CN107937406B - 一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用，涉及三疣梭子蟹基因工程，该三疣梭子蟹新型Crustin基因序列如SEQ NO.1所示，本发明还提供一种制备三疣梭子蟹新型Crustin基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹新型Crustin基因重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白；与现有技术相比，本发明具有如下优点：Crustin基因的重组蛋白可能广泛参与了三疣梭子蟹抗微生物感染的先天免疫反应，在微生物新药物开发上显示出诱人的应用前景。

Description

一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用。
背景技术
抗菌肽是广泛存在于生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体固有免疫的关键因子之一。Steiner最早在天蚕中发现后，到目前为止，在各种生物中总共发现了800 多种抗菌肽。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类：(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如鲎的血蓝蛋白。Crustin作为一种针对革兰氏阳性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中发现的 (Relf et al.1999)。随后的研究发现其氨基酸序列在其C末端有12个Cys，其中8个位置保守，形成WAP结构域。
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。但随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的多种疾病在三疣梭子蟹养殖群体中频频爆发，造成了巨大的经济损失，严重制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。目前蟹病的防治仍主要采用传统抗生素药物防治，但长期盲目滥用药物，容易造成耐药性等问题，导致产品质量下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。Crustin作为一种重要的抗菌肽在其免疫防御中发挥着非常重要的作用。因此，这就迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物进行免疫防治。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹新型的Crustin基因。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种制备三疣梭子蟹新型Crustin基因的重组蛋白。
本发明所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹新型Crustin基因重组蛋白的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该三疣梭子蟹新型Crustin基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹新型Crustin基因的序列如SEQ NO.1所示。
进一步地，所述的三疣梭子蟹新型Crustin基因的氨基酸序列为Met Thr Ser LeuArg Ile Ala Phe Leu Val Leu Val Gly Cys Val Val Pro Ala Tyr Met Gln Phe GlySer Asn Cys Val His Trp Cys Arg Thr Pro Glu Asn Gln Val Tyr Cys Cys Lys AspThr His Asp Thr Pro Ala Ser Pro Ile Gln Val Val Asn His Gly Arg Cys Pro ProVal Arg Pro Val Cys Pro Pro Val Arg Ser Phe Ser Pro Pro Gln Ser Cys Ser SerAsp Ser Asp Cys Tyr Gly Gln Lys Cys Cys Tyr Asp Arg Cys Leu Glu Glu His ValCys Lys Pro Gln His Tyr Gly His Gly Gly His Gly Gly His Gly Gly His Gly GlyHis Gly Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Gly Phe Gly Arg。
本发明为解决第二个技术问题提供了一种制备上述的三疣梭子蟹新型Crustin基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建三疣梭子蟹新型Crustin基因重组表达载体；
(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；
(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即三疣梭子蟹新型Crustin 基因重组蛋白。
进一步地，在所述步骤(1)中的表达载体选用pET-21a(+)。
进一步地，在所述步骤(2)中，所述宿主细胞为大肠杆菌Origami(DE3)。
本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从中华绒螯蟹中克隆到新型Crustin基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码Crustin成熟肽的基因片段并将其克隆到pET-21a(+)表达载体中，在大肠杆菌Origami(DE3)实现体外重组表达。
本发明为解决第三个技术问题提供了一种利用上述的三疣梭子蟹新型Crustin基因在制备抑菌药中的应用。
本发明为解决第三个技术问题提供了一种利用上述的三疣梭子蟹新型Crustin基因在制备动物饲料抗菌添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明在分离出的三疣梭子蟹新型Crustin 基因的基础上，根据三疣梭子蟹Crustin基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得三疣梭子蟹Crustin的抗菌肽，该抗菌肽具有广谱的抗菌活性，表明三疣梭子蟹Crustin的抗菌肽可能广泛参与了三疣梭子蟹抗微生物感染的先天免疫反应，重组蛋白在动物饲料添加剂和抗病原微生物新药物开发上显示出较好的应用前景。
具体实施方式
以下通过结合序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明中的三疣梭子蟹Crustin的cDNA序列克隆及体外重组表达包括下列步骤：
a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；
b)三疣梭子蟹cDNA文库构建；
c)三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；
d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及Crustin基因片段的筛选；
e)EST序列拼接获得Crustin的全序列；
f)三疣梭子蟹Crustin的体外重组表达及活性分析。
具体操作如下：
1、三疣梭子蟹总RNA 的提取及mRNA的纯化：利用Invitrogen公司的Trizol 试剂从感染了溶藻弧菌的三疣梭子蟹血淋巴中提取总RNA，利用QIAGEN公司的 OligotexmRNA纯化试剂盒纯化mRNA。
2、三疣梭子蟹cDNA文库构建：利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和ZAP-Synthesis Kit(Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II AgaroseGelExtraction Kit对大于100bp的酶切片段进行回收，与Invetrogen公司Uni-ZAP XRvector载体连接，利用Stratagene公司的ZAP-III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从Uni-XRVector上体外切割pBluescript成为质粒文库。
3、三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件 (*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于 Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。
4、三疣梭子蟹EST序列的同源性分析Crustin基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，根据相似性分析结果寻找出与 Crustin基因同源的EST序列。
5、三疣梭子蟹Crustin基因cDNA全长序列的克隆：根据与Crustin的EST序列设计特异性引物F1(CCCTCCTGTTCGTCCTGTATGT)与通用引物 oligodT(GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT)进行3`末端的扩增。 PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海博大泰克)进行 PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10F’，挑选阳性克隆用载体引物M13-47和RV-M进行测序，所得结果经CLUSTER分析拼接和得到全长序列。
3’RACE扩增所用反应体系及反应条件：
25μl反应体系，包含
2.5μl 10×PCR buffer，
1.5μl MgCl2(2.5mM)，
1.0μl引物F1(10pmol/μl)，
1.0μl引物oligo dT(10pmol/μl)，
2.0μl dNTP(2.5mM)，
0.15μl Taq DNA polymerase(Promega)，
1.0μlcDNA模板，
15.85μlPCR-grade water。
反应在PTC-100PCR热循环仪(MJ Research)中进行，反应条件为：94℃预变性 5分钟，然后进入35个循环：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸60秒。最后进行72℃延伸10分钟。
实施例2
根据SEQ ID NO.1对应的cDNA序列，设计含有限制性内切酶Nde I和Xho I 酶切位点的特异性引物F2(CATATGCAGTTTGGATCTAATTGTGTTCA)和 R2(CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCGACCAAATCCGCCGCCGA)，通过 PCR技术扩增编码Crustin成熟肽的基因片段，反应在PTC-100Programmable Thermal Crontroller然后进行35个循环包含94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30 秒；最后72℃延伸10分钟。然后将其克隆到pET21a(+)表达载体中，转化大肠杆菌 origami(DE3)，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到LB培养基中，37℃振荡培养至O.D600＝0.4-0.6，加入IPTG至终浓度1mM诱导4小时后离心收集菌体。菌体用超声波200W处理30-60分钟(每次3秒，间隔3秒)。离心收集上清，利用Amersham公司的HiTrapchelating柱纯化重组产物。纯化后的产物利用梯度稀释法进行抑菌活性测定。以大肠杆菌，嗜水气单胞菌，溶藻弧菌，产吲哚金黄杆菌，金黄色葡萄球菌，溶壁微球菌作为受试菌株检验表达产物的杀菌活性。将104-105的对数生长期受试菌在28℃培养24-36小时后，600nm测定细菌浓度。发现革兰氏阴性菌在所有Crustin试验浓度下都能正常生长，而革兰氏阳性菌只在含低浓度Crustin或者不含Crustin的LB培养基中生长。
利用pET21a(+)表达载体在大肠杆菌origami(DE3)重组表达了该蛋白，表达产物对革兰氏阳性菌具有明显抑菌活性，如金黄色葡萄球菌、产吲哚金黄杆菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为0.69μM、0.34μM、1.38μM、0.69μM。具体见下表：
微生物 MIC(μM)
革兰氏阳性菌
产吲哚金黄杆菌 0.69
金黄色葡萄球菌 0.34
革兰氏阴性菌
溶藻弧菌 1.38
嗜水气单胞菌 0.69
实施例3重组表达产物在药物生产、饲料添加剂、防腐剂以及保鲜剂方面的应用。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用
<130> Not published yet
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 627
<212> DNA
<213> Portunus trituberculatus
<400> 1
ctccgttgct gttgaagatg acgtcactgc ggatagcgtt cctggtgttg gtgggatgcg 60
tggtgccagc ttacatgcag tttggatcta attgtgttca ctggtgccgg acacctgaaa 120
atcaagtgta ctgttgcaag gatacacatg acaccccggc ctctcccatc caagtggtta 180
atcatggacg ctgccctcct gttcgtcctg tatgtccacc tgtcagatcc ttcagtccgc 240
cccagagttg ctccagcgac agcgactgct acggccagaa gtgctgctat gacagatgtc 300
ttgaggaaca cgtgtgcaaa cctcagcatt atggacatgg tgggcacggc ggacacggcg 360
gtcacggtgg gcacggaggc tttggtgggt tcggcggcgg atttggtcgc taagaaccgg 420
gatgaatttt tcacttttca cttgttctat tatttcttga tcaaacctcc atgttggtaa 480
tagagaccaa gccaggacat cgattaatga tttagtagat ttattttaca ttttctcgtg 540
attgttttta tatgtgtttg atataaaaaa ttcttttaat aataaatacc tttaaaaagc 600
gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 627

Claims (6)

1.一种三疣梭子蟹Crustin基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹Crustin基因的序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹Crustin基因，其特征在于所述的三疣梭子蟹Crustin基因编码的氨基酸序列为：Met Thr Ser Leu Arg Ile Ala Phe Leu Val Leu ValGly Cys Val Val Pro Ala Tyr Met Gln Phe Gly Ser Asn Cys Val His Trp Cys ArgThr Pro Glu Asn Gln Val Tyr Cys Cys Lys Asp Thr His Asp Thr Pro Ala Ser ProIle Gln Val Val Asn His Gly Arg Cys Pro Pro Val Arg Pro Val Cys Pro Pro ValArg Ser Phe Ser Pro Pro Gln Ser Cys Ser Ser Asp Ser Asp Cys Tyr Gly Gln LysCys Cys Tyr Asp Arg Cys Leu Glu Glu His Val Cys Lys Pro Gln His Tyr Gly HisGly Gly His Gly Gly His Gly Gly His Gly Gly His Gly Gly Phe Gly Gly Phe GlyGly Gly Phe Gly Arg 。
3.一种制备如权利要求1或2所述的三疣梭子蟹Crustin基因编码的重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 构建三疣梭子蟹Crustin基因的重组表达载体；
(2) 将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；
(3) 分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即三疣梭子蟹Crustin基因编码的重组蛋白。
4.根据权利要求 3 所述的制备三疣梭子蟹Crustin基因编码的重组蛋白的方法，其特征在于在所述步骤(1)中的表达载体选用pET-21a (+)。
5.根据权利要求 3 所述的制备三疣梭子蟹Crustin基因编码的重组蛋白的方法，其特征在于在所述步骤(2)中，所述宿主细胞为大肠杆菌origami(DE3)。
6.一种根据权利要求1或2所述的三疣梭子蟹Crustin基因在制备抑制革兰氏阳性菌药物中的应用。
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