CN113755469B

CN113755469B - 肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶及其应用

Info

Publication number: CN113755469B
Application number: CN202111315964.1A
Authority: CN
Inventors: 祝先潮; 何平; 胡付品; 马瑞景; 徐磊; 毛意芝; 方红燕
Original assignee: Shanghai Ruizhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Ruizhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2041-11-09
Also published as: CN113755469A

Abstract

本发明提供了肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶及其应用。本发明所提供的肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶能够有效分解K19型肺炎克雷伯菌胞外多糖和荚膜，从而利于能够杀伤肺炎克雷伯菌的药物或免疫细胞与肺炎克雷伯菌进行接触，进而发挥药效。

Description

肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶及其应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌是一种常见的机会致病菌，也是一种重要的医源性感染病原体。2018年1-6月流行病学调查显示，肺炎克雷伯菌在主要临床分离菌种中占近14%，仅次于大肠埃希菌，位居第二。且历年主要革兰阴性杆菌分离率研究中发现，肺炎克雷伯菌分离率呈现升高趋势。其可定植于口腔、皮肤、肠道等部位，可引起包括败血症、肺炎、尿路感染、具有重要临床研究价值。

由于近年来临床大量使用抗生素，多种细菌产生了多重耐药现象，包括肺炎克雷伯菌，主要表现为产广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株。其中，细菌生物被膜的产生大大提高了细菌抵御抗生素的能力。肺炎克雷伯菌能够合成多糖，在细菌周围形成荚膜多糖或分泌为胞外多糖，形成一种自然生物膜。该生物膜既可以作为包裹细菌体的物理屏障，抵御噬菌体或其他有害物质的攻击，也能够减轻抗生素的渗透，并一定程度上抵抗宿主的免疫系统。因此，生物膜的形成在细菌感染中具有重要意义。对抗生物膜发展对于减轻细菌耐药性是十分必要的。

噬菌体是一类能够感染细菌等微生物的病毒，部分可引起宿主菌的裂解。噬菌体衍生的荚膜解聚酶在肺炎克雷伯菌感染的治疗中得到了诸多关注。荚膜解聚酶能够分解细菌的荚膜多糖，破坏宿主菌的荚膜屏障，增加其对抗生素和免疫攻击的敏感性。

在一项全国成人碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）荚膜多糖血清型研究中发现，其血清型中K47 和K64 型两型总共仅占全部成人CRKP的61%-76%左右。其余如K19型等也占有一定的比例。然而，由于噬菌体的宿主谱特异性，早期发现的解聚酶并无法对K19荚膜型CRKP产生满意的荚膜裂解作用。

因此，本领域迫切需要开发新的可高效或特异降解K19肺炎克雷伯菌荚膜多糖的解聚酶。

发明内容

本发明的目的就是提供可高效或特异降解肺炎克雷伯菌荚膜多糖的解聚酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的解聚酶，所述的解聚酶为：

(a) 具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或

(b) 将SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶活性的衍生多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的解聚酶，所述的解聚酶选自下组：

(a) 具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b) 将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶活性的衍生多肽；

(c) 氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的同源性≥85%(较佳地≥95%)，并具有肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶活性的衍生多肽；

(d) 序列中含有(a)、(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

在另一优选例中，所述的解聚酶为多糖解聚酶。

在另一优选例中，所述的序列(d)为由(a)、(b)或(c)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的解聚酶具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述多肽。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2 所示。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、或整合载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有第三方面所述的载体，或其基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞、真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞，293细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种生产本发明第一方面所述的解聚酶的方法，包括步骤：

(a) 在适合表达的条件下，培养第四方面所述的遗传工程化的宿主细胞，从而表达第一方面所述的解聚酶；和

(b) 任选地分离所述的解聚酶，从而获得经分离的所述的解聚酶。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有(a)第一方面所述的解聚酶和(b) 药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有(c) 额外的药物。

在另一优选例中，所述的额外的药物包括抗菌药物。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自下组：口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。

在本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的解聚酶的用途，它被用于制备抗肺炎克雷伯菌感染的药物。

在另一优选例中，所述的肺炎克雷伯菌包括K19型肺炎克雷伯菌。

在本发明的第八方面，提供了一种体外对肺炎克雷伯菌的荚膜多糖进行降解的方法，包括步骤：

(S1) 将所述的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖与第一方面所述的解聚酶进行接触，从而使得所述的荚膜多糖发生降解。

在另一优选例中，所述的荚膜多糖包括位于活的或死的肺炎克雷伯菌上的荚膜多糖。

在另一优选例中，所述的荚膜多糖被降解为低聚糖。

在另一优选例中，所述的肺炎克雷伯菌K19型肺炎克雷伯菌。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断和非治疗性的。

在本发明的第九方面，提供了一种治疗肺炎或抑制肺炎克雷伯菌的方法，给需要的对象施用第一方面所述的解聚酶或第六方面所述的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了噬菌体SH-KP156570在Kp 6570双层琼脂平板上形成的噬菌斑及晕圈。

图2显示了噬菌体SH-KP156570编码蛋白种类。

图3显示了ORF7基因产物的N-末端区域与T7噬菌体的N-末端序列有较高的相似性；其下游区域与tail spike protein和pectate lyase有较高的相似性。

图4显示了Dpo7蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图5显示了不同浓度Dpo7蛋白在Kp 6570双层琼脂平板上形成的晕圈。

图6显示了血清杀伤实验中经解聚酶Dpo7处理的菌及对照组菌的存活率。

图7显示了解聚酶Dpo7水解多糖(KP19-01-PS-20201222)的HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次提供了结构新颖的肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶及其在抗肺炎克雷伯菌中的应用。具体地，本发明发现了一种肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶多肽及编码该多肽的核苷酸，并提供了适合表达该肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶的表达体系，该荚膜多糖解聚酶能够有效分解肺炎克雷伯菌胞外聚合物。在此基础上完成了本发明。

定义

如本文所用，术语“本发明活性多肽”、“本发明的多肽及其衍生多肽”、“本发明的酶”、“本发明的解聚酶”、“本发明的多糖解聚酶”、“本发明的肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶”，“解聚酶 Dpo7”可互换使用，均指本发明第一方面中所述的肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶或其衍生多肽。

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明的活性多肽具有肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶活性，并且能够降解肺炎克雷伯菌的荚膜多糖。

所述的多肽优选序列为SEQ ID NO.: 1所示的多肽，该术语还包括具有与所示多肽具有相同功能的、SEQ ID NO: 1序列的变异形式及衍生多肽。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括解聚酶Dpo7的活性片段和活性衍生物。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与解聚酶Dpo7的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了降解细菌胞外多糖性能的多肽。

本发明的解聚酶蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly –His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述解聚酶Dpo7的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO: 1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO: 1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO: 1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1% Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO: 1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码解聚酶Dpo7蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的解聚酶Dpo7核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或解聚酶Dpo7蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的解聚酶Dpo7多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码解聚酶Dpo7多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，解聚酶Dpo7多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含解聚酶Dpo7编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

应用

本发明涉及的活性多肽或解聚酶 Dpo7的用途包括(但不限于)：有效分解K19荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物，从而利于能够杀伤该菌的药物与该菌进行接触进而发挥药效。

本发明的主要优点包括：

1.本发明提供了一种肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶，其对于 K19 荚膜型肺炎克雷伯菌具有高度敏感性和特异性，能够有效分解该荚膜型肺炎克雷伯菌的荚膜多糖。

2.本发明提供的肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶能够显著促进细菌对血清杀菌作用的敏感性，在药物组合物中起到协助抗菌作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1 菌株分离鉴定

以分离自上海交通大学医学院附属仁济医院南院的肺炎克雷伯菌6570作为宿主菌，其他肺炎克雷伯菌临床菌株来自仁济南院及复旦大学附属华山医院。根据Brisse (Wzi gene sequencing, a rapid method for determination of capsular type forKlebsiella strains. J. Clin. Microbiol. 51, 4073-4078.)方法，进行菌株荚膜类型的测定和分型。这些临床分离株在37℃的LB液体培养基中过夜培养，加入50%甘油保存于﹣80℃。

结果：分离获得24株临床菌株，均对多种抗生素耐药，包括头孢呋辛(CXM)、头孢噻肟(CTX)、阿米卡星(AMK)、头孢唑林(CZO)、美罗培南(MEM)、亚胺培南(IMP)、庆大霉素(GEN)和哌拉西林(PIP)。首先将这些临床菌株在37℃的LB培养基中培养，次日将培养物以 1:100稀释至新鲜培养基中，培养至所需生长阶段，并采用wzi测序法对临床分离的菌株进行分型测定。

实施例2感染肺炎克雷伯菌6570 菌株的噬菌体（SH-KP156570）的分离

利用肺炎克雷伯菌临床分离株6570从生物处理的污水中分离得到噬菌体。具体操作如下：将未处理的水样5000 rpm离心15 min，过0.22 μm滤膜后与LB液体培养基中感染肺炎克雷伯菌6570的菌液37℃共同过夜培养。次日离心后，将含有噬菌体的上清液用0.22μm过滤器过滤，在覆盖肺炎克雷伯菌6570的双层琼脂平板上点滴5μL滤液后过夜培养，在平板上发现具有晕圈的噬菌体斑块。挑取斑块，采用SM缓冲液(100 mM NaCl，8 mM MgSO₄·7H₂O，50 mM Tris-HCl，pH=7.5)梯度稀释后，与菌液共孵育五分钟后铺板于1.5%琼脂LB培养基之上，待上层凝固后，置于37℃培养箱过夜培养。次日，挑选单一的斑块进行噬菌体的纯化，直至平板上产生形状及大小一致的斑块为止。根据Pires ( Use of newly isolated phagesfor control of Pseudomonasaeruginosa PAO1 and ATCC 10145 bioflms. Res.Microbiol. 162, 798-806.)的方法得到纯化后的噬菌体。获得裂解性噬菌体并将其命名为SH-KP156570。纯化后的噬菌体经扩增后保存于4℃的SM缓冲液中。

结果：将肺炎克雷伯菌6570菌株与瑞金医院收集的污水在LB液体培养基中共培养过夜。从医院的污水中分离出特异性的噬菌体(命名为SH-KP156570)。将稀释的噬菌体悬液利用双层琼脂平板法铺于Kp 6570细菌的半固体平板，能够形成透明的噬菌斑，在噬菌斑周围可见淡淡的晕圈(图1)。

实施例3 宿主谱测定

通过点滴试验和双层琼脂平板试验，对分离获得的24株临床菌株进行SH-KP156570的宿主谱检测。简而言之，取400 μL细菌培养物与4 mL 0.5%琼脂LB充分混匀，铺板于1.5%琼脂LB培养基之上。待上层琼脂凝固后，将5 μL纯化的噬菌体混悬液滴在菌苔上，在37℃过夜孵育后，观察噬菌体对细菌的作用。

结果：所有细菌经噬菌体感染后均产生噬菌斑和晕圈，而对于肺炎克雷伯非K19型菌株，噬菌体不能对其进行裂解。结果表明，SH-KP156570噬菌体对肺炎克雷伯K19型菌株具有高度敏感性和特异性(表1)。

表1. 噬菌体SH-KP156570和解聚酶Dpo7、Dpo41、Dpo42、Dpo43的裂解谱

注：﹢表示有作用，﹣表示无作用。

Dpo41为K64型菌株特异性解聚酶，Dpo42和Dpo43为K47型菌株特异性解聚酶。

实施例4 基因组DNA测序和注释

噬菌体基因组DNA的提取采用前述的标准方案。向含有噬菌体的SM缓冲液中加入10 μg/mL脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶A，37℃下处理1 h，随后加入25 mmol/mL乙二胺四乙酸(EDTA)。将提取好的噬菌体DNA送至上海派森诺生物科技有限公司进行基因组测序，利用Illumina 高通量测序平台(IlluminaHiseq 3000)完成。使用SOAP denovo2软件进行基因组装和结果优化。GeneMark软件和Glimmer 3.02软件用于预测分析噬菌体基因组的开放阅读框(open reading frame，ORF)。通过使用NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上的BLAST在线工具与已知序列进行比较，并对这些预测基因进行注释。

结果：全基因组测序结果显示，SH-KP156570噬菌体具有38,667碱基对的线性双链基因组，GC含量为50.85%。基因组序列的注释表明，该噬菌体基因组预计包含47个开放阅读框(ORFs)，这些ORFs的平均长度为851 bp。根据功能的不同，噬菌体编码蛋白可分为5类：DNA包装和形态相关蛋白(6个)、DNA复制/重组/修饰蛋白(16个)、宿主裂解蛋白(4个)、未分类蛋白(3个)，其余都是假设蛋白，无毒力基因和耐药基因(图2)。

实施例5 重组解聚酶的克隆、表达和纯化

实施例3中实验表明噬菌体SH-KP156570具有多糖解聚酶活性。因此，我们试图在体外分离纯化该噬菌体解聚酶。根据基因组分析，推测假定蛋白ORF7可能是候选基因。

该基因(长度2,292 bp)位于噬菌体基因组的核苷酸4,183到6,474之间。ORF7基因产物的conserved domain blast结果显示其N-末端区域与T7噬菌体的N-末端序列有较高的相似性，在其下游区域显示出与tail spike protein和pectate lyase较高的相似性(图3)。

利用HHpred的一致序列比较方法在蛋白数据库(PDB)中鉴定出一个相似度较高的同源物，结果显示Escherichia virus CBA120的tailspike protein与我们预测的蛋白具有28%的一致性，并且含有β-螺旋结构的果胶裂解酶区域。据报道，Escherichia virusCBA120的tailspike protein 3是大肠杆菌的脂多糖裂解酶。综上所述，所有信息表明ORF7基因的产物可能对应于噬菌体SH-KP156570中的一种多糖解聚酶，命名为该多糖解聚酶为Dpo7。

多糖解聚酶Dpo7 的氨基酸序列如SEQ ID No: 1 所示：

MSTITQFPSGNTRYRIEFDYLARTFVVVTLVNSSNPTLNRVLEVGRDYRFLNPTMIEMLVDQSGFDIVRIHRQTGTDLVVDFRNGSVLTASDLTNAELQAIHIAEEGRDQTVDLAKEYADAAGSSAGNAKDSEDEARRIAERIKAAGLVGYITRRSFEKGFNVTTWNEVLLWEEDGAYYRWDGTLPKNVPAGSTPETSGGIGLGSWVSVGDASLRADLIDDNDRLGDALITIKQPYNGSVARTQHSKNLDTISVKDFGAKGDGESDDTVYVQAALDWLAGGEARTIVMPDGTYNVTNLTLSLNGTGTKNCKIISHGVFKHIGSGNMLLIKGGMYCQFELRVTGEGYDASTIPDYTIADPIGANQAFVVESCRACKFKVIGHGYPGRVFRTRKENTANVKLSFLDLDITTGNDTCGQAMYLQGTDAWGCITFAQTNWDYFGSVIDTILDISVVYWEAGCKNRNKPVIHFKEVTNSHFTTLAAGGAKMLVEGGAGITIQKALLGESQDYALEVIGKGEGQPKHQLTIHSMLTANTGASGGGIRLSNAVGVTINDTLCDGAHNAVVMYNLCRDVTIKGHFRNSQVAAIYAVQGSTLENVTISGKCYAAGNSGFCDFSQADTKNVTLVDTTVVTKGFYLRLKDNNNGVNVRGGNWSGTEMTVSAINMRPRSIKDVTGIDTRKTASKQKFASGSESGTTLVIPHGLWKAPNEVFVTVLDPENKVTGRANTVIVKEVADTHITFKYSGGAPLSNDLHFQFTAKAEERSN(SEQ ID No: 1)

多糖解聚酶Dpo7 的核苷酸序列如SEQ ID No: 2 所示：

ATGTCCACGATTACACAATTCCCCTCAGGAAACACTCGGTACAGGATTGAGTTCGACTACCTAGCCAGAACGTTTGTTGTTGTTACACTGGTGAATAGCTCTAACCCTACCCTGAACCGTGTACTGGAAGTTGGTCGAGATTACCGCTTCCTTAATCCAACGATGATTGAGATGCTGGTTGACCAATCGGGTTTCGACATCGTTCGTATTCACCGTCAGACTGGAACTGACTTAGTGGTAGACTTCAGGAATGGCTCAGTGTTGACAGCTAGTGACCTGACCAATGCAGAGCTTCAGGCTATCCATATTGCAGAAGAAGGTCGAGACCAAACCGTTGACTTAGCGAAGGAATATGCCGATGCTGCTGGTAGCTCTGCTGGCAACGCTAAGGATAGCGAGGACGAAGCAAGACGAATCGCTGAGCGTATCAAGGCAGCTGGTCTAGTTGGCTACATTACCCGGCGCTCCTTCGAGAAAGGATTCAACGTTACAACATGGAACGAGGTCCTGCTATGGGAAGAGGATGGTGCTTATTACCGCTGGGATGGCACGCTTCCAAAGAACGTTCCCGCTGGTTCGACTCCTGAAACGTCTGGCGGTATTGGTCTAGGGTCGTGGGTTAGTGTTGGTGATGCTTCGTTGAGAGCAGATCTTATTGATGATAATGATCGTCTAGGCGATGCACTGATAACTATCAAACAACCGTACAACGGTTCTGTGGCAAGAACACAGCACTCTAAGAACTTGGATACTATTAGCGTTAAGGACTTTGGTGCCAAAGGGGATGGAGAGTCAGATGATACAGTGTATGTCCAAGCTGCTTTAGATTGGCTAGCTGGGGGAGAGGCTAGAACTATTGTAATGCCGGATGGTACTTACAATGTCACAAACCTAACTTTATCACTAAATGGCACCGGAACTAAGAACTGTAAGATTATCTCACATGGTGTATTCAAACATATAGGTAGCGGTAATATGCTCTTAATCAAGGGCGGCATGTATTGTCAGTTTGAACTTCGTGTCACAGGTGAAGGATATGATGCTTCTACTATACCTGATTACACCATAGCAGACCCTATTGGTGCAAATCAAGCCTTTGTTGTAGAATCTTGCCGTGCATGTAAGTTCAAAGTTATAGGGCACGGGTACCCGGGTCGTGTATTCCGTACCCGCAAAGAAAATACAGCTAATGTAAAGTTATCATTCTTAGACCTAGATATCACTACTGGAAATGATACATGCGGACAGGCCATGTACCTTCAAGGCACTGATGCTTGGGGCTGCATCACCTTTGCCCAGACTAACTGGGATTACTTCGGAAGTGTAATTGACACGATTCTAGACATCTCAGTTGTATATTGGGAAGCTGGGTGTAAAAACCGTAACAAGCCAGTTATCCATTTCAAAGAAGTGACCAACTCACATTTCACGACCCTAGCTGCTGGTGGAGCTAAGATGTTAGTTGAAGGCGGAGCAGGTATCACCATCCAGAAGGCATTACTTGGTGAAAGTCAAGATTACGCATTGGAAGTTATTGGTAAAGGTGAAGGTCAGCCAAAACACCAACTTACAATTCACAGCATGTTGACTGCTAATACTGGTGCATCTGGTGGTGGCATTCGTCTATCTAATGCTGTTGGTGTCACTATTAACGACACTTTGTGTGATGGTGCGCATAATGCAGTGGTAATGTATAACCTGTGTCGTGATGTAACAATCAAAGGTCATTTTCGTAATAGCCAAGTTGCTGCTATTTACGCGGTTCAAGGTTCTACATTGGAGAACGTAACAATTAGCGGCAAGTGTTATGCTGCTGGTAATAGTGGGTTCTGTGACTTCTCTCAAGCTGATACTAAGAACGTAACATTAGTAGACACCACTGTTGTAACCAAAGGCTTCTATTTGAGACTAAAAGACAACAATAATGGTGTAAATGTACGTGGTGGTAATTGGTCGGGGACTGAAATGACTGTTTCTGCTATCAATATGCGCCCTCGTTCTATTAAAGATGTAACAGGTATAGATACGAGAAAGACTGCCAGCAAACAGAAGTTTGCATCTGGTTCAGAGTCTGGAACCACACTAGTCATACCTCACGGACTATGGAAGGCACCTAACGAGGTATTTGTCACAGTACTTGACCCAGAAAATAAAGTAACTGGTAGGGCTAATACTGTAATAGTTAAGGAGGTTGCTGATACTCATATTACCTTCAAATATAGTGGTGGGGCACCTCTTTCAAACGATTTACATTTTCAATTTACAGCAAAAGCTGAAGAGAGAAGTAACTAA(SEQ ID No: 2)

采用人工合成的方法合成多糖解聚酶Dpo7 编码序列，或利用引物6570-ORF7-F(5'-CAGCAGCAGACGGGAGGATCCATGTCCACGATTACACAATTC-3') (SEQ ID No: 3)和6570-ORF7-R(5'-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGTTACTTCTCTCTTCAGC-3')(SEQ ID No: 4)，从含编码序列的模板DNA 中扩增多糖解聚酶Dpo7 的编码序列。

将多糖解聚酶Dpo7 的编码序列（2292 个碱基的PCR 扩增产物），经BamH I和HindIII酶切位点克隆到N末端6 × His标记的pSumo3表达载体上。重组质粒经DNA测序验证成功后转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。随后为了得到重组Dpo7蛋白，在0.1 mM IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)中25℃下诱导表达4 h，收菌进行蛋白的表达纯化。得到重组Dpo7蛋白(解聚酶Dpo7)。

将表达细菌菌体重悬在含PMSF 的20 mL 裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl，500 mMNaCl，10%甘油，20 mM咪唑，pH=7.5)中，冰上超声裂解；在4℃下、以12,000 rpm离心1 h，取上清随后采用镍离子柱进行蛋白纯化，平衡Ni柱后，分别用20 mM、40 mM裂解缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液(20 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，300 mM咪唑，pH=7.5)洗脱，得到融合蛋白SUMO-Dpo7。将蛋白在30 KD滤膜上离心富集(Thermo，USA)，后加入SUMO蛋白酶去除his标记的SUMO蛋白，得到纯化后的蛋白Dpo7，进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，并在﹣80℃保存。纯化后的重组蛋白大小约为84 kDa, 纯度在95%以上(图4)。

实施例6 解聚酶Dpo7 活性分析

为确认ORF7基因产物具有多糖解聚酶活性，通过点滴实验测定解聚酶Dpo7活性。将纯化后的重组解聚酶稀释到不同的浓度(4 µg/mL～ 0.4 mg/mL )。将400 µL对数生长期的肺炎克雷伯菌6570与4 mL 0.5%的软琼脂培养基混合，然后将混合物倒在1.5% LB的琼脂上，形成双层琼脂平板。随后在平板上滴加5 µL稀释成不同浓度梯度的多糖解聚酶，SUMO蛋白作为阴性对照，37℃孵育过夜，通过观察其是否有透明晕圈形成来检测Dpo7的酶活性。此外，其他肺炎克雷伯菌株对解聚酶Dpo7的敏感性也通过点滴实验进行测定。

结果：观察到滴加稀释到4 μg/mL浓度多糖解聚酶的平板仍有透明晕圈产生(图5)。此外，Dpo7与针对K47型菌株有特异性解聚活性的Dpo42、Dpo43和针对K64型的Dpo41同时对不同的K19型菌株进行了点滴实验，结果显示，多糖解聚酶Dpo7对肺炎克雷伯菌的识别谱与其噬菌体的宿主谱完全一致，表明其具有较好的对K19型菌株的特异性(表1)。

实施例7 胞外多糖的纯化

将肺炎克雷伯6570菌株在新鲜的TSB培养基中培养过夜，于37℃不搅拌培养5天。进行胞外多糖纯化，具体步骤如下：

向10 mL细菌培养物中加入60 μL甲醛溶液(36.5%)，100 rpm室温孵育1 h；加入1M NaOH，搅拌3 h，在16,800 g下离心1 h以分离多糖(上清)和菌体沉淀；上清液加入三氯乙酸(TCA，20% w/v)沉淀上清以去除蛋白质和核酸，将溶液在16,800 g下离心1 h，收集上清液；加入1.5倍体积的96%乙醇，﹣20℃下放置24 h析出胞外多糖EPS；再经16,800 g离心1 h，将沉淀重悬于双蒸水(ddH₂O)中；胞外多糖混合物在4℃使用12～14 kDa透析袋于ddH₂O中过夜透析，以去除小分子杂质，最后对透析得到的胞外多糖进行冻干称重。

实施例8 用解聚酶Dpo7裂解细菌胞外多糖

为了证明重组蛋白Dpo7具有降解胞外多糖的活性，我们采用高效液相体积排阻色谱(SEC-HPLC)进行分析解聚实验。将纯化后的K19胞外多糖溶解于50 mM Na₂HPO₄ (pH=7.0)中至终浓度为0.5 mg/mL，分别与Dpo7 (10 μg/mL)或PB溶液在37℃孵育30 min，孵育后在100℃加热15 min终止反应。

SEC-HPLC 分析多糖解聚物：HPLC 进样体积为20 μL，30 min 内采用溶液A(0.2 M磷酸盐缓冲液)作为流动相，以0.5 mL/min流速进行色谱分析，对比降解前后的峰图，可以分析解聚酶Dpo7对KP19多糖的活性。

结果：由图7可知，在37℃温育，100℃的终止反应条件下，解聚酶Dpo7能够很好地将KP19多糖水解；对比KP19+水+PB(磷酸缓冲液)在经过前处理和直接进样图谱可得，峰图面积数值没有明显区别，说明在没有加入解聚酶Dpo7的情况下多糖只经过37℃孵育和终止反应时含量并没有变少。

实施例9 血清敏感性检测

为了探讨解聚酶的辅助杀菌作用，进行了肺炎克雷伯菌的血清敏感性试验。将肺炎克雷伯菌对数生长期的2.5 × 10⁵ CFU菌液离心，重悬于1 mL PBS缓冲液中，vortex混匀后于菌液中分别加入终浓度为100 µg/mL的解聚酶Dpo7及K64-P2410-ORF41(实验室前期获得的特异性针对K64型菌株的解聚酶)，总体积为25 µL，在37℃下预处理1 h。随后，将其与75 µL健康志愿者的血清混合。样品在37℃下孵育1、2 h后，分别在LB平板上以适当稀释度将其稀释涂板。37℃过夜培养后测定活菌数，计算活菌率。

结果测定肺炎克雷伯菌K19型菌株6570经多糖解聚酶Dpo7孵育后的血清杀伤效果。为了确定Dpo7是否能够通过降解细菌表面的荚膜多糖促进细菌对血清的敏感性，我们通过血清杀伤实验分析了经Dpo7 解聚酶处理后菌的存活率(图6)。

结果表明，用Dpo7 酶处理后的肺炎克雷伯菌K19型菌株6570与未处理的细菌相比，在1、2 h 血清杀伤后存活率明显降低。因此，解聚酶可以提高细菌对血清杀伤的敏感性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海瑞宙生物科技有限公司

<120> 肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶及其应用

<130> P2021-1403

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 763

<212> PRT

<213> 噬菌体SH-KP156570 (Bacteriophage SH-KP156570)

<400> 1

Met Ser Thr Ile Thr Gln Phe Pro Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Arg Ile

1 5 10 15

Glu Phe Asp Tyr Leu Ala Arg Thr Phe Val Val Val Thr Leu Val Asn

20 25 30

Ser Ser Asn Pro Thr Leu Asn Arg Val Leu Glu Val Gly Arg Asp Tyr

35 40 45

Arg Phe Leu Asn Pro Thr Met Ile Glu Met Leu Val Asp Gln Ser Gly

50 55 60

Phe Asp Ile Val Arg Ile His Arg Gln Thr Gly Thr Asp Leu Val Val

65 70 75 80

Asp Phe Arg Asn Gly Ser Val Leu Thr Ala Ser Asp Leu Thr Asn Ala

85 90 95

Glu Leu Gln Ala Ile His Ile Ala Glu Glu Gly Arg Asp Gln Thr Val

100 105 110

Asp Leu Ala Lys Glu Tyr Ala Asp Ala Ala Gly Ser Ser Ala Gly Asn

115 120 125

Ala Lys Asp Ser Glu Asp Glu Ala Arg Arg Ile Ala Glu Arg Ile Lys

130 135 140

Ala Ala Gly Leu Val Gly Tyr Ile Thr Arg Arg Ser Phe Glu Lys Gly

145 150 155 160

Phe Asn Val Thr Thr Trp Asn Glu Val Leu Leu Trp Glu Glu Asp Gly

165 170 175

Ala Tyr Tyr Arg Trp Asp Gly Thr Leu Pro Lys Asn Val Pro Ala Gly

180 185 190

Ser Thr Pro Glu Thr Ser Gly Gly Ile Gly Leu Gly Ser Trp Val Ser

195 200 205

Val Gly Asp Ala Ser Leu Arg Ala Asp Leu Ile Asp Asp Asn Asp Arg

210 215 220

Leu Gly Asp Ala Leu Ile Thr Ile Lys Gln Pro Tyr Asn Gly Ser Val

225 230 235 240

Ala Arg Thr Gln His Ser Lys Asn Leu Asp Thr Ile Ser Val Lys Asp

245 250 255

Phe Gly Ala Lys Gly Asp Gly Glu Ser Asp Asp Thr Val Tyr Val Gln

260 265 270

Ala Ala Leu Asp Trp Leu Ala Gly Gly Glu Ala Arg Thr Ile Val Met

275 280 285

Pro Asp Gly Thr Tyr Asn Val Thr Asn Leu Thr Leu Ser Leu Asn Gly

290 295 300

Thr Gly Thr Lys Asn Cys Lys Ile Ile Ser His Gly Val Phe Lys His

305 310 315 320

Ile Gly Ser Gly Asn Met Leu Leu Ile Lys Gly Gly Met Tyr Cys Gln

325 330 335

Phe Glu Leu Arg Val Thr Gly Glu Gly Tyr Asp Ala Ser Thr Ile Pro

340 345 350

Asp Tyr Thr Ile Ala Asp Pro Ile Gly Ala Asn Gln Ala Phe Val Val

355 360 365

Glu Ser Cys Arg Ala Cys Lys Phe Lys Val Ile Gly His Gly Tyr Pro

370 375 380

Gly Arg Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Asn Thr Ala Asn Val Lys Leu

385 390 395 400

Ser Phe Leu Asp Leu Asp Ile Thr Thr Gly Asn Asp Thr Cys Gly Gln

405 410 415

Ala Met Tyr Leu Gln Gly Thr Asp Ala Trp Gly Cys Ile Thr Phe Ala

420 425 430

Gln Thr Asn Trp Asp Tyr Phe Gly Ser Val Ile Asp Thr Ile Leu Asp

435 440 445

Ile Ser Val Val Tyr Trp Glu Ala Gly Cys Lys Asn Arg Asn Lys Pro

450 455 460

Val Ile His Phe Lys Glu Val Thr Asn Ser His Phe Thr Thr Leu Ala

465 470 475 480

Ala Gly Gly Ala Lys Met Leu Val Glu Gly Gly Ala Gly Ile Thr Ile

485 490 495

Gln Lys Ala Leu Leu Gly Glu Ser Gln Asp Tyr Ala Leu Glu Val Ile

500 505 510

Gly Lys Gly Glu Gly Gln Pro Lys His Gln Leu Thr Ile His Ser Met

515 520 525

Leu Thr Ala Asn Thr Gly Ala Ser Gly Gly Gly Ile Arg Leu Ser Asn

530 535 540

Ala Val Gly Val Thr Ile Asn Asp Thr Leu Cys Asp Gly Ala His Asn

545 550 555 560

Ala Val Val Met Tyr Asn Leu Cys Arg Asp Val Thr Ile Lys Gly His

565 570 575

Phe Arg Asn Ser Gln Val Ala Ala Ile Tyr Ala Val Gln Gly Ser Thr

580 585 590

Leu Glu Asn Val Thr Ile Ser Gly Lys Cys Tyr Ala Ala Gly Asn Ser

595 600 605

Gly Phe Cys Asp Phe Ser Gln Ala Asp Thr Lys Asn Val Thr Leu Val

610 615 620

Asp Thr Thr Val Val Thr Lys Gly Phe Tyr Leu Arg Leu Lys Asp Asn

625 630 635 640

Asn Asn Gly Val Asn Val Arg Gly Gly Asn Trp Ser Gly Thr Glu Met

645 650 655

Thr Val Ser Ala Ile Asn Met Arg Pro Arg Ser Ile Lys Asp Val Thr

660 665 670

Gly Ile Asp Thr Arg Lys Thr Ala Ser Lys Gln Lys Phe Ala Ser Gly

675 680 685

Ser Glu Ser Gly Thr Thr Leu Val Ile Pro His Gly Leu Trp Lys Ala

690 695 700

Pro Asn Glu Val Phe Val Thr Val Leu Asp Pro Glu Asn Lys Val Thr

705 710 715 720

Gly Arg Ala Asn Thr Val Ile Val Lys Glu Val Ala Asp Thr His Ile

725 730 735

Thr Phe Lys Tyr Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Asn Asp Leu His Phe

740 745 750

Gln Phe Thr Ala Lys Ala Glu Glu Arg Ser Asn

755 760

<210> 2

<211> 2292

<212> DNA

<213> 噬菌体SH-KP156570 (Bacteriophage SH-KP156570)

<400> 2

atgtccacga ttacacaatt cccctcagga aacactcggt acaggattga gttcgactac 60

ctagccagaa cgtttgttgt tgttacactg gtgaatagct ctaaccctac cctgaaccgt 120

gtactggaag ttggtcgaga ttaccgcttc cttaatccaa cgatgattga gatgctggtt 180

gaccaatcgg gtttcgacat cgttcgtatt caccgtcaga ctggaactga cttagtggta 240

gacttcagga atggctcagt gttgacagct agtgacctga ccaatgcaga gcttcaggct 300

atccatattg cagaagaagg tcgagaccaa accgttgact tagcgaagga atatgccgat 360

gctgctggta gctctgctgg caacgctaag gatagcgagg acgaagcaag acgaatcgct 420

gagcgtatca aggcagctgg tctagttggc tacattaccc ggcgctcctt cgagaaagga 480

ttcaacgtta caacatggaa cgaggtcctg ctatgggaag aggatggtgc ttattaccgc 540

tgggatggca cgcttccaaa gaacgttccc gctggttcga ctcctgaaac gtctggcggt 600

attggtctag ggtcgtgggt tagtgttggt gatgcttcgt tgagagcaga tcttattgat 660

gataatgatc gtctaggcga tgcactgata actatcaaac aaccgtacaa cggttctgtg 720

gcaagaacac agcactctaa gaacttggat actattagcg ttaaggactt tggtgccaaa 780

ggggatggag agtcagatga tacagtgtat gtccaagctg ctttagattg gctagctggg 840

ggagaggcta gaactattgt aatgccggat ggtacttaca atgtcacaaa cctaacttta 900

tcactaaatg gcaccggaac taagaactgt aagattatct cacatggtgt attcaaacat 960

ataggtagcg gtaatatgct cttaatcaag ggcggcatgt attgtcagtt tgaacttcgt 1020

gtcacaggtg aaggatatga tgcttctact atacctgatt acaccatagc agaccctatt 1080

ggtgcaaatc aagcctttgt tgtagaatct tgccgtgcat gtaagttcaa agttataggg 1140

cacgggtacc cgggtcgtgt attccgtacc cgcaaagaaa atacagctaa tgtaaagtta 1200

tcattcttag acctagatat cactactgga aatgatacat gcggacaggc catgtacctt 1260

caaggcactg atgcttgggg ctgcatcacc tttgcccaga ctaactggga ttacttcgga 1320

agtgtaattg acacgattct agacatctca gttgtatatt gggaagctgg gtgtaaaaac 1380

cgtaacaagc cagttatcca tttcaaagaa gtgaccaact cacatttcac gaccctagct 1440

gctggtggag ctaagatgtt agttgaaggc ggagcaggta tcaccatcca gaaggcatta 1500

cttggtgaaa gtcaagatta cgcattggaa gttattggta aaggtgaagg tcagccaaaa 1560

caccaactta caattcacag catgttgact gctaatactg gtgcatctgg tggtggcatt 1620

cgtctatcta atgctgttgg tgtcactatt aacgacactt tgtgtgatgg tgcgcataat 1680

gcagtggtaa tgtataacct gtgtcgtgat gtaacaatca aaggtcattt tcgtaatagc 1740

caagttgctg ctatttacgc ggttcaaggt tctacattgg agaacgtaac aattagcggc 1800

aagtgttatg ctgctggtaa tagtgggttc tgtgacttct ctcaagctga tactaagaac 1860

gtaacattag tagacaccac tgttgtaacc aaaggcttct atttgagact aaaagacaac 1920

aataatggtg taaatgtacg tggtggtaat tggtcgggga ctgaaatgac tgtttctgct 1980

atcaatatgc gccctcgttc tattaaagat gtaacaggta tagatacgag aaagactgcc 2040

agcaaacaga agtttgcatc tggttcagag tctggaacca cactagtcat acctcacgga 2100

ctatggaagg cacctaacga ggtatttgtc acagtacttg acccagaaaa taaagtaact 2160

ggtagggcta atactgtaat agttaaggag gttgctgata ctcatattac cttcaaatat 2220

agtggtgggg cacctctttc aaacgattta cattttcaat ttacagcaaa agctgaagag 2280

agaagtaact aa 2292

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cagcagcaga cgggaggatc catgtccacg attacacaat tc 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ctcgagtgcg gccgcaagct tttagttact tctctcttca gc 42

Claims

1.一种分离的解聚酶，其特征在于，所述的解聚酶为：

(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；或

(b) 将SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽添加信号肽序列后形成的、并具有肺炎克雷伯菌荚膜多糖解聚酶活性的衍生多肽。

2.如权利要求1所述的解聚酶，其特征在于，所述的解聚酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的解聚酶。

4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种生产权利要求1所述的解聚酶的方法，其特征在于，包括步骤：

(a) 在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的遗传工程化的宿主细胞，从而表达所述的解聚酶；和

(b) 分离所述的解聚酶，从而获得经分离的所述的解聚酶。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有(i)权利要求1所述的解聚酶和(ii)药学上可接受的载体。

8.一种权利要求1所述的解聚酶的用途，其特征在于，它被用于制备抗K19型肺炎克雷伯菌感染的药物。

9.一种体外对肺炎克雷伯菌的荚膜多糖进行降解的方法，其特征在于，包括步骤：

(S1) 将所述的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖与权利要求1所述的解聚酶进行接触，从而使得所述的荚膜多糖发生降解。