPI蛋白B：加等量培养液作为对照。

【具体实施方式】

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例：

1.BPI基因的克隆

1.1引物设计与合成

根据GenBank中已公布同源物种BPI基因的基因序列，利用primer 5.0软件设计特异引物

Ch-BPI-F1：TGTTGTGTGAAAAGCCACA；

Ch-BPI-R1：TATATCCGTCTTCTGTGAAAAA。

1.2总RNA提取和cDNA第一链的合成

使用Trizol法提取香港巨牡蛎总RNA。RNA提取后，通过分光光度计及电泳检测其纯度和完整性，并置于-80℃保存备用。按照AMV反转录试剂盒说明书进行反转录反应。反转录体系20μl：Total RNA 2μg，DNasel 1μl，DNasel Buffer 1.3μl，EDTA 1μl，dNTP 1μl，随机引物2μl，5×AMV Buffer 4μl，RNase Inhibitor 0.5μl，AMV逆转录酶1μl，RNase FreeH2O补至20μl。反应条件：25℃5min，42℃90min，95℃10min；4℃终止。

1.3 RT-PCR

反应以反转录产物作模板进行PCR反应。PCR反应体系20μl：模板1μl，上、下游引物各0.5μl，10×LA Buffer 2μl，dNTP 1μl，LA Taq酶0.3μl，ddH2O补至20μl。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；4℃终止反应。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。

1.4 PCR产物的连接与测序

PCR产物纯化回收后，将目的片段与克隆载体pMD18-TVector连接，然后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，再将菌液涂布在含有氨苄青霉素(Amp⁺)的LB固体培养基上，37℃培养过夜。通过挑取单克隆在含Amp⁺的LB液体培养基中培养，然后cracking鉴定并用天根普通质粒小提试剂盒提取重组质粒，将含有目的片段的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

最终得到香港巨牡蛎BPI序列1729bp(如ESQ ID NO：1所示)，其中开放阅读框为1434bp，共编码477个氨基酸(如ESQ ID NO：2所示)。该蛋白分子量为52.21kDa，等电点为9.26，其中编码序列的1-19位为信号肽，编码序列的27-252位为N端结构域，编码序列的267-471位为C端结构域，两个半胱氨酸Cys(分别位于152和194位)形成一个分子内二硫键。

2 BPI重组蛋白的构建及表达

2.1 pCznI-bpi测序验证

Ch-BPI-F2：ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGAAGACCCCGGGCCTGCAGACCCGC；

Ch-BPI-R2：GATTCTGTGCTTTTAAGCAGAGATTACCTATCTAGATTAGCCACTATATTTCAGATCGGT。

酶切位点NdeI和XbaI，将获得的重组质粒pCznI-bpi转入TOP10克隆菌株。

2.2 pCznI-bpi载体转化至大肠杆菌Rosseta

将重组质粒1μL加入100μL感受态细菌中，置冰上20min。42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μL LB培养液。37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mL Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

2.3 IPTG诱导pCznI-bpi载体融合蛋白的表达

挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL Amp的3mL LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜。次日按1：100接种于50μg/mL Amp的30mL LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达。取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带，结果如图1所示。

2.4表达鉴定结果分析

利用IPTG诱导蛋白表达，经12％SDS-PAGE分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，结果如图1所示。

2.5包涵体蛋白的变复性

(1)将菌体沉淀重悬于20mL裂解液(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF andbacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)。

(2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀。

(3)使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次。

(4)用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min。

(5)将30mL上述溶液逐步滴加到30mL 20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0缓冲液中，缓慢搅拌，滴加速度在1mL/1min，再将稀释蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。

2.6融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析

2.6.1 Ni柱纯化

(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。

(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(4)用Ni-IDA ELution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜。

(6)进行12％SDS-PAGE分析，结果如图2所示。

2.6.2纯化结果分析

包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12％SDS-PAGE分析。

虽然公开一些动物品种的BPI均有一定杀菌效果，但是杀菌的达到何种效果？高效杀菌的时间点如何都不从而知。并且每一种属的BPI的表达存在差异，功能和结构并未有人研究透彻。3香港巨牡蛎重组蛋白的抑菌活性分析

(1)分别挑取受试革兰氏阴性菌溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)平板单克隆接种于装有5mlLB肉汤的试管，盖上盖子在恒温摇床内培养2h。

(2)取10支试管分为两组，A(抑制)组每支加50μl抑制蛋白，B组每支加入50μl LB肉汤，两组每支再各加入50μl培养2h后的菌液，恒温摇床内以温度为30℃，转速180r/min培养2h。

(3)恒温摇床培养2h后A，B两组各加入900μl的LB肉汤(每管总共1ml)，再放入摇床培养5h，每小时测一次OD值。

结果表明，添加ChBPI蛋白的实验组中，溶藻弧菌和副溶血弧菌各时间点的OD₆₀₀比对照组低，说明ChBPI蛋白对溶藻弧菌和副溶血弧菌的生长具有抑制作用。其中，溶藻弧菌的实验组和对照组相比较在培养5小时的时候抑制作用最为显著；副溶血弧菌的实验组和对照组相比较在培养4小时的时候抑制作用最为显著。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北部湾大学

<120> 香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及克隆方法和重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌构建方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1729

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

ccgctacttt gttgtgtgaa gccacaaagg agaaaaaaaa attgcgcatt ttcaaatcat 60

tttaaacctt ccggaaaacg ggaatcatgc agcaagtgtg tttgcttact gtagtgtccc 120

tgtttgtgac gtcagcccaa tgtaagaccc ccggcttaca gacaagaatc actgacaggg 180

cccttgaata tgctacagac gtggcccttg atattttgtc caaacaagtg acgggtcagc 240

aaataccaga ccagcatggc caatccggtg acgtcaagtt cgacattacg ggaatgaatg 300

ttaatcagtt cacaaagccc agcagtagag tatccctgat tcagaacgtc ggtctgtcgt 360

ggtccacgag tggaactggt cttgctatac atggaaactt caaatacaaa tacaggaaag 420

gaataatcaa aatttctgat tcgggtagct ttgacttgaa agcgaatggt atcaatttcc 480

agataaagat agagatagga atggacggca gtggacgccc tactatgaag gctgtagggt 540

gtagctgtaa tgtcgggtca gcagacataa aattccacgg aggtgcagcg tggatctata 600

acctgttttc agggaaactc gaagataaac tgaaagatat ggttggaggc ggagatggat 660

tactttgcaa acaattgaat actttgatag atgtaaatgg aatgaagagt ttacagaaat 720

tacctgtaac tgtgcaaatt gcaaagaggt ttttactgga ttacagattt ttatcgaaac 780

cctcatttca aacaaaattt atggaaactt atcacaaggg agaggtttac tggaatgcag 840

atcccttgga tgccccattt gcagcccccc ctttgttgaa atccgcagat acttccagaa 900

tgatgtatat ctggctatct gattacatct tcaatacgat gtcatacaat gcattgaaat 960

ataaccaact gcaatataat gttacaaata aagatcttcc atcgggtgta ttaaatacga 1020

cttgtcctca atcaacatgc attgggaaaa taataaaatc aattggcacc aaattcccaa 1080

acaccacagt gatgttatac atgaaatcta catctatgcc aaacatgacg gtactgaacg 1140

gatctacgat ggtaaacgct gccggggaca tcatgttctt tgcacaacaa ccaggaggaa 1200

aatataccta cttcctaacg ctgtcagcta cgatgtcaac cacgatttct ctgatgatac 1260

agaacgagaa agtgttcgct aaagtcctca aattacctat ttcagtaact gtgaaagatt 1320

cgaaaattcc ggtttcgtcg gaggggctca atttcatcgt gaaaggcatt gtttccgtct 1380

ttgtcgaacc aaaactgaat gaactcgggg cagcgggatt ccctcttccg gtcattaatt 1440

ccgtgcattt catcaacaca caactgaccg tcgctaagga cacgcttttg attgcaacag 1500

atctgaaata cagtggctga tacaatacat gtgcaatttt caaaaagaca cttttggaaa 1560

tcgaatttct aaattaattt gaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 1620

agagagagag agagagaatc gttttactta agacacatat gtaaactaat tagcattttt 1680

ttcacagaag acggatataa agggcagctc aatcgcccta taggagtca 1729

<210> 2

<211> 477

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Gln Gln Val Cys Leu Leu Thr Val Val Ser Leu Phe Val Thr Ser

1 5 10 15

Ala Gln Cys Lys Thr Pro Gly Leu Gln Thr Arg Ile Thr Asp Arg Ala

20 25 30

Leu Glu Tyr Ala Thr Asp Val Ala Leu Asp Ile Leu Ser Lys Gln Val

35 40 45

Thr Gly Gln Gln Ile Pro Asp Gln His Gly Gln Ser Gly Asp Val Lys

50 55 60

Phe Asp Ile Thr Gly Met Asn Val Asn Gln Phe Thr Lys Pro Ser Ser

65 70 75 80

Arg Val Ser Leu Ile Gln Asn Val Gly Leu Ser Trp Ser Thr Ser Gly

85 90 95

Thr Gly Leu Ala Ile His Gly Asn Phe Lys Tyr Lys Tyr Arg Lys Gly

100 105 110

Ile Ile Lys Ile Ser Asp Ser Gly Ser Phe Asp Leu Lys Ala Asn Gly

115 120 125

Ile Asn Phe Gln Ile Lys Ile Glu Ile Gly Met Asp Gly Ser Gly Arg

130 135 140

Pro Thr Met Lys Ala Val Gly Cys Ser Cys Asn Val Gly Ser Ala Asp

145 150 155 160

Ile Lys Phe His Gly Gly Ala Ala Trp Ile Tyr Asn Leu Phe Ser Gly

165 170 175

Lys Leu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Met Val Gly Gly Gly Asp Gly Leu

180 185 190

Leu Cys Lys Gln Leu Asn Thr Leu Ile Asp Val Asn Gly Met Lys Ser

195 200 205

Leu Gln Lys Leu Pro Val Thr Val Gln Ile Ala Lys Arg Phe Leu Leu

210 215 220

Asp Tyr Arg Phe Leu Ser Lys Pro Ser Phe Gln Thr Lys Phe Met Glu

225 230 235 240

Thr Tyr His Lys Gly Glu Val Tyr Trp Asn Ala Asp Pro Leu Asp Ala

245 250 255

Pro Phe Ala Ala Pro Pro Leu Leu Lys Ser Ala Asp Thr Ser Arg Met

260 265 270

Met Tyr Ile Trp Leu Ser Asp Tyr Ile Phe Asn Thr Met Ser Tyr Asn

275 280 285

Ala Leu Lys Tyr Asn Gln Leu Gln Tyr Asn Val Thr Asn Lys Asp Leu

290 295 300

Pro Ser Gly Val Leu Asn Thr Thr Cys Pro Gln Ser Thr Cys Ile Gly

305 310 315 320

Lys Ile Ile Lys Ser Ile Gly Thr Lys Phe Pro Asn Thr Thr Val Met

325 330 335

Leu Tyr Met Lys Ser Thr Ser Met Pro Asn Met Thr Val Leu Asn Gly

340 345 350

Ser Thr Met Val Asn Ala Ala Gly Asp Ile Met Phe Phe Ala Gln Gln

355 360 365

Pro Gly Gly Lys Tyr Thr Tyr Phe Leu Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser

370 375 380

Thr Thr Ile Ser Leu Met Ile Gln Asn Glu Lys Val Phe Ala Lys Val

385 390 395 400

Leu Lys Leu Pro Ile Ser Val Thr Val Lys Asp Ser Lys Ile Pro Val

405 410 415

Ser Ser Glu Gly Leu Asn Phe Ile Val Lys Gly Ile Val Ser Val Phe

420 425 430

Val Glu Pro Lys Leu Asn Glu Leu Gly Ala Ala Gly Phe Pro Leu Pro

435 440 445

Val Ile Asn Ser Val His Phe Ile Asn Thr Gln Leu Thr Val Ala Lys

450 455 460

Asp Thr Leu Leu Ile Ala Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Gly

465 470 475

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

tgttgtgtga aaagccaca 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

tatatccgtc ttctgtgaaa aa 22

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatgaaga ccccgggcct gcagacccgc 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

gattctgtgc ttttaagcag agattaccta tctagattag ccactatatt tcagatcggt 60

Claims

1.一种香港巨牡蛎BPI基因，其特征在于，该基因具有ESQID NO：1所示的cDNA序列。

2.一种香港巨牡蛎BPI基因的克隆方法，其特征在于，具体步骤是：根据BPI基因同源序列设计引物，引物名称和序列为：ChBPI-F1：TGTTGTGTGAAAAGCCACA；ChBPI-R1：TATATCCGTCTTCTGTGAAAAA；PCR反应体系为：总体积25ul，包括10×PCR缓冲液2.5ul、dNTP(2.5mmol/L)2.0ul、两种引物(25mmol/L)各1ul、水17.3ul、Taq聚合酶(中国大连Takara)0.2ul和cDNA模板1ul；PCR反应条件：94℃5min，35个循环；94℃30s，55℃45s，72℃1min，然后72℃10min，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中，转化到大肠杆菌中，在含氨苄的LB培养基平板上涂板，挑阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，测序所得基因序列如ESQID NO：1。

3.一种如权利要求1所述的香港巨牡蛎BPI基因的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白具有ESQID NO：2所示的氨基酸序列。

4.一种利用权利要求3所述的香港巨牡蛎BPI基因的编码蛋白编码基因构建重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)pCznI-bpi测序验证

Ch-BPI-F2：ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGAAGACCCCGGGCCTGCAGACCCGC；

Ch-BPI-R2：GATTCTGTGCTTTTAAGCAGAGATTACCTATCTAGATTAGCCACTATATTTCAGATCGGT；

(2)pCznI-bpi载体转化至大肠杆菌Rosseta

(3)IPTG诱导pCznI-bpi载体融合蛋白的表达

(4)包涵体蛋白的变复性

2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀；

3)使用包涵体洗涤液洗涤包涵体3次；

5)将30mL上述溶液逐步滴加到30mL 20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0缓冲液中，缓慢搅拌，滴加速度在1mL/1min，再将稀释蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15MNaCl，pH8.0溶液中透析过夜；

(5)融合蛋白Ni柱纯化

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解液的配方是：20mM Tris-HClcontaining 1mM PMSF and bacteria proteaseinhibitor cocktail，pH 8.0；包涵体洗涤液的配方是：20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0；溶解缓冲液的配方是：20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0；Ni-IDA Washing-Buffer的配方是：20mMTris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0。

6.一种重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌的应用，其特征在于，其表达的重组杀菌通透性增强蛋白具有制备抑制溶藻弧菌和副溶血弧菌抗菌药物的用途。