CN111304181A

CN111304181A - 一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111304181A
Application number: CN202010095974.8A
Authority: CN
Inventors: 田园; 马兴元
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2020-02-17
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-02-17
Also published as: CN111304181B

Abstract

本发明提供了一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys，所述PCNP‑lys的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种抑菌剂，其主要活性成分为副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys、含有PCNP‑lys表达元件的载体，含有PCNP‑lys表达元件的表达盒或含有PCNP‑lys表达元件的宿主细胞中的至少一种。本发明还提供了一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys的制备方法。本发明的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys能够裂解多种致病弧菌，可以为耐药性副溶血性弧菌的替代疗法打下了基础。

Description

一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用。

背景技术

副溶血性弧菌是弧菌属中一种最常见的致病菌种，它是一种具有直的和单一刚性曲线的革兰氏阴性，嗜盐的产孢杆菌，具有单一的极性鞭毛，在液体培养基中生长时能运动。这种细菌是一种人类病原体，天然存在于海洋环境中，经常从多种海产品中分离出来，包括鳕鱼，沙丁鱼，小龙虾，比目鱼，鲭鱼，蛤，章鱼，虾，蟹，扇贝和牡蛎。

根据粮食及农业组织报道，水产养殖是动物粮食生产增长最快的部门之一，支持全球约50％的人类和鱼类消费。食用被副溶血弧菌污染的未加工或未煮熟的海鲜，尤其是贝类，可能导致急性胃肠炎，其特征是腹泻，头痛，呕吐，恶心，腹部绞痛和低烧。对患有基础疾病如肝病或免疫疾病的人来说，感染也有可能导致败血症，危及生命。

目前抗生素的施用是治疗副溶血性弧菌感染的主要方法，抗生素的频繁使用已导致在水产养殖，农业和医学领域中耐药性病原细菌的频率增加。而且，如果应用于海洋孵化场，抗生素会扰乱水中的天然微生物平衡，以及幼虫发育的微生物群。此外抗生素还用于过去几十年的预防弧菌病，抗生素的过量使用，用于治疗弧菌病效果已经甚微，耐药菌的存在已成为人类和动物健康以及环境中不断增长的问题。控制所应用抗生素的数量和类型存在根本性的困难，因为它们的使用规定在不同国家之间可能有很大差异。由于很少有新的化学治疗药物被许可用于渔业，因此这个问题可能特别严重，多株耐药菌株的发现，天然微生物群的干扰，环境残留和公共卫生问题，因此，用生物方法替代化学疗法是必不可少的。

噬菌体是一组广泛分布于自然界中的病毒，其生命周期与细菌严格相关。它们被称为细菌寄生虫，因为它们缺乏食物摄取，蛋白质合成或新颗粒构建所必需的细胞结构和酶系统，所以它们只能依靠细菌复制和生长。噬菌体发现之初就作为对抗细菌的物质，但随后随着抗生素的发现，在20世纪40年代被西方遗弃。然而，近些年细菌多药耐药性的持续发展促使西方科学界重新评估噬菌体治疗细菌感染，这是传统方法无法治愈的。

噬菌体裂解酶是由噬菌体产生的高度进化的酶，可消化细菌细胞壁以释放噬菌体。这种水解酶有明显的抗菌活性，使之成为一种很好的抗菌药物。噬菌体裂解酶已成功用于多种动物模型中，以控制在粘膜表面或组织上发现的耐药菌的数量。噬菌体裂解酶优于抗生素的一点是它们具有特异性，只杀死病原体，不杀灭有益菌。在细菌对抗生素越来越适应的情况下，噬菌体裂解酶可能是非常重要的抗感染药。

噬菌体裂解酶主要作用于细菌细胞壁上的肽聚糖，因此，对革兰氏阳性菌有明显的裂解效果；但是对于革兰氏阴性菌来说，细菌细胞壁的脂多糖外膜阻碍了噬菌体裂解酶发挥裂解作用。因此，有必要研发一种可以抑制革兰氏阴性菌生长的抑菌物。

发明内容

本发明通过研究发现，将噬菌体裂解酶lys基因(ADX87518.1)的N端加两个连接有连接肽的PCNP多聚阳离子肽后，能够抑制致病性副溶血性弧菌的生长，具有杀致病性副溶血性弧菌的作用。因此，本发明的第一目的在于提供一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，以抑制副溶血性弧菌的生长。本发明的第二个目的在于提供所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法。本发明的第三个目的在于所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的应用，为细菌耐药性提供一种选择。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，所述PCNP-lys具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

根据本发明，所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的编码基因具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。

作为本发明的第二个方面，一种如上述所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys在制备抑制副溶血性弧菌生长的药物或药物组合物中的应用。

作为本发明的第三个方面，一种抑菌组合物，所述抑菌组合物含有上述所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys。

作为本发明的第四个方面，一种抑菌剂，其主要活性成分为副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，含有PCNP-lys表达元件的表达盒或含有PCNP-lys表达元件的宿主细胞中的至少一种，所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者，所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的编码基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

作为本发明的第五个方面，一种鱼饲料添加剂，包括副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者，所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的编码基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

作为本发明的第六个方面，一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、以副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys的DNA为模板，设计引物进行PCR扩增，将两个接有连接肽1的多聚阳离子肽PCNP基因连接到副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys基因的N端，并克隆至表达载体上；其中，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys的核苷酸序列如SEQ IDNO：20所示；连接肽1的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；PCNP的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；

步骤二、将验证为阳性的重组表达载体依次经液体培养基培养，诱导表达，收集菌液，提取，纯化。

根据本发明，所述的载体为pET-28a。

根据本发明，所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys表达的条件为20℃诱导，IPTG浓度为0.75mg/ml，诱导时间12h。

根据本发明，所述的纯化采用Ni柱纯化。

根据本发明，步骤一的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物。

根据本发明，步骤一的如SEQ ID NO.3的引物的5’端设计有BamH I内切酶的识别位点；步骤一的如的SEQ ID NO.7所示的引物的5’端设计有XhoI内切酶的识别位点。

根据本发明，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法的步骤一的具体步骤为：

A、第一次PCR扩增：以副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys的DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的引物进行PCR扩增，获得连接有一个连接肽1和PCNP后半段的目的片段；

B、第二次PCR扩增：以第一PCR扩增的产物为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：3所示的引物进行PCR扩增，获得连接有一个连接肽1和完整的PCNP的目的片段；

C、第三次PCR扩增：以第二PCR扩增的产物为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示的引物进行PCR扩增，获得连接有两个连接肽和完整的PCNP的目的片段；

D、以第三PCR扩增的产物为模板，依次重复第一次PCR扩增和第二次PCR扩增，获得连接两个连接肽1和两个PCNP的目的片段；

其中，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；连接肽1的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；PCNP的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。

根据本发明，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法的步骤一的PCR反应体系和反应条件如下：

反应体系为50μL：高保真酶混合物25μL；引物各10μM，1μL；DNA模板10μM，1μL；ddH₂O 22μL；

PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃60s；共30个循环；72℃ 10min。

本发明的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，其有益效果：副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys通过PCR扩增连接了具有两个具有连接肽1和PCNP的片段，一方面有助于提高噬菌体裂解酶PCNP-lys的稳定性，另一方面能够抑制致病性副溶血性弧菌的生长，具有杀致病性副溶血性弧菌的作用；为耐药致病性副溶血性弧菌病的替代疗法打下了基础。

附图说明

图1为重组质粒构建示意图。

图2为PCR扩增出来的PCNP-lys基因，泳道M为2000Marker；泳道1为连接肽1连接的PCNP-lys目的片段，大小约为500bp左右。泳道2为连接肽2连接PCNP-lys目的片段，大小约为500bp左右。泳道3为无连接肽连接的PCNP-lys目的片段，大小约为480bp左右。

图3为两种连接肽的连接方式图。

图4为PCNP-lys蛋白电泳图。左图泳道M：低分子量蛋白maker；泳道1：连接肽2纯化后的蛋白，泳道2：连接肽1纯化后蛋白；泳道3：无连接肽纯化后的蛋白。

图5为生长曲线法检测PCNP-lys噬菌体裂解酶的抑菌活性结果。

图6为计数法检测PCNP-lys噬菌体裂解酶的抑菌活性结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

1、本发明涉及的生物材料的来源

(1)pET-28a(+)购买于Novagen公司，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys(ADX87518.1)基因由上海睿勉公司合成，副溶血性弧菌(NBRC 12711)可购自于华东理工大学实验室。rTaq DNA聚合酶和高保真酶混合物均购买于TaKaRa公司。

(2)YD培养基(专门用于培养副溶血性弧菌的)：胰蛋白胨20g，酵母膏2g，NaCl37.5g。

(3)透析液：将20mM PB，1M NaCl，10％甘油溶解于1L超纯水或去离子水中，调PH6.5，室温保存。

(4)Bradford测蛋白浓度试剂盒购买于生工生物工程有限公司。

2、本发明涉及的化学名称解释如下：

(1)IPTG：异丙基硫代半乳糖苷

(2)Kan：卡那霉素

3、实施例1-3的扩增引物、反应体系和反应条件分别如表1、表2和表3所示。

表1 副溶血性弧菌噬菌体的扩增引物

备注：引物1-5中PCNP与lys之间的连接肽1为GRGR，引物6-8为无连接肽连接，引物9-12中PCNP与lys之间连接肽2为AAAK，具体方式见图3。

表2 PCR反应体系

表3 PCR扩增的反应条件

4、本发明的PCNP的核苷酸序列为：

CGT CGT AAA CTG CGT GAC CGT AGG CTG SEQ ID NO：15

5、本发明的连接肽的核苷酸序列和氨基酸序列分别如下：

Linker1：GGT AGG GGT AGG SEQ ID NO：16

Linker2：GCTGCTGCTCAA SEQ ID NO：17

连接肽1：GRGR SEQ ID NO：18

连接肽2：AAAK SEQ ID NO：19

6、本发明的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶lys的核苷酸序列和氨基酸序列如下：

Lys的核苷酸序列：

ATGGCTGCTTTCAAAAAACGTACCCAGACCAAAGCTATCCTGGTTCACTGCACCGCTACCAAACCGCACCAGGACATCGGTGTTCGTGAAGTTCGTCAGTGGCACACCCGTGACAACGGTTGGTTCGACGTTGGTTACCACTTCATCATCCGTCGTAACGGTGTTATCGAAAACGGTCGTCCGGTTGACGTTGTTGGTGCTCACGCTTCTGGTTTCAACTCTGACTCTGTTGGTGTTTGCCTGGTTGGTGGTATCAACGAAGAAGGTAAAGCTGACGCTAACTTCACCCTGGAACAGTACGTTTCTCTGAAAACCCTGCTGGACACCCTGAAAGCTAGTTACCCGGAATCTGAAATCAAAGGTCACCGTGACGTTAACAACGGTAAAGAATGCCCGTCTTTCGACATCCAC GGT CTG CTG GCT AACGTTAAA SEQ ID NO：20

Lys的氨基酸序列：

MAAFKKRTQTKAILVHCTATKPHQDIGVREVRQWHTRDNGWFDVGYHFIIRRNGVIENGRPVDVVGAHASGFNSDSVGVCLVGGINEEGKADANFTLEQYVSLKTLLDTLKASYPESEIKGHRDVNNGKECPSFDIHGLLANVK SEQ ID NO：21

实施例1连接肽1连接PCNP-lys目的片段的扩增

步骤一、以弧菌噬菌体裂解酶lys基因(其NCBI蛋白质数据库中的编号为ADX87518.1，核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示)为模板，用引物4和引物5进行第一次PCR，得到连接了一个连接肽1和PCNP后半段的目的片段，回收PCR产物作为下次扩增的模板；再用引物5和引物3进行第二次PCR，得到了连接了一个连接肽1和一个完整PCNP的目的片段(此次PCR的目的主要是连接PCNP前半段)，回收PCR产物作为下次扩增的模板；再用引物2和引物5进行第三次PCR，得到了一个连接完整PCNP和两个新的连接肽1的目的片段(此次PCR的目的为第二次连接连接肽1)，回收PCR产物为下次扩增的模板；

步骤二、依次重复一次步骤一中的前两次PCR，得到了连接两个连接肽和两个PCNP的目的片段(本次PCR的目的是再连接一个PCNP目的片段)；

步骤三、最后用引物1和引物5进行最后一次PCR，(此目的为将BamHI的酶切位点引入目的片段)。这样将两个多聚阳离子肽PCNP添加到噬菌体裂解酶lys的N端。

实施例2连接肽2连接PCNP-lys目的片段扩增

步骤一、以弧菌噬菌体裂解酶lys基因(其NCBI蛋白质数据库中的编号为ADX87518.1，核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示)为模板，用引物12和引物5进行第一次PCR，得到连接了一个连接肽2和PCNP后半段的目的片段，回收PCR产物作为下次扩增的模板；再用引物5和引物11进行第二次PCR，得到了连接了一个连接肽2和一个完整PCNP的目的片段(此次PCR主要目的是连接PCNP前半段)回收PCR产物作为下次扩增的模板；再用引物10和引物5进行第三次PCR，得到了一个连接完整PCNP和两个新的连接肽1的目的片段(此次PCR的目的为第二次连接连接肽2)，回收PCR产物为下次扩增的模板；

步骤二、依次重复一次步骤一中的前两次PCR，得到了连接两个连接肽和两个PCNP的目的片段(本次PCR的目的为再连接一个PCNP目的片段)；

步骤三、最后用引物9和引物5进行最后一次PCR，(此次PCR扩增的目的为将BamHI的酶切位点引入目的片段)。这样将两个多聚阳离子肽PCNP添加到噬菌体裂解酶lys的N端。

实施例3无连接肽连接的PCNP-lys目的片段的扩增

步骤一、以弧菌噬菌体裂解酶lys基因(其NCBI蛋白质数据库中的编号为ADX87518.1，核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示)为模板，用引物8和引物5进行第一次PCR，得到连接了PCNP后半段的目的片段，回收PCR产物作为下次扩增的模板；再用引物5和引物7进行第二次PCR，得到了连接一个完整PCNP的目的片段(此次PCR主要连接PCNP前半段)；回收PCR产物作为下次扩增的模板.

步骤二、依次重复一次步骤一的步骤，得到了连接两个PCNP的目的片段(连接新的一个PCNP目的片段)；

步骤三、最后用引物6和引物5进行最后一次PCR，(此目的为将BamHI的酶切位点引入目的片段)。这样将两个多聚阳离子肽PCNP添加到噬菌体裂解酶lys的N端。

实施例4

(1)目的片段表达载体双酶切

按凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒中的操作步骤，回收实施例1-3的目的片段，并提取到了质粒，随后对目的片段和质粒进行双酶切，体系见表4。

表4 双酶切体系

(2)连接

将(1)中双酶切后的产物通过回收试剂盒回收DNA后，用T₄DNA连接酶在16℃放置12h连接，具体体系见表4。

表5 酶切产物连接体系

(3)转化

16℃取出(2)中的连接产物，将连接产物全部加入感受态中，将样品放在冰上30min中，将样品42℃放90s，冰浴10min后，加入1ml YD培养基，振荡培养1h，6000rpm离心30s，在含有kan抗生素的固体培养基上涂板。

(4)挑选阳性克隆

在超净工作台上将含有kan抗生素的固体培养基上挑取单菌落，接种于5ml试管中，过夜培养，获得菌液，随后进行菌液PCR。PCR反应体系和反应条件分别如表5和表6所示。

表6 菌液PCR反应体系

表7 菌液PCR反应条件

(5)序列比对

将阳性克隆送去派森诺公司测序，测序结果与PCNP-lys序列进行比对。确认重组载体pET28(a)-PCNP-lys的构建成功。重组质粒的构建示意图如图1所示。

实施例5噬菌体裂解酶PCNP-lys的表达与纯化

1)取实施例4构建好的带有PCNP-lys的菌，挑取单个克隆于含有5mlLB培养基的试管(5ulKan)中，37℃振荡培养10h。

2)取过夜培养的菌液1mL于100mL含有100μL50 mg/mL Kan(终浓度为50μg/mL)的LB培养基摇瓶中，37℃，200rpm培养2.5h左右(取1mL用于SDS-PAGE)至OD600＝0.6左右，加IPTG(75μL)(终浓度为0.75mM)。之后20℃，200rpm培养12h。

3)12h后，收集菌液(1mL用于SDS-PAGE凝胶电泳鉴定产物表达情况)，结果如图4所示。证明目的蛋白表达。

4)当蛋白表达后，用Ni柱纯化蛋白。

其中，连接肽1连接的噬菌体裂解酶PCNP-lys的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MRRKLRDRRLGRGRRRKLRDRRLGRGRAAFKKRTQTKAILVHCTATKPHQDIGVREVRQWHTRDNGWFDVGYHFIIRRNGVIENGRPVDVVGAHASGFNSDSVGVCLVGGINEEGKADANFTLEQYVSLKTLLDTLKASYPESEIKGHRDVNNGKECPSFDIHGLLANVK SEQ ID NO.1

连接肽1连接的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

ATGCGTCGTAAACTGCGTGACCGTAGGCTGGGTAGGGGTAGGCGTCGTAAACTGCGTGACCGTAGGCTGGGTAGGGGTAGGGCTGCTTTCAAAAAACGTACCCAGACCAAAGCTATCCTGGTTCACTGCACCGCTACCAAACCGCACCAGGACATCGGTGTTCGTGAAGTTCGTCAGTGGCACACCCGTGACAACGGTTGGTTCGACGTTGGTTACCACTTCATCATCCGTCGTAACGGTGTTATCGAAAACGGTCGTCCGGTTGACGTTGTTGGTGCTCACGCTTCTGGTTTCAACTCTGACTCTGTTGGTGTTTGCCTGGTTGGTGGTATCAACGAAGAAGGTAAAGCTGACGCTAACTTCACCCTGGAACAGTACGTTTCTCTGAAAACCCTGCTGGACACCCTGAAAGCTAGTTACCCGGAATCTGAAATCAAAGGTCACCGTGACGTTAACAACGGTAAAGAATGCCCGTCTTTCGACATCCACGGTCTGCTGGCTAACGTTAAA SEQ ID NO.2

实施例6噬菌体裂解酶PCNP-lys的透析与浓缩

将纯化好的蛋白溶液加入透析袋中，蛋白量与透析液的比例为1:10，用夹子夹好后。置于透析液中，置于4℃冰箱中，在400rpm磁力搅拌器12h。将透析好的蛋白于12000rpm，4℃条件下离心20min，去掉沉淀，上清液加入到预先用超纯水清洗的超滤管中并在4℃，5000rpm条件下超滤浓缩。噬菌体裂解酶PCNP-lys用3,000KD的超滤管超滤。

用Bradford测蛋白浓度，具体操作为：按照Bradford测蛋白浓度试剂盒制作标准曲线，随后取10ul纯化后蛋白，190ulBradford溶液于96孔板，酶标检测仪检测OD595值，计算蛋白浓度。接着，用bradford法检测透析和超滤后的蛋白的蛋白浓度，结果如表8所示。

表8 同样条件下不同连接肽下的噬菌体裂解酶PCNP-lys的蛋白浓度

从表8可以看出：带有连接肽1的PCNP-lys透析后的蛋白浓度最高。

结论：连接肽1的接入，有助于提高噬菌体裂解酶PCNP-lys的稳定性。

因此，采用带有连接肽1的PCNP-lys进行后续实验。

实施例5噬菌体裂解酶PCNP-lys的裂解活性

测定纯化出来的蛋白浓度，由于副溶血性弧菌为革兰氏阴性菌，有外膜，为评价PCNP-lys是否对其有裂解效果时，通常与EDTA联用。

1、测生长曲线法

(1)挑取副溶血性弧菌NBRC 12711的单克隆，放入5ml YD培养基中，培养至OD600值大约为0.6左右；

(2)取上述含有副溶血性弧菌的菌液100ul于新的5ml YD液体培养基1中，取18支EP管，全部加入960ul新的YD液体培养基，取其中6支加入30ul超滤后的PCNP-Lys，10ulEDTA，再取6支加入30ul空白YD培养基，10ul EDTA；取6支加入与PCNP-lys同样浓度的30ulLys，10ulEDTA，在30℃保温箱中分别放置2h，4h，8h，10h，12h后，测量它们的OD600值。结果如图5所示。

图5结果显示：与PBS空白对照相比，当噬菌体裂解酶lys与副溶血性弧菌作用时，OD600值下降了0.792；但引入多聚阳离子肽PCNP后，在相同浓度下噬菌体裂解酶PCNP-lys比噬菌体裂解酶lys的OD600值还要下降了0.344，可见多聚阳离子肽PCNP能显著提高lys裂解酶的活性。

结论：噬菌体裂解酶PCNP-lys能够制致病性副溶血性弧菌的生长。

2、计数法

取多支EP管，分别加入500ul PBS，400ul含有副溶血性弧菌的OD600值大约为0.6左右菌液，100ul EDTA设置空白对照，再取多支EP管按同等剂量加入，把PBS换成纯化后的同样浓度PCNP-lys蛋白或lys蛋白，培养一段时间后，取各个EP管中上清液，稀释一定倍数后在YD固体培养基上涂板，30℃放置12h后，计算菌落数，每个平板取3个平行。结果如图6所示。

图6结果显示：副溶血性弧菌与原lys噬菌体裂解酶相比，PCNP-lys在4h内明显降低2个数量级。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用

<141> 2020-02-17

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 170

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)

<400> 1

Met Arg Arg Lys Leu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Arg Gly Arg Arg Arg

1 5 10 15

Lys Leu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Arg Gly Arg Ala Ala Phe Lys Lys

20 25 30

Arg Thr Gln Thr Lys Ala Ile Leu Val His Cys Thr Ala Thr Lys Pro

35 40 45

His Gln Asp Ile Gly Val Arg Glu Val Arg Gln Trp His Thr Arg Asp

50 55 60

Asn Gly Trp Phe Asp Val Gly Tyr His Phe Ile Ile Arg Arg Asn Gly

65 70 75 80

Val Ile Glu Asn Gly Arg Pro Val Asp Val Val Gly Ala His Ala Ser

85 90 95

Gly Phe Asn Ser Asp Ser Val Gly Val Cys Leu Val Gly Gly Ile Asn

100 105 110

Glu Glu Gly Lys Ala Asp Ala Asn Phe Thr Leu Glu Gln Tyr Val Ser

115 120 125

Leu Lys Thr Leu Leu Asp Thr Leu Lys Ala Ser Tyr Pro Glu Ser Glu

130 135 140

Ile Lys Gly His Arg Asp Val Asn Asn Gly Lys Glu Cys Pro Ser Phe

145 150 155 160

Asp Ile His Gly Leu Leu Ala Asn Val Lys

165 170

<210> 2

<211> 510

<212> DNA

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)

<400> 2

atgcgtcgta aactgcgtga ccgtaggctg ggtaggggta ggcgtcgtaa actgcgtgac 60

cgtaggctgg gtaggggtag ggctgctttc aaaaaacgta cccagaccaa agctatcctg 120

gttcactgca ccgctaccaa accgcaccag gacatcggtg ttcgtgaagt tcgtcagtgg 180

cacacccgtg acaacggttg gttcgacgtt ggttaccact tcatcatccg tcgtaacggt 240

gttatcgaaa acggtcgtcc ggttgacgtt gttggtgctc acgcttctgg tttcaactct 300

gactctgttg gtgtttgcct ggttggtggt atcaacgaag aaggtaaagc tgacgctaac 360

ttcaccctgg aacagtacgt ttctctgaaa accctgctgg acaccctgaa agctagttac 420

ccggaatctg aaatcaaagg tcaccgtgac gttaacaacg gtaaagaatg cccgtctttc 480

gacatccacg gtctgctggc taacgttaaa 510

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccat gcgtcgtaaa ctgcgtgac 29

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaccgtaggc tgggtagggg tagg 24

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaggggta ggcgtcgtaa actgcgtgac cgt 33

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaccgtaggc tgggtagggg tagggctgct ttcaaa 36

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgctcgagt ttaacgttag ccag 24

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggatccat gcgtcgtaaa ctgcgtgac 29

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaccgtaggc tgcgtcgtaa actgcgt 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaccgtgacc gtaggctggc tttcaaa 27

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggatccat gcgtcgtaaa ctgcgtgac 29

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaccgtaggc tggctgctgc tcaa 24

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctgctgctc aacgtcgtaa actgcgtgac cgt 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaccgtaggc tggctgctgc tcaagctttc aaa 33

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtcgtaaac tgcgtgaccg taggctg 27

<210> 16

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtaggggta gg 12

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctgctgctc aa 12

<210> 18

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gly Arg Gly Arg

1

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Ala Ala Ala Lys

1

<210> 20

<211> 432

<212> DNA

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)

<400> 20

atggctgctt tcaaaaaacg tacccagacc aaagctatcc tggttcactg caccgctacc 60

aaaccgcacc aggacatcgg tgttcgtgaa gttcgtcagt ggcacacccg tgacaacggt 120

tggttcgacg ttggttacca cttcatcatc cgtcgtaacg gtgttatcga aaacggtcgt 180

ccggttgacg ttgttggtgc tcacgcttct ggtttcaact ctgactctgt tggtgtttgc 240

ctggttggtg gtatcaacga agaaggtaaa gctgacgcta acttcaccct ggaacagtac 300

gtttctctga aaaccctgct ggacaccctg aaagctagtt acccggaatc tgaaatcaaa 360

ggtcaccgtg acgttaacaa cggtaaagaa tgcccgtctt tcgacatcca cggtctgctg 420

gctaacgtta aa 432

<210> 21

<211> 144

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)

<400> 21

Met Ala Ala Phe Lys Lys Arg Thr Gln Thr Lys Ala Ile Leu Val His

1 5 10 15

Cys Thr Ala Thr Lys Pro His Gln Asp Ile Gly Val Arg Glu Val Arg

20 25 30

Gln Trp His Thr Arg Asp Asn Gly Trp Phe Asp Val Gly Tyr His Phe

35 40 45

Ile Ile Arg Arg Asn Gly Val Ile Glu Asn Gly Arg Pro Val Asp Val

50 55 60

Val Gly Ala His Ala Ser Gly Phe Asn Ser Asp Ser Val Gly Val Cys

65 70 75 80

Leu Val Gly Gly Ile Asn Glu Glu Gly Lys Ala Asp Ala Asn Phe Thr

85 90 95

Leu Glu Gln Tyr Val Ser Leu Lys Thr Leu Leu Asp Thr Leu Lys Ala

100 105 110

Ser Tyr Pro Glu Ser Glu Ile Lys Gly His Arg Asp Val Asn Asn Gly

115 120 125

Lys Glu Cys Pro Ser Phe Asp Ile His Gly Leu Leu Ala Asn Val Lys

130 135 140

Claims

1.一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，其特征在于，所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，其特征在于，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的编码基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.一种如权利要求1或2所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys在制备抑制副溶血性弧菌生长的药物或药物组合物中的应用。

4.一种抑菌组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys。

5.一种抑菌剂，其特征在于，其主要活性成分为副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，含有PCNP-lys表达元件的表达盒或者含有PCNP-lys表达元件的宿主细胞中的至少一种，所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者，副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的编码基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

6.一种鱼饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys。

7.一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤二、将验证为阳性的重组表达载体依次经培养基培养，诱导表达，收集菌液，提取，纯化。

8.如权利要求7所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法，其特征在于，所述的载体为pET-28a。

9.如权利要求7所述的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法，其特征在于，步骤一的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物。