CN112080475B - 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用 - Google Patents

一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用，所述副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2020242，保藏日期为2020年06月28日。相比传统平板计数和qPCR定量检测技术，本发明利用噬菌体VppYZU84检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的方法具有选择性，对死亡细胞和其他菌株无交叉反应，本发明方法操作简便快速，适合于食品或环境样本中副溶血性弧菌大流行株存活细胞的快速定量检测。

Description

一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株 活细胞含量中的应用
技术领域
本发明涉及一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用，属于细胞检测技术领域。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的人兽共患病原菌，广泛分布于海水、海底沉积物、海产品及腌制食品中。副溶血性弧菌是世界范围内海产食品传播的细菌性胃肠炎的重要病原体，生长速度快，在温度为30～37℃条件下每隔12min传代一次，在夏秋季极易引起食物中毒爆发。副溶血性弧菌根据致病因子和传播能力可分为非致病性菌株、致病性菌株以及大流行株，目前认为拥有毒力基因tdh或trh者被认为是致病株，没有这两个基因者则认为非致病株，而大流行株往往还拥有toxRS/new，orf8等独特的核酸标志。尽管大流行株在环境中仅占副溶血性弧菌群体极小部分，但是致病性和传播能力强，建立副溶血性弧菌大流行株的快速检测技术对该菌溯源以及控制食物中毒具有极为重要的意义。
目前对副溶血性弧菌的检测主要依据国标方法(GB4789.7)，该方法虽然成熟，但是操作繁琐、耗时耗力。而对副溶血性弧菌大流行的鉴定，则需要进一步根据血清分型或者PCR技术进行判断。部分临床分离株中常有K抗原生长不良现象，导致无法凝集分型问题。以副溶血性弧菌特异性核酸标志物为靶标建立的基于聚合酶链式反应(PCR)的检测方法，检测具有高特异性、灵敏快速等优点，为副溶血性弧菌大流行株的快速辨别和检测提供了有效方法。然而，现有的PCR方法是以副溶血性弧菌特异性核酸标志物作为靶标进行扩增检测，只能测定副溶血性弧菌总体细胞(包含死亡细胞和存活细胞)情况，无法辨别细胞的死亡/存活状态。目前对于经过消毒减菌处理的食品以及环境样本，往往需要通过测定致病菌存活细胞的数量来快速评价处理手段的有效性和可靠性，现有PCR和qPCR检测方法则无法提供有效结果。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2020242，保藏日期为2020年06月28日。
所述噬菌体VppYZU84，其基因组中含有如SEQ ID NO.1所示的特征DNA序列。
5’-GCGCCTCGGATGAATTTGTGGAAGCACTAGCTGAACGCTTTGACCGTCCGAAGTCTCGCATCACAACAGGTGTTTACACTGACTCGGCAACGTTCATTGACACAATCCCTGAGTGCACCAACATCGGTGTGGGTTACTACAATGAGCACACTGACCGTGAGACGCTGAACTTGAATGAGTTCTACGATACGCTTGAGCACTGCTTGAAGCCTGAGACTTGGGCTGAGCTGCCAGTGGGTGAACGTCCAGAACCTGCACCTGTGC-3’(SEQ ID NO.1)
本发明还提供了所述副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用。
一种副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，包括以下步骤：
1)制备副溶血性弧菌大流行株特异性裂解培养液(A试剂)，其具体成分包括胰蛋白胨、酵母浸出粉、NaCl、CaCl2、MgSO4和噬菌体VppYZU84；
2)制备空白对照以及101、102、103、104、105、106CFU/mL副溶血性弧菌大流行株标准菌株梯度悬液(B试剂)；将待测样品进行匀浆、稀释处理，获得待测样品稀释液；将不同浓度的B试剂分别与待测样品稀释液和步骤1)制备的A试剂混合，混匀，同时进行培养；
3)应用一对特异性引物对步骤2)获得的共培养物进行qPCR扩增，测定Ct值，按照公式△Ct＝Ctx-Ct0，计算△Ct值，其中，Ctx代表含有不同浓度菌株的共培养的Ct值，Ct0代表空白对照不含有菌株的共培养的Ct值；
4)根据△Ct值和B试剂标准菌株浓度的线性关系，计算样品中副溶血性弧菌大流行株存活细胞含量。
作为本发明的一种实施方案：
步骤1)中，所述特异性裂解培养液中的各成分的浓度如下：胰蛋白胨1.0g/100mL，酵母浸出粉0.50g/100mL，NaCl 3.50g/100mL，CaCl2 0.11g/100mL，MgSO4 0.24g/100mL，噬菌体VppYZU84 105PFU/100mL；pH值为7.5。
步骤2)中，所述培养的条件为：37℃共培养3h，每隔30min取出涡旋混匀1min。
步骤3)中，所述一对特异性引物是以噬菌体VppYZU84基因组特征DNA序列为靶标的一对引物。
步骤3)中，所述一对特异性引物对如下所示：
VppYZU84-orf7-Fa：5'-GCGCCTCGGATGAATTTGTGG-3'(SEQ ID NO.2)
VppYZU84-orf7-Rb：5'-GCACAGGTGCAGGTTCTGGAC-3'(SEQ ID NO.3)。
本发明的一种实施方案，具体步骤如下：
(1)制备副溶血性弧菌大流行株特异性裂解培养液(A试剂)。将噬菌体VppYZU84与宿主菌按照感染复数MOI＝1比例混合，静置10min后加入10mL液体培养基中，37℃、150r/min培养8h。培养液经6000r/min离心10min取上清，通过0.45μm孔径滤膜，滤过液4℃保存。应用双层平板法测定滤过液中噬菌体滴度，并用SM缓冲液将滴度调节至107PFU/mL。配制含有胰蛋白胨1.0g/100mL，酵母浸出粉0.50g/100mL，NaCl 3.50g/100mL，CaCl2 0.11g/100mL，MgSO4 0.24g/100mL，噬菌体VppYZU84 105PFU/100mL；pH值为7.5，通过0.45μm滤膜过滤，即得副溶血性弧菌大流行株特异性裂解培养液(A试剂)。
(2)噬菌体VppYZU84特异性核酸标志物的筛选及引物设计。按常规方法提取噬菌体VppYZU84基因组DNA，通过Illumina Hiseq测序平台获得全基因组序列，通过比对筛选特异性核酸序列。依据VppYZU84基因组中特异性核酸序列orf7基因，利用BLAST工具盒BioEdit软件分析所设计的引物，并商业化生物工程有限公司合成。获得的引物序列为：VppYZU84-orf7-Fa：5'-GCGCCTCGGATGAATTTGTGG-3'和VppYZU84-orf7-Rb：5'-GCACAGGTGCAGGTTCTGGAC-3'。
(3)噬菌体VppYZU84特异性引物验证。选择不同的副溶血性弧菌及其它噬菌体的基因组DNA为模板，建立PCR反应体系验证引物的特异性。具体为：PCR反应体系(25μL)为：DNA模板，1μL；10μM引物VppYZU84-orf7-Fa，0.5μL；10μM引物VppYZU84-orf7-Rb，0.5μL；2×Taq Master Mix，12.5μL；ddH2O，10.5μL。PCR循环参数设计与优化：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃再延伸10min，反应结束。120V，90mA电泳30min，用凝胶成像仪观察反应结果。
(4)标准菌株梯度悬液(B试剂)和待测样品稀释液与A试剂混合并共培养。具体为：制备空白对照(生理盐水)以及101、102、103、104、105、106CFU/mL副溶血性弧菌大流行株标准菌株梯度悬液(B试剂)；按常规方法将待测样品进行匀浆、稀释处理，获得待测样品稀释液；取100μL B试剂、待测样品稀释液分别与900μL步骤1)制备的A试剂混合，涡旋混匀，同时置于37℃共培养3h，每隔30min取出涡旋(200rmp)混匀1min。
(5)通过qPCR测定步骤(4)获得的共培养物的△Ct值。应用步骤(2)设计的特异性引物VppYZU84-orf7-Fa和VppYZU84-orf7-Rb对步骤(4)获得的共培养物进行qPCR扩增，测定Ct值。计算B试剂和待测样品稀释液与A试剂共培养物Ct值(Ctx)与空白对照(生理盐水)与A试剂共培养物Ct值(Ct0)的差值(△Ct＝Ctx-Ct0)。
(6)待测样品中副溶血性弧菌大流行株活细胞的定量。具体为：将步骤(5)中测定的△Ct值和B试剂中菌株浓度做线性分析，计算待测样品中副溶血性弧菌大流行株活细胞含量。
本发明方法利用特异性裂解噬菌体及其特异性核酸标志物、特异性检测引物、以及噬菌体扩增联合qPCR检测，实现了副溶血性大流行株存活细胞特异性定量检测，在此基础上对试剂和步骤进行了组装和优化，操作简单快速。检测过程无需细菌培养鉴定，操作简单，检测周期4.5小时，检测精确性优于目前使用的传统方法，并且适用于消毒减菌处理对复杂体系中副溶血性弧菌大流行株的有效性评价。
本发明采用的噬菌体VppYZU84是一种专性细胞内寄生生物，具有宿主专一性，能够识别特定范围的宿主菌，常被用于细菌的鉴别和分型。噬菌体随着宿主生长而复制，具有区分活菌和死菌的能力。本发明在副溶血性大流行菌群特异性噬菌体分离鉴定的基础上，公开了特异性裂解噬菌体的核酸标志物、特异性检测引物、以及噬菌体扩增联合qPCR检测步骤，实现副溶血性大流行株存活细胞的定量检测，在此基础上对试剂和步骤进行了组装和优化，操作简单快速，为检测食品及环境样本中副溶血性大流行株以及评价消毒减菌处理的有效性提供新的方法，具有广阔的市场需求。
技术效果：相对于现有技术，本发明方法具有以下优势：
(1)本发明A试剂能特异性裂解副溶血性弧菌大流行株活细胞并产生增殖，引物VppYZU84-orf7-Fa和VppYZU84-orf7-Rb能特异性扩增噬菌体基因组上ORF7片段，因此检测方法具有特异性辨别副溶血性弧菌大流行株存活细胞效果，对样品中死亡细胞和其它微生物没有交叉反应。
(2)本技术快速简单，结果稳定，整个过程无需菌株分离鉴定，检测限达到1.26×102CFU/mL,检测周期为4.5小时；该方法能够高通量检测菌群复杂的食品和环境样品中副溶血性弧菌大流行株存活细胞及其失活状态，为食品工业中评价消毒减菌手段的有效性提供新的方法。
附图说明
图1：噬菌体VppYZU84基因组序列测定结果。每圈信息(从外到里)：(1)ORFs编码蛋白的方向；(2)GC含量，图中GC值高于平均值为外峰，低于的为内峰；(3)GC偏移值，偏移值大于零为紫红色，小于零为绿色；(4)以kbp为单位的物理基因图。
图2：噬菌体VppYZU84检测引物特异性验证结果。图中，泳道1：DNA marker；泳道2：为模板的扩增产物；泳道3：VpYZU84；泳道4：VpYZU64；泳道5：VpYZU78；泳道6：VpYZU82；泳道7：VpYZU103；泳道8：VpYZU105；泳道9：VpYZU106；泳道10：VpYZU116；泳道11：Vm 21613；泳道12：Vf 21612；泳道13：VppYZU64；泳道14：Vmp21613；泳道15：EspYZU05。
图3：B试剂与A试剂共培养产物的qPCR扩增曲线(A)及△Ct值与菌浓度的线性关系(B)。图B中，横坐标为副溶血性弧菌大流行株活细胞浓度(Lg CFU/mL)，纵坐标为△Ct值，获得的线性方程为：Y＝2.9949×X-6.2915，R2值为0.9826。
图4：模拟污染样品中副溶血性弧菌大流行株在热处理过程中的活菌测定结果。图A为热处理样品与A试剂共培养产物的qPCR扩增曲线横；图B为平板计数方法和噬菌体联合qPCR计数方法测定的活菌数随热处理时间的变化图。图中，横坐标为热处理时间，纵坐标为活菌总数(Lg CFU/mL)，■表示细菌总数(活细菌+死细菌)，●表示TCBS平板涂布法测定70℃处理后的菌数，★为噬菌体联合qPCR计数方法测定70℃处理后的菌数；▲为TCBS平板涂布法测定80℃处理后的活菌数，▼为噬菌体联合qPCR计数方法测定80℃处理后的活菌数。
图5：噬菌体联合qPCR计数检测方法的特异性评价。图中，○表示无非致病菌株VPYZU105污染的样品，用平板稀释涂布计数测定的活菌数(平均值，n＝3)；△表示无非致病菌株VPYZU105污染的样品，用噬菌体联合qPCR计数测定活菌数(平均值，n＝3)；●表示有非致病菌株VPYZU105污染的样品，用平板稀释涂布计数测定活菌数(平均值，n＝3)；▲表示有非致病菌株VPYZU105污染的样品，用噬菌体联合qPCR计数测定活菌数(平均值，n＝3)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。
本发明试验用副溶血性弧菌大流行株(Vibrio parahaemolyticus VpYZU84)，噬菌体VppYZU84保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏号：CCTCC M 2020242，保藏日期2020.06.28)；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；其它试剂设备除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1副溶血性弧菌大流行株特异性裂解培养液(A试剂)制备
(1)噬菌体VppYZU84的制备：将噬菌体悬液梯度稀释后与宿主菌液按照最佳感染复数为MOI＝1的比例混合，静置10min后加入到10mL液体培养基中，37℃、150r/min培养8h。培养液经6000r/min，10min后取上清液过0.22μm孔径滤膜于4℃保存。
(2)噬菌体VppYZU84的效价测定：用SM缓冲溶液将噬菌体增值液梯度稀释后，取100μL噬菌体液与100μL新鲜培养宿主菌VpYZU84混合10min后，制成双层平板，37℃静置培养8h，人工计数，每组实验3个平行，取平均数代表噬菌体VppYZU84的效价。
(3)噬菌体VppYZU84基因组序列测定：噬菌体核酸提取后由上海凌恩生物基因测序有限公司进行二代Illumina Hiseq测序，结果如附图1所示。
(4)特异性裂解培养液(A试剂)制备：精确称取1g胰蛋白胨，0.50g酵母浸出粉，3.50g NaCl，0.11g CaCl2，0.24g MgSO4，用蒸馏水定容至100mL，调节pH至7.5，121℃高压灭菌15min，冷却备用；取107PFU/mL储存液用0.45μm过滤除菌，按1:1000加入培养液至终浓度为103PFU/mL。
实施例2噬菌体VppYZU84特异性核酸标志物的筛选及引物设计、验证
(1)噬菌体VppYZU84特异性检测引物设计与验证：依据VppYZU84基因组序列中的orf7基因采用NCBI网站上的BLAST工具盒BioEdit软件分析所设计的引物。VppYZU84-orf7-Fa：5'-GCGCCTCGGATGAATTTGTGG-3'和VppYZU84-orf7-Rb：5'-GCACAGGTGCAGGTTCTGGAC-3'。扩增序列为：3’-GCGCCTCGGATGAATTTGTGGAAGCACTAGCTGAACGCTTTGACCGTCCGAAGTCTCGCATCACAACAGGTGTTTACACTGACTCGGCAACGTTCATTGACACAATCCCTGAGTGCACCAACATCGGTGTGGGTTACTACAATGAGCACACTGACCGTGAGACGCTGAACTTGAATGAGTTCTACGATACGCTTGAGCACTGCTTGAAGCCTGAGACTTGGGCTGAGCTGCCAGTGGGTGAACGTCCAGAACCTGCACCTGTGC-5’
(2)引物特异性验证：选择不同的副溶血性弧菌(菌株VpYZU84；VpYZU64；VpYZU78；VpYZU82；VpYZU103；VpYZU105；VpYZU106；VpYZU116；)、其他弧菌(Vm 21613；Vf 21612；)及其他噬菌体(VppYZU64；Vmp21613；EspYZU05)的基因组DNA作为模板，检测引物VppYZU84-orf7-Fa和VppYZU84-orf7-Rb的特异性。
PCR反应体系(25μL)为：噬菌体DNA模板，1μL；10μM上游引物，0.5μL；10μM下游引物，0.5μL；2×Taq Master Mix，12.5μL；ddH2O，10.5μL。PCR循环参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃再延伸10min，反应结束。反应产物电泳条件为：120V，90mA电泳30min，在凝胶成像仪上观察结果。结果如图2所示，除目标噬菌体外，其它菌株的基因组DNA均无扩增条带，表明引物具有良好特异性。
实施例3鱼汁模拟污染样品中副溶血性弧菌大流行株活性细胞的测定
(1)鱼汁模拟污染样品的制备：采集市售新鲜海鲈鱼去头去骨，采集鱼肉，按1:2加水煮沸10min，鱼汁用无菌纱布和滤纸过滤后，取过夜培养的VpYZU84标准菌株，加入无菌鱼汁中使鱼汁终浓度为107CFU/mL。
(2)标准菌株梯度悬液(B试剂)制备：取过夜培养的VpYZU84标准菌株100μL，加入到900μL SM缓冲液中进行10倍稀释，依次作1:10递增稀释，分别制成制备101、102、103、104、105、106CFU/mL标准菌株悬液。
(3)样品灭活处理：鱼汁样品分别分装到1.5mL的无菌离心管中，每管1mL，将无菌离心管置于不同温度80℃、70℃孵育5min，每隔1min取样一次(0min、1min、2min、3min、4min、5min)。加热完成后，迅速将离心管置于冰水浴冷却2s。4℃保存。
(4)样品中存活细胞测定：采用常规稀释涂布法测定。取100μL样品用生理盐水进行10倍稀释，依次作1:10递增稀释，取合适稀释度涂布于TCBS平板上，37℃培养12h，进行人工菌落计数，每个样品测定三个平行，取平均数表示存活细胞数。
(5)噬菌体联合qPCR计数：移取100μL B试剂以及灭活处理的鱼汁模拟污染样品分别与900μL A试剂混合，涡旋混匀，置于37℃恒温共培养3h，每隔30min取出涡旋混匀1min。取500μL共培养物，10000g离心2min，收集上清于1.5mL离心管中，99℃加热10min，8000g离心10min，取上清液5μL作为模板建立qPCR反应体系。qPCR反应体系(20μL)为：模板5μL；10μM引物VppYZU84-orf7-Fa 0.5μL；10μM引物VppYZU84-orf7-Rb，0.5μL；TB Green Premix ExTaq II(Tli RNaseH Plus)(2×)，10μL；ddH2O 4μL；热循环参数为：预变性95℃30s，95℃5s，退火55℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s，65℃1min熔解60℃5s，记录B试剂及各样品扩增Ctx值，按△Ct＝Ctx-Ct0计算△Ct值，Ct0为空白对照测得的Ct值。测定的△Ct值和B试剂中菌株浓度做相关性分析，根据线性方程计算待测样品中副溶血性弧菌大流行株活细胞含量。
结果显示：测得的B试剂的扩增曲线如图3A所示，将△Ct和B试剂菌株悬液的浓度(LgCFU/mL)做线性分析，结果如图3B所示，获得的线性方程为：Y＝2.9949×X-6.2915，R2＝0.9826。测得的鱼汁模拟污染样品的扩增曲线如图4A所示，将得到的△Ct代入线性方程计算得到的副溶血性弧菌大流行株细胞的存活曲线如图4B所示，图中横坐标为鱼汁模拟污染样品灭活时间，纵坐标为副溶血性弧菌大流行株活菌总数(Lg CFU/mL)，■为起始细菌总数(活细菌+死细菌)；●为TCBS平板涂布法测定70℃失活曲线，★为应用本发明方法测定70℃失活曲线，▲为TCBS平板涂布法测定80℃失活曲线，▼为本发明方法测定80℃失活曲线。TCBS平板涂布法与本发明方法测定值基本一致，差值在0-0.35CFU/mL之间，结果表明噬菌体联合qPCR方法能够用于快速测定样品中副溶血性弧菌大流行株残活细胞。
实施例4噬菌体联合qPCR计数检测方法的特异性评价
(1)灭菌鱼汁的制备：参照Dalgaard等的方法制备灭菌鱼汁，海鲈鱼去鳞、去内脏、清洗，将鱼片剪成细条，按1:2加水煮沸10min，鱼汁用纱布和滤纸过滤后，弃去鱼渣，121℃高压15min灭菌。
(2)鱼汁模拟污染样品的制备：取100μL过夜培养的副溶血性弧菌菌株VpYZU84培养物，加入到900μL灭菌鱼汁中进行10倍稀释，充分混匀；取100μL混合物用无菌鱼汁依次作1:10递增稀释，制备模拟污染样品A、B、C、D、E、F；以无菌鱼汁作为对照样品(G)，每样做3个平行。背景菌干扰样品在1mL模拟污染样品A、B、C、D、E、F中分别加入10μL 106CFU/mL副溶血性弧菌非致病菌株VPYZU105，充分混匀备用。
(3)模拟污染鱼汁样品中副溶血性弧菌大流行株VpYZU84的检测：
1)平板稀释涂布计数测定：
取100μL样品用生理盐水进行10倍稀释，依次作1:10递增稀释，取合适稀释度涂布于TCBS平板上，37℃培养12h，进行人工菌落计数，每个样品测定三个平行，取平均值用于分析。
2)噬菌体联合qPCR计数测定：
移取100μL B试剂以及A、B、C、D、E、F、G鱼汁模拟污染样品分别与900μL A试剂混合，涡旋混匀，置于37℃恒温共培养3h，每隔30min取出涡旋混匀1min。取500μL共培养物，10000g离心2min，收集上清于1.5mL离心管中，99℃加热10min，8000g离心10min，取上清液5μL作为模板建立qPCR反应体系。qPCR反应体系(20μL)为：模板5μL；10μM引物VppYZU84-orf7-Fa 0.5μL；10μM引物VppYZU84-orf7-Rb，0.5μL；TB Green Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)，10μL；ddH2O 4μL；热循环参数为：预变性95℃30s，95℃5s，退火55℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s，65℃1min熔解60℃5s，记录B试剂及各样品扩增Ctx值，按△Ct＝Ctx-Ct0计算△Ct值，Ct0为空白对照测得的Ct值。测定的△Ct值和B试剂中菌株浓度做相关性分析，根据线性方程计算待测样品中副溶血性弧菌大流行株活细胞含量。结果平板稀释涂布计数测定获得的结果相比，评价测定方法的特异性。
结果如附图5所示，表示无非致病菌株VPYZU105污染的样品，用平板稀释涂布计数测定数据(○)和噬菌体联合qPCR计数测定数据(△)十分接近；但是，对于样品中有非致病菌株VPYZU105污染的样品，用平板稀释涂布计数测定数据(●)显著偏离真实值，而用噬菌体联合qPCR计数测定数据(▲)依然接近真实值。结果表明本发明建立的检测方法能够选择性检测模拟污染样品中的大流行株，与传统平板稀释涂布计数法相比，具有不受背景菌的干扰，特异性，检测简单快速强等优势。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 264
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌噬菌体(VppYZU84)
<400> 1
gcgcctcgga tgaatttgtg gaagcactag ctgaacgctt tgaccgtccg aagtctcgca 60
tcacaacagg tgtttacact gactcggcaa cgttcattga cacaatccct gagtgcacca 120
acatcggtgt gggttactac aatgagcaca ctgaccgtga gacgctgaac ttgaatgagt 180
tctacgatac gcttgagcac tgcttgaagc ctgagacttg ggctgagctg ccagtgggtg 240
aacgtccaga acctgcacct gtgc 264
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgcctcgga tgaatttgtg g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcacaggtgc aggttctgga c 21

Claims (7)

1.一种副溶血性弧菌噬菌体（Vibrio Parahemolyticus phage）VppYZU84，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2020242，保藏日期为2020年06月28日；所述副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84，其基因组中含有如SEQ ID NO.1所示的特征DNA序列。
2.权利要求1所述的副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84在检测食品或环境中副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84检测食品或环境中副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备副溶血性弧菌大流行株特异性裂解培养液A试剂，其具体成分包括胰蛋白胨、酵母浸出粉、NaCl、CaCl2、MgSO4和副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84；
2）制备空白对照以及101、102、103、104、105、106 CFU/mL副溶血性弧菌大流行株标准菌株梯度悬液B试剂；将待测样品进行匀浆、稀释处理，获得待测样品稀释液；将不同浓度的B试剂分别与待测样品稀释液和步骤1）制备的A试剂混合，混匀，同时进行培养；
3）应用一对特异性引物对步骤2）获得的共培养物进行qPCR扩增，测定Ct值，按照公式△Ct= Ctx- Ct0，计算△Ct 值，其中，Ctx代表含有不同浓度菌株的共培养的Ct值，Ct0代表空白对照不含有菌株的共培养的Ct值；
4）根据△Ct值和B试剂标准菌株浓度的线性关系，计算样品中副溶血性弧菌大流行株存活细胞含量。
4.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤1）中，所述特异性裂解培养液中的各成分的浓度如下：胰蛋白胨1.0 g/100 mL，酵母浸出粉0.50 g/100 mL，NaCl 3.50 g/100 mL，CaCl2 0.11 g/100 mL，MgSO4 0.24 g/100 mL，副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84 105 PFU/100mL；pH值为7.5。
5.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤2）中，所述培养的条件为：37℃共培养3 h，每隔30 min取出涡旋混匀1 min。
6.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述一对特异性引物是以副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84基因组特征DNA序列为靶标的一对引物。
7.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述一对特异性引物对如下所示：
VppYZU84-orf7-Fa：5'-GCGCCTCGGATGAATTTGTGG-3'
VppYZU84-orf7-Rb：5'-GCACAGGTGCAGGTTCTGGAC-3'。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1231701A (zh) * 1996-09-27 1999-10-13 鄂尔呀诺股份有限公司 细菌的检测方法及其检测器
CN101160410A (zh) * 2005-02-16 2008-04-09 恩尼格马诊断有限公司 使用病毒检测样本中活细胞的方法
CN105531382A (zh) * 2013-06-19 2016-04-27 六品科技公司 基于噬菌体的细菌检测法
CN107686832A (zh) * 2016-08-05 2018-02-13 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 新的副溶血性弧菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用
CN107723280A (zh) * 2017-11-10 2018-02-23 扬州大学 波罗的海希瓦氏菌噬菌体SppYZU01及其用途
CN107828743A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05及其用途
CN109239333A (zh) * 2018-10-29 2019-01-18 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体偶联的纳米磁珠及其制备方法和应用
CN109239343A (zh) * 2018-10-23 2019-01-18 扬州大学 一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法
CN110616197A (zh) * 2019-07-02 2019-12-27 上海海洋大学 副溶血性弧菌噬菌体vB_VpaP_MGD2、其用途和新型生物杀菌制剂
CN111304181A (zh) * 2020-02-17 2020-06-19 华东理工大学 一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用
CN112063732A (zh) * 2020-09-17 2020-12-11 扬州大学 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9504721B2 (en) * 2012-06-04 2016-11-29 Ctc Bio, Inc. Bacteriophage and its use for preventing proliferation of pathogenic bacteria
WO2016014575A1 (en) * 2014-07-22 2016-01-28 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Organization of polymers by inovirus bacteriophage
WO2016160823A1 (en) * 2015-04-03 2016-10-06 Becton, Dickinson And Company Methods of amplifying nucleic acids and compositions and kits for practicing the same
EP3763823A1 (en) * 2016-08-16 2021-01-13 Touchlight IP Limited Closed linear dna production
CN106771194B (zh) * 2017-01-18 2018-07-20 青岛大学 一种检测病原微生物的方法
CN107828853A (zh) * 2017-12-08 2018-03-23 厦门昶科生物工程有限公司 一种利用烈性副溶血弧菌噬菌体快速鉴定副溶血弧菌的方法及试剂盒
CN111855753B (zh) * 2020-08-05 2023-04-07 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种水体中副溶血弧菌的现场检测试剂盒和检测方法
CN112063593B (zh) * 2020-09-17 2021-08-31 扬州大学 一种致病性弧菌噬菌体VmYZU10474及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1231701A (zh) * 1996-09-27 1999-10-13 鄂尔呀诺股份有限公司 细菌的检测方法及其检测器
CN101160410A (zh) * 2005-02-16 2008-04-09 恩尼格马诊断有限公司 使用病毒检测样本中活细胞的方法
CN105531382A (zh) * 2013-06-19 2016-04-27 六品科技公司 基于噬菌体的细菌检测法
CN107686832A (zh) * 2016-08-05 2018-02-13 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 新的副溶血性弧菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用
CN107828743A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05及其用途
CN107723280A (zh) * 2017-11-10 2018-02-23 扬州大学 波罗的海希瓦氏菌噬菌体SppYZU01及其用途
CN109239343A (zh) * 2018-10-23 2019-01-18 扬州大学 一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法
CN109239333A (zh) * 2018-10-29 2019-01-18 扬州大学 一种阪崎肠杆菌噬菌体偶联的纳米磁珠及其制备方法和应用
CN110616197A (zh) * 2019-07-02 2019-12-27 上海海洋大学 副溶血性弧菌噬菌体vB_VpaP_MGD2、其用途和新型生物杀菌制剂
CN111304181A (zh) * 2020-02-17 2020-06-19 华东理工大学 一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用
CN112063732A (zh) * 2020-09-17 2020-12-11 扬州大学 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alleviating effects of Lactobacillus strains on pathogenic Vibrio parahaemolyticus-induced intestinal fluid accumulation in the mouse model;Zhen-quan Yang等;《FEMS MICROBIOLOGY LETTERS》;20121204;第339卷(第1期);第30-38页 *
副溶血性弧菌广谱裂解性噬菌体的筛选及其在海产品安全控制中的应用;郑小双等;《食品科学》;20190525;第40卷(第10期);第141-148页 *
副溶血性弧菌检测新方法研究进展;张梦静等;《现代食品》;20191030;第58-60页 *

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