CN109797155B - 三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体来说是一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用。本发明利用转录组测序获得的unigene和RACE技术从三疣梭子蟹中扩增得到PtMBL基因cDNA，发现重组PtMBL蛋白具有显著的抑菌、菌结合和菌凝集活力。重组蛋白PtMBL对革兰氏阴性菌(溶藻弧菌、铜绿假单胞菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌)具有明显的抑制效果，最小抑菌浓度分别为0.81～1.61μM、0.81μM、0.81～1.61μM、3.22～6.44μM。重组蛋白PtMBL对溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和毕赤酵母菌均具有明显的结合活力。此外，在Ca²⁺存在下，重组蛋白PtMBL对溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和毕赤酵母菌具有明显的凝集效果。本发明为三疣梭子蟹的病害防治奠定了基础，在开发抗菌药物、菌凝集制剂、新型免疫制剂、饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值。

Description

三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和 应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

补体系统是先天免疫系统的重要组成部分，也是联系先天免疫和获得性免疫的纽带。脊椎动物补体系统的激活主要通过三条途径，即经典途径(classic pathway)、凝集素途径(lectin pathway)和替代途径(alternative pathway)。无脊椎动物缺乏真正的抗体和特异性的免疫细胞，机体防御反应主要依靠先天免疫系统，其中补体凝集素途径既不需要经典途径中抗原—抗体复合物的存在，也不像替代途径中缺乏特定的识别分子，而是依赖模式识别受体与微生物多糖结合而启动，在无脊椎动物免疫防御中具有十分重要的生物学意义。

甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)属于Collectin家族，能够识别病原微生物表面的甘露糖残基并激活脊椎动物补体凝集素途径。脊椎动物中的MBL主要包含N-末端半胱氨酸富集结构域、胶原样结构域、颈区和C-末端糖识别结构域(CRD)。其中，胶原样结构域能够与MBL相关丝氨酸蛋白酶MASP结合形成复合体，而CRD在钙离子参与下能够参与对微生物的识别，特别是CRD中的EPN(Glu-Pro-Asn)基序仅特异性的识别甘露糖，从而引发补体激活、吞噬作用或炎症反应来清除细菌。无脊椎动物补体凝集素途径研究起步较晚，在尾索动物海鞘中仅发现了MBL的类似分子，即葡萄糖结合凝集素GBL。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养价值丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的各种疾病日趋严重，给梭子蟹养殖业造成巨大的经济损失。病害的不断爆发和病因的多样性迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物。到目前为止，关于三疣梭子蟹PtMBL的研究尚少。因此，开展PtMBL的研究对理解三疣梭子蟹的免疫防御机制、进行病害防治具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明旨在提供一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因，三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因为序列表由SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)三疣梭子蟹总RNA的提取及检测；

b)三疣梭子蟹文库构建；

c)三疣梭子蟹转录组测序及分析；

d)三疣梭子蟹unigene序列的同源性分析及PtMBL基因片段的筛选；

e)RACE扩增获得PtMBL的全序列(由SEQ ID No.1中的碱基序列所示)以及全序列的验证。

一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白，所述PtMBL基因编码蛋白由序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。

所述编码蛋白通过PCR技术扩增编码PtMBL成熟肽的基因片段并将其克隆到pET32a(+)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)-plysS实现体外重组表达。重组蛋白PtMBL经TALON柱纯化和透析后即获得由序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示的重组蛋白。

一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白的应用，所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白在制备为抗菌药物、菌凝集制剂、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂中的应用。

所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白在用于制备抑菌药物或菌凝集制剂中的应用。

所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白在用于制备革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌的抗菌药物或凝集制剂。

所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌或铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌或藤黄微球菌。

所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白在用于制备真菌的凝集制剂中的应用。

所述真菌为毕赤酵母菌。

本发明所具有的优点：

本发明利用转录组测序获得的unigene和RACE技术从三疣梭子蟹中克隆到PtMBL基因cDNA全长序列，通过PCR技术扩增编码PtMBL成熟肽的基因片段并将其克隆到pET32a(+)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)-plysS实现体外重组表达。重组蛋白PtMBL经TALON柱纯化和透析后，对革兰氏阴性菌(溶藻弧菌、铜绿假单胞菌)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌)和真菌(毕赤酵母菌)均具有结合和凝集活力。重组蛋白PtMBL对溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌均有明显的抑制作用，最小抑菌浓度分别为0.81～1.61μM、0.81μM、0.81～1.61μM、3.22～6.44μM。

本发明的PtMBL基因及其重组蛋白主要在药物生产、免疫增强剂、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中应用，另外还可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治提供参考。

附图说明

图1为本发明实例提供的纯化后三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL编码成熟肽的基因扩增产物(其中，M：DNA marker，1：成熟肽的基因扩增产物)。

图2为本发明实例提供的诱导和纯化后三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白(其中M：蛋白marker；1：IPTG诱导后pET-32a空质粒表达的蛋白2：未诱导菌体中表达的蛋白；3：IPTG诱导后表达的蛋白；4：纯化的重组蛋白)。

图3为本发明实例三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白对细菌、真菌结合活力作用图(其中M：蛋白marker；E：微生物与PtMBL重组蛋白的洗脱液；S：微生物与重组蛋白孵育离心后上清液；W：微生物与PtMBL重组蛋白孵育后洗涤液)。

图4为本发明实例三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白对细菌和真菌凝集活性作用图。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

本发明中的三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)三疣梭子蟹总RNA的提取及检测；

b)三疣梭子蟹文库构建；

c)三疣梭子蟹转录组测序及分析；

d)三疣梭子蟹unigene序列的同源性分析及PtMBL基因片段的筛选；

e)RACE扩增获得PtMBL的全序列以及全序列的验证。

实施例1.

三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因由SEQ ID No.1中所示的碱基序列。

序列表SEQ ID No.1为：

GTTCCTCAGGTTTGATGCTCGGGGACTTCTCCTCCGCAAGATGAAGGTCGCTGTCGTCCTGCTGTCGTGCCTCGCCTTCGCCGCCTCCTCCCGGCGTCCCTACCCGAGCCGCTACCCAAGCTCCGGCGGCGGCTTCCCTGGCAGAGGCTCAGTTATCGTCTTCCCCGACGAGGTCAAGGGCGGTGGAGGAAGCGGGGGCCACGTCCACCCTGGAGTTGGTGTTGGGAATATTTACCCCCCACCAGTCGGTCATGGTGGCGAGCCTCTGGTCACTAGCCACTGCCCACGCGCTATTTCCAAAGATGTCCACGGCACCTTCCTGGGACACAACTACCACTTCTCTTGGTGCGCTGATGGCGGCCAGCGCTACACTTGGGAGGCCGCCCGCGACTACTGCACCAGGCTGGGCCCCGGCTGGTACCCTGTGGCCATCGAAAGTAGGGATGAAGACAACTACATCATCGACATTGTTGGCAGCCACCAATCTCCCTGGATCTGGACTGGCGGGAACACTTTGAGCAACACTAACTACGTCTGGCAATGGCTGGATGGAAGTTCTCTCATCTACACTAACTGGGGACAGACTGGATCATTGGACAGACCACAGCCAGACAACGCCGAAAACAACAACGAACGGTGCCTGGCTATCCTCAACCAGTTCTACGCAGGAGACTTCATTACTTTCCACGACATCGGATGCCATCACACCAAACCAACCATCTGCGAGAACTCTAATGTCCAGGTTCCCGTCCCCGTGCCCCAGTATGGTTAAGAGCGATGGCTAAGGTATAATAGGTTCGGAGATAGTGACTGTCCAACGGCCTAAGAGCGAAGGGTTAATGCTTCTGTTAAGGGGAATGTAATGGTCTTAAGTGGTGATTATTTAAAAAAGAAGGAATATAAAATGCAGCGTGTGAAAGTCCATGATAGGATTGTGTTCTTGTAATTTATCAGTATTAGAATAAGAGAAACTTGTGTATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATAACTGTGATGCTTCGAGACACTAATTACGATTGTTACCTGCTTTTCTGGGGTGTTCATGATGTAATCAACTAAAGCTCAATGGACAAACACACCTGTGACTAAAATTTAAGCAGGTTATTGGATGATAATGTGACATTAAGTGAATAAATTGCTTGAATGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

(a)序列特征

●长度：1208bp(有效长度41～772bp)

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)

(f)特异性名称：CDS

构建具体操作如下：

1.三疣梭子蟹总RNA的提取及检测：利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取三疣梭子蟹成体组织的总RNA。琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop检测RNA的纯度，Qubit对RNA浓度进行精确定量，Agilent 2100精确检测RNA的完整性。

2.三疣梭子蟹文库构建：委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行文库构建和测序分析。步骤简要说明如下：总RNA样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。随后加入破碎缓冲液将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I和RNase H合成二链cDNA，再用AMPure XPbeads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPureXP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。

3.转录组测序及分析：委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行测序分析。步骤简要说明如下：文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq/MiSeq测序。对于无参考基因组物种的转录组分析，先将测序所得的序列拼接成转录本，以转录本为参考序列，进行后续分析。获得clean reads后，采用Trinity转录组拼接软件对clean reads进行拼接。取每条基因中最长的转录本作为unigene，以此进行后续的分析。后续分析包括基因功能注释(基因功能注释数据库包括Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swiss-prot，KEGG，GO)、CDS预测、基因表达水平分析等生物信息学分析。

4.三疣梭子蟹unigene序列的同源性分析及PtMBL基因片段的筛选：在三疣梭子蟹转录组中获得1条PtMBL相关的unigene，将其在数据库中进行BLASTx分析，结果显示该序列与克氏原螯虾MBL序列相似性较高，确定为三疣梭子蟹PtMBL基因的unigene序列。

5.三疣梭子蟹PtMBL基因cDNA全长序列的克隆：根据与PtMBL基因同源的unigene序列设计特异引物F1(5'TTCTCCTCCGCAAGATGAAGGTC 3')和R1(5'GGACAGTCACTATCTCCGAACCTATT 3')进行5'末端和中间片段扩增；利用特异引物F2(5'CTGGCAATGGCTGGATGGAAGTT 3')和3'RACE Outer Primer(5'GACTCGAGTCGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT3')进行3'末端的扩增。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Axygen胶回收试剂盒进行PCR产物回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态Trans 5α(北京全式金生物技术有限公司)，挑选阳性克隆用载体引物M13和特异引物进行测序，所得结果经Seqman软件进行拼接，得到三疣梭子蟹PtMBL基因全长cDNA序列见SEQ ID No.1。

6.三疣梭子蟹PtMBL基因cDNA全长的验证：在测序拼接的PtMBL全长序列上，利用特异性引物F1(5'TTCTCCTCCGCAAGATGAAGGTC 3')和R3(5'CAGGTGTGTTTGTCCATTGAGCT 3')，以cDNA为模板进行全长的验证。测序及分析同5。

5'RACE扩增反应体系及反应条件：

25μl反应体系：

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，58℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

3'RACE扩增反应体系及反应条件：

25μl反应体系：

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

全长验证的PCR反应体系和反应条件为：

25μl反应体系：

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

序列表SEQ ID No.1从三疣梭子蟹中克隆到PtMBL基因cDNA全长1208bp，其中开放阅读框732bp，5'非翻译区40bp，3'非翻译区436bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。

实施例2.

三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL序列表SEQ ID No.1所述碱基序列，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所述。

序列表SEQ ID No.2为：

MKVAVVLLSCLAFAASSRRPYPSRYPSSGGGFPGRGSVIVFPDEVKGGGGSGGHVHPGVGVGNIYPPPVGHGGEPLVTSHCPRAISKDVHGTFLGHNYHFSWCADGGQRYTWEAARDYCTRLGPGWYPVAIESRDEDNYIIDIVGSHQSPWIWTGGNTLSNTNYVWQWLDGSSLIYTNWGQTGSLDRPQPDNAENNNERCLAILNQFYAGDFITFHDIGCHHTKPTICENSNVQVPVPVPQYG

其具有完整的编码蛋白含有243个氨基酸，该编码序列1-16个氨基酸为信号肽，成熟肽包含227个氨基酸，预测的分子量为24.87kDa，等电点为5.95。成熟肽缺少脊椎动物报道的半胱氨酸富集结构域、胶原样结构域和颈区，但具有典型的CRD结构域(92-229)，其中包含4个半胱氨酸残基，能够形成两个二硫键(C¹¹⁹-C²²⁸,C²⁰⁰-C²²⁰)。CRD结构域中缺少典型的脊椎动物和其它无脊椎动物中识别甘露糖的基序EPN，但却含有典型的识别半乳糖的基序QPD(Gln-Pro-Asp)和Ca²⁺结合位点基序FHD(Phe-His-Asp)。

三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白的获得，具体操作如下：

根据SEQ ID No.2对应的cDNA序列，设计含有限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点的特异性引物F4(5'CGGGATCCTCCCGGCGTCCCTACCCGAG 3')和R4(5'CCCTCGAGTTAACCATACTGGGGCACGG 3')，通过PCR技术扩增编码PtMBL成熟肽的基因片段(见图1)，反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。然后通过酶切将其克隆到pET32a(+)表达载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)-plysS，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到LB培养基中，37℃振荡培养至O.D.₆₀₀＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1mM诱导4h后离心收集菌体。菌体在冰浴条件下用超声波180W处理30min(每次2s，间隔2s)，离心去掉上清，收集沉淀。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱纯化重组产物。将纯化的重组蛋白转移到透析袋中，4℃条件下，在含有2mM还原谷胱苷肽、0.2mM氧化谷胱苷肽、1mM EDTA、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、10％甘油和1％甘氨酸的及梯度降低的尿素(6、5、4、3、2、1、0M)的透析复性液(pH＝8.0)中透析，使重组蛋白复性，最后在50mM Tris-HCl(pH＝8.0)的缓冲液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析复性后的重组蛋白经PALL公司的Microsep Advance超滤离心浓缩管进行浓缩，用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测得三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白的浓度为1.52mg/ml(见图2)。

实施例3.

1.三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白的体外抑菌试验：

微生物的培养及制备：溶藻弧菌用TSB培养基28℃培养，铜绿假单胞菌用TSB培养基37℃，金黄色葡萄球菌用LB培养基37℃培养，藤黄微球菌用LB培养基37℃培养，毕赤酵母用YPD培养基28℃培养，上述各菌株用摇床220rpm/min培养使菌浓度达到对数生长期时，分别用50mM Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1×10³个。

重组蛋白PtMBL抑菌活性测定：利用上述实施例所得由序列表SEQ ID No.2所述氨基酸序列的重组蛋白PtMBL用Tris-HCl(50mM，pH＝8.0)梯度稀释(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64)后，各取上述重组蛋白的不同梯度稀释50μl分别加到无菌平底96孔板(Costar，Fisher)中，以50μl Tris-HCl(50mM，pH＝8.0)设为对照，然后向各孔板中分别加入50μl稀释好的不同菌株的菌悬液，同时以只加入50μl菌液(不同菌株的)的孔为空白孔；而后将96孔板在菌液的培养温度下孵育2小时后，孵育后再向各孔中加入相应的培养基150μl，空白孔加入培养基200μl，孵育过夜。

加溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、毕赤酵母的96孔板在波长为560nm下读数测吸光值，加金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的96孔板在波长为600nm下测量。

最小抑菌浓度为微生物可以生长的最大重组蛋白浓度和微生物被完全抑制生长的最低浓度之间的范围。发现上述实施例重组蛋白PtMBL对革兰氏阴性菌溶藻弧菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌有明显的抑制作用，最小抑菌浓度依次分别为0.81～1.61μM、0.81μM、0.81～1.61μM、3.22～6.44μM，而对真菌毕赤酵母没有明显的抑制作用。

2.三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白的体外微生物结合实验

分别取上述培养至对数生长期的细菌、真菌各1.0ml，10000rpm离心1min收集菌体；将收集的菌体用1.0ml 37％的甲醛中固定，37℃轻摇震荡1h。将细菌、真菌于4℃，4000rpm离心10min，收集菌体；用1.0ml Tris-HCl缓冲液将菌体洗2次，最后用1.0ml Tris-HCl缓冲液重悬菌体；分别将0.5ml菌悬液与0.5ml PtMBL重组蛋白混合，4℃轻摇震荡30min后，于4℃，4000rpm离心5min；保留上清到新的离心管(即为上清液)，用1.0ml Tris-HCl缓冲液将沉淀洗涤2遍，第1次的洗涤液要保留到新的离心管(即为洗涤液)；将菌体重组蛋白结合物与50.0μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液洗脱(即为洗脱液)，将50.0μl上清液、50.0μl洗涤液分别与50.0μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀；分别将洗脱液、上清液、洗涤液进行15％SDS-PAGE电泳。发现上述实施例重组蛋白PtMBL对革兰氏阴性菌溶藻弧菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌以及真菌毕赤酵母菌均有结合活力(见图3)。

3.三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL重组蛋白的体外微生物凝集实验

FITC染色：分别取上述培养至对数生长期的细菌、真菌1.0ml，于4℃4000rpm离心5min收集菌体，弃去培养基后用PBS洗菌3次。加入终浓度为0.1mgmL^-1的FITC，暗处慢摇染色过夜。于4℃4000g离心5min收集菌体，弃去培养基后用PBS洗菌3次，以去除残留的FITC。

凝菌实验：使用无菌PBS将FITC标记的菌重悬，调整菌浓度至2.5×10⁹个mL^-1。实验组中，取25μLPtMBL重组蛋白与20μL FITC标记的菌悬液于1.5ml离心管中混匀；对照组中，取25μL rTrx与20μL FITC标记的菌悬液混匀。为观察Ca²⁺是否对凝集活性有影响，在实验组和对照组中分别加入或不加入10mM CaCl₂。将样品置于暗处28℃慢摇孵育2h，取5μL于荧光显微镜下观察。发现上述实施例重组蛋白PtMBL在Ca²⁺存在下对革兰氏阴性菌溶藻弧菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌以及真菌毕赤酵母菌均有显著的凝集作用(见图4)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1208

<212> DNA

<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)

<400> 1

gttcctcagg tttgatgctc ggggacttct cctccgcaag atgaaggtcg ctgtcgtcct 60

gctgtcgtgc ctcgccttcg ccgcctcctc ccggcgtccc tacccgagcc gctacccaag 120

ctccggcggc ggcttccctg gcagaggctc agttatcgtc ttccccgacg aggtcaaggg 180

cggtggagga agcgggggcc acgtccaccc tggagttggt gttgggaata tttacccccc 240

accagtcggt catggtggcg agcctctggt cactagccac tgcccacgcg ctatttccaa 300

agatgtccac ggcaccttcc tgggacacaa ctaccacttc tcttggtgcg ctgatggcgg 360

ccagcgctac acttgggagg ccgcccgcga ctactgcacc aggctgggcc ccggctggta 420

ccctgtggcc atcgaaagta gggatgaaga caactacatc atcgacattg ttggcagcca 480

ccaatctccc tggatctgga ctggcgggaa cactttgagc aacactaact acgtctggca 540

atggctggat ggaagttctc tcatctacac taactgggga cagactggat cattggacag 600

accacagcca gacaacgccg aaaacaacaa cgaacggtgc ctggctatcc tcaaccagtt 660

ctacgcagga gacttcatta ctttccacga catcggatgc catcacacca aaccaaccat 720

ctgcgagaac tctaatgtcc aggttcccgt ccccgtgccc cagtatggtt aagagcgatg 780

gctaaggtat aataggttcg gagatagtga ctgtccaacg gcctaagagc gaagggttaa 840

tgcttctgtt aaggggaatg taatggtctt aagtggtgat tatttaaaaa agaaggaata 900

taaaatgcag cgtgtgaaag tccatgatag gattgtgttc ttgtaattta tcagtattag 960

aataagagaa acttgtgtat gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 1020

gagaataact gtgatgcttc gagacactaa ttacgattgt tacctgcttt tctggggtgt 1080

tcatgatgta atcaactaaa gctcaatgga caaacacacc tgtgactaaa atttaagcag 1140

gttattggat gataatgtga cattaagtga ataaattgct tgaatgtcaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaa 1208

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)

<400> 2

Met Lys Val Ala Val Val Leu Leu Ser Cys Leu Ala Phe Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ser Arg Arg Pro Tyr Pro Ser Arg Tyr Pro Ser Ser Gly Gly Gly Phe

20 25 30

Pro Gly Arg Gly Ser Val Ile Val Phe Pro Asp Glu Val Lys Gly Gly

35 40 45

Gly Gly Ser Gly Gly His Val His Pro Gly Val Gly Val Gly Asn Ile

50 55 60

Tyr Pro Pro Pro Val Gly His Gly Gly Glu Pro Leu Val Thr Ser His

65 70 75 80

Cys Pro Arg Ala Ile Ser Lys Asp Val His Gly Thr Phe Leu Gly His

85 90 95

Asn Tyr His Phe Ser Trp Cys Ala Asp Gly Gly Gln Arg Tyr Thr Trp

100 105 110

Glu Ala Ala Arg Asp Tyr Cys Thr Arg Leu Gly Pro Gly Trp Tyr Pro

115 120 125

Val Ala Ile Glu Ser Arg Asp Glu Asp Asn Tyr Ile Ile Asp Ile Val

130 135 140

Gly Ser His Gln Ser Pro Trp Ile Trp Thr Gly Gly Asn Thr Leu Ser

145 150 155 160

Asn Thr Asn Tyr Val Trp Gln Trp Leu Asp Gly Ser Ser Leu Ile Tyr

165 170 175

Thr Asn Trp Gly Gln Thr Gly Ser Leu Asp Arg Pro Gln Pro Asp Asn

180 185 190

Ala Glu Asn Asn Asn Glu Arg Cys Leu Ala Ile Leu Asn Gln Phe Tyr

195 200 205

Ala Gly Asp Phe Ile Thr Phe His Asp Ile Gly Cys His His Thr Lys

210 215 220

Pro Thr Ile Cys Glu Asn Ser Asn Val Gln Val Pro Val Pro Val Pro

225 230 235 240

Gln Tyr Gly

Claims (7)

1.一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因，其特征在于：三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因为序列表由SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

2.一种权利要求1所述的三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白，其特征在于：所述PtMBL基因编码蛋白由序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。

3.按权利要求2所述的三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白的应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白在用于制备抑菌药物或菌凝集制剂中的应用。

4.按权利要求3所述的三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白的应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白在用于制备革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌的抗菌药物或凝集制剂。

5.按权利要求4所述的三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白的应用，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌或铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌或藤黄微球菌。

6.按权利要求3所述的三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白的应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白在用于制备真菌的凝集制剂中的应用。

7.按权利要求6所述的三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因的编码蛋白的应用，其特征在于：所述真菌为毕赤酵母菌。

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