CN101245344B - 中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因克隆及体外重组表达技术，中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因，具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列。本发明利用构建的中华绒鳌蟹cDNA文库，采用RACE技术及体外重组表达技术，对中华绒鳌蟹抗脂多糖因子进行了研究，首次从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，该基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重组技术表达了具有较强杀菌活性的重组蛋白。

Description

中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因克隆及体外重组表达技术，具体地说是从中华绒鳌蟹cDNA文库中克隆出中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的cDNA全序列并对该序列进行了原核重组表达，还涉及到该基因及其表达产物在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂及人类败血病治疗生产中的应用。

背景技术

细菌内毒素引发败血症休克的防治长期以来难获重要突破，其发病率和死亡率仍呈上升趋势。目前已发现多种具有中和内毒素作用的蛋白质，如多粘菌素B(PMB)、杀菌渗透性增强蛋白(BPI)等，然而这些中和蛋白多需预先或在LPS攻击同时给予才有效。抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharidefactor，ALF)是一种通过特异性识别R型革兰氏阴性菌LPS亚单位脂质A而结合并中和内毒素的蛋白质。动物实验研究表明，在内毒素血症发生时、甚至在内毒素血症的晚期给予ALF，都对实验动物具有良好的保护作用，其保护作用可能与ALF降低脂多糖(LPS)诱导的炎症因子NO的产生并增加抗炎因子IL-10的分泌有关。同时，ALF显示了对某些菌株的生长抑制活性，还可抑制LPS对家兔的致热反应。因此，ALF逐渐成为临床中防治内毒素血症的一条重要途径。但对于该基因的研究却与其重要的应用前景不相符。目前仅在Limulus polyphemus(Tanaka et al，1982)、Litopenaeusvannamei(Gross et al，2001)，Tachypleus tridentatus(Wang et al，2001)，Penaeus monodon(Supungul et al，2002；Supungul et al，2004)，Fenneropenaeus chinensis(Liu et al，2004)和Marsupenaeus japonicus(Nagoshi et al，2006)中获得该基因的同源分子。

中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹，因其营养丰富、味道鲜美而深受人们喜爱，是我国重要的水产养殖品种之一。自20世纪80年代以来，中华绒螯蟹养殖业发展迅速，到2000年全国养殖产量已超过100,000吨，年产值达120-150亿元，已成为水产养殖支柱产业之一(崔朝霞等，2003)。但随着养殖规模的不断扩大，各种疾病日趋严重，给中华绒螯蟹养殖产业造成了巨大损失。养殖中华绒鳌蟹病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从河蟹自身的免疫防御因子入手，研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。考虑到当前分离到甲壳类的病原菌多为革兰氏阴性菌，抗脂多糖因子作为一种重要的结合LPS的抗菌肽势必会在其免疫防御中发挥着非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，并对其实现原核表达及重组产物的活性鉴定，为进一步研究中华绒鳌蟹防御机制提供基础，并为中华绒鳌蟹的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和饲料添加剂奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因，具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列。其是从从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，该序列全长700bp，包括363bp的开放阅读框，编码120个氨基酸，5’非编码区长20bp，3’非编码区长317bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在中华绒鳌蟹免疫防御方面发挥着重要作用。利用pET32a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中重组表达了该蛋白，表达产物对藤黄微球菌Micrococcus luteus和鳗弧菌Vibrio anguilarum和大肠杆菌TOP10F均具有明显的杀菌活性。其中对于藤黄微球菌的杀菌活性为100％；而对于革兰氏阴性细菌鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F的杀菌活性分别是80％和26.42％.

其编码蛋白具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，分子量为13273.42Da，等电点为8.59，其中编码序列的1-25位为信号肽序列，成熟肽分子量为10588.14Da，等电点为8.79，有11个净正电荷，并且具有典型的抗脂多糖因子W(T)CPG(S)WT模体结构。分析该成熟肽序列发现其N-端具有明显的疏水性，呈现β-折叠结构，而C-端亲水性较强，具有典型的α-螺旋结构。

中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的重组表达产物可作为动物饲料添加剂、食品防腐剂、食品保鲜剂或用于制备治疗人类败血病的药物。

本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码抗脂多糖因子成熟肽的基因片断并将其克隆到pET32a表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中实现了原核体外重组表达。重组产物经HiTrap chelating柱纯化和透析复性后，对藤黄微球菌和鳗弧菌均表现出明显的杀伤活性。其中对于藤黄微球菌的杀菌活性为100％；而对于革兰氏阴性细菌鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F的杀菌活性分别是80％和26.42％。本发明可为进一步研究中华绒鳌蟹免疫防御机制提供基础，并为中华绒鳌蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂奠定基础，同时为进一步开发治疗人类败血病医药产品提供了更多的选择。

本发明利用构建的中华绒鳌蟹cDNA文库，采用RACE技术及体外重组表达技术，对中华绒鳌蟹抗脂多糖因子进行了研究，首次从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，该基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重组技术表达了具有较强杀菌活性的重组蛋白。

附图说明

图1为本发明重组抗脂多糖因子和融合标签杀菌活性图谱。

具体实施方式

下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1.

一种克隆得到的中华绒鳌蟹抗脂多糖因子，具有以下序列：

序列表(1)SEQ ID NO 1的信息

序列特征

长度：700碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线形

分子类型：DNA

特性名称：CDS(21-383)

来源：中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)

序列描述：

GAATTCGTCAAACCACCAGTATGGCACGCCTGTCGCTGTTCCTTCTCG

TTGTGGCTGTTGCCGTGTTTACTCCAAACATTCCACAGTGTGAAGCTG

GCTGGCTGGACCGGATTATTGGTACAGCAGTTGATTCTGTTGCTGAAT

TCGGAACCACTAATATAGTGGACCAAATCTGCAACACCCGTGTGATGC

CCACCATAAAGAAGTTTGAACTGTACTTCAGGGGGAGAGTGTGGTGC

CCAGGCTGGACAACAATCCAGGGGGAGTCTCTGACTCGCAGCAGGAC

CAGGGTGGTGAACAAAGCTGTGGAAGACTTCGCCAGGAAGGCTGTC

GCTGCAGGCCTCATGACGCAGGAGGATGCTAACCCTTTGCTGAATGCC

TGATCATGGAGCAGGACGCCACACCTCTGGGGCACATGGCTATCCTGA

CCCATGTGTCCTTCATCTGCCATCACTCAACCTCTCCCTCAGGCGACAT

TGTAGAGCAGGATTTCTTAACCTTTTCTAGCATCTGAACCCTTGTACTA

TATTAAGGTATATCAAGCCGCCCTCCACCCCTTCAAGTAAGGCTTTAGT

AGTTCAGCACACCCGATGATTTTGTTAAAAGACTACCTTTACTACATCA

TCATGAAGTAAAAGAAGTTGTTTGGCCAGTACTTTGTTGATTTCATAAT

AAAAGAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAA

(2)SEQ ID NO 2的信息

序列特征：

长度：120个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线形

特性：编码蛋白分子量为13273.42Da，等电点为8.59，其中编码序列的1-25位为信号肽序列，成熟肽分子量为10588.14Da，等电点为8.79，有11个净正电荷，并且具有典型的抗脂多糖因子W(T)CPG(S)WT模体结构。分析该成熟肽序列发现其N-端具有明显的疏水性，呈现β-折叠结构，而C-端亲水性较强，具有典型的α-螺旋结构。

来源：中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)

序列描述：

MARLSLFLLVVAVAVFTPNIPQCEAGWLDRIIGTAVDSVAEFGTTNIVDQI

CNTRVMPTIKKFELYFRGRVWCPGWTTIQGESLTRSRTRVVNKAVEDFAR

KAVAAGLMTQEDANPLLNA

本发明的中华绒鳌蟹抗脂多糖因子cDNA序列克隆及其体外重组表达，包括下列步骤：

a)中华绒鳌蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；

b)中华绒鳌蟹cDNA文库构建；

c)中华绒鳌蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；

d)中华绒鳌蟹EST序列的同源性分析及抗脂多糖因子基因片段的筛选；

e)用基因特异性引物GSF1：GACGCAGGAGGATGCTAAC和GSF2：TGATGGCAGATGAAGGACAC

进行3’和5’RACE克隆到中华绒鳌蟹抗脂多糖因子cDNA全长序列；

f)中华绒鳌蟹抗脂多糖因子的体外重组表达及其活性分析。

具体操作如下：

1)中华绒鳌蟹总RNA的提取及mRNA的纯化：将中华绒鳌蟹注射50μlOD₆₀₀＝0.4的鳗弧菌暂养12小时后，利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取中华绒鳌蟹血淋巴中总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。

2)中华绒鳌蟹cDNA文库构建：利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和

Synthesis Kit(Stratagene)进行cDNA的合成，分别按照试剂盒的说明进行双链cDNA末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切，后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose GelExtraction Kit对大于100bp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector载体连接，利用Stratagene公司的

III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist HelperPhage和SOLR菌株从

XR Vector上体外切割pBluescript成为质粒文库。

3)中华绒鳌蟹cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3(AATTAACCCTCACTAAAGGG)在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体的操作参照《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。

4)中华绒鳌蟹EST序列的同源性分析及抗脂多糖因子基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，具体的操作参照《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。根据相似性分析结果寻找出与抗脂多糖因子基因同源的EST序列。

5)中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因cDNA全长序列的克隆：根据与抗脂多糖因子基因同源的EST序列设计基因特异性引物GSF1：GACGCAGGAGGATGCTAAC和GSF2：TGATGGCAGATGAAGGACAC，分别利用载体通用引物T3(AATTAACCCTCACTAAAGGG)、T7(GTAATACGACTCACTATAGGGC)进行3’和5’末端的扩增，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌XL1-blue，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物M13-47(CGCCAGGGTT TTCCCAGTCACGAC)、RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定，测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。

3’RACE扩增所用体系以及反应条件：

25μl反应体系：

2.5μl 10×PCRbuffer

1.0μl MgCl₂(2.5mM)

2.0μl dNTP(2.5mM)

1μl引物GSF1(10pmol/μl)

1μl引物T7(10pmol/μl)

16.3μl of PCR-grade water

0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)

1μl cDNA文库模板。

反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJResearch)中进行，反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性25秒，57℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。

5’RACE扩增所用体系以及反应条件：

25μl反应体系：

2.5μl 10×PCR buffer

1.0μl MgCl₂(2.5mM)

2.0μl dNTP(2.5mM)

1μl引物GSF2(10pmol/μl)

1μl引物T3(10pmol/μl)

16.3ul of PCR-grade water

0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)

1μl cDNA模板。

反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJResearch)中进行，反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸50秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟。

PCR筛选阳性克隆的反应条件：

25μl反应体系：

2.5μl 10×PCR buffer

1.0μl MgCl₂(2.5mM)

2.0μl dNTP(2.5mM)

1μl引物M13-47(10pmol/μl)

1μl引物RV-M(10pmol/μl)

16.3μl of PCR-grade water

0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)

1μl菌液模板。

反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJResearch)中进行，反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性25秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

将3’RACE和5’RACE的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌XL1-blue，挑选阳性克隆提取质粒，送上海鼎安生物科技有限公司测序，测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。

6)中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的体外重组表达：通过PCR技术，利用R1(GAATTCGGCTGGCTGGACCGGATTATT)和R2(GCGGCCGCTCAGGCATTCAGCAAAGGGTTAG)扩增编码抗脂多糖因子成熟肽的基因片断，反应在PTC-100 Programmable Thermal ControllerCycler(MJ Research)中进行，反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性25秒，65℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。按照《分子克隆第三版》的方法将其克隆到pET32a表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，测序确认表达框的正确性。接种阳性克隆到含有1％葡萄糖的SOB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀0.4-0.6，加入1mM的IPTG诱导过夜，离心保存菌体沉淀。菌体以1mg/mL鸡蛋清溶菌酶处理30min后超声破碎：200W，超声60次，每次2秒，间隔14秒。离心收集上清和沉淀，沉淀以8M的尿素溶解后，利用Amersham公司的HiTrap chelating柱纯化重组产物，纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、1mM EDTA、50mMTris-HCl、50mM NaCl、10％甘油、1％甘氨酸及梯度降低的尿素溶液透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到5M、4M、3M、2M、1M，最后一次透析至无尿素的透析液时不添加甘油。复性后的重组产物采用经典的杀菌活性检测方法(Wang D.，Liu C.，Liu J.，He Z.，Zhang W.，Wu X.2001.Thenative gene of anti-LPS factor from Tachypleus tridentatus：cloning，expressionand its bacteriostatic activity in vitro.Protein Pept Lett.8，273-280)，以藤黄微球菌、鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F作为受试菌株检验表达产物的杀菌活性。表达产物与指数生长期的供试菌株共孵育1hr后，将适度稀释的样品涂步于SOB固体平板，发现藤黄微球菌没有生长，表明重组产物对于该菌株的杀菌活性为100％；而对于革兰氏阴性细菌鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F的杀菌活性分别是80％和26.42％。

实施例2

中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的重组表达产物可作为动物饲料添加剂、食品防腐剂、食品保鲜剂或用于制备治疗人类败血病的药物。

多糖因子.txt

SEQLENCE LISTING

<110>中国科学院海洋研究所

<120>中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因及其编码蛋白和应用

<130>

<160>2

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>700

<212>DNA

<213>中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)

<220>

<221>CDS

<222>(21)..(383)

<223>

<400>1

gaattcgtca aaccaccagt atg gca cgc ctg tcg ctg ttc ctt ctc gtt gtg    53

                      Met Ala Arg Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Val

                      1               5                   10

gct gtt gcc gtg ttt act cca aac att cca cag tgt gaa gct ggc tgg     101

Ala Val Ala Val Phe Thr Pro Asn Ile Pro Gln Cys Glu Ala Gly Trp

            15                  20                  25

ctg gac cgg att att ggt aca gca gtt gat tct gtt gct gaa ttc gga     149

Leu Asp Arg Ile Ile Gly Thr Ala Val Asp Ser Val Ala Glu Phe Gly

        30                  35                  40

acc act aat ata gtg gac caa atc tgc aac acc cgt gtg atg ccc acc     197

Thr Thr Asn Ile Val Asp Gln Ile Cys Asn Thr Arg Val Met Pro Thr

    45                  50                  55

ata aag aag ttt gaa ctg tac ttc agg ggg aga gtg tgg tgc cca ggc     245

Ile Lys Lys Phe Glu Leu Tyr Phe Arg Gly Arg Val Trp Cys Pro Gly

60                  65                  70                  75

tgg aca aca atc cag ggg gag tct ctg act cgc agc agg acc agg gtg     293

Trp Thr Thr Ile Gln Gly Glu Ser Leu Thr Arg Ser Arg Thr Arg Val

                80                  85                  90

gtg aac aaa gct gtg gaa gac ttc gcc agg aag gct gtc gct gca ggc     341

Val Asn Lys Ala Val Glu Asp Phe Ala Arg Lys Ala Val Ala Ala Gly

            95                  100                 105

ctc atg acg cag gag gat gct aac cct ttg ctg aat gcc tga             383

Leu Met Thr Gln Glu Asp Ala Asn Pro Leu Leu Asn Ala

         110                115                 120

tcatggagca ggacgccaca cctctggggc acatggctat cctgacccat gtgtccttca   443

tctgccatca ctcaacctct ccctcaggcg acattgtaga gcaggatttc ttaacctttt   503

ctagcatctg aacccttgta ctatattaag gtatatcaag ccgccctcca ccccttcaag   563

taaggcttta gtagttcagc acacccgatg attttgttaa aagactacct ttactacatc   623

atcatgaagt aaaagaagtt gtttggccag tactttgttg atttcataat aaaagaaata   683

aaaaaaaaaa aaaaaaa                                                  700

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)

<400>2

Met Ala Arg Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Val Ala Val Ala Val Phe

1               5                   10                  15

Thr Pro Asn Ile Pro Gln Cys Glu Ala Gly Trp Leu Asp Arg Ile Ile

            20                  25                  30

Gly Thr Ala Val Asp Ser Val Ala Glu Phe Gly Thr Thr Asn Ile Val

        35                  40                  45

Asp Gln Ile Cys Asn Thr Arg Val Met Pro Thr Ile Lys Lys Phe Glu

    50                  55                  60

Ieu Tyr Phe Arg Gly Arg Val Trp Cys Pro Gly Trp Thr Thr Ile Gln

65                  70                  75                  80

Gly Glu Ser Leu Thr Arg Ser Arg Thr Arg Val Val Asn Lys Ala Val

                85                  90                  95

Glu Asp Phe Ala Arg Lys Ala Val Ala Ala Gly Leu Met Thr Gln Glu

            100                 105                 110

Asp Ala Asn Pro Leu Leu Asn Ala

        115                 120

Claims (3)

1.一种中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因，其特征在于：所述基因是序列表SEQ ID No：1所示的碱基序列。

2.一种权利要求1所述中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因编码蛋白，其特征在于：所述蛋白是序列表SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的应用，其特征在于：中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的重组表达产物作为动物饲料添加剂、食品防腐剂、食品保鲜剂或用于制备治疗人类败血病的药物。

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