CN105531382A - 基于噬菌体的细菌检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测目标细菌的方法。在一些实施方式中,所述方法包括将样本暴露于能够感染一组目标细菌并包括编码标记物的异源核酸序列的噬菌体。在一些实施方式中,所述目标细菌包括李斯特菌。在一些实施方式中,所述目标细菌全部为李斯特菌。本发明还提供了包括编码标记物的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体,还提供了该噬菌体的有用组合物,以及包括该噬菌体等的制品。
Description
关联申请
本申请要求2013年6月19日提交的美国临时申请US61/837152、2013年7月9日提交的美国临时申请US61/844399、2013年9月18日提交的美国临时申请US61/879640、2013年9月30日提交的美国临时申请US61/884931、2013年9月30日提交的美国临时申请US61/884935和2013年9月30日提交的美国临时申请US61/884946的优先权。前述申请的全部内容通过引用合并到本文中。
背景技术
细菌污染和感染对于公众健康和其他许多领域来说是很重要的一个问题。细菌食源性疾病对人类健康造成了显著威胁,预计每年在美国导致多达约七千六百万起疾病、325000起住院治疗,以及5000起死亡。
例如,在1996年,被大肠杆菌污染的果汁被果汁制造商投放给公众,导致一起死亡和66起发病。该公司付了1.5百万美元罚款,并且仅是召回就使得该公司损失6.5百万美元。在2006年,来自起源于加尼福尼亚的被污染的菠菜的大肠杆菌O157:H7爆发导致205起发病和3起死亡。在2011年,在7月、8月和9月,来自源于科罗拉多的甜瓜的李斯特菌爆发导致30起死亡。自从疾病控制和预防中心在20世纪70年代起开始记录疾病爆发时起,在死亡人数方面,这是第二最致死的有记录的美国疾病爆发。在2012年的另一次甜瓜召回表明了,食物供应仍不安全,并强调了用于测试食物供应以发现污染的其他方法和试剂的一般的和普遍的需求。
另一个例子是牛科动物乳腺炎——一种由导致牛科动物乳房发炎、牛奶产量降低并牛奶品质降低的细菌细胞引起的感染。该病症由细菌金黄色葡萄球菌和无乳葡萄球菌引起。仅在西方世界,牛奶产量和品质的降低就意味着导致每年37亿美元的经济损失。
再一个例子是牛科动物结核病(牛结核分枝杆菌),一种在全世界导致经济损失的细菌。例如,在2005年,在密歇根的一个小型农场中,55头牛的一群牛中有12头被测试出牛结核病阳性。该农场被迫毁掉整个牛群以及整个猪群。在牛群中测试结核病要求限制牛2天,并且有5%的几率测试为假阳性。通常整个牛群被隔离检疫或被摧毁。估计全世界每年经济损失为30亿美元。
结核病是全世界范围内致死的一个主要原因。世界人口的三分之一被感染结核分支杆菌,这是导致结核病的细菌。每天有25000人被感染,5000人死于该疾病。此外,主要是由于诊断不佳,正在出现结核分支杆菌的多重耐药性菌株,作为世界性传染病的结核病的再度出现成为了现实威胁。全世界每年结核病诊断的市场预计为18亿美元。
MRSA是常见的金黄色葡萄球菌细菌的耐药性版本,在美国有250万携带者。携带者可能为健康个体,但仍是高度传染性的,因为MRSA细菌的性质。该细菌是高度传染性的,通过接触传染。所有感染中的大约86%发生在医院里,这些感染有20%的死亡率。按治疗的标准花费,该细菌平均花费21000美元来治疗,每年在美国杀死大约19000人。
单核细胞增多性李斯特菌在人和动物中是能够导致侵袭性疾病的细胞内病原体。大约99%的人类李斯特菌病感染是食源性的。虽然单核细胞增多性李斯特菌已从多种生的和即食食品中被分离出来,大部分人类李斯特菌病感染似乎是由允许该病原体的污染后生长的即食食品的食用导致的。估计李斯特菌病每年在美国导致约500起死亡,占归因于已知的食源性病原体的每年死亡量的28%,仅次于沙门氏菌感染。
存在检测微生物污染的方法和系统。这些方法和系统苦于有大量缺陷,包括在大多数情况下,需要将可能被污染的样本从收集该样本的环境中移走,并转移到实验室环境中,其中样本被放置在培养环境下,以在很长一段时间内(在从好几个小时至数日的范围内)富集和生长。此外,由于这些实验室常常在异地,将样本运到实验室通常有延迟。一旦被富集,通常使用昂贵的设备、传统培养方法、PCR和其他方法来分析样本。因此,目前的方法常常在取样和结果之间包括很长的时间延迟,在这段时间内,取样的条件可能已发生变化,实验的结果并不能用于例如诊断病人的感染,或者作用于大量已制备的食品中的污染。因此,需要用于检测微生物污染的新的组合物和方法。本发明解决这些需求。
发明内容本发明描述了一种包括能够感染至少一种目标微生物的至少一种重组噬菌体的组合物。所述目标微生物可以从环境样本获得。所述重组噬菌体包括编码标记物的异源核酸序列。所述组合物还包括适用于在至少一种目标微生物中增殖所述至少一种重组噬菌体的至少一种水溶液。
所述水溶液包括至少一种营养物;适用于抑制所述环境样本中至少一种非目标微生物的生长的至少一种筛选剂;至少一种维生素;至少一种二价金属;能够维持所述组合物在pH7.0-7.5的至少一种缓冲试剂;适用于中和在所述环境样本中存在的消毒剂的至少一种试剂;以及用于防止荧光素分解的至少一种试剂。
在一些实施方式中,所述至少一种重组噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、P100::ffluc、LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc或P100::nluc。
在一些实施方式中,所述至少一种重组噬菌体以1x106至1x1011pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。在一些实施方式中,所述至少一种重组噬菌体以1x107至1x108pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。在一些实施方式中,所述至少一种重组噬菌体以1.5x107pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。在一些实施方式中,所述组合物包括3种重组噬菌体,并且每种重组噬菌体以1.5x107pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。
在一些实施方式中,所述水溶液中的所述至少一种营养物包括脑心浸液培养基。在一些实施方式中,所述水溶液中的所述至少一种筛选剂选自于由LiCl、吖啶黄、萘啶酸和环己酰亚胺构成的组中。在一些实施方式中,所述水溶液中的所述至少一种维生素包括酵母提取物。在一些实施方式中,所述水溶液中的所述至少一种二价金属包括CaCl2。在一些实施方式中,所述水溶液中的所述至少一种缓冲剂包括HEPES缓冲剂。在一些实施方式中,所述水溶液中的所述至少一种中和试剂选自由非离子型清洁剂、去氧剂和乳化剂构成的组中。在一些实施方式中,所述水溶液中的所述至少一种中和试剂或用于防止荧光素分解的至少一种试剂选自由硫代硫酸钠、聚山梨醇酯80、HEPES和卵磷脂构成的组中。
在一些实施方式中,所述水溶液包括1X脑心浸液培养基;0.5%LiCl;0.002%萘啶酸;0.2%酵母提取物;2mMCaCl2;40mMHEPES,pH7.4;1mM焦亚硫酸钠;0.1%硫代硫酸钠;0.5%聚山梨醇酯80;和0.1%卵磷脂。
在一些实施方式中,所述水溶液包括半强度脑心浸液培养基、5%重量/体积葡萄糖、1%体积/体积甘油、1%重量/体积LiCl和0.002%重量/体积萘啶酸。
在一些实施方式中,被异源核酸序列编码的所述标记物是荧光素酶。在一些实施方式中,所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70%相同。在一些实施方式中,所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70%相同。在一些实施方式中,所述荧光素酶包括选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述标记物还包括亲和标签。在一些实施方式中,所述亲和标签是HIS标签。
在一些实施方式中,所述目标微生物选自由下列各项组成的组中:沙门氏菌属、大肠型细菌、埃希氏杆菌属、志贺氏菌属、李斯特菌属、梭菌属、弧菌属、肠杆菌科(Enterobacteriacae)、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、弯曲菌属、假单胞菌属、链球菌属、不动杆菌属、克雷白氏杆菌属、弯曲菌属和耶尔森菌属。在一些实施方式中,所述目标微生物是大肠杆菌。在一些实施方式中,所述目标微生物是选自于下列各项组成的组中的李斯特菌:无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)、威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)、付氏李斯特菌(Listeriafloridensis)、水生李斯特菌(Listeriaaquatic)、科氏李斯特菌(Listeriacornellensis)、沙燕属李斯特菌(Listeriariparia)和格兰德斯李斯特菌(Listeriagrandensis)。
在一些实施方式中,本发明还包括一种试剂盒,所述试剂盒包括能够感染至少一种目标微生物的至少一种重组噬菌体。所述目标微生物可以从环境样本中获得。所述重组噬菌体包括编码标记物的异源核酸序列。所述组合物还包括适用于在至少一种目标微生物中增殖至少一种重组噬菌体的至少一种水溶液。所述试剂盒还包括一种水溶液,所述水溶液包括至少一种营养物;适用于抑制所述环境样本中的至少一种非目标微生物的生长的至少一种筛选剂;至少一种维生素;至少一种二价金属;能够维持所述组合物在pH7.0-7.5的至少一种缓冲试剂;适用于中和在所述环境样本中存在的消毒剂的至少一种试剂;以及用于防止荧光素分解的至少一种试剂。所述试剂盒还包括能够支持被至少一种目标微生物附着的固体基质(solidsubstrate)。
在一些实施方式中,本发明包括一种测定环境样本中目标微生物存在或不存在的方法。所述方法包括如下步骤:收集环境样本;将环境样本与能够感染从环境样本获得的至少一种目标微生物的至少一种重组噬菌体接触,所述重组噬菌体包括编码标记物的异源核酸序列;对暴露于噬菌体的环境样本提供足够使得所述重组噬菌体感染与环境样本相联系存在的目标微生物,并由目标微生物产生由异源核酸序列编码的标记物的条件;以及测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,来确定目标微生物存在或不存在。在该方法中,从使环境样本与重组噬菌体接触到检测目标微生物存在或不存在的时间在1分钟至6小时之间。
在一些实施方式中,在所述方法中使用的所述至少一种重组噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、P100::ffluc、LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc或P100::nluc。
在一些实施方式中,对暴露于噬菌体的环境样本提供足够使得所述重组噬菌体感染与环境样本相联系存在的目标微生物的条件包括将暴露于噬菌体的环境样本暴露于适用于在至少一种目标微生物中增殖至少一种重组噬菌体的至少一种水溶液。该水溶液包括:至少一种营养物;适用于抑制至少一种非目标微生物在所述环境样本中生长的至少一种筛选剂;至少一种维生素;至少一种二价金属;能够维持所述组合物在pH7.0-7.5的至少一种缓冲剂;适用于中和存在于所述环境样本中的消毒剂的至少一种试剂;以及用于防止荧光素分解的至少一种试剂。
在一些实施方式中,从使环境样本与重组噬菌体接触到检测目标微生物存在或不存在的时间为4小时或更少。在一些实施方式中,从使环境样本与重组噬菌体接触到检测目标微生物存在或不存在的时间为1小时或更少。
在一些实施方式中,测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,来确定目标微生物存在或不存在具有在使环境样本与重组噬菌体接触30分钟之后检测100个目标微生物细胞的下限。在一些实施方式中,测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,来确定目标微生物存在或不存在具有在使环境样本接触重组噬菌体60分钟之后检测10个目标微生物细胞的下限。在一些实施方式中,测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,来确定目标微生物存在或不存在包括在使环境样本接触重组噬菌体180分钟之后检测单个目标微生物细胞的下限。
在一些实施方式中,对于环境样本,所述方法的准确度为至少90%,其中,所述方法具有对于包括代谢活性的目标微生物的对照样本,在约60分钟内检测约10个或更少个细胞的检测下限。在一些实施方式中,所述方法的特异性是至少90%。在一些实施方式中,所述方法的灵敏度是至少80%。
具体实施方式
除非本文中另有说明,关于本公开所使用的科学和技术术语应该具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。此外,除非本文另有要求,单数术语应包括复数术语,复数术语应包括单数术语。一般来说,本文中所描述的关于生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学和杂交的技术所使用的术语是本领域所熟知的并通常使用的术语。本文所引用的某些参考文献和其他文献通过引用清楚地合并到本文中。此外,本文中所引用的所有基因库(Genbank)或其他序列数据库记录由此通过引用合并到本文中。如果有冲突,将以本说明书(包括定义)为准。所述材料、方法和实施例都仅为阐释性的,并不意在限定。
除非另有说明,本公开的方法和技术一般根据本领域已知的常规方法或如在本说明书全文中引用和讨论的多项一般性的和更加具体的参考文献来实施。请参见例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001);Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992,andSupplementsto2002);TaylorandDrickamer,IntroductiontoGlycobiology,OxfordUniv.Press(2003);WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,N.J.;HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolI,CRCPress(1976);HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolII,CRCPress(1976);EssentialsofGlycobiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。许多可用于噬菌体的分子生物学和遗传学技术描述在Clokieetal.,Bacteriophages:MethodsandProtocols,Vols.1and2(MethodsinMolecularBiology,Vols.501and502),HumanaPress,NewYork,N.Y.(2009)中,其由此通过引用合并到本文中。
本公开涉及在互联网上公开的某些氨基酸和核酸序列的序列数据库条目(例如UniProt/SwissProt或GENBANK记录),以及互联网上的其他信息。本领域技术人员理解包括序列数据库条目的互联网上的信息不时地更新,例如用于指代一个特定序列的参考号可能会改变。当参考互联网上的序列信息或其他信息的公开数据库时,应理解可能发生这样的改变,互联网上的信息的具体实施方式可能会时隐时现。由于本领域技术人员可以通过搜索互联网找到等价信息,参考互联网网页地址或者序列数据库条目可证明所涉及的信息的可获得性和公开传播性。
在公开和描述本发明的重组噬菌体、组合物、方法和其他实施方式之前,应理解本文所使用的术语是仅出于描述特定实施方式的目的,并不意在限定。必须注意的是,在本说明书和所附的权利要求书中所用的单数形式的“一”“一个”和“所述”包括复数对象,除非本文另有明确说明。
本文所用的术语“包括”与“包含”或“含有”是同义词,并且是包括的或开放式的,并不排除额外的、未记载的成员、元素或方法步骤。
在本文中所用的术语“体外”是指发生在人工环境(例如在试管或反应容器中、在细胞培养中、在培养皿中等),而不是发生在生物体(例如动物、植物或微生物)内的事件。
在本文中所用的术语“体内”是指发生在生物体(例如动物、植物或微生物)内的事件。然而,至少部分发生在微生物中的体内试验可以发生在体外,如果例如部分试验发生在培养中的微生物之外。
在本文中所用的术语“分离的”是指物质或实体已被(1)从其最初生产时结合的组分(无论是自然地或是在实验设置下)中的至少一些分离,和/或(2)通过人工生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以从至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更多的其最初结合的其他组分中分离。在一些实施方式中,分离的试剂的纯度为超过约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或超过约99%。在本文中所用的物质是“纯”的,如果其实质上没有其他组分。
在本文中所用的术语“肽”是指短的多肽,例如典型地包括少于约50个氨基酸的多肽,更典型地少于约30个氨基酸的多肽。本文所使用的该术语包括模拟结构并由此模拟生物学功能的类似物和模拟物。
术语“多肽”包括天然产生的和非天然产生的蛋白质及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体或聚合体。进一步地,多肽可包括大量不同的结构域,其中每个具有一种或多种不同的活性。为了消除怀疑,“多肽”可以为超过两个氨基酸的任意长度。
在本文中所用的术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是由于其起源或衍生的来源(1)并不与在其天然状态下伴随它的天然结合的组分相结合,(2)以在天然中并未发现的纯度存在,其中纯度可以根据其他细胞材料的存在来调节(例如,不存在来自相同物种的其他蛋白质),(3)由来自不同物种的细胞表达,或(4)并不在大自然中产生(例如,其是在大自然中发现的多肽的片段,或其包括在大自然中并未发现的氨基酸类似物或衍生物,或者不同于标准肽键的连接物)的蛋白质或多肽。因此,化学合成的多肽或者在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将从其天然结合的组分中被“分离”。使用本领域熟知的蛋白质纯化技术,多肽或蛋白质也可以通过分离成为实质上不含天然结合的组分。如这样所定义的“分离的”并不一定要求所述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已从于其中其被合成的细胞中物理除去。
在本文中所用的术语“多肽片段”是指具有缺失(例如相对于全长多肽、如天然发生的蛋白质,氨基末端和/或羧基末端缺失)的多肽。在一个实施方式中,所述多肽片段是连续序列,其中所述片段的氨基酸序列与天然发生的序列中的相应位点相同。片段通常为例如至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长,或至少12、14、16、18个氨基酸长,或至少20个氨基酸长,或至少25、30、35、40或45个氨基酸长,或至少50或60个氨基酸长,或至少70个氨基酸长。
在本文中所用的术语“融合蛋白”是指包括偶联有异源氨基酸序列的多肽或片段的多肽。融合蛋白非常有用,因为其可以被构建为包括可以来自两个或多个不同蛋白质的两个或多个所需的功能元件。融合蛋白包括来自感兴趣的多肽的至少10个连续氨基酸,或者至少20或30个氨基酸,或者至少40、50或60个氨基酸,或者至少75、100或125个氨基酸。包括在融合蛋白中的异源多肽通常为至少6个氨基酸长,或者至少8个氨基酸长,或者至少15、20或25个氨基酸长。包括较大多肽(例如IgGFc区域)、甚至整个蛋白质(例如包括绿色荧光蛋白(“GFP”)发色团的蛋白质)的融合尤为实用。融合蛋白可以通过构建编码多肽或者其片段的核酸序列与编码不同蛋白质或肽的核酸序列在框架中,并表达该融合蛋白来重组制备。或者,融合蛋白可以通过将多肽或其片段与另一个蛋白质交联来化学制备。
在本文中所用的术语“重组”是指(1)并不与其中的基因在自然中发现的多聚核苷酸的全部或一部分相结合,(2)可行地连接于并不在自然中相连的多聚核苷酸,或(3)并不在自然中产生的生物分子,例如基因或蛋白质。优选地,“重组”是指并不在自然中产生的生物分子。术语“重组”可以在有关被克隆的DNA分离物、化学合成的多聚核苷酸类似物、或通过异源系统生物合成的多聚核苷酸类似物、以及由这样的核酸编码的蛋白质和/或mRNA中使用。因此,例如由微生物合成的蛋白质是重组的,如果其由从细胞中存在的重组基因合成的mRNA来合成。噬菌体是“重组的”,如果其包括重组生物分子。优选地,噬菌体是“重组的”,如果其包括并不在天然中产生的重组生物分子。因此,例如并且无限定地,噬菌体是重组的,如果所述噬菌体的基因组包括重组的核酸序列。
术语“多聚核苷酸”“核酸分子”“核酸”或“核酸序列”是指至少10个碱基长的核苷酸的聚合物形式。所述术语包括DNA分子(例如cDNA或基因组的或合成的DNA)和RNA分子(例如mRNA或合成的RNA),以及包括非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的DNA或RNA的类似物。核酸可以为任何拓扑构象。例如,核酸可以为单链、双链、三链或四链的,部分双链的、分支的、发卡结构的、环状的、或扣锁结构的构象。
“合成的”RNA、DNA或混合聚合物是在细胞外创造的RNA、DNA或混合聚合物,例如化学合成的RNA、DNA或混合聚合物。
在本文中所用的术语“核酸片段”是指具有缺失(例如相对于全长参考核苷酸序列,具有5’-末端或3’-末端缺失)的核酸序列。在一个实施方式中,核酸片段是连续序列,其中所述片段的核苷酸序列与天然产生的序列中的相应位点相同。在一些实施方式中,片段为至少10、15、20或25个核苷酸长,或者至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个核苷酸长。在一些实施方式中,核酸序列的片段是开放阅读框序列的片段。在一些实施方式中,这样的片段编码由开放阅读框核苷酸序列编码的蛋白质的多肽片段(如本文所定义的)。
在本文中所用的术语“表达调控序列”是指对于影响其可行地连接的编码序列的表达所必须的多聚核苷酸序列。表达调控序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达调控序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的RNA加工信号如剪接信号和多腺苷酸化信号;稳定mRNA的序列;增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点);增强蛋白质稳定性的序列;以及当需要时增强蛋白质分泌的序列。调控序列的性质基于宿主生物而不同;在原核生物中,这样的调控序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“调控序列”意在至少包括其存在对于表达是必须的的任何组分,并还可以包括其存在是有利的的其他组分,例如引导序列和融合伙伴序列。
在本文中所用的术语“可操作地连接的”或“可行地连接的”表达调控序列是指其中表达调控序列与感兴趣的基因是连续的、以调控该感兴趣的基因的连接,以及以反式或一定距离地作用以调控感兴趣的基因的表达调控序列。
在本文中所用的术语“细菌噬菌体(bacteriophage)”是指感染细菌的病毒。类似地,“古生菌噬菌体(archaeophage)”是指感染古生菌的病毒。术语“噬菌体”用于表示这两种病毒,但在本文所指出的某些情况下,也可以用作具体表示细菌噬菌体或古生菌噬菌体的简称。细菌噬菌体和古生菌噬菌体是在细菌/古生菌中通过使用宿主生物合成机构中的部分或全部来繁殖的专性细胞内寄生物(即感染细菌/古生菌的病毒)。虽然不同细菌噬菌体和古生菌噬菌体可能包括不同的物质,但是它们都包括核酸和蛋白质,并且可以在某些条件下被封装到脂膜中。基于噬菌体,核酸可以是DNA或RNA,但通常不是两者,并且核酸可以以多种形式存在。
如在本文中所用的,“异源核酸序列”是指被置于基因组中其并不通常产生的位置的任何序列。异源核酸序列可以包括并不在具体细菌/古生菌和/或噬菌体中天然产生的序列,或者其可以仅仅包括在细菌/古生菌和/或噬菌体中天然发现的序列,但置于在基因组中并非通常产生的位置。在一些实施方式中,所述异源核酸序列并非天然噬菌体序列;在一些实施方式中,其是天然噬菌体序列,但是来自于不同噬菌体;在另一些实施方式中,其是在起始噬菌体的基因组中天然产生的序列,但是其随后被转移到其非天然产生的另一个位点,使得其在新的位点是异源序列。
“起始噬菌体”或“起始噬菌体基因组”是指从天然的、或并没有通过遗传工程修饰的人工环境、或者该噬菌体的基因组分离的噬菌体。
“重组噬菌体”或“重组噬菌体基因组”是指包括通过将异源核酸序列插入到噬菌体、或噬菌体的基因组中来进行遗传修饰的基因组的噬菌体。在一些实施方式中,起始噬菌体的基因组通过重组DNA技术来修饰,以将异源核酸序列引入到基因组中的预定的位点。在一些实施方式中,异源序列以并没有内源性噬菌体基因组核苷酸的相应损失的方式引入。换言之,如果碱基N1和N2在起始噬菌体基因组中是邻近的,则在N1和N2之间插入所述异源序列。因此,在得到的重组基因组中,异源序列的左右两边为核苷酸N1和N2。在一些情况下,插入异源序列,移除内源性核苷酸或者将其用外源性序列替换。例如,在一些实施方式中,将外源性序列插入到被移除的内源性序列的部分或全部位置中。在一些实施方式中,将内源性序列从远离外源性序列插入的位点的噬菌体基因组中的位置移除。
“编码序列”或“开放阅读框”是指编码多肽或蛋白质的核苷酸的序列。编码序列的末端是起始密码子和终止密码子。
如在本文中所用的,“噬菌体基因组”包括天然产生的噬菌体基因组及其衍生物。通常(但非必要地),衍生物具有在与母体相同的宿主中增殖的能力。在一些实施方式中,天然产生的噬菌体基因组和衍生的噬菌体基因组之间的唯一区别在于,从噬菌体基因组的至少一端(如果基因组是线状的)或者从基因组的至少一个位点(如果基因组是环状的)缺失或增加核苷酸中的至少一种。
如在本文中所用的,“噬菌体宿主细胞”是指可以从特定类型的噬菌体基因组DNA形成噬菌体的细胞。在一些实施方式中,噬菌体基因组DNA通过由噬菌体感染细胞而被引入到细胞中。即所述噬菌体结合到宿主细胞的外部上的受体分子,并将其基因组DNA注入宿主细胞中。在一些实施方式中,使用转化或者任何其他适宜的技术将所述噬菌体基因组DNA引入到所述细胞中。在一些实施方式中,当被引入细胞中时,噬菌体基因组DNA实质上是纯的。在一些实施方式中,当被引入到细胞中时,噬菌体基因组DNA存在于载体中。在一个非限制性的示例性的实施方式中,噬菌体基因组DNA存在于酵母人工染色体(YAC)中,所述酵母人工染色体通过转化或等同的技术被引入到噬菌体宿主细胞中。然后噬菌体基因组DNA被复制并装入噬菌体颗粒中,随后裂解噬菌体宿主细胞。“噬菌体宿主细胞”的定义必须可以从一个噬菌体到另一个噬菌体而改变。例如,大肠杆菌可以是特定类型的噬菌体的噬菌体宿主细胞,而肠道沙门氏菌并不是;肠道沙门氏菌可以是另一种特定类型的噬菌体的噬菌体宿主细胞,而大肠杆菌不是。
如在本文中所用的,“感受态噬菌体宿主细胞”是指噬菌体颗粒可以感染并且噬菌体的基因组可以在其中从细胞直接生产噬菌体颗粒的噬菌体宿主细胞。因此,并非所有“噬菌体宿主细胞”都是“感受态噬菌体宿主细胞”,但是所有“感受态噬菌体宿主细胞”都是“噬菌体宿主细胞”。
如在本文中所用的,“目标微生物”是指检测试验被设计用来检测的微生物的集合。试验的“目标微生物”是在试验中所用的重组噬菌体的感受态噬菌体宿主细胞的集合。在一些实施方式中,试验的目标微生物是单个物种的微生物。在一些实施方式中,试验的目标微生物是单个亚种的微生物。在一些实施方式中,试验的目标微生物是单个菌株的微生物。在一些实施方式中,所述目标微生物包括单个属、种、亚种或菌株的微生物,或者由单个属、种、亚种或菌株的微生物构成。在一些实施方式中,所述目标微生物包括至少一个属,和/或至少一个种,和/或至少一个亚种,和/或至少一个菌株的微生物,或者由至少一个属,和/或至少一个种,和/或至少一个亚种,和/或至少一个菌株的微生物构成。在一些实施方式中,试验的目标微生物包括单个分类群的所有已知成员,以及另一个分类群的部分但并非全部成员。因此,例如试验的目标微生物可以是第一个属的所有成员,以及第二个属的成员的子集。在其他实施方式中,试验的目标微生物是更加多样化的群组,例如整个属或甚至更大的群组。在一些实施方式中,试验的目标微生物并不与通常被接受的系统分类相一致。例如,试验的目标微生物可以是一个属的细菌的种的集合,该集合可能并不包括该属的所有已知菌株。可选地或者此外,试验的目标微生物可以是一个种的细菌的亚种的集合,该集合并不包括该种的所有已知亚种。可选地或者此外,试验的目标微生物可以是一个种的细菌的菌株的集合,该集合并不包括该种的所有已知菌株。“目标微生物”的组合通过在试验中所用的重组噬菌体的宿主范围来确定。如在本文中所公开的,在本文中所公开的重组噬菌体对本文公开的细菌检测方法提供特异性。在一些实施方式中,在试验中使用多种重组噬菌体。如果多种类型的重组噬菌体中的至少两种的特异性是不同的,在试验中包含多种重组噬菌体增大了试验的目标微生物的范围。在一些实施方式中,试验中所用的至少一对重组噬菌体的特异性并不重叠。在一些实施方式中,在试验中所用的所有重组噬菌体的特异性至少部分重叠。
如在本文中所用的,当噬菌体感染目标微生物,但并不感染在由该试验方法测试的样品中存在的其他非目标微生物时,包括重组噬菌体的噬菌体在检测方法的背景下对于目标微生物是“特异的”。如果噬菌体感染所有已知种类的大肠杆菌时,包括重组噬菌体的噬菌体可对于属(例如大肠杆菌)是特异的,但如果其感染已知类型的大肠杆菌,但并不感染非大肠杆菌的微生物时,包括重组噬菌体的噬菌体可以被认为对大肠杆菌是特异的。
如在本文中所用的,“收集装置”是指包括被设计以与被怀疑包括微生物污染的固体表面接触以移除并保留存在于固体表面的微生物的第一部分的任何装置。第一部分收集微生物并将微生物保留在其表面中或表面上。当接触固体表面时,第一部分可以是干燥的或湿润的。通常,收集装置包括用于被用户操作的第二部分。所述第二部分可以被用户直接操作,或者可以连接于移动收集装置的控制工具。该装置的一个例子是标准Q头拭子(Q-tipswab)。另一个例子是具有李氏肉汤(LetheenBroth)SSL10LET的定制海绵棒(CustomSponge-Stick)(由3M生产)。具有李氏肉汤的3M海绵棒是在无菌袋中被运送的、用10mL李氏肉汤水化的不含杀生物剂的纤维素海绵。塑料把手使得用户不需直接触摸(并且有可能污染)海绵就可以收集环境样本,并使其更易于达到排水沟、管道和裂缝中去收集样本。纤维素材料收集微生物并将微生物保持在海绵基质中或海绵基质上。存在李氏培养基来帮助中和清洁化学物质,例如季铵,并保持生物体的活性用于检测。
在一些实施方式中,收集装置的第一部分包括有机材料,例如但不限于纤维素、棉花或具有有用特性(例如有用的湿润性、在第一组条件下结合微生物并在第二组环境下释放微生物的能力、抗磨损和保存期限的至少一种)的其他天然纤维。
在一些实施方式中,收集装置的第一部分包括合成材料,例如但不仅限于聚酯或聚氨酯,其具有例如有用的湿润性、在第一组条件下结合微生物并在第二组环境下释放微生物的能力、抗磨损和保存期限中的至少一种的有用特性。
如在本文中所用的,“敏感性”是指通过试验方法被正确地鉴定为阳性的真阳性样本的比例。正阳性样本通常通过使用用于检测目标微生物存在的验证试验来限定。在一些实施方式中,真阳性通过包括培养样本以确定目标微生物是否存在的方法来限定。
如在本文中所用的,“特异性”是指通过试验方法被正确地鉴定为阴性的真阴性样本的比例。正阴性样本通常通过使用用于检测目标微生物存在的验证试验来限定。在一些实施方式中,真阴性通过包括培养样本以确定目标微生物是否存在的方法来限定。
如在本文中所用的,“准确率”是指在总体样本群组中的敏感性和特异性的加权综合。
A.噬菌体
噬菌体包括细菌噬菌体和古生菌噬菌体两者,其是在细菌/古生菌中通过使用宿主生物合成机构中的部分或全部来繁殖的专性细胞内寄生物(即感染细菌/古生菌的病毒)。在识别要感染的宿主细胞方面以及在仅能够在适宜的宿主细胞中有效复制其基因组方面,噬菌体是专性寄生物。虽然不同噬菌体可能包括不同物质,其均包括核酸和蛋白质,并且可以被脂膜覆盖。基于噬菌体,核酸可以是DNA或RNA,通常不是两者皆是,并且核酸可以以多种形式存在。核酸的大小基于噬菌体而不同。最简单的噬菌体仅具有几千核苷酸大小的基因组,而更加复杂的噬菌体在其基因组中可能具有超过100000个核苷酸,在罕见情况下,可能超过1000000个。噬菌体颗粒中的不同种类的蛋白质的数量和每种蛋白质的量将基于噬菌体而变化。蛋白质的功能为感染以及保护核酸不受环境中的核酸酶破坏。
噬菌体可以有多种不同大小和形状。大部分噬菌体的大小在直径为24-200nm的范围。头部或衣壳由一种或多种不同蛋白质的许多拷贝构成。若头部存在,核酸位于头部,其起到核酸的保护性外壳的作用。许多但并非所有噬菌体具有连接于噬菌体头部的尾部。尾部是中空管,在感染期间,核酸穿过该中空管。尾部的大小可以变化,甚至有些噬菌体并不具有尾部结构。在更加复杂的噬菌体中,尾部被收缩鞘包围,其在细菌的感染期间收缩。在尾部的末端,噬菌体具有底盘,一个或多个尾部纤维连接于该底盘上。底盘和尾部纤维参与噬菌体与细胞中的结合。并非所有噬菌体都具有底盘和尾部纤维。在这些情况下,其他结构参与到噬菌体颗粒与细菌/古生菌的结合中。
感染过程中的第一步是噬菌体附着至细胞。这一步通过尾部纤维或者在缺乏尾部纤维的噬菌体中的某些类似物结构来调节,并且这是可逆的。尾部纤维结合至细胞上的特异性受体,并且噬菌体的宿主特异性(即噬菌体能够感染的细菌/古生菌)通常噬菌体具有的尾部纤维的类型来决定。细菌/古生菌受体的性质因不同的细菌/古生菌而改变。例子包括细胞的外表面上的蛋白质,细菌细胞壁和细胞膜的成分(例如LPS或磷壁酸)、菌毛、脂蛋白,等等。这些生物分子出于其他目的位于细胞上,噬菌体已进化来利用它们作为感染的受体。
噬菌体通过尾部纤维对细胞的附着是很弱的附着,并且是可逆的。噬菌体对细胞的不可逆结合通过底盘的一种或多种组分来调控。缺乏底盘的噬菌体具有变成紧密结合至细胞的其他方式。
噬菌体对细胞的不可逆结合(对于具有鞘的那些噬菌体)导致鞘的收缩,并且空心尾部纤维被推动通过细菌/古生菌包膜。不具有收缩鞘的噬菌体使用使噬菌体颗粒通过细菌/古生菌包膜的其他机理。一些噬菌体具有消化包膜的多种组分的酶。
当噬菌体已通过包膜时,来自头部的核酸通过空心尾部,并进入细胞。通常,仅实际进入细胞的噬菌体组分为核酸。噬菌体的其他部分通常留在细胞外部。对该规则有一些例外。这与动物病毒不同,在动物病毒中,大部分病毒颗粒通常进入细胞内。
溶解性或烈性噬菌体是可仅在细菌/古生菌上繁殖并在生命周期的末尾通过溶解杀死细胞的噬菌体。溶解性噬菌体的生命周期以掩蔽期开始。在掩蔽期,在细胞内外都不能找到感染性噬菌体颗粒。噬菌体核酸接管宿主生物合成机构,制备噬菌体特异的mRNA和蛋白质。存在噬菌体指导的大分子合成的有序表达,正如人们在动物病毒感染中所看到的那样。早期mRNA编码噬菌体DNA合成所需的早期蛋白,并关闭宿主DNA、RNA和蛋白质生物合成。在一些情况下,早期蛋白实际上降解宿主染色体。在制备噬菌体DNA之后,制备晚期mRNA和晚期蛋白。晚期蛋白是包括噬菌体以及溶解细菌细胞所需的蛋白质的结构蛋白。接着,在细胞内积累阶段中,组装已被制得的核酸和结构蛋白,感染性噬菌体颗粒在细胞内累积。在溶解和释放阶段,细菌/古生菌开始溶解,因为噬菌体溶解蛋白的累积和细胞内噬菌体被释放到基质中。每个感染的细胞释放的颗粒的数目可以高达1000或更多。
溶解性噬菌体可以由噬菌斑试验来计数。噬菌斑是由细菌/古生菌的溶解导致在生长在固体培养基上的细菌/古生菌的菌苔中的空白区域(cleararea)。该试验以足够低浓度的噬菌体进行,每个噬菌斑由单个感染性噬菌体产生。在本试验的背景中,导致噬菌斑的感染性颗粒被称为PFU(噬菌斑形成单元)。
如下所述,本公开提供了包括基因组的重组噬菌体,所述基因组包括编码标记物的开放阅读框。重组噬菌体是基于天然产生的噬菌体或“起始噬菌体”。
在本公开的一些实施方式中,起始噬菌体基因组包括至少5千碱基(kb)、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少45kb、至少50kb、至少55kb、至少60kb、至少65kb、至少70kb、至少75kb、至少80kb、至少85kb、至少90kb、至少95kb、至少100kb、至少105kb、至少110kb、至少115kb、至少120kb、至少125kb、至少130kb、至少135kb、至少140kb、至少145kb、至少150kb、至少175kb、至少200kb、至少225kb、至少250kb、至少275kb、至少300kb、至少325kb、至少350kb、至少325kb、至少350kb、至少375kb、至少400kb、至少425kb、至少450kb、至少475kb、至少500kb或更多。在本公开的一些实施方式中,起始噬菌体基因组包括5-50kb、10-100kb、50-200kb、100-300kb、200-400kb或300-500kb。
在本公开的一些实施方式中,起始噬菌体是选自尾噬菌体目、微小噬菌体科、覆盖噬菌体科、复层病毒科、光滑病毒科、囊状噬菌体科、丝状噬菌体科、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)和小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)的目的成员。在一些实施方式中,噬菌体是目尾噬菌体目的成员并且是选自肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科和短尾噬菌体科的家族的成员。
选择起始噬菌体的首要标准是噬菌体的宿主范围。噬菌体的宿主范围可以使用本领域已知的任何方法来限定。通常来说,限定噬菌体的宿主范围的方法(即“宿主范围分析”)通过在允许条件下将噬菌体与一组宿主微生物细胞混合并确定噬菌体是否可以感染宿主并完成溶解宿主细胞的生命周期来进行。在一些实施方式中,可替代的或额外的分析还包括确定噬菌体是否感染宿主并变成溶原性的。
在噬菌体宿主范围分析中,所用的微生物组的组成将取决于将如何使用噬菌体。可以首先筛选噬菌体感染不同属的细菌的能力,例如埃希氏杆菌属、假单胞细菌属、葡萄球菌属、沙门氏菌属和李斯特菌属。然后,被选择的噬菌体(例如感染并溶解沙门氏菌属菌株的噬菌体)可以任选地被进一步筛选,以确定该噬菌体可以感染和溶解的沙门氏菌属的种或甚至菌株。
起始噬菌体或重组噬菌体的宿主范围可以使用本领域已知的任何技术来修改。通常,该技术可分为两个大的类别。第一类是遗传修饰,其可以是理性的,例如尾部纤维交换,或者可以是随机的,例如诱变目标区域。第二类是筛选(平衡噬菌体中的天然变异或者通过将人工变异引入噬菌体的种群中,例如通过诱变剂)。在一些实施方式中,细菌噬菌体的种群在许可条件下、在非许可性宿主存在下孵育。细菌噬菌体的种群包括具有与种群中大部分噬菌体不同的宿主范围的低频变异体。产生子代噬菌体的许多种群并将其镀于非许可性宿主上可导致表现出改变的宿主范围的子代噬菌体的分离。在一些实施方式中,宿主范围变大。在一些实施方式中,宿主范围改变,这意味着对部分或全部之前可允许的宿主的感染能力丧失,并获得新宿主。在一些实施方式中,改变的宿主范围是永久性的和稳定的;在另一些中,其是暂时的。在一些实施方式中,对于相同或不同宿主的其他轮选择将暂时改变的宿主范围改变成稳定改变的宿主范围。
在一些实施方式中,起始噬菌体或重组噬菌体还基于除了宿主范围之外的至少一个标准被选择。该至少一个其他标准可以选自生命周期特征、基因组大小和/或结构、对细菌防御系统的天然抗性、基因组末端结构、复制速度、裂解量、感染性、稳定性和生长特性等。这些特征还可以在起始噬菌体或重组噬菌体中例如通过使用前面段落所述的方法来修改。
B.重组噬菌体
在一些实施方式中,将异源核酸序列插入起始噬菌体基因组,以产生重组噬菌体基因组。在一些实施方式中,进一步修改重组噬菌体基因组以产生不同的重组噬菌体基因组。在一些实施方式中,重组噬菌体基因组相对于起始噬菌体基因组包括除了插入异源核酸序列之外的至少一种改变。
异源核酸序列可以为任何核酸序列;但是,其最通常包括至少一个开放阅读框和表达调控序列。在一些实施方式中,异源核酸序列包括开放阅读框和表达调控序列。在一些实施方式中,表达调控序列是启动子。在一些实施方式中,其包括至少两个表达调控序列。在一些实施方式中,表达调控序列对于起始噬菌体基因组是内源性的。在一些实施方式中,其对于起始噬菌体基因组不是内源性的。在一些实施方式中,异源核酸序列包括修改版本的内源性噬菌体核酸序列的核酸序列。开放阅读框可编码可检测的标记物。在一些实施方式中,异源核酸序列的长度为至少100个碱基、至少200个碱基、至少300个碱基、至少400个碱基、至少500个碱基、至少600个碱基、至少700个碱基、至少800个碱基、至少900个碱基、至少1千个碱基(kb)、至少1.1kb、至少1.2kb、至少1.3kb、至少1.4kb、至少1.5kb、至少1.6kb、至少1.7kb、至少1.8kb、至少1.9kb、至少2.0kb、至少2.1kb、至少2.2kb、至少2.3kb、至少2.4kb、至少2.5kb、至少2.6kb、至少2.7kb、至少2.8kb、至少2.9kb、至少3.0kb、至少3.1kb、至少3.2kb、至少3.3kb、至少3.4kb、至少3.5kb、至少3.6kb、至少3.7kb、至少3.8kb、至少3.9kb、至少4.0kb、至少4.5kb、至少5.0kb、至少5.5kb、至少6.0kb、至少6.5kb、至少7.0kb、至少7.5kb、至少8.0kb、至少8.5kb、至少9.0kb、至少9.5kb、至少10kb或更多。在一些实施方式中,异源核酸序列的长度为500个碱基或更少、1.0kb或更少、1.5kb或更少、2.0kb或更少、2.5kb或更少、3.0kb或更少、3.5kb或更少、4.0kb或更少、4.5kb或更少、5.0kb或更少、5.5kb或更少、6.0kb或更少、6.5kb或更少、7.0kb或更少、7.5kb或更少、8.0kb或更少、8.5kb或更少、9.0kb或更少、9.5kb或更少、或10.0kb或更少。
在一些实施方式中,异源核酸序列的长度为100-500个碱基、200-1000个碱基、500-1000个碱基、500-1500个碱基、1-2kb、1.5-2.5kb、2.0-3.0kb、2.5-3.5kb、3.0-4.0kb、3.5-4.5kb、4.0-5.0kb、4.5-5.5kb、5.0-6.0kb、5.5-6.5kb、6.0-7.0kb、6.5-7.5kb、7.0-8.0kb、7.5-8.5kb、8.0-9.0kb、8.5-9.5kb或9.0-10.0kb。
在一些实施方式中,异源核酸序列的长度比起始噬菌体基因组的长度的比值为0.05或更少、0.10或更少、0.15或更少、0.20或更少或0.25或更少。在一些实施方式中,重组噬菌体的基因组的长度比相应起始噬菌体基因组的长度的比值为1.05或更少、1.10或更少、1.15或更少、1.20或更少或1.25或更少。
在一些实施方式中,将异源核酸序列插入到起始噬菌体基因组中而不损失内源性起始噬菌体基因组序列。在一些实施方式中,被插入的异源核酸序列替换内源起始噬菌体基因组序列。在一些这样的实施方式中,异源核酸序列替换一定量的比异源核酸序列长度短的内源性基因组序列。因此,在这些实施方式中,重组噬菌体基因组的长度比起始噬菌体基因组的长度更长。在一些这样的实施方式中,异源核酸序列替换一定量的比异源核酸序列的长度更长的内源性基因组序列。因此,在这些实施方式中,重组噬菌体基因组的长度比起始噬菌体基因组的长度更短(除非在基因组其他地方加入额外的异源序列)。在一些这样的实施方式中,异源核酸序列替换一定量的与异源核酸序列的长度相同的内源性基因组序列。
在一些实施方式中,异源核酸序列包括开放阅读框。
在一些实施方式中,所述开放阅读框编码可检测的标记物,所述标记物赋予目标微生物宿主细胞至少一种表型。所述可检测的标记物可以是可筛选的标记物和/或可选择的标记物。
在一些实施方式中,异源核酸序列包括至少一个第二开放阅读框。在一些实施方式中,所述第一开放阅读框和至少一个第二开放阅读框可操作地连接于相同的表达调控序列。在一些实施方式中,所述第一开放阅读框和至少一个第二开放阅读框可操作地连接于不同的表达调控序列。
在一些实施方式中,将由异源开放阅读框编码的蛋白质或多肽修改以减少被噬菌体宿主细胞中存在的蛋白酶剪切。例如,可以使用计算算法来识别已知的蛋白酶剪切位点,然后可以使用保守替换来修改开放阅读框的序列以除去这些位点。或者,使用定向诱变来逐步形成编码对于噬菌体宿主细胞中或者噬菌体宿主细胞的培养物中存在的至少一种蛋白酶具有增加的抗性的产物的开放阅读框序列。
在一些实施方式中,重组噬菌体可以通过定向转化来构建,例如通过将工程噬菌体YACDNA转化到适宜的宿主细胞。这些噬菌体YAC复制,切除,并装配到能够重复感染的感染性噬菌体颗粒中。
在此方法中,工程YAC(酵母人工染色体)从包括YAC的酵母转化子去除。在一些实施方式中,这通过由玻璃珠溶解扰乱酵母转化子由此从转化的细胞释放YAC来实现。携带被释放的YAC的噬菌体被电穿孔到适宜的噬菌体宿主细胞并在标准噬菌斑试验中涂板。发明人已从转化携带YAC的噬菌体基因组制备了噬菌斑。到现在,这已经使用大肠杆菌噬菌体(T3和T7)以及沙门氏菌噬菌体(FelixO1)成功实现。这些结果证明从克隆的噬菌体基因组生产功能性噬菌体。
可以使用本领域已知的任何方法从起始噬菌体制备被遗传修饰的噬菌体。例如,美国专利5824468公开了制备被遗传修饰的噬菌体的方法。在2012年9月26日提交的、并在2013年5月16日作为US2013/0122549A1公布的一同待审的申请13/627060公开了可替代的方法,其由此通过引用合并到本发明中。可替代的方法在本申请的实施例中公开。
C.可检测的标记物
可检测的标记物包括可选择的标记物和/或可筛选的标记物。在本文中所用的“可选择的标记物”是赋予具有标记物的细胞在分别抑制或刺激不表达标记物的类似细胞生长的试剂的存在和/或不存在下生长的能力。也可以说这样的细胞具有“可选择的表型”,由于其表达可选择的标记物。例如,氨苄青霉素抗性基因(AmpR)赋予具有并表达该基因的细胞在氨苄青霉素存在的条件下生长的能力。(参见Sutcliffe,J.G.,ProcNatlAcadSciUSA.1978August;75(8):3737–3741.)其他非限制性的实施例包括赋予对氯霉素、卡那霉素和四环素的抗性的基因。其他标记物包括URA3、TRP和LEU,其分别允许在所述尿嘧啶、色氨酸和亮氨酸不存在的条件下生长。
在本文中所用的“可筛选的标记物”是可用作识别表达标记物的细胞的基础的可检测的标签。也可以说这样的细胞具有“可筛选的表型”,由于其表达可筛选的标记物。可以差异化地被检测到的并且可以由重组噬菌体编码的任何分子可以作为可筛选的标记物。可筛选的标记物可以是核酸分子或其一部分,例如单链或双链的RNA或DNA分子。或者,可筛选的标记物可以是蛋白质或其一部分。适宜的蛋白质标记物包括催化形成可检测的反应产物的酶。一个例子是化学发光蛋白,例如荧光素酶或变体,例如luxAB和β-半乳糖苷酶。另一个例子是辣根过氧化物酶。用于产生冷光信号的蛋白质落入两个大的类别:直接产生光的蛋白(荧光素酶及相关蛋白)以及用于作为化学级联的部分间接产生光的蛋白(辣根过氧化物酶)。在生物研究中最常用的生物发光蛋白是水母发光蛋白和荧光素酶。前一种蛋白原子来源于维多利亚发光水母(jellyfishAequoreavictoria),并可用于确定溶液中的钙浓度。荧光素酶家族蛋白质适用于广范围的实验目的。来自萤火虫和海肾的荧光素酶是生物研究中最常用的荧光素酶。这些蛋白质也已经在遗传学上被分为两个不同功能的结构域,其将仅仅在蛋白质被紧密地共定位时产生光。这两种蛋白两者的多种发射光谱偏移的变异体衍生物已在过去十年间产生。它们已经被用于在活细胞中多色成像和共定位。用于产生化学发光信号的其他组的蛋白质是过氧化物酶和磷酸酶。过氧化物酶产生在发光反应中氧化鲁米诺的过氧化物。最广泛使用的过氧化物酶是辣根过氧化物酶(HRP),其已被广泛用于蛋白质印迹和ELISA中的检测。已经被以类似方式使用的第二组蛋白质是碱性磷酸酶,其从底物分子去除磷酸酯,使其不稳定化,并启动导致发光的级联反应。
在一些实施方式中,编码标记物的异源核酸序列选自SEQIDNO:1;与SEQIDNO:1至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同源的序列;在严苛的杂交条件下与SEQIDNO:1杂交的序列。在一些实施方式中,所述标记物是包括选自如下序列的氨基酸序列的蛋白:SEQIDNO:2;与SEQIDNO:2至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同源的序列;由在严苛的杂交条件下与SEQIDNO:1杂交的序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方式中,编码标记物的异源核酸序列选自SEQIDNO:3;与SEQIDNO:3至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同源的序列;在严苛的杂交条件下与SEQIDNO:3杂交的序列。在一些实施方式中,所述标记物是包括选自如下序列的氨基酸序列的蛋白:SEQIDNO:4;与SEQIDNO:4至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同源的序列;由在严苛的杂交条件下与SEQIDNO:3杂交的序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方式中,标记物是在美国专利申请公开US2010/0281552A1的段落0061至0093中公开荧光素酶或修饰过的荧光素酶蛋白。在一些实施方式中,异源核酸序列是编码在美国专利申请公开US2010/0281552A1的段落0061至0093中公开荧光素酶或修饰过的荧光素酶蛋白的核酸序列。美国专利申请公开US2010/0281552A1的段落0061至0093的全部内容由此出于所有目的通过引用并入本文中。
在一些实施方式中,标记物是在美国专利申请公开US2012/0174242A1的段落0190至0206中公开荧光素酶或修饰过的荧光素酶蛋白。在一些实施方式中,异源核酸序列是编码在美国专利申请公开US2012/0174242A1的段落0190至0206中公开的荧光素酶或修饰过的荧光素酶蛋白的核酸序列。美国专利申请公开US2012/0174242A1的段落0190至0206的全部内容由此出于所有目的通过引用并入本文中。
其他适宜的可筛选的标记物包括荧光蛋白。荧光蛋白包括但不仅限于蓝色/紫外荧光蛋白(例如TagBFP、蓝铜矿、EBFP2、mKalama1、天狼星(Sirius),、蓝宝石(Sapphire)和T-蓝宝石)、蓝绿色荧光蛋白(例如ECFP、天蓝色(Cerulean)、SCFP3A、mTurquoise、单体Midoriishi-蓝绿色、TagCFP和mTFP1)、绿色荧光蛋白(例如EGFP、祖母绿(Emerald)、SuperfolderGFP、单体蓟绿色(MonomericAzamiGreen)、TagGFP2、mUKG和mWasabi)、黄色荧光蛋白(例如EYFP、柠檬色(Citrine)、金星(Venus)、SYFP2和TagYFP)、橙色荧光蛋白(例如单体Kusabira-橙色(MonomericKusabira-Orange)、mKOκ、mKO2、m橙色和m橙色2)、红色荧光蛋白(例如m覆盆子、m樱桃、m草莓、m橘子、td土豆、TagRFP、TagRFP-T、m苹果和m红宝石)、远红外荧光蛋白(例如m梅子、Hc红-串联(HcRed-Tandem)、mKate2、m海王星(mNeptune)和NirFP)、近红外荧光蛋白(例如TagRFP657、IFP1.4和iRFP)、长斯托克斯偏移蛋白(longstokes-shiftproteins)(例如mKeima红、LSS-mKate1和LSS-mKate2)、可光活化的荧光蛋白(例如PA-GFP、Pam樱桃1和PATagRFP)、可光转化的荧光蛋白(例如Kaded(绿)、Kaede(红)、KikGR1(绿)、KikGR1(红)、PS-CFP2、PS-CFP2、mEos2(绿)、mEos2(绿)、mEos2(红)、PSm橙和PSm橙)以及可光开关的荧光蛋白(例如Dronpa)。对于所列例子的一些变体和可替代物对于本领域技术人员来说是熟知的,并可以在合适的应用中替换。
其他适宜的标记物包括表位。例如,包括可以被抗体或者其他结合分子检测的表位的蛋白质是可筛选标记物的一个例子。识别表位的抗体可以与信号产生部分直接连接(例如通过与荧光蛋白的化学发光部位共价附着),或者例如其可以使用例如直接连接于信号产生部分的第二抗体的至少一种其他结合试剂来检测。在一些实施方式中,表位并不存在于噬菌体或目标微生物的蛋白质中,因此在样本中检测到表位表明包括表位的蛋白质在包括编码包含表位的蛋白质的基因的重组噬菌体感染之后,由微生物生产了包括表位的蛋白质。在其他实施方式中,在目标微生物或噬菌体中天然存在的蛋白的情况下,标记物可以是纯化标签。例如该标签(例如6-His标签)可以用于从其他细菌或噬菌体蛋白中纯化异源蛋白,并且随后可以使用例如抗体来检测被纯化的蛋白质。
D.重组噬菌体制备
熟练技术人员知晓可以使用和/或改进以用于生产用于本公开的方法中的重组噬菌体的许多不同方法。一个示例性的方法在实施例10中呈现。一般来说,例如噬菌体溶菌产物可以使用根据本公开的重组噬菌体来制备。为了制备噬菌体溶菌产物,在适宜的液体生长培养基中接种单个菌落的感受态噬菌体宿主细胞,并在落地摇床中过夜生长。第二天,将一小份培养物稀释在较大体积的液体培养基中,并生长直到OD600达到适宜的浓度。然后将培养物用要增殖的重组噬菌体接种。然后将烧瓶进一步培养,直到溶菌产物呈澄清状(例如OD600<0.02)。再将溶菌产物通过0.45μm真空过滤器过滤,然后通过0.22μm真空过滤器,并在4℃下储存直到进一步纯化。
使用前,使用大体如SambrookandRussell,MolecularCloningVolume1,3rdedition2001中所述的方法来纯化噬菌体颗粒。简言之,使用pp2.43-2.44的方案6“PrecipitationofBacteriophageLambdaParticlesfromLarge-scaleLysates”(其由此通过引用合并到本文中)从溶菌产物中沉淀噬菌体颗粒,但有如下不同:省略了DNase和RNase步骤,以及氯仿萃取步骤。然后使用pp2.47-2.51的方案8“PurificationofBacteriophageLambdaParticlesbyIsopycnicCentrifugationthroughCsClGradients”(其由此通过引用合并到本文中)用氯化铯梯度纯化噬菌体颗粒,但有如下不同:使用SW28转子在BeckmanXL-90超速离心机中以22000rpm旋转分步梯度2小时;并且使用70.1ti转子在BeckmanXL-90超速离心机中以47000rpm旋转平衡梯度24小时。
从平衡梯度收获噬菌体带时,将噬菌体在4℃下对PerceG2Slide-a-lyzercassette(10,000MWCO)中的4LSM缓冲剂进行透析24小时。然后将噬菌体储存在4℃下,直到使用。
如本文中所述的,已发现在生产噬菌体溶菌产物期间产生的标记物蛋白可能污染制得的噬菌体储备物。污染的标记物将与噬菌体一起被加入到微生物检测试验中,并可以增加试验的背景。在一些实施方式中,相比于如果噬菌体储备物不包含标记物蛋白时的信噪比,这将反过来降低试验的信噪比。这反过来可降低试验的灵敏度和/或准确率。本文所述的方法可任选地用于催化失活存在于噬菌体储备物中的标记物蛋白,由此来降低存在于噬菌体储备物中的活性标记物蛋白的量。本方法是基于发明人的如下观察:将包括包含标记物蛋白(其为酶)的重组噬菌体的噬菌体储备物暴露于酶的底物会导致该酶(标记物蛋白)的催化失活。这样,存在于噬菌体储备物中的活性标记物蛋白的量降低,这在许多实施方式中会增加使用噬菌体储备物可达到的信噪比。这反过来增加使用该噬菌体储备物的方法的灵敏度和/或准确率。
在本文中所用的“催化失活”是指将包括为酶的标记物的噬菌体储备物暴露于实质上降低该标记物蛋白的催化活性的至少一种条件。关于这一点,实质上降低是指降低至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%。在一些实施方式中,暴露于实质上降低标记物蛋白的催化活性的至少一种条件导致少于约25%、少于约20%、少于约15%、少于约10%或少于约5%的噬菌体储备物的pfu/ml的降低。在一些实施方式中,暴露于催化失活的条件为持续约1小时至约24小时、约2小时至约12小时、约3小时至约12小时、约3小时至约6小时或约6小时至约24小时的时间。
在一些实施方式中,标记物蛋白是荧光素酶。在一些实施方式中,催化失活之后,噬菌体储备物中存在的相对光度单元(产生于污染性标记物荧光素酶蛋白)的水平为少于1x10-4、少于9x10-5、少于8x10-5、少于7x10-5、少于6x10-5、或少于5x10-5。
E.目标微生物
在本文中公开的重组噬菌体和在本文中公开的方法可用于感染和检测任何类型的古生菌和/或细菌。在一些实施方式中,古生菌是广古菌门(Euryarcheota)。在一些实施方式中,古生菌是泉古菌门(Crenarcheota)。在一些实施方式中,细菌是选自放线菌门、产水菌门、装甲菌门(Armatimonadetes)、拟杆菌门、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门、绿弯菌门、产金菌门、蓝藻菌门、脱铁杆菌门、异常球菌-栖热菌门、网团菌门、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门、螺旋体门、互养菌门(Synergistets)、柔膜菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门的门的成员。在一些实施方式中,细菌是选自芽孢杆菌属、李斯特菌属和葡萄球菌属的至少一种厚壁菌门的细菌。在一些实施方式中,细菌是选自Acidobacillus、气单胞菌属、伯克氏菌属、奈瑟菌属、希瓦氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、克吕沃氏菌属、摩根菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、柯克斯体属、立克次体属、军团杆菌属、禽杆菌属、嗜血杆菌属、巴氏杆菌属、不动杆菌属、莫拉菌属、假单胞菌属、弧菌属、黄单胞菌属的至少一种变形菌门。在一些实施方式中,目标细菌是选自支原体属、螺原体属和脲解支原体属的至少一种柔膜菌门。
可以使用本文公开的噬菌体和方法来检测的食品的常见细菌污染物包括但不限于沙门菌、大肠杆菌(包括但不限于病原性大肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、产生志贺毒素的大肠杆菌、大肠杆菌O26、O大肠杆菌111、大肠杆菌O103、大肠杆菌O121、大肠杆菌O45和大肠杆菌O145)、大肠型细菌(其包括但不限于柠檬酸菌属、肠杆菌属、哈夫尼亚菌属、克氏杆菌属、沙雷氏菌属)、志贺氏菌属、李斯特菌属(其包括但不限于单核细胞增多性李斯特菌)、梭菌属(其包括但不限于肉毒梭菌和产气荚膜梭菌)、弧菌属(其包括但不限于霍乱弧菌和创伤弧菌)、肠杆菌科、葡萄球菌属(其包括但不限于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)、芽孢杆菌属(其包括但不限于蜡样芽胞杆菌)、弯曲菌属(其包括但不限于空肠弯曲菌)、假单胞菌属、链球菌属、不动杆菌属、克雷伯氏菌属、弯曲菌属和耶尔森氏菌属。
常见的李斯特菌种包括但不仅限于无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)、威氏李斯特菌、付氏李斯特菌(Listeriafloridensis)、水生李斯特菌(Listeriaaquatic)、科氏李斯特菌(Listeriacornellensis)、沙燕属李斯特菌(Listeriariparia)和格兰德斯李斯特菌(Listeriagrandensis)。其中一些最近已经被描述(参见Bakkeretal.,Int.J.ofSystematicandEvolutionaryMicrobiology.2014.64:1-8.)。
F.检测可检测的标记物的方法
可以通过本领域已知的任何方法来检测由异源核酸序列编码的可检测的标记物。技术人员将理解,在许多实施方式中,可以使用尤其适用于所用的类型的标记物或所用种类的标记物的方法来检测可检测的标记物。例如,如果可检测的标记物是化学发光蛋白或荧光蛋白,例如标记物将通常通过测量在合适条件下由样本产生的光的量来检测。例如,如果可检测的标记物是荧光素酶,标记物通过在允许在由荧光素酶催化的反应中产生光的条件下对荧光素酶提供底物来检测。例如,由萤火虫荧光素酶催化的化学反应发生在两个步骤中:
1)荧光素+ATP→萤光素化腺苷酸+Ppi;以及
2)萤光素化腺苷酸+O2→氧化荧光素+AMP+光。
因为反应形成电子激发态的氧化荧光素而发光。随着氧化荧光素返回至基态,反应释放光的光子。步骤1由萤火虫荧光素酶催化。因此,如果可检测的标记物是萤火虫荧光素酶,标记物可以通过在允许在由荧光素酶催化的反应中产生光的条件下对荧光素酶提供荧光素底物来检测。
对于腔肠素(是其的衍生物)的化学反应如下进行。
1)腔肠素+O2→腔肠素-过氧化物
2)腔肠素-过氧化物→腔肠酰胺阴离子(coelenteramideanion)+CO2+光
因为腔肠素-过氧化物自动分解而发光。更具体地,二氧环丁酮四元环分开键,如同在甲壳虫荧光素酶的情形中一样。当能量水平迁移至基态时,腔肠酰胺的酰胺阴离子的激发态发光,导致发出450-470nm范围内的光,即在可见光谱中的蓝光。
在一些实施方式中,可检测的标记物可以使用并不尤其适用于所用类型的标记物的方法来检测。例如,由异源核酸序列编码的标记物可以通过用测量由细胞生产感兴趣的蛋白质的标准方法来测量标记物蛋白的产生来检测。例如,总蛋白或总蛋白的一部分可以从样本中回收,在聚丙烯酰胺胶上跑胶,将胶用考马斯染料染色,以显示出标记物蛋白的产生。在该方法的变体中,可以使用抗体通过蛋白质印迹法来分析胶,例如对于标记物蛋白特异性的抗体,以检测标记物的产生。
在一些实施方式中,可检测的标记物包括用于检测在样品中标记物的产生的标签。在一些实施方式中,该标签是用于在检测前纯化和/或浓缩在样本中产生的标记物的亲和标签。在一些实施方式中,所述标记物是6xHis标签。在一些实施方式中,所述标签是由抗体特异性识别的表位,其被用于在检测前纯化和/或浓缩在样本中产生的标记物,和/或被用于检测标记物。
在一些实施方式中,标记物通过包括直接观察目标微生物细胞的方法来检测。在本文中所用的“直接观察”是指包括识别作为标记物的产生的空间上的局部化来源(spatiallylocalizedsource)的至少一个细胞的方法。该方法的一个例子是使用重组溶原性噬菌体来将编码荧光标记物的异源核酸序列传递至目标微生物,然后使用显微镜来识别由于标记物蛋白的产生而在适宜的照明下发荧光的至少一个细胞。
在一些实施方式中,通过并不包括对目标微生物细胞直接观察的方法来检测标记物。这样的间接观察方法并不包括识别作为标记物产生的局部来源的至少一个细胞。相反,测量在样本中产生的标记物的量,以间接确定重组噬菌体已经感染过、并且正在产生由异源核酸序列编码的标记物的样本中存在的目标微生物的量。
当标记物是荧光素酶时,在一些实施方式中,分析样本以检测荧光素酶标记物的存在和/或不存在以确定目标微生物的存在和/或不存在包括将由目标微生物产生的标记物与荧光素酶底物结合。在一些实施方式中,荧光素酶底物选自荧光素或其衍生物,以及腔肠素或其衍生物。在一些实施方式中,腔肠素或其衍生物是在美国专利申请US2012/0174242A1第0157至0189段公开的分子。
可以在固体基质的存在下分析可检测的标记物的存在,或者可以在将小份所产生的标记物从暴露于噬菌体的收集装置和/或暴露于噬菌体的固体基质中分离之后分析可检测的标记物的存在。例如,如果固体基体表面(例如食品加工厂的排水管)与收集装置(例如3M海绵棒)接触;收集装置与能够感染目标微生物并包括编码标记物的异源核酸序列的重组噬菌体接触,以提供暴露于噬菌体的收集装置;并且对暴露于噬菌体的收集装置提供足够允许重组噬菌体感染与收集装置结合存在的目标微生物细胞、并且由目标微生物细胞产生由异源核酸序列编码的标记物的条件,结果是包括收集器以及进一步包括产生的标记物的溶液。可以在收集装置的存在下直接分析该溶液,或者可以移除并从收集装置分离小份,然后分析标记物的存在。技术人员将理解,基于本公开,可以实施这些程序的多种重排和变体。一般而言,可以对该分析使用阈值来检测可检测的标记物的存在,以确定样本对于可检测的标记物的存在(由此对于目标微生物的存在)是阳性还是阴性的。在一些实施方式中,该分析的LLOD通过(1)测量在一系列对照样本中存在的信号;以及(2)对平均测量的信号加上三个标准偏差来确定。如果在测试试验中检测到的信号是在LLOD处或之上,则将测试样本记为阳性的,如果不是,则将其记为阴性的。技术人员知晓在合适的环境中可以被替换的许多可替代的方法。
在一些实施方式中,以连续方式直接或间接地测定标记物的总量。如果在一段预定的时间内的任意时间标记物的总量达到阈值,则实验被记为阳性的。
G.工作流程
技术人员将理解,本公开的方法包括并能够实施用于检测微生物污染的多种不同工作流程。一个非限制性的实施例如下。
1.样本收集和制备
使用具有李氏肉汤SSL10LET(3M)的定制海绵棒(CustomSponge-Stick)收集固相样本。具有李氏肉汤的3M海绵棒是装运在无菌袋中的不含杀生物剂的纤维素海绵,并且用10mL李氏肉汤来水化。塑料把手使得用户不需直接触摸(并且有可能污染)海绵就可以收集环境样本,并使其更易于达到排水沟、管道和裂缝中收集样本。纤维素材料将微生物收集并保留在海绵基质中或海绵基质上。存在李氏肉汤来帮助中和清洁化学物质,例如季铵,并保持用于检测的生物体活性。
塑料把手带有拇指导轨,以告知用户应该避免接触该位点之外,以避免可能的污染。一旦已收集样本,将海绵返回袋子,折断塑料把手,使得袋子能够被密封且仅仅装有海绵在袋内。
根据制造商的说明,从储存袋中移除在李氏肉汤中的预湿润的3M海绵棒,涂抹4”X4”固体表面来进行收集。收集后,将海绵棒返回储存袋并关闭袋子。
收集一组样本之后,对每个收集的环境样本标注50mL锥形管。
为了制备噬菌体混合物(cocktail),加入预测量的小份的浓度为1x106至1x1011pfu/ml的至少一种重组噬菌体。在另一个实施方式中,所述至少一种重组噬菌体的浓度可以是1x107至1x108pfu/ml。在又一个实施方式中,所述至少一种重组噬菌体的浓度可以是1.5x107pfu/ml。在再一个实施方式中,三种不同的重组噬菌体各自的浓度可以是1.5x107pfu/ml。将预测量的重组噬菌体加入到海绵感染缓冲液(SIB)中。所述海绵感染缓冲液包括至少一种营养物、适用于抑制至少一种非目标微生物在所述环境样本中生长的至少一种筛选剂、至少一种维生素、至少一种二价金属、能够维持所述组合物在pH7.0-7.5的至少一种缓冲剂、适用于中和在所述环境样本中存在的消毒剂的至少一种试剂、以及用于防止荧光素分解的至少一种试剂。
所述海绵感染缓冲液可以包括半强度脑心浸液(BHI)培养基(18.5g/LDifcoBHI培养基),其添加有5%重量/体积葡萄糖、1%体积/体积甘油、1%重量/体积LiCl和0.002%重量/体积萘啶酸。该添加物的组合促进了李斯特菌属的回收,以及在感染过程期间竞争者微生物的生长抑制。
在一个可替代的实施方式中,所述缓冲液可以包括表1的组分。
表1
海绵感染缓冲液的组分在第一栏中显示,这些组分所属类别在第二栏中显示,这些组分在海绵感染中的作用的简单描述在第三栏中显示。应理解,该缓冲液的组分中的一部分可以分入多个组中。例如,HEPES缓冲液可用作缓冲剂或者用作用于防止荧光素分解的试剂。此外,中和剂可用于中和可能存在于用于收集环境样本的目标区域中的化学物质或者消毒剂,并且这些组分可进一步用于防止荧光素分解。
2.样本感染:
为了任选地允许独立证实假定的阳性样本,任选地从样本回收李氏肉汤。以某个角度拿着袋子,挤压海绵以去除所有液体,小心不要让液体重新吸收到海绵中。打开袋子,用移液吸管将液体转移到相应的预先标记好的50mL锥形瓶中。
加入具有添加的终浓度为1.5x107pfu/ml的重组噬菌体的6mL海绵感染缓冲液。应理解,在试验中可以使用超过一种的重组噬菌体。例如,可以使用三种重组噬菌体,每种重组噬菌体的浓度为1.5x107pfu/ml。
通过轻轻挤压来按摩海绵约15次,以将SIB平衡入海绵,小心不要让液体起泡。完成所述按摩后,使所有液体重新吸收到海绵中。
通过使用与上面概述的样品处理方法相同的方法来处理2个无菌3M海绵棒来制备2个阴性海绵。
将所有海绵放在30℃下。
3.样本特异性阴性
为了任选地允许校正本试验中存在的非特异性背景,30分钟后从每次感染中任选地收集样本。
从30℃培养箱拿走海绵,通过轻轻挤压来按摩海绵约15次,小心不要让液体起泡。
将所有液体从海绵挤出进入袋子中,小心地使海绵被夹持在袋中,但是要远离液体,以避免被海绵重新吸收。
将300uL转移到无菌微量离心管,并将该微量离心管放在4℃下。
为了将阴性样标准化,并说明在信号方面海绵-对-海绵的变化性,从2个阴性海绵中的每一个添加150uL到四个微量离心管中的每个管中。
重新关闭袋子,通过轻轻挤压来按摩约15秒,小心不要让液体起泡。
让液体重新吸收到海绵中。
将海绵放回30℃下。
4.时间点读取
按照制造商的说明,通过混合NanoGlo缓冲液和NanoGlo底物来重建NanoGlo试剂。
培养4小时后,将样本从培养箱取走,按摩海绵约15秒。应理解,在本方法的一些实施方式中,可以改变培养时间,以使得从使样本接触重组噬菌体到检测目标微生物的存在或不存在的时间可在1分钟至6小时之间。在一些实施方式中,该时间可以为4小时或更少。在一些实施方式中,该时间可以为数小时或更少。
将所有液体从海绵挤出进入袋子中,小心地使海绵被夹持在袋中,但是要远离液体,以避免被海绵重新吸收。
将300uL转移到无菌微量离心管。
在16100rcf下旋转微量离心管1分钟。
将上清液转移到干净的低能光子微量离心管中。
在SiriusL中读取被转移的样本32秒,10秒后注射300uLNanoGlo试剂(Promega商品目录#N1130或N1150)。
为了将阴性样标准化,并说明在信号方面海绵-对-海绵的变化性,从2个阴性海绵中的每一个添加150uL到四个微量离心管中的每个管中。
5.在4小时时的样本特异性阴性样读取
从4℃下移走微量离心管。
在16100rcf下旋转1分钟。
将上清液转移到干净的低光子微量离心管中。
与4小时培养样本相同地读取样本。
在实施例中提供了额外的示例性的且是非限制性的工作流程。
H.目标细胞扩增
确定在样本中目标微生物存在和/或不存在的方法通常需要通过将样本暴露于细胞生长条件下以扩增在阳性样本中存在的目标细胞的数量,以使目标细胞在样本中富集的步骤。该扩增步骤在实施检测方法之前进行,或者其本身就是检测方法整体的一部分。在一个实例中,使用微生物特异性的富集培养基实施选择性扩增。这种培养基使得要富集的微生物的生长成为必要,其通常比传统的培养肉汤更长。富集肉汤包括对目标微生物的生长有益的化合物,以及对于对目标微生物生长、或者下游试验步骤不利的其他微生物的抑制性化合物。连续富集在不同选择性培养基上的目标微生物是检测目标微生物存在的方法。例如在对于食物样本或食物生产环境或制药环境的领域中的已知的方法可以在USDA微生物实验指南(USDAMicrobialLaboratoryGuide,USDA-MLG)或者FDA细菌学检测方法手册(FDABacteriologicalAssayMethodsvolume,FDA-BAM)中找到。这些方法花费多天时间来达到可以以高可信度识别目标微生物的结果。其他方法使用分子技术例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、侧向流试验格式(lateralflowassayformats)、或基于PCR的检测方法。一种基于ELISA侧向流的方法例如是Biomerieux’试验。在该工作流程中,将样品在特异性富集培养基中富集24-48小时,然后将其特异性地处理,随后用热处理和自动ELISA侧向流工作流程进一步处理。至产生富集后的时间为90-120分钟。基于PCR的方法着重于扩增来自目标微生物的识别序列。一个实验是DuPont的系统。在该工作流程中,在特异性富集培养基中富集样本24-28小时,然后将其特异性处理,随后进一步处理,萃取核酸并人工处理样本。
本发明公开的方法可以包括目标细胞扩增步骤。但是,在一些实施方式中,本公开的方法并不包括目标细胞扩增。出乎意料的是,发明人发现在一些实施方式中,可以实现检测下限低至100个细胞、10个细胞、或者甚至单个细胞,在某些实施方式中无需扩增。在某些实施方式中,该特征使得本公开的方法能够提供比包括扩增目标细胞的现有技术方法更快的结果。
在一些实施方式中,检测暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,来确定目标微生物存在或不存在具有在使环境样本接触重组噬菌体30分钟之后的100个目标微生物细胞的检测下限。在一些实施方式中,检测暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,来确定目标微生物存在或不存在具有在使环境样本接触重组噬菌体60分钟之后检测到10个目标微生物细胞的检测下限。在一些实施方式中,检测暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,来确定目标微生物存在或不存在包括在使环境样本接触重组噬菌体180分钟之后检测到单个目标微生物细胞的检测下限。
尽管本发明公开的方法和重组噬菌体一般使得目标微生物扩增在许多情况下是非必要的,但是在一些实施方式中,本公开的方法包括在样本中扩增目标细胞。与经没有扩增步骤完成的可比较的试验相比,扩增通常将增加试验的敏感度。目前相信在本公开的方法的一些实施方式中,扩增来自来源的样本使得能够以比不包括扩增目标细胞的类似方法所实现的检测下限更低的检测下限检测微生物细胞。在扩增过程中,单个细胞可能至少分裂一次,使得在试验过程期间,被噬菌体感染的细胞的数量比在不包括扩增目标细胞的类似试验过程期间被噬菌体感染的细胞的数量多。在一些实施方式中,扩增持续10分钟至12小时的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续30分钟至8小时的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续1小时至8小时的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续2小时至6小时的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少1次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少2次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少3次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少4次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少5次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少10次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少1-10次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少2-8次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均至少3-6次的时间期间。在一些实施方式中,扩增持续足以使得样本中存在的任何活的目标微生物细胞分裂平均约1次、约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次或约10次的时间期间。
在一些实施方式中,样本分为至少两个部分:第一部分直接用于本公开的基于噬菌体的目标微生物检测试验;第二部分被保留用于选自于验证基于噬菌体的目标微生物检测试验和不同试验的一种或多种用途。在一些实施方式中,在分离这些部分之前扩增样本,而在另一些实施方式中则并不这样。这些部分中的一个或多个也可以在分开之后进行扩增。
I.不经细胞增殖的检测
当噬菌体感染目标微生物细胞时,它们快速指派宿主细胞的新陈代谢机构来生产噬菌体蛋白,如果噬菌体是溶菌性的,宿主细胞会很快被溶解。因此,噬菌体感染样本中的微生物目标细胞具有停止在样本中的目标细胞增殖的效果,并最终导致样本中的所有目标细胞的溶解。因此,在本方法的一些实施方式中,试验中所用的噬菌体的浓度足够高,以实质上停止样本中所有宿主细胞增殖。在该上下文中,“实质上停止”是指将样本与噬菌体接触之后,样本中没有宿主细胞完成超过一轮完整的细胞分裂周期。本领域技术人员通常识别感染的多重性或MOI作为被感染性单元(infectiousunit)感染的种群的比例的衡量标准。这是一个统计方法,通常被理解为按照泊松分布建模,即MOI为3表示种群的95%被至少一个感染性单元感染,而MOI为8表示种群的100%被感染。
该实施方式的一个优势为试验的操作和处理以及对在其中进行实验的容器的处理是安全的,以及不太可能导致由目标微生物产生的污染。这可能在例如医疗诊断和食物污染检验的情况下是有用的,这些情况中必要的是微生物污染物不被传播。这也增加了该试验的使用者的安全性。
J.表征细菌污染
本发明公开的试验的高敏感度和快速使得比较多个样本中的细菌污染的方法具有很高的准确率。因此,本公开还提供了在多种固体基质中比较细菌污染的方法和/或比较在一段时间内一种或多种固体基质中的细菌污染的方法。
在一些实施方式中,多种固体基质中的至少两种被确定包括不同数量的目标微生物细胞。该信息可用于表征被目标微生物污染的传播的至少一个特征。
在一些实施方式中,多个样本中的至少两个被确定包括大概相同数量的目标微生物细胞。该信息可用于表征被目标微生物污染的传播的至少一个特征。
在一些实施方式中,多种固体基质包括在不同时间点从相同来源收集的样本。如果在时间T1分析的固体基质显示出被目标微生物污染的第一水平,在时间T2随后分析的相同的固体基质显示出在样本中被目标微生物污染的更高水平,这表示在T1至T2的间隔期间固体基质的被目标微生物污染的水平增加。或者,如果在时间T1分析的固体基质显示出被目标微生物污染的第一水平,在时间T2随后分析的相同的固体基质显示出在样本中被目标微生物污染的更低水平,这表示在T1至T2间隔期间固体基质被目标微生物污染的水平降低。因此,本公开还提供了比较在一段时间内固体基质被目标微生物污染的水平的变化的方法。
在一些实施方式中,多个样本包括从不同固体基质来源收集的样本。如果从来源S1收集的样本显示出在样本中被目标微生物污染的第一水平,从来源S2收集的样本显示出在样本中被目标微生物污染的更高水平,这表示被来源S2的目标微生物污染的水平比被来源S1的目标微生物污染的水平更高。因此,本公开还提供了比较不同来源的被目标微生物污染的水平的方法。
在一些实施方式中,多个样本包括在不同时间点从至少一个来源收集的样本,还包括从不同来源收集的多个样本。从不同来源收集的多个样本可以包括在相同和/或不同时间点收集的样本。
在本方法的一些实施方式中,不同数量的目标微生物细胞被确定为存在于至少两个样本中,该差别被用于表征被目标微生物进行的污染的传播的至少一个特征。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的时间进程。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的空间分布。
在本方法的一些实施方式中,不同数量的目标微生物细胞被确定为存在于至少两个样本中,该差别被用于监控被目标微生物进行的污染的修复。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的时间进程。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的空间分布。
在一些实施方式中,大概相同数量的目标微生物细胞被确定为存在于至少两个样本中,该特征被用于表征被目标微生物进行的污染的传播的至少一个特征。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的时间进程。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的空间分布。
在一些实施方式中,大概相同数量的目标微生物细胞被确定为存在于至少两个样本中,该特征被用于监控被目标微生物进行的污染的修复。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的时间进程。在一些实施方式中,所述至少一个特征为污染的空间分布。
本公开的重组噬菌体可用于检测细菌的存在。目标细菌的检测是基于重组噬菌体结合目标细菌,将噬菌体基因组转移到目标细菌中,并由细菌表达编码标记物的异源核酸序列的能力。因此,使用包括编码标记物的异源核酸序列的重组噬菌体来检测目标细菌的方法的特异性是基于在暴露于噬菌体之后,支持标记物的表达的细菌类型的范围。有时,在暴露于噬菌体之后支持标记物的表达的细菌类型的范围在本文中被称为噬菌体的“宿主范围”。构成噬菌体的宿主范围的这组细菌类型有时在本文中被称为对于的“目标细菌”。
K.被引入感染有重组噬菌体的目标微生物中的异源标记物核酸序列的扩增
在本公开的方法中,如果目标微生物存在于样本中,则将暴露于噬菌体的样本保持在允许重组噬菌体感染样本中的目标微生物细胞,并允许由对目标微生物是内源性的或者由重组噬菌体基因组编码的至少一种核酸聚合酶扩增异源标记物核酸序列的感染条件下,导致在样本中产生异源标记物核酸序列的复制。在该阶段,包括被扩增的异源标记物核酸序列的样本还包括其他组分的复杂混合物,包括目标细胞残骸和组分以及重组噬菌体组分。通常在该阶段处理该样本,以降低至少一种这些其他组分的浓度和/或增加被扩增的异源标记物核酸序列的浓度。
样本处理可以包括目标捕获以特异性或非特异性地从其他样本组分中分离被扩增的异源标记物核酸序列的步骤。非特异性的目标制备方法可以从实质上含水混合物中选择性地沉淀核酸,将核酸附着在支持物上,该支持物被洗涤以去除其他样本组分,或者使用其他方法从包含其他组分的混合物中物理分离核酸,包括STEC核酸。其他非特异性目标制备方法可从样本中的DNA选择性地分离RNA。
L.使用重组聚合酶扩增异源标记物核酸序列
核酸扩增的许多已熟知的方法要求用以使双链核酸交替变性和杂交引物的热循环;但是,核酸扩增的其他已熟知的方法是等温的。示例性的扩增方法包括聚合酶链式反应(“PCR”)、连接酶链式反应(“LCR”)、链置换扩增(“SDA”)、基于核酸序列的扩增(“NASBA”)、自我持续序列复制以及转录介导的扩增(“TMA”)。
考虑本公开,技术人员可以很容易确定适宜的扩增条件。如本文公开的扩增条件是指允许核酸扩增的条件。在一些实施方式中,扩增条件可以比本文所述的“严格的杂交条件”较不严格。“严格的杂交条件”是指其中特异性检测探针能够越过在测试样本中存在的其他核酸与目标核酸杂交的杂交试验条件。将被理解的是,这些条件可以基于包括GC含量和探针长度、杂交温度、杂交试剂或溶液的组成、和所追求的杂交特异性的程度的因素而变化。
本文所公开的在扩增反应中所用的寡核苷酸可以对于其预期目标是特异性的,并在扩增条件下与其预期目标杂交,但是在某些实施方式中,在更加严格的杂交条件下可能杂交或不杂交。另一方面,检测探针通常在严格杂交条件下杂交。
在一些实施方式中,异源标记物核酸序列还可通过基于转录的扩增技术进行扩增。如上所讨论的,一种基于转录的扩增系统是转录介导的扩增(TMA),其利用RNA聚合酶生产目标区域的多个RNA转录子。示例性的TMA扩增方法在例如美国专利IMos.4868105、5124246、5130238、5399491、5437990、5480784、5554516和7374885;以及PCT公布文本WO88/01302、WO88/10315和WO95/03430中描述。
本公开的方法可包括涉及单引物TMA反应的使用的TMA反应,如在美国专利7374885中所述。通常,单引物TMA方法使用引物寡聚物(例如NT7引物)、被修饰以防止从DNA的3’末端合成DNA的启动(例如通过包括3’-阻碍部分)的被修饰的基于启动子的寡聚物(或“启动子提供者寡聚物”;例如T7提供者)、以及任选的用于终止cDNA从目标链的延伸的阻碍子寡聚物(blockeroligomer)(例如阻碍子)。基于启动子的寡聚物提供被RNA聚合酶识别的寡核苷酸序列。该单引物TMA方法合成目标序列的多重复制,包括用引发寡聚物和结合分子来处理包含目标序列的目标RNA的步骤,其中引物与目标链的3’末端杂交。RT启动从引物的3’末端的引物延伸,以生产cDNA,其是具有目标链的双链(例如RNAxDNA)。当在反应中使用阻碍子寡聚物时,其与邻近目标序列的用户指定的5’末端的目标核酸结合。当引物通过RT的DNA聚合酶活性来延伸以生产cDNA时,cDNA的3’末端通过阻碍子寡聚物的位置来确定,因为当引物延伸产物达到结合于目标链的结合分子时,聚合反应停止。因此,cDNA的3’末端与目标序列的5’末端互补。当RNase(例如RT的RNaseH)使RNA链降解时,RNAxDNA双链分离,尽管本领域技术人员将理解可以使用任何形式的链分离。然后,启动子提供者寡聚物与接近cDNA链的3’末端的cDNA杂交。
启动子提供者寡聚物包括对于RNA聚合酶的5’启动子序列,以及与cDNA的3’区域中的序列互补的3’目标杂交区域。启动子提供者寡聚物还具有包括防止从启动子提供者寡聚物的3’末端开始DNA合成的阻碍部分的修饰过的3’末端。在启动子提供者xDNA双链中,cDNA的3’末端被RT的DNA聚合酶活性延伸,其使用启动子寡聚物作为模板,以向cDNA添加启动子序列,并创造出功能性双链启动子。
随后,对启动子序列特异性的RNA聚合酶结合功能性启动子,并转录与cDNA互补、并且与从初始目标链扩增的目标区域序列基本相同的多个RNA转录子。得到的被扩增的RNA随后可再通过结合引物并作为进一步的cDNA生产的模板,最终从样本中存在的初始目标核酸生产许多扩增子的方法来循环。结合单引物转录的扩增方法的一些实施方式并不包括阻碍性寡聚物,因此从引物制得的cDNA产物具有不确定的3’末端,但是扩增步骤实质上如上面针对所有其他步骤所描述的进行。
本公开的方法也可以利用反转录介导的扩增(RTMA),其许多方面在例如美国专利申请公开US2006-0046265Al中公开。RTMA是使用两种酶来驱动反应的RNA转录介导的扩增系统:RNA聚合酶和反转录酶。RTMA是等温的;整个反应在相同温度下在水浴或加热块中实施。这与需要温度循环仪器来快速改变温度以驱动反应的其他扩增反应(例如PCR)形成对比。
RTMA可以扩增DNA或RNA,并可以生产DNA或RNA扩增子,这与仅生产DNA的大部分其他核酸扩增方法形成对比。RTMA具有非常快的动力学,在15-60分钟内产生十亿倍扩增。RTMA可以与杂交保护试验(HPA)结合,后者使用标记有发射化学发光信号的吖啶酯检测物分子的特异性寡核苷酸探针,用于端点检测或与分子火炬(moleculartorches)一起用于实时检测。不存在洗涤步骤,不曾有扩增子被转移到管外,这简化了步骤,并且降低了污染的可能性。因此,RTMA的优势包括多个目标的扩增,结果可以是定性的或定量的,无需转移和洗涤步骤,以及使用分子火炬检测可以是实时的。
作为阐释性的实施方式,RTMA反应通过用被标记的扩增寡聚物和任选地阻碍寡聚物两者处理核酸样本中的RNA目标序列来启动。被标记的扩增寡聚物包括与目标序列的3’末端杂交的目标杂交区域和位于目标杂交区域的5’端的标记区域。阻碍寡聚物与在目标序列的5’端附近包括目标序列的目标核酸杂交。因此,在启动引物延伸反应之前,目标核酸与目标序列的3’端的被标记的扩增寡聚物、和位于目标序列的被确定的5’端旁边或附近的终止寡核苷酸形成稳定的复合体。
然后,在用被标记的引物寡核苷酸启动引物延伸反应之前,使未杂交的被标记的扩增寡聚物对于与目标序列杂交是不可利用的,优选通过灭活和/或从核酸样本中除去未杂交的被标记的引发寡核苷酸。已被灭活或从体系中去除的未杂交的被标记的扩增寡聚物随后对于与污染性核酸的不期望的杂交是不可利用的。在从反应混合物中除去未杂交的被标记的扩增寡聚物的一个实施方式中,将被标记的扩增寡核苷酸与目标核酸杂交,然后使用洗脱步骤,将被标记的扩增寡聚物目标核酸复合体从未杂交的被标记的扩增寡聚物中除去。在该实施例中,被标记的扩增寡聚物核酸复合体可进一步与目标捕获寡聚物和固体支撑物复合。在将未杂交的被标记的扩增寡聚物灭活的一个实施例中,被标记的扩增寡聚物进一步包括目标关闭区域。在该实施例中,被标记的扩增寡聚物的目标杂交区域在第一组条件(例如严格条件)下与目标核酸杂交。在形成被标记的扩增寡聚物核酸复合体之后,将未杂交的被标记的扩增寡聚物在第二组条件下灭活,由此将目标关闭区域与未杂交的被标记的扩增寡聚物的目标杂交区域杂交。然后,失活的被标记的扩增寡聚物对于与污染性核酸杂交是不可利用的。还可以包括洗涤步骤来从试验中除去失活的被标记的扩增寡聚物。
然后,用DNA聚合酶、例如反转录酶从被标记的扩增寡聚物的3’末端开始延伸反应,以生产包括标记序列的初始扩增产物。随后,使用选择性地降解目标序列的酶(例如RNAseH活性)将该初始扩增产物从目标序列分离。接着,用具有目标杂交区域和位于目标杂交区域的5’端的RNA聚合酶启动子区域的基于启动子的寡聚物来处理初始扩增产物,由此形成基于启动子的寡聚物:初始扩增产物杂交物。可以修饰基于启动子的寡聚物来阻止DNA合成的开始,优选通过使阻碍部分位于基于启动子的寡聚物的3’末端(例如具有3’至5’方向的核苷酸序列)来修饰。然后延伸初始扩增产物的3’末端,以增加与启动子互补的序列,导致双链启动子序列的形成。之后,使用RNA聚合酶(其识别双链启动子并从中启动转录)将与初始扩增产物的至少一部分互补的RNA产物的多个拷贝进行转录。结果,RNA产物的核苷酸序列与目标核酸的核苷酸序列以及与标签序列的核苷酸序列的互补序列实质上相同。
然后,可以用标签靶向的寡聚物处理RNA产物,其与标签序列的互补序列杂交来形成标签靶向的寡聚物:RNA产物杂交物,用DNA聚合酶延伸标签靶向的寡聚物的3’末端来产生与RNA产物互补的扩增产物。然后,用选择性地降解第一RNA产物的酶(例如RNAseH活性)将该扩增产物的DNA链从该扩增产物的RNA链分离。用基于启动子的寡聚物处理扩增产物的DNA链,所述基于启动子的寡聚物与第二DNA引物延伸产物的3’末端杂交来形成基于启动子的寡聚物扩增产物杂交物。基于启动子的寡聚物:扩增产物杂交物随后重新进入扩增周期,其中转录从双链启动子被启动,然后该周期继续进行,由此提供目标序列的扩增产物。
然后,可以在随后的试验中使用扩增产物。一个随后的试验包括核酸检测,优选基于核酸探针的核酸检测。检测步骤可以使用用于检测与被扩增的目标序列特异相关的信号的多种已知方法中的任意方法来实施,例如通过将扩增产物与被标记的探针杂交,并检测由被标记的探针产生的信号。检测步骤还可提供关于被扩增的序列的额外信息,例如其核酸碱基序列的所有或者部分。
检测可以在扩增反应完成之后进行,或者可以与扩增目标区域同时进行,即实时进行。在一个实施方式中,检测步骤允许杂交探针的检测而无需从混合物中除去未杂交的探针(参见例如美国专利5639604和5283174)。
在某些实施方式中,本文所公开的扩增方法还运用了能有效改善扩增反应的敏感度、选择性、效率等的一种或多种其他类型的寡核苷酸的使用。
M.目标捕获
在一些实施方式中,在扩增核酸之前从样本纯化或富集异源标记物核酸序列。一般而言,目标捕获是指将目标多核苷酸捕获至固体支持物上,例如磁吸引颗粒(magneticallyattractableparticles),其中,固体支持物在目标多核苷酸纯化过程的一个或多个洗涤步骤期间保留目标多核苷酸。这样,在后续核酸扩增步骤之前,目标多核苷酸被实质上纯化了。多种目标捕获方法在本领域中已知,并适合结合本发明所述的方法来使用。例如,可以使用任何支持物,例如溶液中游离的基质或颗粒,其可以由多种材料中的任意材料制得,例如尼龙、硝酸纤维素、玻璃、聚丙烯酸酯、混合的聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯硅烷或金属。
阐释性的实施例使用磁吸引颗粒作为支持物,例如单分散的顺磁珠,固定探针直接(例如通过共价连接、螯合或离子相互作用)或间接(例如通过连接物)结合于该顺磁珠,其中该连接在核酸杂交条件期间是稳定的。简言之,只要对于扩增前纯化感兴趣的目标核酸序列是有效的,实质上对于本领域技术人员可获得的任何技术都可以使用。
N.异源标记物核酸序列的检测
用于检测核酸杂交的任何标记系统或检测系统或这两者可以用于检测异源标记物核酸序列,包括扩增的异源标记物核酸序列。这样的系统在本领域是熟知的。
检测系统通常使用一种类型或另一种类型的检测寡核苷酸来促进检测感兴趣的目标核酸。检测可以是直接的(即探针直接与目标杂交)或间接的(即探针与将探针连接于目标的中间结构杂交)。探针的目标序列通常是指在较大序列中的特定序列,探针特异性地与该特定序列杂交。基于目标序列是否存在,检测探针可包括目标特异性序列和对探针的三维结构作出贡献的其他序列或结构。
可以用于监测特异性核酸杂交的大量已熟知的标记和检测系统中的基本上任意一种可结合本公开的方法使用。包括在有用的标记的集合中的有荧光部分(单独或者与“淬灭”部分一起)、化学发光分子、和服从电子检测方法的氧化还原活性部分。在一些实施方式中,优选的荧光标记包括非共价结合标记(例如嵌入染料),例如溴化乙锭、溴化丙锭、色霉素、吖啶橙等。
在一些应用中,显示出至少一些程度的自身互补性的探针是需要的,以促进检测测试样本中的探针:目标双链,无需在检测前首先去除未杂交的探针。通过举例的方式,设计被称为“分子火炬”和“分子信标”的结构包括自身互补的不同区域和目标互补的区域。分子火炬在美国专利6849412、6835542、6534274、和6361945中充分描述,分子信标在美国专利5118801、5312728、和5925517中充分描述。
将标记连接于核酸以及检测标记的合成技术和方法在本领域中是已熟知的。
虽然本发明已根据其具体实施方式被描述,本领域技术人员应理解可以进行多种改变,可用等价物替换,而不偏离本发明的真正精神和范围。此外,可以进行许多改进来使具体环境、材料、物质的组成、方法、方法步骤或步骤适用于本发明的目的、精神和范围。所有这样的改进都意在包括于本文随附的权利要求的范围内。
实施例
下列实施例用于更加充分地描述制备和使用本文公开的发明的具体实施方式的方式。这些实施例被呈现用于阐释性目的,不应作为对本文公开的发明的真实范围的限定。
实施例1:重组李斯特菌噬菌体
研发了一种新型的噬菌体工程方法来产生重组噬菌体。该方法在本文有时被称为噬菌体感染工程(PIE)。该方法允许将异源核酸序列插入噬菌体基因组的任何所需位置。对于插入所选的起始位点是在Loessner,etal.(Appl.EnvironMicrobiol.,62:1133–1140)中所用的位点,其在主要衣壳蛋白基因cps的下游。萤火虫荧光素酶(SEQIDNO:2)的编码序列(SEQIDNO:1)或nanoluc荧光素酶(SEQIDNO:4)的编码序列(SEQIDNO:3)被插入在该位置。
PIE方法使用噬菌体靶向载体PTV,其包括侧翼为所需的插入位点(称为上游同源区域(UHR)和下游同源区域(DHR))的直接上游和下游的大约1KB的噬菌体序列的荧光素酶基因序列。这些插入中的每一种都是用会扩增所需扩增子的PCR引物来创造的,但是加了20bp的同源来促进组装。使用GeneArt无缝组装试剂盒(LifeTechnologies)来组装质粒。将三个插入(UHR、luc、DHR)组装到革兰氏阳性/革兰氏阴性穿梭载体pMK4中,其被SmaI和PstI(NEB)限制性酶切。
A511噬菌体基因组序列可以在Genbank(NC_009811)获得。A511噬菌体可以从ATCC(PTA-4608TM)获得。
使用PIE方法将萤火虫荧光素酶基因(SEQIDNO:1)直接插入到A511的cps基因的终止密码子之后,在基因组序列的碱基46695和46696之间。没有从噬菌体基因组缺失任何序列。包括核糖体结合位点的16bp序列(GAGGAGGTAAATATAT)(SEQIDNO:36)被放在萤火虫荧光素酶基因的起始密码子(ATG)之前。
为了设计噬菌体A511,使用寡聚核苷酸“pMAKupf”和“pMAKupr”扩增cps基因的1276个碱基,形成片段“A511UHR”。使用引物“pMAKlucf”和“pMAKlucr”扩增荧光素酶基因,形成片段“A511luc”。引物“pMAKlucf”还在荧光素酶基因的上游加入核糖体结合位点(Shine-Dalgarno)。使用“pMAKdnf”和“pMAKdnr”扩增紧挨着cps终止密码子之后的1140bp,被称为“A511DHR”。
根据制备商的说明,使用GeneArt无缝组装试剂盒将这3个扩增子重新结合到被SmaI/PstI限制性酶切pMK4中其。一旦质粒在大肠杆菌中被分离,对其进行测序来验证正确的扩增和组装。一经验证,将质粒转化到单核细胞增多性李斯特菌菌株EGD-e,并在BHI-氯霉素(10μg/ml)琼脂板上选择。
一旦PTV成功转化到EGD-e中,则进行初始重组:将包括A511::FFPTV的EGD-e过夜培养物1:100稀释,使其生长至OD600为0.1。然后将该培养物稀释回OD600为0.02,用2ml体积的1x105pfu/ml的野生型A511噬菌体混合。在30℃下培养该感染,在50rpm下过夜摇晃。
为了评估是否已发生重组,第二天检测感染。首先,用氯仿混合裂解物以杀死任何留下的细胞,并摧毁由PTV制得的背景荧光素酶。噬菌体对氯仿具有抗性,这是细菌噬菌体中的常见特征。往裂解物中加入4%v/v的CHCl3,涡旋震动,减慢旋转,回收上清液。进行测试感染,加入1:10稀释的EGD-e的过夜培养物,与重组裂解物混合(90μl细胞稀释,10μl噬菌体裂解物)。设置了没有细胞的对照感染。将该感染物在30℃下静止培养3小时,然后在Glomax20/20上测试发光。将20μl感染物与100μlPromega荧光酶实验试剂(20μl裂解物和20μl用于NanoLuc噬菌体的NanoGlo),然后使用10秒整合来读数(对于NanoGlo是1s)。重组体裂解物产生光,表明在裂解物中存在重组噬菌体。
为了富集和分离重组噬菌体,需要将其从重组体裂解物中存在的野生型噬菌体中分离出来。使用连续几轮的稀释和分离。用投入噬菌体的10倍稀释制备裂解物,并通过测试裂解物的荧光素酶活性来筛选重组噬菌体的存在。
预计重组效率为1:1x105至1:1x106。为了分离纯的重组体裂解物,将在(Appl.EnvironMicrobiol.62:1133–1140)中所述的方法进行了如下修改。滴定初始重组体裂解物。设置20个1ml裂解物,每个具有1x106、1x105和1x104pfu/ml的重组体裂解物:1mlEGD-eOD0.02,1x10x噬菌体;O/N,30℃,50rpm。第二天,如上所述,对每个裂解物进行CHCl3处理。用裂解物设置上述感染。在Glomax20/20上测试每个裂解物(20μl感染、100μl用于FF的试剂、20μl感染、20μl用于nluc的NanoGlo)。目标是,定位用最少数量的在感染时表现出发光的噬菌体制得的裂解物。一旦识别了该裂解物,对其进行滴定,并用其设置1x103、1x102和1x101pfu/ml的裂解物。一旦分离了以1x102噬菌体制得的发光裂解物,将该溶菌产物涂板以获得单个噬菌斑。挑选噬菌斑放入SM缓冲液中。该“浸泡物(soakates)”在dH2O中1:10稀释,并用“DBONO360”和“DBONO361”通过PCR测验,以探索荧光素酶基因和噬菌体序列之间的重组连接的存在。
P100噬菌体基因组序列可以在Genbank(DQ004855)中获得。P100可以从ATCC(PTA-4383TM)获得。
P100的荧光素酶插入位点也在相同的cps基因的下游。P100中萤火虫荧光素酶插入的位置在P100基因组序列的碱基13196和13197之间。
以与A511相同的方式对P100进行改造,不同之处在于如下所述:用引物“pMAKdnf”和“pMAKdnrP100”扩增“P100DHR”片段。通过将噬菌斑挑进100μlSM缓冲液中来识别单个重组噬菌斑。将10μl的该浸泡物与50μl的荧光素混合,在光度计上看到发光。识别阳性的该方法在后续重组噬菌体分离中被利用。
使用对于A511::ffluc所述的萤火虫荧光素酶基因和方法来改造下列噬菌体:LP48、LP124、LP125、LP99、LP101和LP143。
使用NanoLuc基因来改造下列噬菌体:A511、P100、LP40、LP124和LP125。
通过扩增下列PCR片段来构建A511::nluc的PTV:使用A511裂解物作为模板,用寡核苷酸pMAKupf和DBONO356产生UHR片段;用寡核苷酸DBONO359和pMAKdnr扩增DHR片段。使用Promega质粒pNL1.1作为模板,用寡核苷酸DBONO357和DBONO358扩增NanoLuc片段。组装和后续PIE方法与所述方法类似。
对于P100::nluc的PTV和改造以与A511::nluc相同的方式实施,不同之处在于,DHR片段使用寡核苷酸pMAKdnrP100而非pMAKdnr来扩增。
LP124、LP125和LP40的PTV以与A511::nluc相同的方式构建,但具有下列改变。使用寡核苷酸DBONO359和DBONO382来扩增的DHR片段较短,以允许质粒更有效地组装。并且,通过在这些噬菌体的cps基因的直接下游加上两个额外的终止密码子(TAATAA)来修改插入位点。通过创造额外的引物DBONO379和DBONO380来加上这六个碱基。这些噬菌体的UHR片段用寡核苷酸pMAKupf和DBONO380来扩增。NanoLuc片段用寡核苷酸DBONO379和DBONO358来扩增。
在PIE方法中使用下列寡核苷酸:
pMAKupf:TTACGCCAAGCTTGGCTGCAACGTGAGTTCCTAGACGACC(SEQIDNO:37)
pMAKupr:ATGTTTTTGGCGTCTTCCATATATATTTACCTCCTCTTAGTTGCTATGAACGTTTT(SEQIDNO:38)
pMAKlucf:AAAACGTTCATAGCAACTAAGAGGAGGTAAATATATATGGAAGACGCCAAAAACAT(SEQIDNO:39)
pMAKlucr:ATTCAATTATCCTATAATTATTACAATTTGGACTTTCCGC(SEQIDNO:40)
pMAKdnf:GCGGAAAGTCCAAATTGTAATAATTATAGGATAATTGAAT(SEQIDNO:41)
pMAKdnr:ACGACGGCCAGTGAATTCCCAGTTACTAACTGCTCTAATG(SEQIDNO:42)
pMAKdnrP100:ACGACGGCCAGTGAATTCCCAGTTACTAACTGTTCTAATG(SEQIDNO:43)
DBONO360:CCTCTAGCTCAAATTAACGCATCTGT(SEQIDNO:44)
DBONO361:TGGCTCTACATGCTTAGGGTTCC(SEQIDNO:45)
DBONO356:TCTTCGAGTGTGAAGACCATATATATTTACCTCCTCTTAGTTGC(SEQIDNO:46)
DBONO357:CTAAGAGGAGGTAAATATATATGGTCTTCACACTCGAAGATTT(SEQIDNO:47)
DBONO358:ATTCAATTATCCTATAATTATTACGCCAGAATGCGTTCGC(SEQIDNO:48)
DBONO359:GCGAACGCATTCTGGCGTAATAATTATAGGATAATTGAATAAA(SEQIDNO:49)
DBONO379:AAAACGTTCATAGCAACTAATAATAAGAGGAGGTAAATATATATGGTCTTCACACTCGAAGATTT(SEQIDNO:50)
DBONO380:ATATTTACCTCCTCTTATTATTAGTTGCTATGAACGTTTTTTACAGG(SEQIDNO:51)
DBONO382:ACGACGGCCAGTGAATTCCCTCGTGGTGTTCTGACTCCCG(SEQIDNO:52)。
在后续实验中,对该方法进行了一些修改。在PTV构建期间,发现DHR片段常常在组装好的质粒中缺失。这通过利用寡核苷酸DBONO382来缩短所用的片段的长度来克服。
在一个改进的方法中,确定重组体裂解物的滴度之后,有时如下实施富集方法,并将其用于制备nanoluc噬菌体。
使用96孔微量滴定板使PIE裂解物以200μl体积生长。对于FF裂解物,初始步骤是制备1x106pfu/裂解物(5x106pfu/ml)的96个裂解物,1x105pfu/裂解物的96个裂解物,1x104pfu/裂解物的96个裂解物。对于NanoLuc噬菌体,发现重组噬菌体的重组效率显著更高,并且稀释下至1x100pfu/裂解物都可以使用。通过在30℃下培养,在50rpm下摇动过夜来制备这些裂解物。使用适宜的荧光素酶实验系统(ff或nanoglo)测试裂解物。并不使用裂解物感染新鲜细胞,而是发现裂解物本身的背景信号是重组噬菌体存在的指征。
一旦识别出从最少数量的噬菌体制得的裂解物,使用该裂解物来用较少的噬菌体设置新的96孔裂解物。一旦达到大约1:10-1:100的重组频率,则将噬菌体在琼脂板上涂板,以分离单个噬菌斑,如上所述。
使用这些方法来创造包括编码ff荧光素酶的异源开放阅读框或编码nanoluc荧光素酶的开放阅读框的重组噬菌体。为了证实重组噬菌体中插入的有效负荷和周围序列的完整性,用PCR扩增片段,并测序。该片段跨越插入的序列,从cps基因开始,穿过萤火虫或nanoluc基因,并跨越到下游序列中。还使用寡核苷酸DBONO398和pMAKupr对完整的cps基因进行PCR扩增。
DBONO398:TGCTATATTATAGGAACATGGGAA(SEQIDNO:53)。
使用寡核苷酸DBONO273、DBONO398和pMAKupr对基因进行测序。
用引物对PCR片段进行扩增:
DBONO273:TGCTTACATGCCAGTAGGGGT(SEQIDNO:54);和
DBONO382:ACGACGGCCAGTGAATTCCCTCGTGGTGTTCTGACTCCCG(SEQIDNO:55)
用寡核苷酸对nanoluc噬菌体进行测序:
DBONO273;
DBONO382;
DBONO361:TGGCTCTACATGCTTAGGGTTCC(SEQIDNO:56);
DBONO360:CCTCTAGCTCAAATTAACGCATCTGT(SEQIDNO:57);
DBONO362:GTATGAAGGTCTGAGCGGCG(SEQIDNO:58)和
DBONO363:GATCTGGCCCATTTGGTCGC(SEQIDNO:59)。
用寡核苷酸对萤火虫噬菌体进行测序:
DBONO273;
DBONO382;
DBONO360;
DBONO361;
DBONO274:CGCATAGAACTGCCTGCGTC(SEQIDNO:60);
DBONO151:CACCCCAACATCTTCGACGC(SEQIDNO:61);和
DBONO152:GCGCAACTGCAACTCCGATA(SEQIDNO:62)
通过Genewiz,Inc公司进行测序。使用Geneious软件包进行比对,对于每个噬菌体产生了一致序列(consensussequence)。
如上所述,已创立下列重组噬菌体,并对插入位点区域进行测序:
包括插入的萤火虫荧光素酶的噬菌体:
LP48::ffluc(SEQIDNO:23);
LP99::ffluc(SEQIDNO:24);
LP101::ffluc(SEQIDNO:25);
LP124::ffluc(SEQIDNO:26);
LP125::ffluc(SEQIDNO:27);
LP143::ffluc(SEQIDNO:28);
A511::ffluc(SEQIDNO:29);和
P100::ffluc(SEQIDNO:30)。
包括插入的nanoluc荧光素酶的噬菌体:
LP124::nluc(SEQIDNO:31);
LP125::nluc(SEQIDNO:32);
A511::nluc(SEQIDNO:33);
P100::nluc(SEQIDNO:34);和
LP40::nluc(SEQIDNO:35)。
包括插入的萤火虫荧光素酶编码序列的噬菌体的插入位点区域包括如表2所示的下列部分。
表2
包括插入的nanoluc荧光素酶编码序列的噬菌体的插入位点区域包括如表3所示的下列部分。
表3
每个噬菌体的cps开放阅读框和编码的蛋白质列在表4中。
表4
使用上述方法改造所有上述噬菌体。部分基因组序列显示,用于A511的引物可以用于创造LP48、LP124和LP125的PTV。当时对于LP99、LP101或LP143没有可获得的基因组序列。使用A511PTV引物,有可能以与A511相同的方式来扩增合适的片段用于PTV构建。这反映了横跨这些噬菌体的cps基因区域之间的同源性。荧光素酶基因插入位点为与在A511::ffluc中的相同的位置(在cps基因终止密码子TAA之后)。
HIS-标记的噬菌体的改造
为了能够浓缩由重组噬菌体感染李斯特菌属产生的信号,生产了重组噬菌体的供替换版本,其包括HIS标签。6xHIS标签(SEQIDNO:63)是用于浓缩和纯化重组蛋白的常用亲和标签。
HIS标签通常放在蛋白质的N末端或C末端,因为通常假定哪个位置是最佳的是未知的。基于被标记的蛋白的结构,以及与底物的相互作用,标签序列可以干扰、抑制或增强酶功能。出于此原因,用N末端或C末端的HIS标签改造噬菌体。
进一步地,很多时候将包括少量氨基酸残基的间隔段序列放在HIS标签和被标记的基因之间。该间隔段的大小、电荷和其他特征可以影响与酶、底物或HIS结合珠/树脂/抗体的相互作用。因此,在HIS标签和Nanoluc蛋白之间使用2种不同的间隔段。
使用与未标记的噬菌体一样的方法来构建A511、LP124和LP40的HIS-标记的nanoluc版本。在PTV构建期间,通过向用于扩增多种DNA片段的寡核苷酸增加序列来引入HIS标签和间隔段。用于构建A511、LP124和LP40的PTV的寡核苷酸对于所有3个噬菌体都是通用的。
构建每种噬菌体的4个版本:
a.C末端长间隔段
b.C末端短间隔段
c.N末端长间隔段
d.N末端短间隔段
用于构建C末端长间隔段PTV的寡核苷酸
a.UHR片段:pMAKupf和DBONO380
b.NLUC片段:DBONO379和DBONO400
c.DHR片段:DBONO401和DBONO382
用于构建C末端短间隔段PTV的寡核苷酸
a.UHR片段:pMAKupf和DBONO380
b.NLUC片段:DBONO379和DBONO402
c.DHR片段:DBONO401和DBONO382
用于构建N末端长间隔段PTV的寡核苷酸
a.UHR片段:pMAKupf和DBONO380
b.NLUC片段:DBONO403和DBONO358
c.DHR片段:DBONO359和DBONO382
用于构建N末端短间隔段PTV的寡核苷酸
a.UHR片段:pMAKupf和DBONO380
b.NLUC片段:DBONO404和DBONO358
c.DHR片段:DBONO359和DBONO382
一旦构建并验证了PTV,如上所述地进行PIE方法的其余部分。
寡核苷酸序列:
DBONO400:
ATTCAATTATCCTATAATTATTAATGGTGATGGTGATGATGACCTCCACCTGCTGCCGCCAGAATGCGTTCGCACA(SEQIDNO:64)
DBONO401:
ATCATCACCATCACCATTAATAATTATAGGATAATTGAATAAAAAC(SEQIDNO:65)
DBONO402:
ATTCAATTATCCTATAATTATTAATGGTGATGGTGATGATGTGCTGCCGCCAGAATGCGTTCGCACA(SEQIDNO:66)
DBONO403:
TAATAAGAGGAGGTAAATATATATGCATCATCACCATCACCATGGTGGAGGTGCAGCAGTCTTCACACTCGAAGATTTCG(SEQIDNO:67)
DBONO404:
AGCAACTAATAATAAGAGGAGGTAAATATATATGCATCATCACCATCACCATGCAGCAGTCTTCACACTCGAAGATTTCG(SEQIDNO:68)
HIS标签氨基酸序列:HHHHHH(SEQIDNO:63)
HIS标签DNA序列:CATCATCACCATCACCAT(SEQIDNO:69)
具有长间隔段氨基酸序列的C末端HIS:AAGGGHHHHHH(SEQIDNO:70)
具有长间隔段DNA序列的C末端HIS:
GCAGCAGGTGGAGGTCATCATCACCATCACCAT(SEQIDNO:71)
具有短间隔段氨基酸序列的C末端HIS:AAHHHHHH(SEQIDNO:72)
具有短间隔段DNA序列的C末端HIS:
GCAGCACATCATCACCATCACCAT(SEQIDNO:73)
具有长间隔段氨基酸序列的N末端HIS:HHHHHHGGGAA(SEQIDNO:74)
具有长间隔段DNA序列的N末端HIS:
CATCATCACCATCACCATGGTGGAGGTGCAGCA(SEQIDNO:75)
具有短间隔段氨基酸序列的N末端HIS:HHHHHHAA(SEQIDNO:76)
具有短间隔段DNA序列的N末端HIS:
CATCATCACCATCACCATGCAGCA(SEQIDNO:77)
对于这12个被标记的酶中的每一个的插入位点提供在表5中。编号与本实施例中前面的表格中相同。
表5
在本实施例中描述的重组噬菌体在2013年5月16日保藏于美国典型培养物保藏中心()。该保藏是根据用于专利程序目的的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约的条款。保藏的专利保藏编号在表6中提供。
表6
其他序列列于下表7中。
表7
实施例2:重组噬菌体的制备
噬菌体降解物(储备)如下制备。将单核细胞增多性李斯特菌(例如ATCC的EGD-e)的单个菌落在5ml0.5XBHI液体中接种,在30℃下、在落地摇床中200rpm下过夜生长。第二天,将5ml培养物稀释到1000ml烧瓶中的500ml0.5XBHI中,在30℃下、在落地摇床中200rpm下生长4小时,或直到OD600达到0.15。然后将培养物接种1x108pfu/ml的要增殖的实施例9中所述的重组噬菌体。将烧瓶返回30℃,在50rpm下摇动4小时,或直到裂解物呈澄清状(OD600<0.02)。然后将裂解物通过0.45μm真空过滤器,再通过0.22μm真空过滤器,在4℃下储存直至下述纯化。
使用前,用总体上如SambrookandRussell,MolecularCloningVolume1,3rdedition2001所述的方法来纯化噬菌体颗粒。简言之,使用方案6“PrecipitationofBacteriophageLambdaParticlesfromLarge-scaleLysates”,第2.43-2.44页(在此其通过引用合并到本文中)从裂解物中沉淀噬菌体颗粒,但有如下不同:省略了DNase和RNase步骤和氯仿萃取步骤。然后,使用第2.47-2.51页的方案8“PurificationofBacteriophageLambdaParticlesbyIsopycnicCentrifugationthroughCsClGradients”(其由此通过引用合并到本文中)用氯化铯梯度纯化噬菌体颗粒,但有如下不同:使用SW28转子在BeckmanXL-90超速离心机中以22000rpm旋转分步梯度2小时;并且使用70.1ti转子在BeckmanXL-90超速离心机中以47000rpm旋转平衡梯度24小时。
一旦从平衡梯度收获噬菌体带,在4℃下将噬菌体对PierceG2Slide-a-lyzer箱(10000MWCO)中的4LSM缓冲液透析24小时。然后将噬菌体储存在4℃下,直到使用。
实施例3:使用重组噬菌体的试验的灵敏度和速度
根据本文的实施例来制备噬菌体LP40::nluc,LP124::nluc,andA511::nluc的储备物。在本试验中,使用这些噬菌体来检测李斯特菌。实施例检测试验实现的检测下限和试验的速度。
李斯特菌的培养物在30℃下在0.5XBHI培养基中过夜生长至饱和。将培养物在新鲜0.5XBHI培养基中1:5稀释,并允许在30℃下回收2小时。随后,将回收的培养物在相同培养基中从1x10-1到1x10-8连续稀释。每个稀释液的细胞浓度通过在非选择性培养基上涂板来确定。随后,将100μl的每个细胞稀释液用100μl的重组噬菌体混合物孵育30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。重组噬菌体混合物是各自终浓度为1x107的LP40::nluc、LP124::nluc和A511::nluc,总噬菌体终浓度为3x107。孵育末期,通过加入1VNanoGlo(比例为1:50的NanoGlo缓冲液和底物)、在实验台上孵育2分钟、在SirusL光度计(TitertekBerthold)上读数10秒(使用1秒整合)来测量结果。用十个读数的平均值来确定样本的RLU值。检测的下限(LLOD)通过测量三个独立的阴性反应的平均值并加上3个标准偏差的已建立的方法来确定。
结果显示,在30分钟时,LLOD是100个细胞,在60分钟时,LLOD是10个细胞,在120和180分钟时,该试验能够检测单个细胞。
在第二个实验中,将李斯特菌的培养物在30℃下在0.5XBHI培养基中过夜生长至饱和。将培养物在新鲜0.5XBHI培养基中1:5稀释,并允许在30℃下回收2小时。随后,将回收的培养物在相同培养基中以1x10-1、1x10-2、1x10-3、1x10-4、1x10-5、1x10-6、1x10-7和1x10-8的稀释度稀释。这些稀释液中的每个的细胞浓度通过在非选择性培养基上涂板来确定。操作并试验5个独立的稀释液。简言之,随后,将100μl的每个细胞稀释液用100μl的重组噬菌体孵育指定时间,并如上所述地测试产物。通过测量三个独立的阴性反应的平均值并加上3个标准偏差的已建立的方法来确定检测的下限(LLOD)。
在每个样本中、在每个稀释度,预期的大概数量的细胞沿着X轴表示。对于任何细胞稀释度,预期在小份之间细胞数量成正态分布。这在数据中看出。阴性对照样本显示非常一致的水平的背景发光。在最低稀释度的受试小份的五分之三与背景是区别不开的,表明这些样本并不包括任何细胞。第四份给出了背景以上约250-275RLU的信号,第五份给出了背景以上约500-550RLU的信号,表明这些样本分别包含一个或多个可感染的目标细胞。在第二低的稀释度中存在类似关系(预期每份4-6个细胞)。在此,试验区分了分别包含1、7、5、5和4个细胞的样本。
注意在该实施例中,从单个目标细胞产生的信号碰巧与背景大概相同,因此,当单个细胞被检测时产生的信号是背景产生的信号的大约2倍。虽然该关系并不必要地存在于根据本公开的所有试验中,本领域技术人员将理解其是并非必要的。重要的是,本方法能够在至少1-10个细胞的范围内以单个细胞的分辨率来辨别细胞的数量。因为每个细胞产生的信号的变异性,该范围以上,细胞的精确数量变得更加大概的。
实施例4:从海绵回收细胞
常常发现环境微生物样本连接于固体基质,例如食品加工厂中的一件设备或者食品本身的表面。从这样的环境来收集样本用于微生物污染测试通常是困难的。例如,测试食品本身的样本来确定食品是否被污染可能是必要的,并且该必要性意味着在测试期间该食物组分将存在,除非采取了费时、昂贵的步骤将它们去除。类似地,从(食物、设备、排水沟等的)环境表面收集样本最常见地导致收集除了可能存在的任何微生物之外,还有环境污染物,例如清洁剂和生物膜组分。本实施例解决了在基于噬菌体的微生物检测实验的环境下这种污染的影响。
这些问题在使用具有李氏肉汤SSL10LET的定制海绵棒(3M)收集的固相样本的情况下得到解决。具有李氏肉汤的3M海绵棒是在无菌袋中装配、用10mL李氏肉汤水化的无杀生物剂的纤维素海绵。塑料把手使得用户不需直接触摸(并且有可能污染)海绵就可以收集环境样本,并使其更易于达到排水沟、管道和裂缝中去收集样本。纤维素材料收集微生物并将其保留在海绵基质中或海绵基质上。存在李氏肉汤来帮助中和清洁化学物质,例如季铵,并保持生物体的活性用于检测。
塑料把手还具有拇指导轨,以告知用户应该避免接触该点之外,以避免可能的污染。一旦已收集样本,将海绵返回袋子,折断塑料把手,使得袋子能够被密封,并且仅仅装有海绵被密封在袋内。
在30℃下摇动,使单核细胞增多性李斯特菌菌株1839恢复(在4mLBHI中的1mL)2小时。测定被恢复的1839的OD值,并转换成大概的细胞浓度(cfu/ml=2.0x109*OD–9.0x107)。然后将细胞在李氏肉汤中连续稀释(1:10),制得最接近1x106cfu/ml(典型地1x10-2稀释)的7ml稀释液。
从3M海绵棒除去缓冲液。将一毫升最接近于1x106pfu/ml的稀释液加入从海绵除去的缓冲液中。也往海绵加入一毫升最接近于1x106pfu/ml的稀释液。将这两个样本在室温下孵育60分钟。
然后,挤压海绵,以挤出缓冲液/细胞。分别从每种条件下除去100μL缓冲液,加入每个1.5mL微量离心管中。
然后,每个微量离心管用100μL的1.0x107pfu/ml的A511:ff感染。然后,将20μL的每个感染涂板,并在30℃下孵育3小时。
然后,将从海绵回收的nanoluc蛋白质的量如下进行定量。根据Promega提供的说明书来混合NanoGlo缓冲液和底物(1:50,底物:缓冲液)。然后将1体积的样本和1体积的NanoGlo在微量离心管中混合,并在实验台上孵育2分钟。
发光的量使用SiriusL光度计(TitertechBerthold)读取10秒,1秒整数。
使用10次读数的平均值来确定样本的RLU值。
为了确定细胞回收,将100μL的1x10-4、1x10-5和1x10-6李氏肉汤稀释液涂布在0.5xBHI板上。将来自细胞稀释液的100μL加入海绵缓冲液中的海绵中。制备来自海绵的细胞、海绵缓冲液中的细胞、和来自3M李氏肉汤的细胞的1:10和1:100稀释液。然后,将100μL未稀释的、1:10和1:100稀释液涂布在BHI板中,并在30度o/n条件下孵育。将从海绵回收的细胞的数量与仅仅在李氏肉汤缓冲液中看到的细胞的数量进行比较。从海绵回收的细胞的CFU/李氏肉汤回收CFU*100%=细胞回收%。
本实施例中所示的两个试验的结果都提供在表8中。
表8
这些实验显示了,相对于对照而言,从海绵回收了大概28%的细胞。从给定海绵回收的细胞的百分率相比于单独是缓冲液中的细胞而言,也更加多变。考虑到这是健康的、浮游的细胞(其中1百万个细胞被加入到海绵中),从用于收集存在较少细胞的环境样本的海绵回收细胞可能遇到其他挑战。
这一发现对于在结合固体基质的样本的环境下使用的基于噬菌体的细胞检测试验具有显著意义。依赖于从收集海绵除去样本细胞,以使得细胞可以被离开海绵的噬菌体感染的试验形式依赖于从海绵回收足够比例的细胞,以使得试验灵敏度不受影响。例如,在设置用于检测(通过挤压海绵回收的5-7mL中)1mL材料的试验中,这些数据暗示着少于20%的起始材料被采样。考虑到<30%的细胞通常从海绵基质回收,这对于试验灵敏度具有显著影响,因为该试验将仅仅具有可使用于检测的海绵回收的总的起始细胞的大约7%。
结果显示,对于这些类型的样本,可替代的试验形式将更为有效,并产生更高的准确率、灵敏度和/或特异性。
实施例5:从海绵回收噬菌体和荧光素酶
对于使用固体基质来收集被微生物潜在污染的样本、将来自固体基质的细胞(若存在)移除并进入液体中、然后将液体和噬菌体合并的一个替代方式是,将(液体中的)噬菌体与海绵直接合并,以使得噬菌体有机会感染可能结合海绵存在的目标细胞。这将允许噬菌体感染结合于海绵的任何目标细胞,无论这些细胞是否可以从海绵回收。然后,敏感的检测方法将通过对液体取样并测试由被噬菌体感染的目标微生物(若存在)产生的标记物得到促进。这种试验形式将避免实施例4中所确定的问题。
这种类型的试验形式的效率将反过来又部分取决于从固体基质释放的、并对于下游检测可使用的噬菌体和/或标记物的比例。例如,如果过高比例的噬菌体和/或标记物陷于固体基质中,并致使对于试验是不可用的,则将降低测试性能。评估这一问题的初步实验是基于用海绵孵育之后,噬菌体和荧光素酶的回收。
方案,第一次(Run1):制备4mL的每个A511:nluc的未过滤的裂解物,起始滴度1.2x1010pfu/mL,稀释的滴度4.0x109、4.0x108和4.0x107pfu/mL。
对于每个裂解物稀释液:
1.挤压3M海绵棒#SSL10LET,以使得尽可能多的李氏肉汤从其中移除。将3mL的李氏肉汤转移到15mL锥形瓶。往这个15mL锥形瓶中加入1mL裂解物稀释液。
2.挤压第二海绵,以使得尽可能多的李氏肉汤从其中移除,并转移到15mL锥形瓶。将其中3mL重新加到海绵棒袋子中,而不让其接触海绵。往该液体中加入1mL裂解物稀释液,混合,用海绵吸收混合物。
3.锥形管和海绵与加入的噬菌体一起在30℃下孵育3小时。
RLU背景的检测:
从每个孵育的锥形管中,转移100μL到3个微量离心管中的每一个管中。
从每个被培养的海绵挤出尽可能多的液体,并转移到15mL锥形瓶中。从该锥形瓶中转移100μL到3个微量离心管中的每一个管中。
所有微量离心管在SiriusL光度计中读数总共40秒,在20秒时注射100μL的PromegaNanoGlo试剂#N1130。
滴度:
将来自每个锥形管(被孵育的或从孵育后的海绵挤压)的100μL转移到96孔滴定板的3个孔中的每个孔中。将溶液连续地以十倍稀释8次。将每组稀释液在制备好的具有一片1839细胞的BHI板上涂布3次。
方案,第二次:使用LP124:nluc未过滤的裂解物、1.2E10pfu/ml的起始滴度重复方案1。
结果证实了噬菌体滴度和来自加入到3M海绵棒的噬菌体的RLU信号两者的大约30%的回收率。这表示在微生物检测试验期间,结合于海绵的任何噬菌体或荧光素酶的大约70%将结合于海绵,或者以其他方式陷入海绵中。这显示了需要使用更高的噬菌体浓度的噬菌体来从在海绵存在下发生的感染中得到足够的信号。
重要的是,该回收水平暗示着依赖于结合于固体基质的细胞的感染以及感染后噬菌体和荧光素酶的回收的试验是可行的试验形式。该结果还暗示了与悬浮相试验形式相比,该试验形式可能具有更高的准确率、灵敏度和/或特异性。
实施例6:试验灵敏度
本实验探究了利用在非悬浮情况下目标细胞的感染的试验形式的灵敏度。
方案:
制备20mL的A511:nluc和LP124:nluc噬菌体的混合物,总噬菌体为4.0x107pfu/mL。
以1x10-01至1x10-08的稀释系列制备4mL的1839细胞。未稀释的培养物的最终细胞计数为5.1x109cfu/mL。
对于每个细胞稀释液:
挤压海绵,从其中移除尽量多的李氏肉汤。将2mL的该挤出液转移到15mL锥形管中。在适当的稀释度下加入1mL细胞和1mL噬菌体。
挤压第二海绵,从其中移除尽量多的李氏肉汤,并转移到15mL锥形管中。记录挤出的体积,以及并没有从海绵中移除的相应体积(10mL-挤出的体积=未挤出的体积)。将其中2mL重新加入袋中,不让其接触海绵。将适当稀释度下的1mL细胞和1mL噬菌体加入该李氏肉汤,并混合。然后,将整个体积与海绵接触并被海绵吸收。
然后,在30℃下孵育加有噬菌体的锥形管和海绵3小时。
将来自每个被孵育的锥形管的100μL转移到3个微量离心管的每一个中。
从每个孵育的海绵挤出尽量多的液体,并转移到15mL锥形管中。然后,将来自锥形管的100μL转移到3个微量离心管中的每个管中。
然后,在SiriusL光度计中读取所有微量离心管总共40秒,在20秒时注入100μLPromegaNanoGlo试剂#N1130。
结果在表9中显示。
表9
这些数据表明,海绵上的感染产生了低于13个细胞的灵敏度的可检测信号。
实施例7:试验持续时间
本实施例处理了1)将海绵和噬菌体合并并且对暴露于噬菌体的海绵提供足以使得重组噬菌体感染样本中存在的目标微生物细胞、并且由目标微生物细胞产生由异源核酸序列编码的标记物的条件;与2)出于检测标记物的目的,从被孵育的海绵支持物和噬菌体中移除培养基之间的持续时间对试验性能的影响。
方案:
第一次:
第一天:
从排水沟和鱼包装/加工工厂的设备收集40海绵的环境样本,随机选取5个。
从与用于收集样本的3M海绵棒同批的3M海绵棒中选取新的、无菌海绵,用作阴性对照。
从每个海绵挤出所有液体,转移到无菌的50mL锥形管中。将具有5%葡萄糖和1%甘油的10mL0.5x脑心浸液培养基加入海绵。轻轻按摩袋子15秒来分散液体。然后将40mLUVM选择培养基加入50mL锥形管中。将海绵放置在30℃下1小时。将盖子松开的锥形管放在30℃下24小时。
1小时后,将海绵从30℃培养箱移出。对于每个海绵,挤出所有液体到袋子的角落中,加入A511::nluc、P100::nluc和LP124::nluc噬菌体的1mL1.1x109pfu/ml(总噬菌体的)混合物,并混合。然后将所有液体重新吸收到海绵中。轻轻按摩海绵15秒来分散液体。然后将海绵放回30℃3小时。
3小时后,将海绵从30℃培养箱移出。对于每个海绵,挤出所有液体到袋子的角落中,将900μL转移(每个300μL)到3个微量离心管中。使用SiriusL光度计对每个样本读数总共40秒,在20秒时注射100μLPromegaNanoGlo试剂#N1130。在5小时、7小时、9小时和约24小时时重复该步骤。
注意:在5小时时间点处,由于在所有样本(包括预期会产生强信号的样本)中看到弱信号,因此在SiriusL中读取样本之前增加澄清化旋转。将来自每个样本的300μL加入第二微量离心管,在16.1rcf下旋转1分钟。然后将上清液转移到新的微量离心管,以以与其他管相同的方式读数。
第二天:
在取24小时时间点来进行RLU确定之后,将来自每个袋子的100μL放在MOX琼脂板上。将100mLUVM加入袋中。将袋子在30℃下孵育24小时。
24小时后读取富含UVM的挤出物:从30℃培养箱取出50mL锥形管。将来自每个锥形管的1mL转移到微量离心管。在4000g下旋转微量离心管1分钟,取出上清液,将沉淀物重新悬浮在100μL1.0E7噬菌体中。将微量离心管在30℃下放置3小时。
3小时后,从30℃培养箱取出微量离心管,在最大速度下旋转1分钟。将50μL的上清液转移到96孔光度计板的孔中。在每孔注入50μLNanoGlo的Glomax96孔光度计中读数,并且每个孔读取1秒,延迟2秒。
将来自每个50mL锥形管的100μL在MOX琼脂板上涂敷,用于培养确认。
第三天:
24小时后读取富含UVM的海绵:从30℃培养箱取出海绵。将来自每个海绵的1mL转移到微量离心管。在4000g下旋转微量离心管1分钟,取出上清液,将沉淀物重新悬浮在100μL1.0E7噬菌体中。将微量离心管在30℃下放置3小时。
3小时后,从30℃培养箱取出微量离心管,在最大速度下旋转1分钟。将50μL的上清液转移到96孔光度计板的孔中。在每孔注入50μLNanoGlo的Glomax96孔光度计中读数,并且每个孔读取1秒,延迟2秒来。
将来自每个袋子的100μL在MOX琼脂板上涂敷,用于培养确认。
第二次(Run2):重复上面详述的方法,在所有时间点增加预读数的澄清化旋转。
结果显示在表10中。
表10
第一次结果证实了,增加样本的预读数的澄清化旋转可将5小时处的准确率改善至没有澄清化旋转时24小时处的准确率。第二次结果证实了,该旋转将3小时处的准确率改善至5小时处的准确率,表明感染后3小时时的样本读取产生了合理的准确率。
实施例8:代谢刺激
传统上,环境样本的基于噬菌体的检测试验已经使用富集步骤来扩增样本中存在的目标细胞的数量来实施。这样的条件的一个效果在于,相对于并未以此方式处理的样本中的细胞,其可能提供了代谢刺激。本实施例证实了在本文公开的试验的某些实施方式中,并不需要单独的代谢刺激步骤。
从排水沟和鱼加工设施处的设备收集40个环境样本,并随机选择10个样本。将样本分成2组,每组5个样本。第二组5个是从与第一组相同的5个位点组取样的样本。也就是说,这两组代表相同的东西。
从相同3M批次的海绵棒,使用两个新的无菌海绵作为阴性对照。
方案1:(样本1-5)
将所有液体挤出每个海绵,并转移到无菌的50mL锥形管。将具有5%葡萄糖和1%甘油的3.5mL0.5x脑心浸液培养基加入到每个海绵中。轻轻按摩海绵15秒来分散液体。然后将40mLUVM选择性培养基加入50mL锥形管中。将海绵放置在30℃下1小时。将盖子松开的锥形管放在30℃下24小时。
1小时后,将海绵从30℃培养箱移出。对于每个海绵,挤出所有液体到袋子的角落中,加入具有1%葡萄糖、5%甘油、6%氯化锂和0.12%萘啶酸的1.5mL0.5x脑心浸液和1mLA511::nluc、P100::nluc和LP124::nluc噬菌体的6.0x108pfu/ml(总噬菌体的)混合物,并混合。将所有液体重新吸收到海绵中。轻轻按摩15秒以分散液体。将海绵放回30℃3小时。
3小时后,将海绵从30℃培养箱取出。对于每个海绵,挤出所有液体到袋子的角落中,将300μL转移到微量离心管中。在16.1rcf下旋转1分钟,将上清液转移到新管中。在SiriusL光度计中读数总共40秒,在20秒时注射100μLPromegaNanoGlo试剂#N1130。
读数后,将每个袋子中的液体取出500μL,在MOX琼脂板上涂敷。将100mLUVM选择培养基加入海绵,在30℃下放置24小时。
方案2:(样本6-10)
将所有液体从每个海绵挤出,并转移到无菌的50mL锥形管。将具有5%葡萄糖和1%甘油培养基的3.5mL0.5x脑心浸液加入到袋子的角落中,加入具有1%葡萄糖、5%甘油、6%氯化锂和0.12%萘啶酸的1.5mL0.5x脑心浸液和1mLA511::nluc、P100::nluc和LP124::nluc噬菌体的6.0x108pfu/ml(总噬菌体的)混合物,并混合。将所有液体吸收回海绵中。轻轻按摩15秒以分散液体。将海绵放置在30℃下4小时。
将40mLUVM选择培养基加入50mL锥形管。将盖子松开的锥形管在30℃下放置24小时。
4小时后,将海绵从30℃培养箱移出。对于每个海绵,挤出所有液体到袋子的角落中,将300μL转移到微量离心管中。在16.1rcf下旋转1分钟,将上清液转移到新管中。在SiriusL光度计中读数总共40秒,在20秒时注射100μLPromegaNanoGlo试剂#N1130。
读数后,将每个袋子中的液体取出500μL,在MOX琼脂板上涂敷。将100mLUVM选择培养基加入海绵,在30℃下放置24小时。
第2天:
24小时后读取富含UVM的挤出物和海绵:从30℃培养箱取出50mL锥形管和海绵袋。将来自每个锥形管/海绵的1mL转移到微量离心管。在6000g下旋转微量离心管2分钟,取出上清液,在100μL1.0x107噬菌体中重新悬浮沉淀物。将微量离心管在30℃下放置3小时。
3小时后,从30℃培养箱取出微量离心管,在16.1rcf下旋转1分钟。将50μL上清液转移到96孔光度计板的孔中。每孔注入50μLNanoGlo,在Glomax96孔光度计中读数,并且每个孔读取1秒,延迟2秒。
将来自每个50mL锥形管的100μL在MOX琼脂板上涂敷,用于培养确认。
结果显示在表11中。
表11
噬菌体感染方案 | 准确率 |
方案1:1小时唤醒,3小时感染 | 60% |
方案2:不唤醒,4小时感染 | 60% |
方案1的合理性在于,样本中存在的细胞可能并非代谢上活性的,这可能导致细胞对噬菌体感染和/或由噬菌体编码的标记物的产生是具有抗性的。如果是这样,则考虑到在将细胞和噬菌体合并之前加上一小时的代谢刺激可让细胞处于使其更加易感于被噬菌体感染和/或产生由噬菌体编码的标记物的状态下。此结果表明,对感染时间加上可能已被用于唤醒的一小时产生了与具有唤醒步骤相同水平的准确率。这在几个方面非常重要。例如,这意味着加上额外的唤醒周期(超过1小时)不太可能增加试验的准确率。这也证实了唤醒步骤(在噬菌体不存在的情况下)对于试验性能并非必要的。这些点是重要的,因为当减少需要用户参与的步骤的数量时,试验的商业化和有用性通常会增加。这也证实了样本收集和结果之间的总的试验时间可以非常短。
实施例9:噬菌体浓度的影响
已熟知,并且在本文中显示,从固体支持物环境获得的微生物样本更难以在微生物试验、包括基于噬菌体的试验中检测。本文中提供的数据还显示,并非在悬浮状态下的目标微生物细胞感染影响几个试验参数。这暗示了在其他情况下确定的用于微生物检测试验的最佳噬菌体浓度可能并不能直接用于此情况。因此,着手研究了噬菌体浓度和试验性能之间的关系。
进行了跨越单日从单个设施中的三个不同测试点取出的10个环境样本的噬菌体浓度的影响的直接比较。
从两个地面排水沟和设施内的一件设备(运送和接收区域的规模)收集四十(40)个环境样本。用海绵棒擦拭测试点,然后将海绵棒返回袋子中。从海绵折断塑料棒,密封袋子,运送回实验室。打开12个其他海绵,取出海绵棒而不擦拭到任何表面。这些海绵作为一组阴性对照。
通过合并并且稀释每个噬菌体的储备物浓度至9x109pfu/ml、4.5x109pfu/ml、2.25x108pfu/ml和9x108pfu/ml来制备A511::nluc、LP40::nluc和LP124::nluc的噬菌体混合物。在每个混合物中,每种噬菌体以相等的pfu/mL存在,并且数字是以总噬菌体的pfu/mL计。即,混合物中每种个别噬菌体的相应值为所列值的1/3。
用单次紧紧的挤压从海绵挤出所有液体;使用血清学吸管将液体转移到包含20mLUVM富集肉汤的50mL锥形管中。将这些锥形管放在30℃下过夜。
往70mL海绵感染缓冲液中加入14mL噬菌体混合物。然后,往每个海绵加入6mL海绵感染缓冲液/噬菌体混合物;对于每个噬菌体浓度,平行检测10个样本加3个阴性样本。
加入噬菌体之后,轻轻按摩海绵3-4次以将液体分散在海绵各处。对每块海绵紧紧挤压一次,以从海绵挤出液体。使用移液管将500μL液体从海绵转移到1.5mL微量离心管。然后,重新密封海绵袋,并防止在30℃培养箱中4小时。
将微量离心管在14000xg下旋转60秒。将300μL液体转移到新的微量离心管。检测前4分钟,往每个管加入300μLNanoGlo缓冲液/底物混合物,在BertholdSiriusL光度计中检测每个样本,其使用20秒动态读数,1秒整合时间。这构成了T0读数,这是每块海绵的样本特异性对照。
4小时后,将袋子从培养箱取出。对每块海绵紧紧挤压一次,以从海绵挤出液体。使用移液管将500μL液体从海绵转移到1.5mL微量离心管中。
2小时后,在6小时或者整个孵育后,将袋子重新从培养箱取出。对每块海绵紧紧挤压一次,以从海绵挤出液体。使用移液管将500μL液体从海绵转移到1.5mL微量离心管中。
将微量离心管在14000xg下旋转60秒。将300μL液体转移到新的微量离心管中。检测前4分钟,往每个管加入300μLNanoGlo缓冲液/底物混合物,在BertholdSiriusL光度计中检测每个样本,其使用20秒动态读数,1秒整合时间。该读数被认为是T4读数,当与T0比较时,该读数可以给出特定海绵是否异常表现的启示。但是,在本实施例中,这一方面并不用于称为阳性或阴性样本。
对于每个样本计算平均RLU值。计算阴性样本的平均值和标准偏差。根据下列公式确定阈值:
阈值={1.2*[(阴性样本平均值)+(3*(阴性样本平均值的标准偏差))]}
超过阈值的任何平均RLU输出被称为阳性的。处于或小于阈值的任何平均RLU输出被称为阴性的。
次日,从培养箱取出液体富集物,将100μL的每种富集物在MOX琼脂板上涂敷。将板在35℃下放置24-28小时,其后,针对单核细胞增多性李斯特菌菌落检查板。还将富集物送到第三方实验室确认。度量以匹配第三方实验室确认结果的样本百分数来表示。4小时时间点的数据显示在表12中。6小时时间点的数据显示在表13中。
表12(4小时)
1x | 2.5x | 5x | 10x | |
灵敏度 | 40% | 60% | 60% | 100% |
准确率 | 70% | 70% | 80% | 100% |
特异性 | 100% | 80% | 100% | 100% |
(1x=9E8pfu/mL)
表13(6小时)
1x | 2.5x | 5x | 10x | |
灵敏度 | 40% | 100% | 60% | 100% |
准确率 | 70% | 100% | 80% | 100% |
特异性 | 100% | 100% | 100% | 100% |
(1x=9E8pfu/mL)
这些数据证实了,当噬菌体浓度从9e8pfu/mL提高到9e9pfu/mL时,使用4小时和6小时孵育的试验性能得到了显著改善。该发现是未预料到的和出乎意料的,因为当被测试的噬菌体混合物以1x107以及更低(数据未显示)的噬菌体浓度用于完全液体试验形式中时,被测试的噬菌体混合物已表现出高的性能。不希望限制于理论,推测环境样本(尤其是较脏的环境样本)中具有需要较高浓度的噬菌体来达到与液体试验中所见的类似的有效浓度的组分。即使这样,这些很高的噬菌体浓度将产生优势也是不可预测的,因为感染的多样性是在1000000:1或更大的数量级,这表示加入更多噬菌体将不是必要的,甚至可能对试验是有害的,如果细胞在能够产生可检测水平的NanoLuc蛋白之前就被噬菌体淹没。
实施例10:催化失活降低噬菌体制剂中的背景
使用PEG沉淀和氯化铯梯度方法制得的本文中公开的重组nluc噬菌体的噬菌体制剂趋向具有1x10-4至4x10-4的RLU/PFU值。这表示由重组噬菌体基因组编码的nluc蛋白在制备裂解物期间被合成,然后与从裂解物中回收的噬菌体结合。
这些值产生了还是比优选的背景更高的背景。在寻求进一步降低噬菌体制剂的背景中,进行了多重努力。这些努力包括:1)多重PEG沉淀步骤(没有观察到改善);2)多步梯度(没有观察到改善);3)多个连续梯度(没有观察到改善);和4)用HIS珠/树脂除去额外的背景(降低了0-15%的背景,基于不同制剂而变化)。
为了提高使用噬菌体试验系统可获得的信噪比,尝试通过将噬菌体与nanoluc酶的NanoGlo底物孵育来催化失活从噬菌体制备过程中剩下的过量的酶。
方案
以适宜体积(2-5ml),将浓缩的噬菌体悬浮液(来自氯化铯梯度,透析之后)在SM缓冲液中稀释至1x1011。
-在50ml锥形管中,通过以1:50的比例将NanoGlo底物加入NanoGlo缓冲液来混合1体积的NanoGlo(Promega)。
-将1体积的噬菌体悬浮液与1体积的NanoGlo合并。
-在30℃下静止孵育24小时。
-使用针头和注射器,将噬菌体/nanoglo转移到透析盒(PierceSlide-a-lyzerG2透析盒,10000MWCO)中。
-在4℃下对5LSM缓冲液O/N透析。
-使用针头和注射器,将已被透析的噬菌体悬浮液从透析盒中移出,转移到50ml锥形管中。
-滴定,并按需要使用。
该催化失活方案已重复得到大的RLU/PFU降低的结果,通常降低到大约5x10-5RLU/PFU。两个近期的催化失活批次显示在下表14中:
表14
失活前RLU/PFU | 失活后RLU/PFU | %降低率 | |
失活1(Burnout 1) | 1.89e-4 | 5.63e-5 | 70.2 |
失活2(Burnout 2) | 1.80e-4 | 6.50e-5 | 63.8 |
在一个单独的实验中,对0小时、3小时、6小时和24小时的催化失活时间进行比较。结果显示3h催化失活除去了90%的背景发光,6h催化失活除去了92%的背景发光,24h催化失活除去了97%的发光。如果随后进行与其他催化失活方案相同的透析,则0h催化失活除去了79%的发光。这后一种结果是因为在至少部分透析步骤期间存在NanoGlo底物。有趣的是,在整个实验中还观察到催化失活方案已重复地导致RLU/PFU降低至大约5e-5RLU/PFU,这并不依赖于催化失活之前的起始背景。这样,还可以使用催化失活来降低批次和批次之间的变化性,反过来又提高了跨批次试验的准确率。
出于几个原因,催化失活的高度有效性是出乎意料的。例如,已知nluc酶是非常稳定的,并且对氯仿具有抗性。此外,因为污染nluc不会完全从噬菌体分离,虽然有众多分离方法(CsCl、切向流过滤、超滤等),但是不清楚该酶能否足够易于接近Nanoglo底物。也不清楚0-24小时是否允许足够的催化周期以使酶被充分摧毁(其催化活性将被损坏)。还不清楚噬菌体是否将被更长的催化孵育时间损坏。如下所示,使用用催化失活步骤制备的噬菌体实施的试验与使用不用催化失活步骤制备的噬菌体的试验的比较证实了催化失活的益处大于任何代价。
实施例11:使用催化失活制备的噬菌体制剂的应用
本实施例处理使用背景被催化失活降低的噬菌体制剂对于试验的影响。
对使用和不使用催化失活制备的LP40::nluc、A511::nluc和LP124::nluc制剂进行了比较。在所有情况下,将噬菌体合并成混合物,每个噬菌体浓度相等。被测试的浓度是1x109pfu/ml、1x108pfu/ml和1x107pfu/ml总噬菌体。在0.5xBHI中稀释噬菌体混合物。将1mL过夜、固定相单核细胞增多性李斯特菌1839培养物在4mL0.5xBHI中稀释,并边摇动边在30℃下孵育2h。然后将培养物连续稀释在0.5xBHI中至1x10-8稀释。将稀释液在0.5xBHI琼脂板上涂敷,用于细胞计数。
将40μL每种稀释液转移到1.5mL微量离心管中,一式6份。将40μL0.5xBHI转移到1.5mL微量离心管,平行地一式6份,作为对照。将一式六份分成单独的稀释系列。每个系列用40μL给定的噬菌体浓度进行感染,催化失活或者未经处理。在30℃下孵育感染物3h。孵育之后将感染物一式三份地转移到96孔板中用于检测。以2秒延迟和1秒整合时间来读取板。
在所有噬菌体浓度中比较结果,无论噬菌体是否被催化失活。本试验的阈值通过取阴性样本(噬菌体仅在0.5xBHI中)的平均RLU、并且对该平均值加上3个标准偏差来确定。通过在阈值和稀释系列的最佳拟合线之间找到交点(其被称为检测的下限(LLOD))来确定灵敏度。
数据显示在1x107浓度的噬菌体下,在催化失活和未处理的噬菌体之间并不存在背景或阈值的区别。在更高浓度的噬菌体下,在催化失活的噬菌体的阈值和未处理的噬菌体的阈值之间存在明显分离。在1x109浓度的噬菌体下,这影响了试验的灵敏度,因为检测单个细胞变得更加困难。在本试验中,1x109催化失活的噬菌体的LLOD是单个细胞。在本试验中,1x109未处理的噬菌体的LLOD是19个细胞。
该数据表明了随着噬菌体的浓度提高,背景相应增加。在一些情况下,该增加可能是这样的程度:在阴性样本之间的绝对RLU输出上的更大的变化性将趋向将阈值提高到超过可以检测单个细胞的点。该效果可能通过使用催化失活的噬菌体制剂来降低。
这些数据还证实了,虽然由催化失活的噬菌体制剂提供的较低背景可能在利用相对较低浓度的噬菌体的应用中不是必要的,但是在较高浓度的噬菌体(其他所有均相同)处,背景降低对于试验的灵敏度有益。很清楚,这样的情况可能在测试与固体基质结合的细菌的样本时发生。在这些情况下,较高的噬菌体浓度提供更高的准确率,但是该益处稍稍被伴随的更高的背景所限制。催化失活的噬菌体制剂的使用将允许更充分地实现对这样的样本使用更高的噬菌体浓度的益处。
实施例12:在固体表面上分析细菌污染
在本实施例中分析的样本从食物加工厂中的多个位置的多种固体表面(包括排水沟、地面、墙面、设备(磅秤、运送车、桌子、机器等))中收集。
环境样本从多个位点的多个测试位置中收集。该收集方案如下。使用具有李氏肉汤SSL10LET的定制海绵棒(3M)收集固相样本。具有李氏肉汤的3M海绵棒是在无菌袋中运输、用10mL李氏肉汤水化的无杀生物剂的纤维素海绵。塑料把手使得用户不需直接触摸(并且有可能污染)海绵就可以收集环境样本,并使其更易于达到排水沟、管道和裂缝中去收集样本。纤维素材料收集微生物并将其保留在海绵基质中或海绵基质上。存在李氏肉汤来帮助中和清洁化学物质,例如季铵,并保持生物体的活性用于检测。
塑料把手还具有拇指导轨,以告知在该点以外,用户应该避免接触以避免可能的污染。一旦已收集样本,将海绵返回袋子,折断塑料把手,使得袋子能够被密封,且仅有海绵在袋内。
根据制备商的说明,将李氏肉汤中预湿润的3M海绵棒从其储存袋子中移出,擦拭4”X4”固体表面来收集样本。收集后,将海绵棒返回储存袋并关闭袋子,直到进一步处理。
对于每组来自给定位点的样本,打开3个其他海绵,取出海绵棒而不擦拭到任何表面。这些海绵作为一组阴性对照。排除两个数据组,因为它们显示出中等至高的信号抑制,没有返回与阴性样本相等的信号,使得不可能确定阳性和阴性样本之间的信号区别,导致使用被用于两组样本两者的该特定噬菌体制剂可能存在问题的假设。现在来测试该假设。
通过合并并且稀释每个噬菌体的储备物来得到9x109pfu/ml的总噬菌体的终浓度来制备LP40::nluc、A511::nluc和LP124::nluc的噬菌体混合物。噬菌体制剂已用实施例10中所述的催化失活方案来处理。不用催化失活处理的用于本实施例的噬菌体制剂中存在的背景发光度的范围为从先前至催化失活,用于β样本的噬菌体制剂的范围为12000RLU至81000RLU(9x109pfu/ml下)。已催化失活处理的用于本实施例的噬菌体制剂中存在的背景发光度的范围为1500RLU至10000RLU(9x109pfu/ml下)。
使用一次紧紧的挤压将所有液体从海绵中移出;然后使用血清学移液管将液体转移到含有20mLUVM富集肉汤的50mL锥形管中。将该锥形管放在30℃下过夜。
将14mL噬菌体混合物加入70mL(或42mL)海绵感染缓冲液中。然后将6mL(或3mL)海绵感染缓冲液/噬菌体混合物加入到每个海绵中;10个样本加上3个阴性样本。所述海绵感染缓冲液是半强度脑心浸液(BHI)培养基(18.5g/LDifcoBHI培养基),其添加有5%重量/体积葡萄糖、1%体积/体积甘油、1%重量/体积氯化锂和0.002%重量/体积萘啶酸。该添加物的组合促进了李斯特菌的回收,以及在感染过程期间竞争者微生物的生长抑制。
加入噬菌体之后,将海绵轻轻按摩3-4次,以将液体分散到海绵各处。对每块海绵紧紧挤压一次,以从海绵挤出液体。使用移液管将500μL液体从袋子转移到1.5mL微量离心管。然后,重新密封海绵袋,并放置在30℃培养箱中4小时。
将微量离心管在14000xg下旋转60秒。将300μL液体转移到新的微量离心管。在检测之前4分钟,往每个管加入300μLNanoGlo缓冲液/底物混合物,在BertholdSiriusL光度计中检测每个样本,其使用20秒动态读数,1秒整合时间。这构成了T0读数,作为对于每块海绵的样本特异性对照。
4小时后,将袋子从培养箱取出。对每块海绵紧紧挤压一次,以从海绵挤出液体。使用移液管将500μL液体从海绵转移到1.5mL微量离心管。
将微量离心管在14000xg下旋转60秒。将300μL液体转移到新的微量离心管。在检测之前4分钟,往每个管加入300μLNanoGlo缓冲液/底物混合物,在BertholdSiriusL光度计中检测每个样本,其使用20秒动态读数,1秒整合时间。该读数被认为是T4读数。
对于每个样本计算平均RLU值。计算阴性样本的平均值和标准偏差。根据下列公式确定阈值:
阈值=[(阴性样本平均值)+(3*(阴性样本平均值的标准偏差))]
超过该阈值的任何平均RLU输出被称为阳性。处于或小于该阈值的任何值被称为阴性。低于该阈值的任何量被称为阴性。
次日,从培养箱取出液体富集物,将100μL的每种富集物在MOX琼脂板上涂敷。将板在35℃下放置24-28小时,其后,针对单核细胞增多性李斯特菌菌落检查这些板。还将富集物送到第三方实验室进行确认。
结果显示在表15中。表中阳性的数量和阴性的数量基于第三方实验室确认结果。准确率、灵敏度和特异性以匹配第三方实验室确认结果的样本的百分数来表示。
表15
实施例13:His标记的荧光素酶
利用在固体基质上的感染的基于噬菌体的微生物检测试验可能遇到很多环境因素,这些环境因素可能在某些情况下影响对于环境样本的试验的性能。本实施例研究了使用带标签的标记物的可行性,例如由在重组噬菌体的基因组中的异源核酸序列编码的带标签的标记物。在该试验中,对nanoluc酶以不同构型加上HIS标签(HIS-tag)。
本实验利用了带有HIS标签的nanoluc蛋白质,其与编码异源性的带有HIS标签的荧光素酶蛋白质的所公开的重组噬菌体的噬菌体裂解物制剂相结合。使用这些制剂用于该试验提供了现成来源的带有HIS标签的荧光素酶。这也允许评价HIS标签在存在在本发明公开的微生物检测试验中利用的那种噬菌体的条件下浓缩带HIS标签的荧光素酶的有效性。
材料和方法:
如实施例2所述,制备LP40::nluc-L、LP40::nluc-S、LP124::nluc-L、LP124::nluc-S、A511::nluc-L和A511::nluc-S噬菌体的噬菌体裂解物。
从LifeTechnologies购买磁珠(His标签磁珠商品号为10103D)。所用的结合缓冲液为0.5xBHI,其包括5%甘油、1%葡萄糖、30mMNaCl和0.01%吐温20。所用的洗脱缓冲液为0.5xBHI,其包括5%甘油、1%葡萄糖和300mM咪唑。以在结合缓冲液中的1.0x10-5稀释度来制备10mL的每种被测试的噬菌体裂解物。从每个管子收集350μL小份来测试初始RLU值。
通过对每个样本加上过量部分收集足够的小份来制备磁珠,然后放在1.5mL管中,将管插入磁力站。2分钟分离时间之后,所有液体被取出而不扰动磁珠,用结合缓冲液洗涤磁珠,最后用原始体积的结合缓冲液重新悬浮磁珠。
将10μL磁珠分散到噬菌体裂解物的每个管中,将管放在旋转平台上,孵育20分钟。孵育之后,将管子放在磁力站中,使磁珠从液体分离2分钟,从每个管子收集350μL,用于测量未结合的RLU值。然后从每个管子取出所有液体,将磁珠重新悬浮在1mL结合缓冲液中,并转移到1.5mL管中。磁力分离步骤之后,重新取出所有液体,边轻轻旋转边用350μL洗脱缓冲液处理磁珠10分钟。在最终磁力分离步骤之后,取出所有液体,用于测量释放的RLU值。
使用一式三份的100μL小份和100μLNanoGlo荧光素酶试验溶液(Promega,商品号#N1110)在酶标仪上进行光度测量。用这些测量值来计算结合的以及从磁珠释放的起始NanoLuc蛋白质的百分比。
结构和讨论:
结果显示在表16中。结合的NanoLuc%是该样本的起始值和该样本的未结合的值之间的差。在未显示的数据中,洗脱的效率被确定为约95%。初始RLU值和从磁珠释放的RLU值的比较是由使用磁珠来浓缩信号导致的实际信号的增长的测量值。
表16
对两个系列的噬菌体裂解物的结合效率的评估揭示了具有N末端His标签的噬菌体显示出比C末端系列高得多的与钴修饰的磁珠的结合效率。这些数据证实了,His标签的可接近性对于N末端连接更好。初始信号的RLU值对于从包括较短间隔段的N末端菌种获得的噬菌体是最高的。这些菌种还给出了最高的被释放的信号值。这些结果显示了,将标签连接标记物蛋白是在本文公开的试验的情况下浓缩信号的可行的方法。该任选步骤可在一些情况下提高试验性能。
实施例14:在筛选剂的存在下的试验性能
特异性检测活细胞的针对李斯特菌污染的试验通常涉及其中使样本中存在的目标微生物生长一段时间的步骤。然后,该唤醒时期使得细胞能经得起试验中的进一步处理。大部分常见试验也已包括延长的培养时期,以使得培养物中的细胞的数量大大增加,然后增加的细胞的数量被检测。在这些试验中,直到细胞的代谢活性被所谓唤醒或修复条件促进之后才进行目标微生物的检测。检测环境样本并区别活细胞的基于噬菌体的细胞检测方法也依赖于目标细胞增殖时延长的培养时期。
在其论文(BuschandDonnelly,1992)“DevelopmentofaRepair-EnrichmentBrothforResuscitationofHeat-InjuredListeriamonocytogenesandListeriainnocua,”Appl.Environ.Microbiol.,Vol.58,No.1,pp.14-20中,作者研发了李斯特菌修复肉汤(LRB)。LRP是基于胰酪胨大豆肉汤(TripticaseSoyBroth,TSB)的富集肉汤,其添加有葡萄糖、酵母提取物、硫酸镁和的丙酮酸盐,并且通过添加MOPS来缓冲。发现这些添加剂中的每种都独立地促进5h或更短时间内受热损伤的李斯特菌的修复。
为了评价在加入生长抑制剂(筛选剂)之前的修复的作用,该作者比较了当在不同的选择性富集培养基vsLRB中生长时受热损伤的李斯特菌细胞的恢复。为了做这个比较,往FDA富集肉汤(FDA)、李斯特菌富集肉汤(LEB)和UVM富集肉汤(UVM)或LRB中加入受损伤的细胞的初始接种物。5小时恢复之后,往LRB中加入在FDA和LEB中使用的相同浓度的筛选剂(吖啶黄、萘啶酸和环己酰亚胺)。所有培养物孵育总共24小时,然后通过在非选择性培养基上涂板来进行细胞计数。在选择性富集培养基(FDA、LEB、UVM)中孵育24小时之后,最终的李斯特菌种群为1.7x108至9.1X108CFU/ml;LRB中的种群一贯地平均为2.5x1011至8.2x1011CFU/ml。该作者作出如下结论:当恢复李斯特菌时未能使用非选择性修复富集步骤将使得受损伤的细胞能够避免在基于培养的方法中被检测。
在PritchardandDonnelly,1999“CombinedsecondaryenrichmentofprimaryenrichmentbrothsincreasesListeriadetection,”JournalofFoodProtection,Vol.62,No.5,pp.532-535中,Donnelly团队试图使用现实生活中的样本而非受损伤的李斯特菌细胞来重复其1992年论文的结果。他们获得了环境样本和食物样本两者,通过至少一种所测试的方法测得23.8%对于李斯特菌是阳性的。他们发现单独使用LRB或UVM并不提高识别李斯特菌阳性样本的可能性,但是进行两种富集肉汤的合并的第二富集则会提高识别李斯特菌阳性样本的可能性。对于这一点,他们要么将样本一分为二,将每个半份在UVM或LRB上富集24小时,然后将两种初级富集的部分合并到第二富集24小时,然后通过由此培养来检测,或者用两种初级富集进行全套程序、然后进行独立的第二富集。
本文公开的试验能够在非常短的时间期间通过活的李斯特菌检测污染。在一些实施方式中,试验还包含选择性抑制可能存在于样本中的非目标微生物的生长的筛选剂。当然,该筛选剂非常有可能还影响样本中李斯特菌的生长,但是程度较低。该选择性抑制的应用被认为降低了试验性能的变化性。考虑到筛选剂的存在以及试验的周期短(其要求由噬菌体有效感染目标细胞),关于李斯特菌修复的文献表明唤醒时间对于实现试验的最大性能来说是必要的。但是,如上所述,至少一种唤醒形式并不影响对于从食物加工设施收集的环境样本的试验性能。
为了确定筛选剂(吖啶黄0.012g/L,萘啶酸0.02g/L)的加入对在本公开的试验中李斯特菌的检测的影响,在0.5xBHI上制备单核细胞增多性李斯特菌菌株1839的过夜培养物的十倍稀释液(1x10-1至1x10-8),六个点的250μL每种稀释液在不锈钢表面干燥18h。作为阴性对照,六个点的无菌0.5xBHI也在表面上干燥。18小时后,用如本文所述的包含李氏肉汤的3M海绵棒擦拭点,将海绵在其袋子中在30℃下孵育2小时。2小时后,从海绵去除过量李氏肉汤(4-5mL),往三个海绵/稀释和三个阴性样本中加入6mL包含等份的的LP40::nluc、A511::nluc和LP124::nluc的总噬菌体为2.25x108pfu/mL的0.5xBHIgg(具有甘油和葡萄糖的半强度BHI)或SIB(BHIgg+筛选剂)。30℃下孵育4h后,挤压海绵,从每块海绵挤出400μL,离心,将300μL转移到新管中用于用300μL检测剂检测。为了确定检测极限,使用了三个阴性样本(基于组,要么具有BHIgg,要么具有SIB)。
如果筛选剂感染试验性能,试验的灵敏度将在包含筛选剂的组降低,和/或通过实验发现是阳性的、来自海绵的光的量(RLU)将比BHIgg低。如果相反没有影响,灵敏度和RLU在两组中将是类似的。
数据显示在表17中。对于每个样本报告的值表示为RLU/300μL每份海绵液体。表中没有涂阴影的单元格表示获得的RLU比LLOD高(识别为阳性结果),而涂阴影的单元格表示测量的TLU比LLOD低(识别为阴性结果)。报告的平均值表示三种海绵/稀释/条件的平均RLU。在每组(SIBvs.BHIgg)的阳性样本之间观察到的光输出并没有统计学上的差别(p>0.5),表明加入筛选剂并不影响从每个条件获得的信号的水平。
表17
由于已公知在检测活细胞存在之前需要将从环境样本收集的李斯特菌复苏,此结果是出乎意料的。此结果意味着在本试验的环境下可以使用筛选剂,而不降低实验性能。
实施例15:李斯特菌组(ListeriaPanel)
选择包括不同组合的李斯特菌物种和亚种的细菌菌株组来鉴定李斯特菌噬菌体。该组包括已经从多个地理和环境生态位(包括食物加工厂和食物零售点)分离的菌株。给予特别考虑以便从食物加工环境以足够的地理隔离获得细菌菌株,以使得细菌菌株组中的自然变化最大。
组合的组最初包含272个李斯特菌分离物,代表四种主要的李斯特菌物种(单核细胞增多性李斯特菌、无害李斯特菌、威氏李斯特菌和西尔李斯特菌)(表18)。在每个物种中,该组包括多种亚种的代表性分离物来保证足够深的覆盖,以允许一般来说数据到亚种的有意义的推断。细菌组的菌株的选取是基于食物环境中、以及与人类疾病相关的特定菌株的流行性。零售食物商店的环境筛选使用等位型来识别最常被识别的李斯特菌亚种,并鉴定了某些等位型常常在所识别的亚种的种群中高度代表。(Williams,S.K.etal.,JFoodProt74,63–77(2011);Sauders,B.D.etal.,ApplEnvironMicrobiol78,4420–4433(2012).)选择来自来自于食物和人类疾病的分离物的所代表的最常见的核糖核酸型的每一种的十(10)个单核细胞增多性李斯特菌来收集。这些种群很大程度上是重叠的,在流行性上具有很强的相关性,因此代表在识别食物加工厂方面最有用的菌株。当考虑基于在人类疾病和食物加工厂中被分离的核糖核酸型的单核细胞增多性李斯特菌的覆盖的宽度时,所构建的组分别表示大约86%和91%的覆盖率。每种单核细胞增多性李斯特菌选取10株的目的是允许识别群组中的自然变异,以保证单核细胞增多性李斯特菌物种的合理全面的覆盖。
为了扩大到单核细胞增多性李斯特菌以外,覆盖该属的其他物种,对于所述组考虑其他物种和亚种变化选择其他菌株。焦点也放在食物加工厂中通常被识别出的物种和亚种。选取代表威氏李斯特菌、无害李斯特菌和西尔李斯特菌的最常见的等位型的每一种的十(10)个分离物。构建的组覆盖Saunders等人识别的96%的无害李斯特菌、98%的西尔李斯特菌和100%的威氏李斯特菌核糖核酸型,提供了李斯特菌属的精确的表示法。因此,组合的李斯特菌宿主组为抗李斯特菌属的任何细菌噬菌体的宿主范围的分析充当工具。因此,该组可以被用于限定任何给定的噬菌体的目标细菌。
该组的成员的属、种和亚种提供在表18中。
表18
实施例16:基于板的噬菌体宿主范围试验
为了定量给定的细菌噬菌体的宿主范围,将在给定分离物上的细菌噬菌体的菌落形成效率对对于细菌噬菌体的参考菌株(其一般是用于制备细菌噬菌体的菌株)进行标准化。为了确定菌落形成效率,产生对于噬菌体的稀释系列,对每个宿主滴定。在本文报告的工作之前,这是噬菌体宿主范围分析的标准方法。请参见例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)。
使用李斯特菌细菌菌株小组确定特定细菌噬菌体的宿主范围。为了这样做,在5mlLBL1中开始培养要测试的每种李斯特菌菌株,在轨道振荡器中在30℃下过夜生长,并允许生长16小时。对于每个细菌宿主菌株,将30μL的16小时培养物与270μL新鲜LBL1培养基混合。对于每个细胞稀释液,加入4mlLBL1软琼脂,并覆盖在100mm培养皿中的LBL1琼脂上。使软琼脂覆盖层在室温下冷却并固化。此外,以与宿主范围分离物类似的方式处理参考菌株(对于A511和P100是FSLF6-367)。制备从10-1到10-8的在LBL1培养基中的细菌噬菌体的10倍稀释系列。将细菌噬菌体的5μL的每份稀释液点在软琼脂覆盖层上,让液体吸收,然后将板在30℃下孵育16小时。孵育后,对每个稀释系列中存在的噬菌斑进行计数,并与参考菌株比较,以提供对于每种宿主范围分离物的形成噬菌斑的有效性。宿主范围表示为,与参考菌株相比,在实验的宿主中观察到的滴度的百分比。显示出大于参考菌株的10%(表19,深灰色阴影)的成斑率的细菌菌株被认为在宿主范围内。显示出小于参考菌株的10%但大于参考菌株的.01%(表19,浅灰色阴影)的成斑率的细菌菌株被认为对于噬菌体是微弱敏感的。对于很多被测试的细菌菌株看到的现象是在文献和现有技术中作为“额外细胞杀死”(ECK)(表19,黑色)所述的现象,参见例如Shawetal.(JImmunolMethods.1983;56(1):75-83)。当在高噬菌体浓度时完全清除菌苔,但是随后的稀释液并不产生清除时,菌株以显示出对于特定噬菌体的ECK而被定义。
基于板的宿主范围确定允许A511和P100抗李斯特菌分离物库的宿主范围的粗略近似。在细菌菌株库中测试的272个菌株中,67个和120个菌株分别支持通过A511和P100形成噬菌斑(表19)。本方法的最大限制在于对于给定细菌噬菌体来处理整个库所需的时间的长度,以及因为ECK现象不能确定整个宿主范围。对于细菌噬菌体A511和P100,在测试的宿主范围小组的272个细菌菌株中分别有117和42个显示出ECK,因此不提供关于这些菌株的宿主范围的信息。此外,考虑到ECK现象,并且因为在板上生长的细菌和在液体培养物中生长的细菌之间的一般区别,假设基于板的确定宿主范围的方法可能不代表基于液体应用的宿主范围。
实施例17:液体培养物噬菌体宿主范围实验
由基于板的宿主范围方法中A511和P100两者证实的额外细胞杀死(ECK)现象的普遍性证实基于板的方法对于确定任一噬菌体的宿主范围并不如其可能的那么有用。为了克服那些缺陷,研发了一种新型的基于液体的宿主范围试验。基于液体的宿主范围试验是端点试验,其中噬菌体感染特定细菌分离物的能力通过比较含有或不含细菌噬菌体的培养物的光学密度来确定。
李斯特菌宿主小组菌株集合在脑心浸液(BHI)琼脂板上产生,将单个菌落接种在2ml96深孔皿中的1mlBHI液体中,用无菌透气的无菌膜覆盖,并在30℃下生长16小时。来自96孔板的每个16小时培养物以1:10000稀释在300μL平底光学96孔板中的198μLLBL1中,然后往96孔板的每个孔中加入1X105pfu的细菌噬菌体或等体积的LBL1。细菌噬菌体的该浓度和细菌细胞稀释液是为了在每孔中接近为1的感染倍数(MOI)。加入噬菌体或对照之后,将板边以50rpm摇动边在26℃下孵育16小时。将板放在96孔板酶标仪(BiotekEon微板酶标仪)上,用轨道振荡搅动3秒将从培养物沉淀出来的细胞重新悬浮。搅动之后,在600nm(OD600)波长光下测量每个孔的光学密度。使用在细菌噬菌体存在下的细菌分离物的OD600比未感染的细菌分离培养物的比例被作为确定细菌菌株感染的效率的度量。比例少于或等于0.4的细菌菌株(表19,深灰色阴影)被认为是对被细菌噬菌体感染是敏感的。
基于液体的宿主范围试验识别了细菌菌株小组中272个菌株中分别对于A511和P100敏感的192个和153个细菌菌株(表19)。该数据显示A511能够感染大概70%,P100能够感染大概58%的宿主范围小组。相比于基于液体的宿主范围,基于板的宿主范围方法识别了分别对于A511和P100证实了成斑率的62个和120个菌株。在基于板的宿主范围方法中识别的菌株中,仅仅8个对A511敏感的细菌菌株和3个对P100敏感的细菌菌株没有在基于液体的清除试验中显示出清除。由于基于液体的试验是末端试验,并表示了在细菌噬菌体感染和细菌细胞生长之间的动态相互作用,具有增加的细胞生长率的某些细菌菌株可能能够使得培养物饱和,即使该菌种易于感染,这可能解释了为何在基于噬菌斑的试验中识别的少量菌种并没有在液体试验中被识别的原因。
由基于液体的宿主范围试验识别的其他菌株是因为在基于板的宿主范围试验中表现出ECK表型的菌株上收集数据的能力。表现出该表型的大量菌株创造了关于A511和P100的宿主范围的大量未知信息。基于液体的试验消除了ECK现象——基于板的宿主范围方法的大的缺陷中的一个。两个因素导致了ECK的缺乏。首先,在基于液体的试验中使用的噬菌体的浓度为比在基于板的宿主范围试验中表现出ECK的噬菌体的浓度低的一组浓度。第二,在液体感染中的细菌噬菌体的离域浓度和低MOI降低了细菌细胞和细菌噬菌体之间的相互作用的数量。有限的相互作用减少了非生产性相遇的可能性,减少了重叠感染或者由细胞的多个细菌噬菌体的感染。通过消除ECK,大大提高了测量特定细菌细胞对于细菌噬菌体的易感性的敏感性,提供了跨李斯特菌物种的细菌噬菌体的宿主范围的更加准确的表示法。
相对于使用基于板的系统用于测量细菌噬菌体的宿主范围的现有技术方法,基于液体的宿主范围试验显示实质性的进步。在先文献并未报道以除了基于板的方法之外的形式使这些细菌噬菌体生长的能力。液体形式也是有用的,因为基于液体的宿主范围试验可以实施的速度提高了确定细菌噬菌体的宿主范围的速度,其对于如其被组合的小组从7-10天提高到动手劳动的几个小时。此外,宿主易感性的评分的高通量性质允许多个细菌噬菌体宿主范围被同时确定,这是先前并不存在的可能性。处理多个细菌噬菌体的能力同时允许通过使细菌培养物生理机能和培养基批次之间的差异最小化来更直接地比较细菌噬菌体。同时,提高的速度和直接的细菌噬菌体表征允许快速处理多个噬菌体并使得本文公开的细菌噬菌体工程优先化。此外,与基于板的宿主范围试验相比,基于液体的宿主范围试验允许更加准确地表示在预测的产品中的潜在的细菌噬菌体的功能性确定。提高的速度、更直接进行比较的能力、以更直接的方法来评估细菌噬菌体对于最终产品的的功能的组合使得基于液体的宿主范围试验在大多数情况下比基于板的宿主范围方法明显更加有用。
P100和A511细菌噬菌体的混合物的效力可以通过每个细菌噬菌体感染特定菌株的能力来确定。用P100和A511的混合物来感染宿主小组显示出从单个宿主范围的推断中预料的加和的宿主范围。根据对于感染过程期间生产最佳荧光素酶所需的细菌噬菌体浓度的观察,加入的细菌噬菌体的浓度维持在1X107的恒定的总噬菌体浓度,无论对于感染使用单一细菌噬菌体或多种噬菌体混合物。A511和P100的混合物显示被构建的小组的74%的覆盖率,而单个细菌噬菌体分别显示出70%和55%的覆盖率。(表19)该小组的增加的覆盖率来源于尽管噬菌体有很大程度上重叠的覆盖率,但是对于P100感染易感的菌株的子集并不完全包括在A511菌株中这一事实。从单个基于液体的宿主范围来推断细菌噬菌体混合物的功能的能力提供了识别和优先化用于设计以构造更加完整的混合物的新型细菌噬菌体的强大工具。
P100和A511的细菌噬菌体混合物对于从环境样本收集的样本的功能并不能从组合的宿主小组来严格推测出。在环境测试中取样的位点代表多种种群的细菌,通常在单个位置具有李斯特菌的超过一种的种或亚种。在具有地理和来源多样性的食物加工厂的环境取样识别了已经使用基于培养物的检测方法在第三方实验室中被证实为李斯特菌阳性的31个样本。在这31个阳性样本中,10个样本包括多个李斯特菌种或亚种。A511和P100混合物能够检测31个阳性样本中的24个(77%)。基于液体的宿主范围结果和收集的环境样本之间的相关性允许进行对要被制备的细菌噬菌体混合物的进一步迭代,以便获得李斯特菌属的更加全面的覆盖,并证实基于液体的宿主范围方法的有用性。
表19
实施例18:其他李斯特菌噬菌体的宿主范围表征
李斯特菌宿主菌株小组的构建和快速的基于液体的宿主范围试验的研发使得能够快速筛选其他细菌噬菌体,以识别将增加李斯特菌属的覆盖的宽度的那些细菌噬菌体。在基于液体的宿主范围试验中对于宿主小组筛选了25个其他细菌噬菌体,并基于清除比未感染的对照,分析了对于宿主的易感性。数据显示在表20中。如果菌株表现出0.4或更小的比率,则该菌株被认为在宿主范围内(深灰色阴影)。在确定培养物的OD600期间,对生长培养基或培养板的吸收率不存在修正,因此,0.09的比率构成了由感染完全清除的培养。因为由不同李斯特菌菌株得到的最大OD600的变化性,选择了保守的0.4的比率来表示对于给定细菌噬菌体敏感的李斯特菌菌株。具有大于0.4的OD600比率的菌株被认为在宿主范围之外(表20,未加阴影的)。基于细菌噬菌体提供有用的宿主小组覆盖、具有研发噬菌体靶向的载体的基因组序列可获得性并能够感染单核细胞增多性李斯特菌菌株EGD-e(最适于转化的李斯特菌菌株)的标准来从测试的这25个细菌噬菌体选择7个细菌噬菌体进入改造工程。
除了A511和P100之外被选取的7个细菌噬菌体为LP44、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125和LP143。没有被测试的个体噬菌体覆盖超过78%的李斯特菌宿主菌株小组。由基于液体的宿主范围实验测得,组合起来,细菌噬菌体覆盖大约92%的宿主菌株小组(表20)。该结合方法能够构建提供李斯特菌物种的必要覆盖的细菌噬菌体混合物,以提供李斯特菌存在于环境样本收集中的可靠确定。
用两种不同的遗传负载——萤火虫荧光素酶和Nano荧光素酶改造噬菌体的基因组之后,重新测试这些噬菌体的宿主范围来保证基因组修饰并不影响噬菌体的适应性,或者损害其感染目标细菌的能力。为了检测合并的细菌噬菌体在感染中的结果,使用基于液体的宿主范围试验来测试噬菌体感染的组合效果。对于这些感染,噬菌体的最终浓度保持在恒定的1X105pfu,其由混合物中的等量的每种噬菌体构成(即两种噬菌体混合物将由5X104pfu的这两种组分噬菌体中的每一种构成)。
表20A
表20B
表20C
表20D
实施例19:克隆并遗传修饰噬菌体T3
A.噬菌体捕获
以下列方式克隆并操作噬菌体T3。使用大肠杆菌DH10B作为宿主,让T3在LB培养基+2mM氯化钙中生长。通过用10%聚乙烯乙二醇8000在4℃下过夜孵育来浓缩噬菌体裂解物,然后离心。将沉淀重新悬浮在SM缓冲液中(Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001))。使用Norgen噬菌体DNA试剂盒(Cat#46700)从浓缩的T3裂解物制备DNA。使用T3的基因组序列(NCBI登记#NC_003298)来设计寡核苷酸以将T3捕获到pYES1L载体()中。所用的寡核苷酸是如下双链体:
CCTAGTGTACCAGTATGATAGTACATCTCTATGTGTCCCTCCTCGCCGCAGTTAATTAAAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGC[SEQIDNO:78]及其互补链,
以及如下双链体:
GAACGACCGAGCGCAGCGGCGGCCGCGCTGATACCGCCGCTCTCATAGTTCAAGAACCCAAAGTACCCCCCCCATAGCCC[SEQIDNO:79]及其互补链。
将所述寡核苷酸与纯化的T3DNA一起转化到感受态MaV203酵母细胞()中,将酵母人工染色体pYES1L转化的细胞在不含色氨酸的合成完全培养基上涂板,在pYES1L上选择TRP标记。通过PCR筛选在不含trp的合成完全培养基上生长的菌落,以显示T3基因组的成功捕获。
B.YAC到噬菌斑
包括pYES1L-T3噬菌体-YAC的被选择的MaV203细胞生长起来,制备玻璃珠裂解物(高阶遗传组装试剂盒),并电穿孔进入TOP10大肠杆菌中。将转化物与LB+2mM氯化钙顶层琼脂混合,并在LB+2mM氯化钙琼脂板上涂敷。过夜孵育显示出噬菌斑,这与捕获的噬菌体相符合。捕获的噬菌体通常每个转化产生1x102至1x104个噬菌斑。
C.荧光素酶插入克隆的T3噬菌体
设计表达盒(cassette)来插入T3基因组的不同位置。表达盒包含完整的荧光素酶开放阅读框,所述完整的荧光素酶开放阅读框被插入以取代内源T3基因,以使得荧光素酶表达由内源T3启动子驱动,然后由具有其自身启动子的URA3基因驱动,以及任选的荧光素酶基因的3’末端的直接重复。对T30.7和4.3基因进行插入。在T3::0.7luc中,将包含荧光素酶和URA3的表达盒调换到T30.7基因中。在T3::0.7DRluc中,将包含荧光素酶、URA3和荧光素酶基因的3’末端的直接重复的表达盒调换到T30.7基因中。在T3::4.3DRluc中,将包含荧光素酶、URA3和荧光素酶基因的3’末端的直接重复的表达盒交换到T34.3基因中。在T3::0.7IceuILuc中,将包含荧光素酶、URA3和ICeuI归航核酸内切酶位点的表达盒调换到T30.7基因中。
为了插入,将表达盒扩增为2种或3种PCR产物,一种包含荧光素酶和对噬菌体中第一位点的侧翼同源性,第二种包含具有对其它两种PCR产物的侧翼同源性的URA3基因,第三种包含荧光素酶的片段和对噬菌体染色体上不同位点的同源性。设计构建物来代替目标基因,而不缺失其它相邻序列。包含URA3的内部片段使用如下引物来扩增:
CCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTCCAAATTGTAAACGGATTCACCACTCCAAGA[SEQIDNO:80]
和
ATAATCATAGGTCCTCTGACACATAATTCGCCTCTCTGATTCAACGACAGGAGCACGATC[SEQIDNO:81]。
全长荧光素酶片段的3’末端由下列引物扩增:
AAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTTACAATTTGGACTTTCCGC[SEQIDNO:82]。
较短的荧光素酶片段的5’末端由下列引物扩增:
TCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAATCAGAGAGGCGAATTATGT[SEQIDNO:83]。
为了在T30.7基因处插入该重复框,全长荧光素酶片段的5’末端由下列引物扩增:
AATTTACTCTTTACTCTTACAGATAACAGGACACTGAACGATGGAAGACGCCAAAAACAT[SEQIDNO:84],
较短的荧光素酶片段的3’末端由下列引物扩增:
ATTCAGGCCACCTCATGATGACCTGTAAGAAAAGACTCTATTACAATTTGGACTTTCCGC[SEQIDNO:85]。
为了在4.3基因位点处插入,全长荧光素酶片段的5’末端由下列引物扩增:CTCACTAACGGGAACAACCTCAAACCATAGGAGACACATCATGGAAGACGCCAAAAACAT[SEQIDNO:86],
较短的荧光素酶片段的3’末端由下列引物扩增:
TGTTTGCGTGCTTGATTGATTTACTCATGTTGTGCTCCTATTACAATTTGGACTTTCCGC[SEQIDNO:87]。
在每种情况(0.7和4.3基因位点)下,创造3种PCR产物,一起转化到上述包含T3-YAC的酵母中。通过在缺乏尿嘧啶的情况下使细胞生长来选择重组产物。将在缺乏尿嘧啶的情况下生长的菌落通过PCR来筛选表达盒的存在。将通过PCR检测为阳性的菌落进行(上述)YAC至噬菌斑技术,以恢复活的噬菌体。随后通过PCR筛选这些噬菌体,以证实表达盒的存在。
D.在重组噬菌体中荧光素酶的表达
将大肠杆菌细胞的过夜培养物进行1/100稀释,并在LB+1mM氯化钙中生长到对数生长中期(大概两个半小时)。稀释细胞并用总共100μL的大量过量的噬菌体(每个感染1x107噬菌体)感染。让感染继续进行,在37℃下不摇动。90分钟后,将100μl的Steady-Glo荧光素酶检测试剂加入到20μl感染液中,并立即在GloMax20/20上读取感染液。被不同改造的噬菌体感染的细胞显示表达水平的一些变化,但是被T3::0.7Luc、T3::DRLuc、T3::4.3DRLuc和T3::0.7IceuILuc感染的细胞都表达了可检测水平的荧光素酶。
实施例20:克隆并遗传修饰噬菌体T7
A.噬菌体捕获
以与实施例19的被改造的T3噬菌体稍微不同的方式创建T7luc。
将T7dspB(T.K.LuandJ.J.Collins,“DispersingBiofilmswithEngineeredEnzymaticBacteriophage,”ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,vol.104,no.27,pp.11197-11202,July3,2007,通过引用结合到本文中)捕获在pYES1L中,其通过将T7dspB、YACpYES1L的基因组DNA——下列双链体:
TTGTCTTTGGGTGTTACCTTGAGTGTCTCTCTGTGTCCCTCCTCGCCGCAGTTAATTAAAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGC[SEQIDNO:88]及其互补链,
以及如下双链体:
CCCGAACGACCGAGCGCAGCGGCGGCCGCGCTGATACCGCCGCCGCCGGCGTCTCACAGTGTACGGACCTAAAGTTCCCCCATAGGGGGT[SEQIDNO:89]及其互补链
转化到MaV203酵母细胞()中。这些寡聚核苷酸桥接了T7基因组序列(NC_001604)和YAC载体的末端。
B.YAC至噬菌斑
如上所述,克隆的T7噬菌体被显示为能够从YAC至噬菌斑。
使包括pYES1L-T7dspB噬菌体-YAC的选择的MaV203细胞生长起来,制备玻璃珠裂解物(高阶遗传组装试剂盒),并电穿孔进入TOP10大肠杆菌中。将转化物涂板,过夜孵育显示出噬菌斑,这与捕获的噬菌体相符合。
C.荧光素酶插入克隆的T7噬菌体中
通过玻璃珠裂解物纯化T7-dspBYAC,用EcoRI和HindIII酶切。用下列引物扩增荧光素酶:
TAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGAAGACGCCAAAAACAT[SEQIDNO:89]
以及
CCAAGGGGTTAACTAGTTACTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACAATTTGGACTTTCCGC[SEQIDNO:90]。
双链的
ACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAAT[SEQIDNO:91]及其互补链也被用来修复HindIII酶切的YAC骨架。将酶切的YAC、荧光素酶PCR产物和双链修复寡核苷酸一起转化到MaV203酵母细胞()中,并在缺乏色氨酸的培养基上筛选,得到单个TRP+菌落。如上所述,工程噬菌体-YAC由PCR证实,并通过YAC至噬菌体技术转化到噬菌体颗粒中。
D.在感染重组噬菌体的大肠杆菌中的荧光素酶的表达
将大肠杆菌细胞的过夜培养物进行1/100稀释,并在LB+1mM氯化钙中生长到对数生长中期(大概两个半小时)。稀释细胞并用总共100μL的大量过量的噬菌体(每个感染1x107噬菌体)感染。让感染继续进行,在37℃下不摇动。90分钟后,将100μl的Steady-Glo荧光素酶检测试剂加入到20μl感染液中,立即在GloMax20/20上读取感染液。被T7::Luc噬菌体感染的细胞表达了可检测水平的荧光素酶。
虽然本发明参考其具体的实施方式进行了说明,但是本领域技术人员应理解可以进行多种改变,可以替代等价形式,而不偏离本发明的精神和范围。此外,可以进行多种变化将具体的情况、材料、物质的组成、方法、方法步骤或步骤适应于本发明的目的、精神和范围。所有这些变化都意在包括在本文随附的权利要求书的范围中。
Claims (36)
1.一种组合物,其包括:
能够感染从环境样本中获得的至少一种目标微生物的至少一种重组噬菌体,所述重组噬菌体包括编码标记物的异源核酸序列;以及
适用于在至少一种目标微生物中增殖至少一种重组噬菌体的至少一种水溶液,所述溶液包括:
a)至少一种营养物;
b)适用于抑制所述环境样本中至少一种非目标微生物的生长的至少一种筛选剂;
c)至少一种维生素;
d)至少一种二价金属;
e)能够维持所述组合物在pH7.0-7.5的至少一种缓冲试剂;
f)适用于中和在所述环境样本中存在的消毒剂的至少一种试剂;以及
g)用于防止荧光素分解的至少一种试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种重组噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、P100::ffluc、LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc或P100::nluc。
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种重组噬菌体以1x106至1x1011pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。
4.根据权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述至少一种重组噬菌体以1x107至1x108pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。
5.根据权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述至少一种重组噬菌体以1.5x107pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。
6.根据权利要求5所述的组合物,其特征在于,所述至少重组噬菌体包括3种重组噬菌体,并且每种重组噬菌体以1.5x107pfu/ml的浓度存在于所述组合物中。
7.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种营养物包括脑心浸液培养基。
8.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种筛选剂选自由LiCl、吖啶黄、萘啶酸和环己酰亚胺构成的组中。
9.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种维生素包括酵母提取物。
10.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种二价金属包括CaCl2。
11.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种缓冲试剂包括HEPES缓冲液。
12.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种中和试剂选自由非离子型清洁剂、去氧剂和乳化剂构成的组中。
13.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述至少一种中和试剂或用于防止荧光素分解的至少一种试剂选自由硫代硫酸钠、聚山梨醇酯80、HEPES和卵磷脂构成的组中。
14.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述水溶液包括1X脑心浸液培养基;0.5%LiCl;0.002%萘啶酸;0.2%酵母提取物;2mMCaCl2;40mMHEPES,pH7.4;1mM焦亚硫酸钠;0.1%硫代硫酸钠;0.5%聚山梨醇酯80;和0.1%卵磷脂。
15.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述水溶液包括半强度脑心浸液培养基、5%重量/体积葡萄糖、1%体积/体积甘油、1%重量/体积LiCl和0.002%重量/体积萘啶酸。
16.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述标记物是荧光素酶。
17.根据权利要求16所述的组合物,其特征在于,所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70%相同。
18.根据权利要求16所述的组合物,其特征在于,所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70%相同。
19.根据权利要求16所述的组合物,其特征在于,所述荧光素酶包括选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列。
20.根据权利要求16所述的组合物,其特征在于,所述标记物还包括亲和标签。
21.根据权利要求20所述的组合物,其特征在于,所述亲和标签是HIS标签。
22.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述目标微生物选自由下列各项组成的组中:沙门氏菌属、大肠型细菌、埃希氏杆菌属、志贺氏菌属、李斯特菌属、梭菌属、弧菌属、肠杆菌科、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、弯曲菌属、假单胞菌属、链球菌属、不动杆菌属、克雷白氏杆菌属、弯曲菌属和耶尔森菌属。
23.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述目标微生物是大肠杆菌。
24.根据权利要求22所述的组合物,其特征在于,所述目标微生物是选自于下列各项组成的组中的李斯特菌:无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)、威氏李斯特菌、付氏李斯特菌(Listeriafloridensis)、水生李斯特菌(Listeriaaquatic)、科氏李斯特菌(Listeriacornellensis)、沙燕属李斯特菌(Listeriariparia)和格兰德斯李斯特菌(Listeriagrandensis)。
25.一种试剂盒,包括:
根据权利要求1所述的组合物;以及
能够支持被至少一种目标微生物附着的固体基质。
26.一种测定环境样本中目标微生物存在或不存在的方法,包括:
收集环境样本;
使环境样本与能够感染从环境样本中获得的至少一种目标微生物的至少一种重组噬菌体接触,所述重组噬菌体包括编码标记物的异源核酸序列;
对暴露于噬菌体的环境样本提供足够使得所述重组噬菌体感染与环境样本相关联存在的目标微生物,并由目标微生物产生由异源核酸序列编码的标记物的条件;以及
测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,以确定目标微生物存在或不存在;
其中,从使环境样本与重组噬菌体接触到检测目标微生物存在或不存在的时间在1分钟至6小时之间。
27.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,所述至少一种重组噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc、P100::ffluc、LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc或P100::nluc。
28.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,对暴露于噬菌体的环境样本提供足够使得所述重组噬菌体感染与环境样本相关联存在的目标微生物的条件包括将暴露于噬菌体的环境样本暴露于适用于在至少一种目标微生物中增殖至少一种重组噬菌体的至少一种水溶液,所述溶液包括:
a)至少一种营养物;
b)适用于抑制所述环境样本中至少一种非目标微生物的生长的至少一种筛选剂;
c)至少一种维生素;
d)至少一种二价金属;
e)能够维持所述组合物在pH7.0-7.5的至少一种缓冲试剂;
f)适用于中和在所述环境样本中存在的消毒剂的至少一种试剂;以及
g)用于防止荧光素分解的至少一种试剂。
29.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,从使环境样本与重组噬菌体接触到检测目标微生物存在或不存在的时间为4小时或更少。
30.根据权利要求29所述的方法,其特征在于,从使环境样本与重组噬菌体接触到检测目标微生物存在或不存在的时间为1小时或更少。
31.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,以确定目标微生物存在或不存在包括在使环境样本与重组噬菌体接触30分钟之后检测到100个目标微生物细胞的检测下限。
32.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,以确定目标微生物存在或不存在包括在使环境样本与重组噬菌体接触60分钟之后检测10个目标微生物细胞的下限。
33.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,测试暴露于噬菌体的环境样本,以检测标记物存在或不存在,以确定目标微生物存在或不存在包括在使环境样本与重组噬菌体接触180分钟之后检测单个目标微生物细胞的下限。
34.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,对于环境样本,所述方法的准确率为至少90%,其中,对于包括代谢活性的目标微生物的对照样本,所述方法具有在约60分钟内被检测的约10个或更少个细胞的检测下限。
35.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,所述方法的特异性为至少90%。
36.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,所述方法的灵敏度为至少80%。
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