JP2021510508A - 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム - Google Patents

感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム Download PDF

Info

Publication number
JP2021510508A
JP2021510508A JP2020538028A JP2020538028A JP2021510508A JP 2021510508 A JP2021510508 A JP 2021510508A JP 2020538028 A JP2020538028 A JP 2020538028A JP 2020538028 A JP2020538028 A JP 2020538028A JP 2021510508 A JP2021510508 A JP 2021510508A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hours
bacteriophage
less
indicator
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2020538028A
Other languages
English (en)
Inventor
ミン ミンディ バオ グエン，
ミン ミンディ バオ グエン，
ホセ エス． ギル，
ホセ エス． ギル，
スティーブン エリクソン，
スティーブン エリクソン，
ドワイト ライマン アンダーソン，
ドワイト ライマン アンダーソン，
ジェシカ スタック，
ジェシカ スタック，
Original Assignee
ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス
ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス, ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス filed Critical ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス
Publication of JP2021510508A publication Critical patent/JP2021510508A/ja
Priority to JP2023181817A priority Critical patent/JP2023182818A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/60—Chemiluminescent detection using ATP-luciferin-luciferase system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

サンプル中の微生物（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）の迅速検出のための方法およびシステムが本明細書で開示される。後期遺伝子領域にインジケーター遺伝子を含む遺伝的に改変されたバクテリオファージも、開示される。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージなどのバクテリオファージの特異性は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．などの特異的微生物の検出を可能にし、アッセイ感度を最適化するためにインジケーターシグナルを増幅することができる。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６１６，９５６号；２０１８年２月９日出願の同第６２／６２８，６１６号；および２０１９年４月２４日出願の同第６２／６６１，７３９号に基づく優先権を主張する。米国特許出願第１３／７７３，３３９号、同第１４／６２５，４８１号、同第１５／２６３，６１９号、同第１５／４０９，２５８号および米国仮特許出願第６２／６１６，９５６号、同第６２／６２８，６１６号、および同第６２／６６１，７３９号の開示は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、感染性因子を使用する、微生物の検出のための組成物、方法、システムおよびキットに関する。
背景
生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および臨床サンプル中の細菌、ウイルス、および他の微生物の検出のための速度および感度を改善することには、強い重要性がある。微生物病原体は、ヒトおよび飼いならされた動物において実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。また、微生物の検出は、ある種の微生物（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）で汚染された食品の摂取によって引き起こされる生命を脅かすもしくは致命的な病気の大流行を考慮すると、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および疾病対策センター（ＣＤＣ）、ならびに米国農務省（ＵＳＤＡ）にとっての優先順位は高い。
細菌を検出するための旧来からの微生物学的試験は、非選択的および選択的な富化培養、続いて、選択培地にプレートし、さらに試験して、疑わしいコロニーを確認することに依拠する。このような手順には、数日を要し得る。種々の迅速な方法が研究されてきており、時間要件を低減するために、実務に導入されてきた。しかし、これらの方法には欠点がある。例えば、直接的イムノアッセイもしくは遺伝子プローブを伴う技法は、一般に、適切な感度を得るために、一晩の富化工程を要する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験はまた、増幅工程を包含し、従って、非常に高い感度および選択性の両方の能力がある；しかし、経済的に、ＰＣＲ試験に供され得るサンプルサイズは、制限される。薄い細菌懸濁物を用いると、大部分の小さな副次サンプルには、細胞がなく、従って、精製および／もしくは長々とした富化工程がなお必要とされる。
旧来の生物学的富化のために必要とされる時間は、上記サンプルの標的細菌集団の増殖速度によって、上記サンプルマトリクスの効果によって、および必要とされる感度によって、規定される。実際には、大部分の高感度法は、一晩のインキュベーションを使用し、全体的には約２４時間かかる。培養のために必要とされる時間に起因して、これらの方法は、同定される予定の生物および上記サンプルの供給源に依存して、最大で３日間かかり得る。この遅延時間（lag time）は、一般に、汚染された食品、水（もしくは他の生成物）は既に、家畜もしくはヒトの中へと入り込んでしまっている可能性があるので、不適切である。さらに、抗生物質耐性細菌および生体防御の懸念事項の増加により、水サンプル、食品サンプルおよび臨床サンプル中の細菌病原体の迅速同定が、世界的に欠くことのできない優先事項になっている。
従って、微生物（例えば、細菌および他の潜在的に病原性の微生物）のより迅速で簡単かつ感度の高い検出および同定が必要である。
要旨
本発明の実施形態は、微生物（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）の検出のための組成物、方法、システムおよびキットを含む。本発明は、種々の方法で具現化され得る。
いくつかの局面において、本発明は、バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む組換えバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、遺伝的に改変されたＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージゲノムである。ある種の実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ（以前は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉとして分類されていた）を特異的に認識するバクテリオファージに由来する遺伝的に改変されたＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態において、上記組換えバクテリオファージを調製するために使用されるバクテリオファージは、１またはこれより多くのＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に特異的に感染する。一実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、他のタイプの細菌の存在下で、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を区別し得る。
組換えインジケーターバクテリオファージのいくつかの実施形態では、上記インジケーター遺伝子はコドン最適化され得、内因性シグナルを生成する可溶性タンパク質生成物または基質との反応の際にシグナルを生成する可溶性酵素をコードし得る。いくつかの組換えバクテリオファージは、上記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に非翻訳領域をさらに含み、上記非翻訳領域が、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。上記ルシフェラーゼ遺伝子は天然に存在する遺伝子、例えばＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ遺伝子もしくはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子であってもよく、または、上記ルシフェラーゼ遺伝子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）などの遺伝子操作された遺伝子であってもよい。
本明細書においてまた開示されるのは、組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法である。いくつかの実施形態は、標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程、上記相同組換えプラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、形質転換された上記標的病原性細菌に、選択された上記野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、上記プラスミド／ベクターと上記バクテリオファージのゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程を含む。いくつかの実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、マイオウイルス（例えば、Ｔ４、Ｔ４様、またはＶｉｌ様）である。いくつかの実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に感染する（例えば、バクテリオファージＳａｋａ２またはＳａｋａ４）。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ファージＳａｋａ２およびＳａｋａ４は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらくマイオウイルスである。他の実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、ポドウイルス（例えば、Ｔ７様ウイルス、またはＳｐ６様ウイルス）である。他の実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、Ｓａｋａ１０である。Ｓａｋａ１０は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらく、Ｔ７ファージに関連するポドウイルスである。
いくつかの実施形態では。相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程が、選択された上記バクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然のヌクレオチド配列を決定する工程、上記ゲノムを注釈し、選択された上記バクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を同定する工程、上記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する工程であって、上記配列がコドン最適化インジケーター遺伝子を含む工程、および相同組換えのために設計された上記配列をプラスミド／ベクターに組み込む工程を含む。上記配列を設計する工程は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を含む遺伝子構築物を、上記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に挿入することを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ファージ後期遺伝子プロモーターは、上記ファージゲノム中のいかなる内因性プロモーターとも異なる、外因性プロモーターである。従って、いくつかの方法において、上記相同組換えプラスミドは、上記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流にバクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載される組換えインジケーターバクテリオファージを含む組成物である。例えば、組成物は、１種または複数種の野生型または遺伝的に改変された感染性因子（例えば、バクテリオファージ）および１種または複数種のインジケーター遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、同じまたは異なるインジケータータンパク質をコードおよび発現し得る、異なるインジケーターファージのカクテルを含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物を検出するための方法を包含し、上記方法は、上記サンプルを、上記目的の微生物に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで上記組換えバクテリオファージは上記バクテリオファージの後期遺伝子領域へと挿入されたインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程、および上記インジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、上記目的の微生物が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。
組換えインジケーターバクテリオファージを調製するための方法のいくつかの実施形態において、上記野生型バクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージであり、上記標的病原性細菌は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．である。いくつかの実施形態において、上記野生型バクテリオファージは、以前はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉとして分類されていた細菌に特異的に感染する。いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージの特定のクローンの単離は、上記インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを含む。
本発明の他の局面は、サンプル中の細菌（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）を検出するための方法であって、上記サンプルを、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程、および上記組換えバクテリオファージによって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．が上記サンプルに存在することを示す工程を含む、方法を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を標的化するバクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを使用して、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するための方法を含む。上記サンプルは、食品サンプルまたは水サンプルであり得る。
細菌を検出するための方法のいくつかの実施形態において、上記サンプルは、２４時間もしくはそれ未満、２３時間もしくはそれ未満、２２時間もしくはそれ未満、２１時間もしくはそれ未満、２０時間もしくはそれ未満、１９時間もしくはそれ未満、１８時間もしくはそれ未満、１７時間もしくはそれ未満、１６時間もしくはそれ未満、１５時間もしくはそれ未満、１４時間もしくはそれ未満、１３時間もしくはそれ未満、１２時間もしくはそれ未満、１１時間もしくはそれ未満、１０時間もしくはそれ未満、または９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、または２時間もしくはそれ未満の富化期間の間、成長を有利にする条件で最初にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、検出の前に富化されない。いくつかの実施形態において、結果までの合計時間は、２６時間未満、２５時間未満、２４時間未満、２３時間未満、２２時間未満、２１時間未満、２０時間未満、１９時間未満、１８時間未満、１７時間未満、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満または２時間未満である。いくつかの実施形態において、上記インジケーターを検出することによって生成されるシグナル 対 バックグラウンドの比は、少なくとも２．０または少なくとも２．５または少なくとも３．０である。いくつかの実施形態において、本方法は、食品安全産業にとって標準サイズのサンプル中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個程度の少なさの特異的細菌を検出する。
さらなる実施形態は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するためのシステムおよびキットを含み、上記システムまたはキットはＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態は、上記組換えバクテリオファージによって発現される可溶性タンパク質生成物を検出するための、インジケーターと反応させるための基質をさらに含む。これらのシステムまたはキットは、本発明のバクテリオファージ、組成物および方法に関して記載される特徴を含み得る。さらに他の実施形態において、本発明は、本発明による方法またはシステムと使用するための非一時的なコンピューター可読媒体を含む。
本発明は、非限定的な図面を参照することによってよりよく理解され得る。
図１は、バクテリオファージの後期（クラスＩＩＩ）領域に挿入された、ルシフェラーゼ遺伝子、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーター、およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む遺伝子構築物の挿入を図示する、本発明の一実施形態に従うインジケーターファージ構築物を示す。上記示されたプロモーターは、内因性後期遺伝子（例えば、主要カプシドタンパク質（ＭＣＰ）の遺伝子）の上流に、上記内因性後期遺伝子プロモーターに加えてあるか、またはそれとは別個にある。
図２は、CRONOBACTERから得られたバクテリオファージＳＡＫＡ２（マイオウイルス（Ｔ４バクテリオファージに関連）のゲノムを示す。ＰＧ７テールシースタンパク質に相同な仮定遺伝子は、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子からなる後期遺伝子領域の周囲にある。他の示される後期遺伝子は、公知の頭頂部（ｈｅａｄ ｖｅｒｔｅｘ）タンパク質ホモログ、ＯＲＦ５８．１、おそらく主要カプシドタンパク質、および公知の外側頭部タンパク質のホモログである。これらのビリオンタンパク質は非常に高レベルで発現されるので、この領域に挿入された任意の遺伝子は、後期遺伝子プロモーターおよび／または他の類似の制御エレメントが使用される限りにおいて、類似の発現レベルを有すると予想され得る。
図３は、３種の異なるファージに対して、相同組換えを促進するために挿入部位の上流および下流にマッチするファージ配列のおよそ５００ｂｐとともにルシフェラーゼ遺伝子を有する２種の相同組換えプラスミド構築物設計を示す。ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼは、専念されるファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む上流の非翻訳領域とともに、ｐＵＣ５７．ＡｍｐＲプラスミド骨格に挿入される。ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒファージＳａｋａ２およびＳａｋａ４は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらくマイオウイルスであった。各構築物は、主要カプシドタンパク質遺伝子のフラグメントからなる５００ｂｐの相同配列、続いて、Ｔ４後期遺伝子プロモーター（これは、ファージゲノム中の主要カプシドタンパク質の上流にある内因性後期遺伝子プロモーターに対する付加である）、ルシフェラーゼ遺伝子、および相同組換えのための下流のマッチする配列のおよそ５００ｂｐからなった。Ｓａｋａ９およびＳａｋａ１０は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらく、ポドウイルス（Ｔ７ファージに関連する）であり、これらは、Ｔ４後期遺伝子プロモーターの代わりに、Ｔ７様後期遺伝子プロモーターを要求した。
図４は、インジケーター遺伝子を発現する組換えファージを識別するために、一連の逐次的感染および希釈工程を使用して、プラスミド構築物（例えば、図３に示されるもの）を使用するバクテリオファージの改変からの組換えファージの単離を示す。
図５は、本発明の一実施形態に従って、細菌細胞の感染の間に、子孫ファージの複製から生成されるルシフェラーゼの検出を介して細菌細胞を検出するための、可溶性ルシフェラーゼをコードするインジケーターファージの使用を示す。
図６は、細菌および組換えファージがフィルタプレート上でインキュベートされ、子孫バクテリオファージの生成後にインジケータータンパク質がインキュベーション培地の除去なしに直接検出される、本発明の一実施形態に従う改変されたバクテリオファージを使用して目的の細菌を検出するためのフィルタープレートアッセイを記載する。
図７は、本発明の実施形態に従う改変されたバクテリオファージを使用して、目的の細菌を検出するための「濃縮なしアッセイ（Ｎｏ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）」を示す。
図８は、目的の微生物に対する抗体を使用して、インジケーター遺伝子を有する組換え感染性因子とインキュベートする前に、アッセイウェルの表面上に上記微生物を捕捉する、本発明の一実施形態に従う改変されたバクテリオファージを使用して、目的の細菌を検出するためのハイブリッドイムノ−ファージ（ＨＩＰ）アッセイを示す。
発明の詳細な説明
試験サンプル（例えば、生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および環境サンプル）中の目的の微生物（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）の検出に関して驚くべき感度を示す、組成物、方法およびシステムが本明細書で開示される。検出は、富化のための培養もなしに、もしくはいくつかの実施形態では最小限のインキュベーション時間（その間に、微生物が潜在的に増殖し得る）を伴って行われるアッセイにおいて、遺伝的に改変された感染性因子を使用して、以前に可能と考えられた時間枠より短い時間枠で達成され得る。また、試験サンプルとともにインキュベートするために、潜在的に高い感染多重度（ＭＯＩ）、もしくは高濃度のプラーク形成単位（ＰＦＵ）を使用することの成功は驚くべきである。このような高いファージ濃度（ＰＦＵ／ｍＬ）は、細菌検出アッセイにおいて有害であると以前に主張された。なぜならそれらは、「非感染溶菌（ｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｏｕｔ）」を引き起こすと主張されたからである。しかし、高濃度のファージは、少数の標的細胞の発見、結合および感染を容易にし得る。
本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ spp.などの微生物の検出において使用するための感染性因子を含み得る。ある種の実施形態において、本発明は、組換えバクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を有する該バクテリオファージを含む組成物を包含し得る。ある種の実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物の産生を生じる。ある種の実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、上記バクテリオファージの後期遺伝子（すなわち、クラスＩＩＩ）領域に挿入され得る。上記バクテリオファージは、ポドウイルス（例えば、Ｔ７、Ｔ７様）、マイオウイルス（例えば、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様（またはＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩによれば、Ｖｉ１ウイルス）、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ，特異的バクテリオファージ、または別の野生型もしくは操作されたバクテリオファージに由来し得る。いくつかの実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、Ｓａｋａ２またはＳａｋａ４である。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ファージＳａｋａ２およびＳａｋａ４は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらくマイオウイルスである。他の実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、ポドウイルス（例えば、Ｔ７様ウイルス）、またはＳｐ６様ウイルスである。他の実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、Ｓａｋａ１０である。Ｓａｋａ１０は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらくＴ７ファージに関連するポドウイルスである。
いくつかの局面において、本発明は、目的の微生物を検出するための方法を含む。上記方法は、上記目的の微生物（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）の検出のために感染性因子を使用し得る。例えば、ある種の実施形態において、上記目的の微生物は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．であり、上記感染性因子は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に特異的に感染するバクテリオファージである。従って、ある種の実施形態において、上記方法は、サンプルを、目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートすることによる、サンプル中の目的の細菌の検出を包含し得る。ある種の実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、インジケーター遺伝子を含む。上記インジケーター遺伝子は、ある種の実施形態において、上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入され得、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、インジケータータンパク質生成物の産生を生じる。上記方法は、上記インジケータータンパク質生成物を検出する工程を包含し得、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、上記目的の細菌が上記サンプルに存在することを示す。いくつかの実施形態では、上記インジケータータンパク質は、可溶性である。
ある種の実施形態において、本発明は、システムを包含し得る。上記システムは、本発明の組成物のうちの少なくともいくつかを含み得る。また、上記システムは、上記方法を行うために上記構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。ある種の実施形態において、上記システムは、キットとして編成される（formulated）。従って、ある種の実施形態において、本発明は、サンプル中のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ spp.などの目的の微生物の迅速検出のためのシステムを包含し得、上記システムは、上記サンプルを、上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素；および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含む。さらに他の実施形態において、本発明は、上記方法もしくはシステムとともに使用するためのソフトウェアを含む。
従って、本発明のいくつかの実施形態は、細菌の存在を示す検出可能なシグナルを増幅するためのバクテリオファージベースの方法を使用することによって、要求を解決する。ある種の実施形態において、１個程度のわずかな細菌が検出される。本明細書で適用される原理は、種々の微生物の検出に適用され得る。微生物の表面上に感染性因子のための多くの結合部位、感染の間に１００もしくはそれより多くの子孫因子を生成する能力、およびコードされたインジケーター部分の高レベル発現の潜在能力があるので、上記感染性因子もしくはインジケーター部分は、上記微生物自体より容易に検出可能であり得る。このようにして、本発明の実施形態は、実に単一感染細胞からの非常に大きなシグナル増幅を達成し得る。
本発明の局面は、サンプル中の特異的微生物を検出および／定量する手段として、感染性因子の結合構成要素などの、特定の微生物に結合し得る結合因子の高い特異性を利用する。いくつかの実施形態において、本発明は、感染性因子（例えば、バクテリオファージ）の高い特異性を利用する。
いくつかの実施形態において、検出は、上記目的の微生物に特異的な結合因子と関連付けられたインジケーター部分を通じて達成される。例えば、感染性因子は、インジケーター部分（例えば、可溶性インジケーターをコードする遺伝子）を含み得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーターは、上記感染性因子（例えば、バクテリオファージ）によってコードされ得、上記バクテリオファージは、インジケーターファージと示される。
本明細書で開示および記載される本発明のいくつかの実施形態は、単一微生物が特異的認識因子（例えば、ファージ）を結合し得るという発見を利用する。上記ファージの感染および複製の後に、子孫ファージは、ファージ複製の間に発現されるインジケーター部分を介して検出され得る。この原理は、微生物表面レセプターの特異的認識に基づいて、１もしくは数個の細胞からのインジケーターシグナルの増幅を可能にする。例えば、細菌の実に単一細胞を複数のファージに曝露し、その後、上記ファージの増幅、および複製の間に、コードされたインジケーター遺伝子生成物の高レベル発現を可能にすることによって、上記インジケーターシグナルは、上記単一細菌が検出可能であるように増幅される。
本発明の方法およびシステムの実施形態は、食品サンプル、水サンプルおよび商業サンプルからの病原体の検出があげられるが、これらに限定されない種々の環境における種々の微生物（例えば、細菌）の検出および定量に適用され得る。本発明の方法は、迅速に、高い検出感度および特異性を提供する。いくつかの実施形態において、検出は、上記バクテリオファージの単一の複製サイクル内で可能であり、このことは、予想外である。
定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有するべきである。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むべきであり、複数の用語は、単数を含むべきである。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。公知の方法および技術は、他に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって、および本明細書を通して考察される様々な一般のおよびより特定の参考文献において記載されているように一般に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造元の仕様によって行われる。本明細書に記載されている実験室の手順および技術に関連して使用される命名法は当技術分野で周知のものであり、一般に使用される。
下記の用語は、他に示さない限り、下記の意味を有すると理解すべきである：
本明細書において使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、他に特に留意しない限り、１つまたは複数を指すことができる。
「または」という用語の使用は、代替物のみを言及することが明確に示されない限り、または代替物が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ超を意味することができる。
本出願を通して、「約」という用語は、その値が、値を決定するために用いられているデバイス、方法についての固有の誤差の変動、または試料の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
「固体支持体」または「支持体」という用語は、その上に生体分子が結合し得る基材および／または表面を提供する構造物を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル（すなわち、例えば、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレート）であり得、または固体支持体は、フィルター、アレイ、または移動性の支持体（例えば、ビーズ）または膜（例えば、フィルタープレート、ラテックス粒子、常磁性粒子またはラテラルフローストリップ）上の位置であり得る。
「結合因子」という用語は、第２の（すなわち、異なる）対象分子に特異的および選択的に結合することができる分子を指す。相互作用は、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電相互作用もしくは疎水的相互作用の結果として非共有結合性であり得、あるいは相互作用は共有結合性であり得る。「可溶性結合因子」という用語は、固体支持体に会合（すなわち、共有結合または非共有結合）していない結合因子を指す。
本明細書で使用される場合、「分析物」とは、測定されている分子、化合物もしくは細胞をいう。目的の分析物は、ある種の実施形態において、結合因子と相互作用し得る。本明細書で記載される場合、用語「分析物」とは、目的のタンパク質もしくはペプチドをいい得る。分析物は、アゴニスト、アンタゴニスト、もしくはモジュレーターであり得る。あるいは、分析物は、生物学的効果を有しなくてもよい。分析物としては、低分子、糖、オリゴサッカリド、脂質、ペプチド、ペプチド模倣物、および有機化合物などが挙げられ得る。
用語「検出可能な部分」もしくは「検出可能な生体分子」もしくは「レポーター」もしくは「インジケーター」もしくは「インジケーター部分」とは、定量的アッセイにおいて測定され得る分子をいう。例えば、インジケーター部分は、基質を、測定され得る生成物に変換するために使用され得る酵素を含み得る。インジケーター部分は、生物発光の放射を生じる反応を触媒する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）であり得る。あるいは、インジケーター部分は、定量され得る放射性同位体であり得る。あるいは、インジケーター部分は、発蛍光団であり得る。あるいは、他の検出可能な分子が使用され得る。
本明細書で使用される場合、「バクテリオファージ」もしくは「ファージ」とは、複数の細菌のウイルスのうちの１種またはそれより多くを含む。本開示において、用語「バクテリオファージ」および「ファージ」は、生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母、および他の顕微鏡レベルの生存している生物に侵入し得るウイルスであって、そして上記生物を使用して、該ウイルス自体を複製するウイルスを指す、マイコバクテリオファージ（例えば、ＴＢおよびパラＴＢに関する）、マイコファージ（ｍｙｃｏｐｈａｇｅ）（例えば、真菌に関する）、マイコプラズマファージ、および任意の他の用語などのウイルスを含む。ここで、「顕微鏡レベルの」とは、最大寸法が１ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。バクテリオファージは、それらを複製する手段として、天然において細菌を使用するように進化したウイルスである。ファージは、このことを、ファージ自体を細菌に付着させ、そのＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）をその細菌の中に注入し、上記ファージを数百倍もしくはさらには数千倍も複製するようにその細菌を誘導することによって行う。これは、ファージ増幅ともいわれる。
本明細書で使用される場合、「後期遺伝子領域」とは、ウイルス生活環において後期に転写されるウイルスゲノムの領域をいう。上記後期遺伝子領域は、代表的には、最も豊富に発現される遺伝子（例えば、上記バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質）を含む。後期遺伝子は、クラスＩＩＩ遺伝子と同義であり、構造およびアセンブリ機能を有する遺伝子を含む。例えば、上記後期遺伝子（クラスＩＩＩと同義）は、ファージＴ７では、例えば、感染後８分から溶解するまでに、クラスＩ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）は、早期に４〜８分に、およびクラスＩＩは、６〜１５分に転写されるので、ＩＩおよびＩＩＩのタイミングは重なり合っている。後期プロモーターは、天然に位置し、このような後期遺伝子領域において活性であるプロモーターである。
本明細書で使用される場合、「富化のための培養」とは、旧来からの培養（例えば、微生物繁殖に都合のよい培地中でのインキュベーション）をいい、語句「富化」の他の考えられる使用（例えば、サンプルの液体構成要素を取り出して、その中に含まれる上記微生物を濃縮することによる富化）、または微生物繁殖の旧来の促進を含まない富化の他の形態と混同されるべきではない。ある期間にわたる富化のための培養は、本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において使用され得る。
本明細書で使用される場合、「組換え（recombinant）」とは他の方法では見いだされない遺伝的物質を一緒にするために、通常は実験室で行われる場合、遺伝的な（すなわち、核酸）改変をいう。この用語は、本明細書において用語「改変された」と交換可能に使用される。
本明細書において使用する場合、「ＲＬＵ」は、ルミノメーター（例えば、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６）または光を検出する類似の機器によって測定される、相対発光量を指す。例えば、ルシフェラーゼと適当な基質（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）とＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標））の間の反応物の検出が、検出されるＲＬＵでしばしば報告される。
本明細書で使用される場合、「結果までの時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｒｅｓｕｌｔｓ）」とは、サンプルインキュベーションの開始から結果が生成されるまでの時間総量をいう。結果までの時間は、いかなる確認試験時間も含まない。データ収集は、結果が生成された後の任意の時間で行われ得る。
サンプル
本発明の方法およびシステムの実施形態の各々は、サンプル中の微生物の迅速検出および定量を可能にし得る。例えば、本発明に従う方法は、優れた結果を有する、短縮した期間で行われ得る。
本発明によって検出可能な細菌細胞は、食品または水に由来する病原体である細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
サンプルは、液体、固体、または半固体であり得る。サンプルは、固体表面のスワブであり得る。サンプルとしては、環境物質（例えば、水サンプル）、またはサイクロンコレクターからの空気サンプルまたはエアロゾルサンプルに由来するフィルターが挙げられ得る。サンプルは、野菜、食肉、魚肉、家禽、ピーナッツバター、加工食品、乳児用調製粉乳、粉乳、茶、デンプン、卵、ミルク、チーズ、または他の酪農製品のサンプルであり得る。
いくつかの実施形態では、サンプルは、調製も、濃縮も、希釈もなしに、本発明の検出法において直接使用され得る。例えば、液体サンプル（ミルクおよびジュースが挙げられるが、これらに限定されない）は、直接アッセイされ得る。サンプルは、緩衝化溶液もしくは細菌培養培地が挙げられ得るが、これらに限定されない溶液中で希釈もしくは懸濁され得る。固体もしくは半固体であるサンプルは、液体中の固体を細かく刻むか、混合するかもしくは浸軟することによって、液体中に懸濁され得る。サンプルは、上記宿主細菌細胞へのバクテリオファージ付着を促進するｐＨ範囲内に維持されるべきである。サンプルはまた、２価カチオンおよび１価カチオン（Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、およびＣａ２＋が挙げられるが、これらに限定されない）の適切な濃度を含むべきである。好ましくは、サンプルは、上記サンプル内に含まれる任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。
検出アッセイのいくつかの実施形態では、上記サンプルは、上記サンプルに存在する任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。例えば、バクテリオファージが細菌細胞に付着している工程の間に、上記サンプルを、バクテリオファージ付着を促進する温度で維持することは、好ましい。バクテリオファージが感染細菌細胞内で複製されているかもしくはこのような感染細胞を溶解する工程の間に、上記サンプルを、バクテリオファージ複製および上記宿主の溶解を促進する温度で維持することは好ましい。このような温度は、少なくとも約２５摂氏度（Ｃ）、より好ましくは、約４５℃以下、最も好ましくは約３７℃である。
アッセイは、種々の適切なコントロールサンプルを含み得る。例えば、バクテリオファージを含まないコントロールサンプルまたは細菌なしのバクテリオファージを含むコントロールサンプルは、バックグラウンドシグナルレベルに関するコントロールとしてアッセイされ得る。
インジケーターバクテリオファージ
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、病原性微生物の検出において使用するための感染性因子を含み得る。ある種の実施形態において、本発明は、組換えインジケーターバクテリオファージを含み、ここで、バクテリオファージゲノムはインジケーターまたはレポーター遺伝子を含むように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、本発明は、バクテリオファージのゲノムに組み込まれるインジケーター遺伝子を有する組換えバクテリオファージを含む組成物を含み得る。
組換えインジケーターバクテリオファージは、レポーターまたはインジケーター遺伝子を含み得る。上記感染性因子のある種の実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、ある種の実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる。ある種の実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入され得る。後期遺伝子は構造タンパク質をコードするので、他のファージ遺伝子より高レベルで一般的に発現される。後期遺伝子領域はクラスＩＩＩ遺伝子領域であってよく、主要カプシドタンパク質のための遺伝子を含み得る。
いくつかの実施形態は、上記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する（および、任意選択で調製する）ことを含む。他の実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の上流に相同組換えのための配列を設計する工程（および必要に応じて調製する工程）を含む。いくつかの実施形態において、上記配列は、非翻訳領域の後にコドン最適化レポーター遺伝子を含む。非翻訳領域は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含み得る。
いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４または別の類似のファージに由来する。インジケーターバクテリオファージはまた、Ｔ４様、Ｔ７様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージ、またはＴ７、Ｔ７様、Ｔ４、Ｔ４様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージ、ＶｉＩ、もしくはＶｉＩ様（またはＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩによればＶｉ１ウイルス様）バクテリオファージと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％ 相同性を有するゲノムを有する別のバクテリオファージに由来し得る。いくつかの実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、Ｓａｋａ２またはＳａｋａ４である。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ファージＳａｋａ２およびＳａｋａ４は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらくマイオウイルスである。他の実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、ポドウイルス（例えば、Ｔ７様ウイルス）、またはＳｐ６様ウイルスである。他の実施形態において、上記選択された野生型バクテリオファージは、Ｓａｋａ１０である。Ｓａｋａ１０は、新たに単離されかつ配列決定されたファージ、おそらくＴ７ファージに関連するポドウイルスである。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、特定の病原性微生物に高度に特異的なバクテリオファージに由来する。遺伝的改変は野生型遺伝子の欠失を回避することができ、したがって、改変されたファージは多くの市販のファージよりも野生型感染性因子に類似のままでいることができる。環境に由来するバクテリオファージは、環境中で見いだされる細菌に対し、より特異的であり得、このように、市販のファージとは遺伝子的に異なり得る。
さらに、非必須であると考えられるファージ遺伝子は、認識されていない機能を有し得る。例えば、見かけは非必須の遺伝子は、アセンブリにおける巧妙な切断、適合、もしくはトリミング機能など、バーストサイズを上昇させることにおいて重要な機能を有し得る。それゆえ、遺伝子を欠失させてインジケーターを挿入することは、有害であり得る。大部分のファージは、それらの天然のゲノムより数パーセント大きいＤＮＡをパッケージし得る。この考察では、より小さなインジケーター遺伝子は、バクテリオファージ（特に、より小さなゲノムを有するバクテリオファージ）を改変するためのより適切な選択であり得る。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、わずか約２０ｋＤａ（コードするのに約５００〜６００ｂｐ）である一方で、ＦＬｕｃは、約６２ｋＤａ（コードするのに約１，７００ｂｐ）である。比較のために、Ｔ７のゲノムは約４０ｋｂｐである一方で、Ｔ４ゲノムは、約１７０ｋｂｐであり、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージのゲノムは約１５７ｋｂｐである。さらに、レポーター遺伝子は細菌によって内因的に発現されるべきでなく（すなわち、細菌ゲノムの一部でない）、高いシグナル対バックグラウンド比を生成するべきであり、タイムリーに容易に検出可能であるべきである。ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変されたＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン）と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、低いバックグラウンドで頑健なシグナルを提供し得る。
いくつかのインジケーターファージ実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、野生型ファージ遺伝子を無傷のままにして、機能的遺伝子の破壊を回避するために非翻訳領域へと挿入され得、これは、非実験室株の細菌に感染させる場合に、より大きな適合をもたらし得る。さらに、３つ全てのリーディングフレームに終止コドンを含めることは、リードスルー（発現漏れ（ｌｅａｋｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）としても公知）を低減することによって、発現を増加させる一助になり得る。このストラテジーはまた、上記ファージから分離できないバックグラウンドシグナル（例えば、ルシフェラーゼ）として現れる融合タンパク質が低レベルで作られるという可能性を排除し得る。
インジケーター遺伝子は、種々の生体分子を発現し得る。上記インジケーター遺伝子は、検出可能な生成物を発現する遺伝子もしくは検出可能な生成物を生成する酵素である。例えば、一実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素をコードする。種々のタイプのルシフェラーゼが使用され得る。代替の実施形態において、および本明細書でより詳細に記載されるように、ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたは工学技術で作製された（engineered）ルシフェラーゼのうちの１種である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子はＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）などの遺伝的に改変されたルシフェラーゼ遺伝子である。
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、上記後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域において非バクテリオファージインジケーター遺伝子を含む遺伝的に改変されたバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、後期プロモーターの制御下にある。ウイルス後期遺伝子プロモーターを使用することは、上記レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がウイルスカプシドタンパク質のように、高レベルで発現されるのみならず、内因性細菌遺伝子もしくはさらには初期ウイルス遺伝子のように停止もされないことを確実にする。
いくつかの実施形態において、上記後期プロモーターは、Ｔ４様、Ｔ７様、もしくはＶｉＩ様プロモーター、または上記選択された野生型ファージ（すなわち、遺伝的改変なし）において見出されたものに類似の別のファージプロモーターである。上記後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であり得、上記バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージ、またはＴ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、もしくはＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％ 相同性を有するゲノムを有する別の野生型バクテリオファージに由来し得る。
感染性因子に対する遺伝的改変は、核酸の小さなフラグメント、遺伝子の実質的部分、もしくは遺伝子全体の挿入、欠失、もしくは置換を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入もしくは置換された核酸は、非天然の配列を含む。非天然のインジケーター遺伝子は、バクテリオファージプロモーターの制御下にあるように、バクテリオファージゲノムへと挿入され得る。従って、いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、いくつかの実施形態において、遺伝的改変は、上記インジケータータンパク質生成物が上記野生型のバクテリオファージのポリペプチドを含まないように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記インジケータータンパク質生成物は、可溶性である。いくつかの実施形態において、本発明は、目的の細菌を検出するための方法を包含し、上記方法は、試験サンプルをこのような組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程を包含する。
いくつかの実施形態において、宿主細菌の感染後の子孫バクテリオファージにおけるインジケーター遺伝子の発現は、遊離の可溶性タンパク質生成物をもたらす。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、ファージ構造タンパク質をコードする遺伝子と連結していないので、融合タンパク質を生じない。カプシドタンパク質への検出部分の融合物（すなわち、融合タンパク質）を使用するシステムとは異なり、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性インジケーターまたはレポーター（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）を発現する。いくつかの実施形態において、上記インジケーターまたはレポーターは、理想的には、上記バクテリオファージ構造を含まない。すなわち、上記インジケーターまたはレポーターは、上記ファージ構造に結合されない。よって、上記インジケーターまたはレポーターの遺伝子は、上記組換えファージゲノムにおける他の遺伝子と融合されない。これは、上記アッセイの感度を大いに増大させ得（単一の細菌まで）、上記アッセイを単純化し得、上記アッセイが、検出可能な融合タンパク質を生成する構築物で必要とされるさらなる精製工程に起因する数時間とは対照的に、いくつかの実施形態に関しては、２時間もしくはこれより短い時間で完了することを可能にする。さらに、融合タンパク質は、例えば、酵素活性部位のコンホメーションもしくは基質へのアクセスを変化させ得るタンパク質折り畳みの制約に起因して、可溶性タンパク質より活性が低い場合がある。上記濃度が、１０ 細菌細胞／ｍＬサンプルである場合、例えば、２時間未満が、上記アッセイに十分であり得る。
さらに、定義による融合タンパク質は、上記バクテリオファージにおけるタンパク質のサブユニットに付着される部分の数を制限する。例えば、融合タンパク質のためのプラットフォームとして働くように設計された市販のシステムを使用すると、各Ｔ７バクテリオファージ粒子において遺伝子１０Ｂカプシドタンパク質の約４１５コピーに相当する、融合部分の約４１５コピーが生じる。この制約がなければ、感染した細菌は、上記バクテリオファージに適合し得るより多くの上記検出部分（例えば、ルシフェラーゼ）のコピーを発現すると予測され得る。さらに、大きな融合タンパク質（例えば、カプシド−ルシフェラーゼ融合物）は、上記バクテリオファージ粒子のアセンブリを阻害し得、そのようにして、より少ないバクテリオファージ子孫を生じる。従って、可溶性の非融合インジケーター遺伝子生成物が好ましいものであり得る。
いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、検出可能な酵素などのレポーターをコードする。上記インジケーター遺伝子産物は、光を生じ得、そして／または色の変化によって検出可能であり得る。種々の適切な酵素は、市販されている（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、もしくはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、上記インジケーター部分として働き得る。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、上記インジケーター部分である。他の工学技術で作製されたルシフェラーゼもしくは検出可能なシグナルを生成する他の酵素もまた、適切なインジケーター部分であり得る。
いくつかの実施形態では、可溶性検出部分の使用は、汚染している親ファージを、上記感染したサンプル細胞の溶解物から除去する必要性を排除する。融合タンパク質システムを用いると、サンプル細胞に感染させるために使用される任意のバクテリオファージは、付着される検出部分を有し、上記検出部分も含む娘バクテリオファージから区別できない。サンプル細菌の検出は、新たに作り出された（デノボ合成された）検出部分の検出に依拠するので、融合構築物の使用は、古い（親）部分を新たに作り出された（娘バクテリオファージ）部分から分離するためにさらなる工程を要する。これは、上記バクテリオファージの生活環の完了の前に、上記感染した細胞を複数回洗浄する工程、物理的もしくは化学的手段によって感染後に過剰な親ファージを不活性化する工程、および／または上記親バクテリオファージを結合部分（例えば、ビオチン）で化学的に改変する工程（これは、次いで、結合および分離され得る（例えば、ストレプトアビジン被覆セファロースビーズによって））によって達成され得る。しかし、除去時にすべてのこれら試みを使用したとしても、親ファージは、少ない数のサンプル細胞の感染を保証するために高濃度の親ファージが使用される場合に残存することができ、感染した細胞の子孫ファージからのシグナルの検出を不明確にし得るバックグラウンドシグナルを作り出す。
対照的に、本発明のいくつかの実施形態において発現される可溶性検出部分を用いると、最終溶解物からの上記親ファージの精製は不要である。なぜなら上記親ファージは、付着されるいかなる検出部分をも有しないからである。従って、感染後に存在する任意の検出部分は、感染した１個もしくは複数の細菌の存在を示して、新たに作り出されていなければならない。この利益を利用するために、親ファージの生成および調製は、細菌培養物中での親バクテリオファージの生成の間に生成された任意の遊離検出部分からの上記ファージの精製を含み得る。標準的なバクテリオファージ精製技術は、本発明に従うファージのいくつかの実施形態を精製するために使用され得る（例えば、スクロース密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度（isopycnic）密度勾配遠心分離、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、および透析または派生技術（例えば、Ａｍｉｃｏｎブランドの濃縮器 − Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｉｎｃ．）。塩化セシウム等密度超遠心分離は、親ファージ粒子を、上記細菌宿主中のファージの増殖の際に生成される汚染するルシフェラーゼタンパク質から分離するために、本発明の組換えファージの調製の一部として用いられ得る。このようにして、本発明の親組換えバクテリオファージは、上記細菌における生成の間に生成される任意のルシフェラーゼが実質的ない。上記ファージストックに存在する残りのルシフェラーゼの除去は、上記組換えバクテリオファージが試験サンプルとともにインキュベートされる場合に観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に低減し得る。
改変されたバクテリオファージのいくつかの実施形態において、上記後期プロモーター（クラスＩＩＩプロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ４、ＶｉＩ、もしくはＳａｋａに由来するもの）は、バクテリオファージ粒子へとアセンブリされる構造タンパク質の遺伝子を転写する同じバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼに対して高親和性を有する。これらのタンパク質は、上記ファージによって作製される最も豊富なタンパク質である。なぜなら各バクテリオファージ粒子は、これら分子の数十または数百ものコピーを含むからである。ウイルス後期プロモーターの使用は、最適には、ルシフェラーゼ検出部分の高レベルの発現を確実にし得る。上記インジケーターファージが由来する元の野生型バクテリオファージに由来するか、これに特異的であるかまたはこの下で活性である後期ウイルスプロモーター、（例えば、Ｔ４ベースの、Ｔ７ベースの、ＶｉＩベースの、またはＳａｋａベースのシステムを有するＴ４、Ｔ７、ＶｉＩ、またはＳａｋａ後期プロモーター）を使用すると、上記検出部分の最適な発現をさらに確実にし得る。標準的な細菌（非ウイルス／非バクテリオファージ）プロモーターの使用は、いくつかの場合では、発現に有害であり得る。なぜならこれらのプロモーターは、バクテリオファージ感染の間に（上記バクテリオファージがファージタンパク質生成のための細菌資源を優先するために）しばしばダウンレギュレートされるからである。従って、いくつかの実施形態において、上記ファージは、好ましくは、発現をファージ構造構成要素のサブユニットの数に制限しないゲノム内での配置を用いて、可溶性（遊離）インジケーター部分をコードし、高レベルで発現するように操作されている。
本発明の組成物は、１種または複数種の野生型または遺伝的に改変された感染性因子（例えば、バクテリオファージ）および１種または複数種のインジケーター遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、同じまたは異なるインジケータータンパク質をコードおよび発現し得る、異なるインジケーターファージのカクテルを含み得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージのカクテルは、少なくとも２種の異なるタイプの組換えバクテリオファージを含む。
インジケーターバクテリオファージを調製する方法
インジケーターバクテリオファージを作製する方法の実施形態は、遺伝的改変のための野生型バクテリオファージの選択から始める。いくつかのバクテリオファージは、標的細菌に高度に特異的である。このことは、高度に特異的な検出の機会を提供する。
従って、本発明の方法は、シグナルを増幅し、それによってサンプルに存在する低レベルの微生物（例えば、単一微生物）を検出する手段として、目的の特定の微生物を認識しかつこれに結合する、感染性因子と関連した、結合因子の高い特異度を利用する。例えば、感染性因子（例えば、バクテリオファージ）は、特定の微生物の表面レセプターを特異的に認識し、従って、それらの微生物に特異的に感染する。よって、これらの感染性因子は、目的の微生物を標的とするために適した結合因子であり得る。
本発明のいくつかの実施形態は、感染させて、目的の細菌の検出を容易にするための迅速かつ高感度の標的化のために、組換えバクテリオファージの結合の特異性および高レベルの遺伝子発現能を利用する。いくつかの実施形態において、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージは、レポーター遺伝子を含むように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの後期遺伝子領域が、レポーター遺伝子を含むように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、主要カプシド遺伝子の下流に配置される。他の実施形態において、レポーター遺伝子は、主要カプシド遺伝子の上流に配置される。いくつかの実施形態において、上記挿入された遺伝子構築物は、上記インジケーター遺伝子の発現を駆動するために、それ自体が外因性の、専用のプロモーターをさらに含む。上記外因性プロモーターは、上記ファージゲノムにおける任意の内因性プロモーターに加えて存在する。
バクテリオファージはポリシストロン性ｍＲＮＡ転写物を生成するので、単一のプロモーターのみが、転写物中の第１の遺伝子／シストロンの上流に必要とされる。従来の組換え構築物は、挿入された遺伝子を駆動するために内因性バクテリオファージプロモーターを使用するに過ぎない。対照的に、上記レポーター遺伝子およびリボソーム結合部位の上流にさらなるプロモーターを付加することは、転写のための第２の開始部位として作用することによって遺伝子発現を増大させ得る。ウイルスの複雑かつ小型のゲノムはしばしば、異なるフレームで、ときには２つの異なる方向で、重複する遺伝子を有する。
組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法のいくつかの実施形態は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．などの標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程、相同組換えプラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、形質転換された標的病原性細菌に、選択された野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、プラスミド／ベクターとバクテリオファージゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程を含む。
相同組換えプラスミドを設計し、調製する種々の方法が公知である。熱ショック、Ｆ線毛媒介細菌接合、エレクトロポレーションおよび他の方法を含めて、プラスミドで細菌を形質転換するための種々の方法が公知である。相同組換えの後、特定のクローンを単離するための種々の方法も公知である。本明細書に記載されるいくつかの方法の実施形態は、特定の戦略を利用する。
従って、インジケーターバクテリオファージを調製する方法のいくつかの実施形態は、標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、選択されたバクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然の配列を決定する工程、ゲノムを注釈し、選択されたバクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を同定する工程、主要カプシドタンパク質遺伝子に隣接した相同組換えのための配列を設計する工程であって、配列がコドン最適化レポーター遺伝子を含む工程、相同組換えのために設計された配列をプラスミド／ベクターに組み込む工程、プラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、形質転換された細菌について選択する工程、形質転換された細菌に、選択された野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、プラスミドとバクテリオファージゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、結果として生じる組換えバクテリオファージ溶解物の力価を決定する工程、および組換えバクテリオファージを富化し、単離するために限界希釈アッセイを行う工程を含む。いくつかの実施形態は、第１の限界希釈アッセイの後に、組換えバクテリオファージが混合物の検出可能な割合を表すまで、必要に応じて限界希釈および力価工程を繰り返すことをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する前に、混合物中のバクテリオファージの少なくとも１／３０が組換え型になるまで、限界希釈および力価工程が繰り返され得る。１：３０ 組換え：野生型の比は、いくつかの実施形態において、９６個のプラークあたり（例えば、９６ウェルプレートにおいて）、平均３．２形質導入単位（ＴＵ）を生じると予想される。組換えファージ ： 野生型ファージの初期比は、米国特許出願第１５／４０９，２５８号に以前に記載されるように、ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量５０％）に基づく限界希釈アッセイを行うことによって決定され得る。ポワソン分布によって、１：３０比は、９６ウェルのどこかで少なくとも１ ＴＵを観察するという９６％の可能性を生じる。
図１は、本発明の組換えインジケーターバクテリオファージのゲノム構造の模式的代表図を示す。図１に示される実施形態に関して、上記検出部分は、ウイルス生活環において後期に発現される、後期（クラスＩＩＩ）遺伝子１１０内に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子１００によってコードされる。後期遺伝子は、他のファージ遺伝子より概して高レベルで発現される。なぜならそれらは、構造タンパク質をコードするからである。従って、図１に示される組換えファージの実施形態において、上記インジケーター遺伝子（すなわち、ルシフェラーゼ）は、後期遺伝子領域へと、主要カプシドタンパク質（ＭＣＰ）の遺伝子１２０の直後に挿入され、ルシフェラーゼ遺伝子１００を含む構築物である。いくつかの実施形態において、図１に示される構築物は、ルシフェラーゼが、融合タンパク質の作製を介してＭＣＰ遺伝子生成物へと組み込まれないことを確実にするために、全３つのリーディングフレームにおいて終止コドンを含み得る。図１にも示されるように、上記構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現を駆動するために、さらなる専用の後期プロモーター１３０を含み得る。上記構築物はまた、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）１４０を含む。この構築物は、可溶性ルシフェラーゼが生成され、その結果、発現が、ファージディスプレイシステムにおいて固有のカプシドタンパク質の数に制限されることを確実にする。
本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明の感染性因子の生成のための環境から単離されている感染性因子を利用することは、好ましいことであり得る。このようにして、天然に由来する微生物に特異的な感染性因子が、生成され得る。
例えば、図２は、バクテリオファージＳＡＫＡ２（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に特異的に感染する野生型バクテリオファージ）のゲノムを示す。実施例で考察されるように、上記主要カプシドタンパク質および種々の他の構造遺伝子は、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子からなる後期遺伝子領域内にある。ＰＧ７テールシースタンパク質遺伝子（ヌクレオチド７４４２４〜７７２２１）に相同な仮定遺伝子は、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子からなる後期遺伝子領域の周辺にある。他の示される後期遺伝子は、公知の頭頂部タンパク質のホモログ（ヌクレオチド７７１１５〜７７６５３）、ＯＲＦ５８．１（ヌクレオチド７７６９３〜７８６１０）、おそらく主要カプシドタンパク質、および公知の外側頭部タンパク質のホモログ（ヌクレオチド８０２４８〜８１８４０）である。これらビリオンタンパク質が非常に高レベルで発現されるので、この領域へと挿入された任意の遺伝子が、後期遺伝子プロモーターおよび／または他の類似の制御エレメントが使用される限りにおいて、類似の発現レベルを有すると予想され得る。
プラスミドを調製するために、多数の公知の方法および商品がある。例えば、プラスミドを調製するために、ＰＣＲ、部位特異的変異誘発、制限消化、ライゲーション、クローニングおよび他の技法が組み合わせて使用され得る。合成プラスミドを商業的に注文することもできる（例えば、ＧｅｎｅＷｉｚ）。バクテリオファージゲノムを選択的に編集するために、コスミドを用いることもでき、または、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムも使用され得る。組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法のいくつかの実施形態は、組換えゲノムを生成するために野生型バクテリオファージゲノムで容易に組み換え得るプラスミドを設計することを含む。プラスミドの設計において、いくつかの実施形態は、ルシフェラーゼ遺伝子などのコドン最適化レポーター遺伝子の付加を含む。いくつかの実施形態は、上流の非翻訳領域へのエレメントへの付加をさらに含む。例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージゲノムで組み換えるためのプラスミドの設計では、ｇｐ２３／主要カプシドタンパク質のＣ末端をコードする配列とＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）レポーター遺伝子の開始コドンとの間に上流非翻訳領域を付加し得る。非翻訳領域は、プロモーター、例えばＴ４、Ｔ４様、Ｔ７、Ｔ７様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージ、ＶｉＩまたはＶｉＩ様プロモーターを含み得る。非翻訳領域は、細菌システムで「シャインダルガルノ配列」としても公知である、リボソーム進入／結合部位（ＲＢＳ）を含むこともできる。これらのエレメントのいずれかまたは両方、または他の非翻訳エレメントは、ファージゲノムの残りとほぼ同じＧＣ含量を含むランダム配列でできている短い上流非翻訳領域の中に埋め込まれ得る。ランダム領域はＡＴＧ配列を含むべきでないが、その理由は、それが開始コドンとして作用するからである。
本発明の組成物は、種々の感染性因子および／またはインジケーター遺伝子を含み得る。例えば、図３は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に特異的なインジケーターファージを作製するにあたって使用される２種の相同組換えプラスミド構築物を示す。構築物を作製し、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ファージＳａｋａ２、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ファージＳａｋａ４、またはＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ファージＳａｋａ１０との組換えにおいて使用して、本発明の組換えバクテリオファージを生成した。図３における第１の構築物は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ファージＳａｋａ２およびＳａｋａ４の両方へのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼの相同組換え挿入のために使用される組換えプラスミドの一般的模式図を、各々、それぞれのファージ：相同組換えプラスミド ｐＵＣ５７．ＨＲ．Ｓａｋａ２．ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）およびｐＵＣ５７．ＨＲ．Ｓａｋａ４．ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）に相当する上流および下流の相同な配列の５００ｂｐとともに示す。
図３における下の構築物は、Ｓａｋａ２またはＳａｋａ４のいずれによっても十分に感染しないＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ株を標的とするために、Ｓａｋａ１０（ポドウイルス）へのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼの相同組換え挿入のために使用される組換えプラスミドを示す：相同組換えプラスミドｐＵＣ５７．ＨＲ．Ｓａｋａ１０．ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）。
ある種の実施形態において、プラスミドは、ｐＵＣ５７．ＨＲ．Ｓａｋａ２．ＮａｎｏＬｕｃと称される。上記検出／インジケーター部分は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）レポーター遺伝子３００によってコードされる。上記挿入物（一連の四角形によって表される）は、ｐＵＣ５７の標準的ＡｍｐＲバージョン３１０の中にある。上流の相同組換え領域は、主要カプシドタンパク質Ｃ末端フラグメントの５００ｂｐ ３２０、５’非翻訳領域内のＴ４様ファージ後期プロモーターコンセンサス配列およびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム進入／結合部位３３０からなる。コドン最適化ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）レポーター遺伝子３００は、直後に続く。下流の相同組換え３４０からなる非翻訳領域（ＵＴＲ）および仮定タンパク質Ｎ末端フラグメントは、相同組換え領域の最後にある。
ある種の実施形態において、プラスミドは、ｐＵＣ５７．ＨＲ．Ｓａｋａ１０．ＮａｎｏＬｕｃと称される。上記検出／インジケーター部分は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーター遺伝子３８０によってコードされる。上記挿入物（一連の四角形によって表される）は、ｐＵＣ５７の標準的なＡｍｐＲバージョン３６０の中にある。上流の相同組換え領域は、主要カプシドタンパク質Ｃ末端フラグメントの５００ｂｐ ３６０、５’非翻訳領域内のＴ７ファージ後期プロモーターコンセンサス配列およびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム進入／結合部位３７０からなる。コドン最適化ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）レポーター遺伝子３５０は、直後に続く。下流の相同組換え３８０からなる非翻訳領域（ＵＴＲ）および仮定タンパク質Ｎ末端フラグメントは、相同組換え領域の最後にある。上記主要カプシドタンパク質フラグメントは、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子の一部である。これらのビリオンタンパク質が非常に高レベルで発現されるので、この領域に挿入される任意の遺伝子は、後期遺伝子プロモーターおよび／もしくは他の類似の制御エレメントが使用される限りにおいて、類似の発現レベルを有すると予測され得る。
いくつかの実施形態において、本発明に従うインジケーターファージは、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を含むように遺伝的に操作されたＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージを含む。例えば、インジケーターファージは、ゲノムが上記ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子の配列を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージであり得る。組換えＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的ＮａｎｏＬｕｃバクテリオファージゲノムは、Ｔ４、Ｔ７、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的、ＶｉＩ、Ｓａｋａバクテリオファージのコンセンサスプロモーターまたは別の後期プロモーターをさらに含み得る。さらなる実施形態において、上記プロモーターは、外因性プロモーターである。インジケーター遺伝子の発現を駆動するための外因性プロモーターの挿入は、発現が他のファージタンパク質（例えば、主要カプシドタンパク質）の発現によって制限されるという点で有利である。
従って、組換えの結果として生成される組換えファージの実施形態において、上記インジケーター遺伝子（すなわち、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標））は、主要カプシドタンパク質をコードする遺伝子のすぐ下流の後期遺伝子領域に挿入され、従って、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子を含む組換えバクテリオファージゲノムを作り出す。上記構築物は、上記ルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現を駆動するために、Ｔ４、Ｔ７、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージ、ＶｉＩのコンセンサスプロモーター、または別の後期プロモーターまたは別の適切なプロモーターをさらに含む。上記構築物はまた、いくつかのＵＴＲから合成される複合非翻訳領域を含み得る。この構築物は、可溶性ルシフェラーゼが生成され、その結果、発現がファージディスプレイシステムにおいて固有のカプシドタンパク質の数に制限されないことを確実にする。
図４は、相同組換えから得られる野生型および組換えバクテリオファージの混合物からの組換えファージの単離を示す。第１の工程４０２において、相同組換えプラスミドで形質転換されたＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．細菌は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．バクテリオファージＳａｋａ２で感染され、野生型 対 組換えファージの非常に低い比率で親ファージと組換えファージとの混合物を有する子孫ファージを生じる４３４。その生じた組換えファージ混合物を、９６ウェルプレート４０６へと希釈して４０４、平均５ 組換え形質導入単位（ＴＵ）／プレート（９．３ ＰＦＵ／ウェル）を与える。上記９６ウェルプレートを、ルシフェラーゼ活性についてアッセイして、組換えファージを含むウェル４３６を、野生型バクテリオファージを含むウェル４４０と比較して識別する。細菌４３８を添加する４０８； 例えば、各ウェルは、約５０μＬの混濁したＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ培養物を含み得る。これは、上記ファージが、複製しかつルシフェラーゼ酵素４４２を生成することを可能にする。４１０に示される３７℃での５時間のインキュベーションの後に、ウェルを、ルシフェラーゼ４４２の存在に関してスクリーニングし得る。任意の陽性ウェルは、おそらく、単一の組換えファージを接種されており、この段階では、上記混合物は、およそ１０ 野生型ファージ： １ 組換えの比（元の比を超える富化）を含み得る。必要な場合（すなわち、組換え：全体の比が１：３０より低い場合）、この富化された培養物４１２からの子孫を、さらなる限界希釈アッセイ４１４に供して、上記比を増大させ得、組換えファージ形質導入単位の実際の濃度を決定し得る。例えば、上記比が１：３８４ 組換え：ＰＦＵであった場合、約５ 組換え体ＴＵとともに１９２０の合計汚染ファージ（５×３８４＝１９２０）／９６ウェルプレート４１６が、以前の陽性ウェルからアリコートに分けられてもよく４１４、第２の希釈アッセイプレートの２０の大部分が野生型ファージ／ウェル（１９２０ ＰＦＵ／９６ウェル＝２０ ＰＦＵ／ウェル）というおよその接種をもたらす４２０。任意の陽性ルシフェラーゼウェルは、おそらく、１９ 野生型ファージとともに単一の組換え体で接種されることになる。これらのウェルを、ルシフェラーゼ４４２の存在に関して分析し得る。
細菌の添加およびインキュベーション（例えば、３７℃で５時間）４１８の後に、可溶性ルシフェラーゼおよびファージは、およそ２０ 合計：１ 組換え体において存在する４２０。この比は、組換え体のＴＵ５０力価測定、細胞殺滅の代わりにルシフェラーゼ活性をスコア付けする組織培養物感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）アッセイに基づく限界希釈アッセイ、および合計ＰＦＵに対するプラークアッセイによって検証され得る。最終的には、プラークアッセイを行って４２２、ルシフェラーゼを発現する組換え体をスクリーニングし得る４４６。少数の個々の（例えば、ｎ＝４８）プラークを、個々に拾い上げ、ルシフェラーゼ活性４３６に対して第３のマルチウェルプレート４２６においてスクリーニングしてもよい。一実施形態において、このアプローチは、十分なプラークがスクリーニングされるので、約３ 組換え体が、組換え体 対 合計ファージの既知の比に基づいてスクリーニングされるプラークの混合物中にあることを保証するべきである。１個のプラークを、上記プレートから９６ウェルプレート４２４の各ウェルへと取り出し得、ルシフェラーゼアッセイを、どのウェルがルシフェラーゼ活性４４２を示すファージを含んだかを決定するために行い得る４２６。ルシフェラーゼ活性を示すウェル４２８は、純粋な組換えファージ４３４を表す一方で、ルシフェラーゼ活性なしのウェル４３０は、純粋な野生型ファージ４３２を表す。
次いで、個々のプラークは、緩衝液（例えば、１００μＬ ＴＭＳ）もしくは培地中に懸濁され得、アリコート（例えば、約５μＬ）が濁ったＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ培養物を含むウェルに添加され得、インキュベーション（例えば、３７℃で約４５分〜１時間）後にアッセイされ得る。陽性ウェルは、組換えファージの純粋培養物を含むと予測される。ある種の実施形態は、プラーク精製のさらなるラウンドを含み得る。
従って、図４によって図示されるように、野生型ファージゲノムでの組換えのために設計されたプラスミドの相同組換えによって生成される組換えファージは、全ファージゲノムのうちの非常に小さな百分率（例えば、０．００５％）を含む混合物から単離され得る。単離後に、大規模生産を、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．検出アッセイにおいて使用するために適した高力価組換えインジケーターファージストックを得るために行い得る。さらに、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離は、ファージ粒子を、汚染するルシフェラーゼタンパク質から分離して、バックグラウンドを低減するために使用され得る。
Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するために感染性因子を使用する方法
本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明は、微生物を検出するための感染性粒子を使用するための方法を包含し得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。
一実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の細菌を検出するための方法であって、サンプルを目的の細菌に感染するバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで、バクテリオファージは、インジケーター遺伝子を含み、その結果、目的の細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間のインジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程、およびインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここでインジケータータンパク質生成物の陽性検出は目的の細菌がサンプル中に存在することを示す工程を含む、方法を含み得る。
ある種の実施形態において、異なるサンプルタイプまたはサイズおよびアッセイフォーマットに適合するように改変し得る一般的な概念を利用して、アッセイが行われ得る。本発明の組換えバクテリオファージ（すなわち、インジケーターバクテリオファージ）を使用する実施形態は、サンプルタイプ、サンプルサイズ、およびアッセイ形式に応じて、１．５時間、２．０時間、２．５時間、３．０時間、３．５時間、４．０時間、４．５時間、５．０時間、５．５時間、６．０時間、６．５時間、７．０時間、７．５時間、８．０時間、８．５時間、９．０時間、９．５時間、１０．０時間、１０．５時間、１１．０時間、１１．５時間、１２時間、１２．５時間、１３．０時間、１３．５時間、１４．０時間、１４．５時間、１５．０時間、１５．５時間、１６．０時間、１６．５時間、１７．０時間、１７．５時間、１８．０時間、１８．５時間、１９．０時間、１９．５時間、２０．０時間、２１．０時間、２１．５時間、２２．０時間、２２．５時間、２３．０時間、２３．５時間、２４．０時間、２４．５時間、２５．０時間、２５．５時間または２６．０時間未満の合計アッセイ時間で、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．などの特定の細菌株の迅速検出を可能にし得る。例えば、必要とされる時間量は、バクテリオファージの株およびこのアッセイで検出される細菌の株、試験されるサンプルのタイプおよびサイズ、標的の生存性のために必要とされる条件、物理的／化学的環境の複雑性、ならびに「内因性」の非標的混在細菌の濃度に応じて、若干より短いかまたは長くてもよい。
図５は、本発明の実施形態に従って可溶性ルシフェラーゼを生成するインジケーターファージを使用するストラテジーを示す。この方法では、ファージ（例えば、Ｔ７、Ｔ４、Ｓａｋａ２、Ｓａｋａ４、Ｓａｋａ９またはＳａｋａ１０ファージ）が、上記ファージの複製の間に、可溶性ルシフェラーゼを発現するように操作され得る。ルシフェラーゼの発現は、ウイルスカプシドプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ７またはＴ４の後期プロモーター）によって駆動され、高発現を生じる。親ファージは、ルシフェラーゼを含まないので、上記アッセイにおいて検出されるルシフェラーゼは、上記細菌細胞の感染の間に子孫ファージの複製から生じなければならない。従って、概して、上記親ファージを上記子孫ファージから分離する必要はない。
これらの実験において、定量されるべき細菌５０２を含むサンプル５００のうちの少なくとも一部は、スピンカラムフィルタに配置され、ＬＢブロスを除去するために遠心分離され、可溶性ルシフェラーゼ５０３を発現するために遺伝的に操作された適切な多重度のファージ５０４が添加される。上記感染細胞は、子孫ファージの複製および細胞溶解が起こるために十分な時間（例えば、３７℃で３０〜１２０分）にわたってインキュベートされ得る。次いで、溶解物中の上記親ファージ５０４および子孫ファージ５１６＋遊離ルシフェラーゼ５０３は、例えば、遠心分離によって集められ得、濾液中のルシフェラーゼのレベルは、ルミノメーター５１８を使用して定量され得る。あるいは、ハイスループット法（ここで細菌サンプルが９６ウェルフィルタープレートに適用される）が使用され得、上記で列挙した全ての操作が行われた後に、最終の遠心分離工程なしに、元の９６ウェルフィルタープレートにおいてルシフェラーゼに関して直接アッセイされ得る。
図６は、本発明の一実施形態に従う改変されたバクテリオファージを使用して、目的の細菌を検出するためのフィルタープレートアッセイを示す。簡潔には、目的の細菌６１８を含むサンプル６１６を、マルチウェルフィルタープレート６０４のウェル６０２に添加し、遠心して６０６、上記サンプルから液体を除去することによって、上記サンプルを濃縮する。遺伝的に改変されたファージ６２０をウェルに添加し、さらなる培地とともに、吸着のために十分な時間にわたってインキュベートし６０８、続いて、標的細菌の感染および上記ファージ生活環を進める６１０（例えば、約４５分）。最後に、ルシフェラーゼ基質を添加し、任意の存在するルシフェラーゼ６２４と反応させる。得られた発光を、ルシフェラーゼ活性６２６を検出するルミノメーターで測定する６１４。
ある種の実施形態において、上記アッセイは、捕捉表面上でまたはその付近で細菌を濃縮することなく行われ得る。図７は、本発明の一実施形態に従う改変されたバクテリオファージを使用して、目的の細菌を検出するための「濃縮なしアッセイ（Ｎｏ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）」を図示する。インジケーターファージ７１４のアリコートを、マルチウェルプレート７０４の個々のウェル７０２に分配し、次いで、細菌７１２を含む試験サンプルアリコートを添加し、ファージが複製し、可溶性インジケーター７１６（例えば、ルシフェラーゼ）を生成するために十分な期間にわたってインキュベートする７０６（例えば、３７℃で４５分）。次いで、可溶性インジケーターおよびファージを含む上記プレートウェル７０８をアッセイして７１０、プレート上の上記インジケーター活性７１８を測定し得る（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）。この実施形態において、上記試験サンプルは、濃縮されない（例えば、遠心分離によって）が、単純に、インジケーターファージとともに一定の期間にわたって直接インキュベートされ得、その後、ルシフェラーゼ活性に関してアッセイされ得る。
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、成長を助長する条件でのインキュベーションによる試験の前に富化することができる。このような実施形態では、富化期間は、サンプルのタイプおよびサイズに応じて、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間もしくは１６時間またはそれより長くてもよい。
いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージは検出可能なインジケーター部分を含み、単一の病原細胞（例えば、細菌）の感染は、インジケーター部分を介して生成される増幅されたシグナルによって検出され得る。従って、本方法は、ファージ複製の間に生成されるインジケーター部分を検出することを含み得、ここで、インジケーターの検出は、目的の細菌がサンプル中に存在することを示す。
一実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の細菌を検出するための方法であって、上記サンプルを、目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで、上記組換えバクテリオファージは上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程、および上記インジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は上記目的の細菌が上記サンプル中に存在することを示す工程を含む、方法を含み得る。いくつかの実施形態において、検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中に存在する目的の細菌の量に相当する。
本明細書により詳細に記載されるように、本発明の方法およびシステムは、サンプルに存在する細菌に感染させるために、一連の濃度の親のインジケーターバクテリオファージを利用することができる。いくつかの実施形態において、上記インジケーターバクテリオファージは、単一細胞などの上記サンプル中に非常に少ない数で存在する標的細菌を迅速に見いだし、標的細菌に結合し、感染するのに十分な濃度で上記サンプルに加えられる。いくつかの実施形態において、ファージ濃度は、１時間未満で標的細菌を見いだし、標的細菌に結合し、感染するのに十分であり得る。他の実施形態において、これらの事象は、上記サンプルへのインジケーターファージの添加の後、２時間未満、または３時間未満に起こることができる。例えば、ある種の実施形態において、上記インキュベートする工程のためのバクテリオファージ濃度は、１×１０５ＰＦＵ／ｍＬより高いか、１×１０６ＰＦＵ／ｍＬより高いか、または１×１０７ＰＦＵ／ｍＬより高い。
ある種の実施形態において、上記組換え感染性因子は、上記感染性因子ストックの生産の際に生成され得るいかなる残留インジケータータンパク質も含まないように、精製され得る。従って、ある種の実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、上記サンプルとともにインキュベートする前に、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用して精製され得る。上記感染性因子がバクテリオファージである場合、この精製は、ＤＮＡを有しないバクテリオファージ（すなわち、空のファージまたは「ゴースト」）を除去するという、追加の利点を有し得る。
本発明の方法のいくつかの実施形態において、上記微生物はサンプルからの上記微生物のいかなる単離または精製もなしに、検出され得る。例えば、ある種の実施形態において、１または数個の目的の微生物を含むサンプルは、アッセイ容器（例えば、スピンカラム、マイクロタイターウェル、またはフィルター）に直接適用され得、上記アッセイはそのアッセイ容器の中で行われる。このようなアッセイの種々の実施形態は、本明細書に開示される。
試験サンプルアリコートは、マルチウェルプレートのウェルへと直接分配され得、インジケーターファージが添加され得、そして感染のための十分な期間の後、溶解緩衝液は、インジケーター部分のための基質（例えば、ルシフェラーゼインジケーターのためのルシフェラーゼ基質）と同様に添加され得、インジケーターシグナルの検出のためにアッセイされ得る。本方法のいくつかの実施形態は、フィルタープレートの上で行うことができる。本方法のいくつかの実施形態は、インジケーターファージによる感染の前のサンプルの濃縮の有りまたはなしで行われ得る。
例えば、多くの実施形態において、マルチウェルプレートは、上記アッセイを行うために使用される。プレート（もしくは検出する工程が行われ得る任意の他の容器）の選択は、上記検出する工程に影響を及ぼし得る。例えば、いくつかのプレートは、光の放射の検出に影響を及ぼし得る、着色したもしくは白色のバックグラウンドを含み得る。概して、白色のプレートは、より高い感度を有するが、より高いバックグラウンドシグナルをも生じる。プレートの他の色は、より低いバックグラウンドシグナルを生成し得るが、わずかにより低い感度を有し得る。さらに、バックグラウンドシグナルに関する１つの理由は、１つのウェルから別の隣接するウェルへの光の漏れである。白色のウェルを有するいくつかのプレートがあるが、上記プレートの残りは黒色である。これは、上記ウェルの内部での高いシグナルを可能にするが、ウェルからウェルへの光の漏れを防止し、従って、バックグラウンドを低減し得る。従って、プレートもしくは他のアッセイ容器の選択は、上記アッセイのための感度およびバックグラウンドシグナルに影響を与え得る。
本発明の方法は、感度を増加させるための種々の他の工程を包含し得る。例えば、本明細書でより詳細に考察されるように、上記方法は、過剰な親バクテリオファージおよび／または上記バクテリオファージ調製物を汚染するルシフェラーゼもしくは他のレポータータンパク質を除去するために、上記バクテリオファージを添加した後であるが、インキュベートする前に、上記捕捉されかつ感染した細菌を洗浄する工程を包含し得る。
いくつかの実施形態において、上記目的の微生物の検出は、上記微生物の集団を増加させる方法としての、上記サンプルを培養する必要性なしに、完了し得る。例えば、ある種の実施形態において、検出に必要とされる合計時間は、２６．０、２５．０、２４．０、２３．０、２２．０、２１．０、２０．０、１９．０、１８．０、１７．０、１６．０時間、１５．０時間、１４．０時間、１３．０時間、１２．０時間未満、１１．０時間、１０．０時間、９．０時間、８．０時間、７．０時間、６．０時間、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間、１．０時間、４５分または３０分未満である。結果までの時間を最小にすることは、病原体に対する食品および環境の試験において重大である。
当該分野で公知のアッセイと対照的に、本発明の方法は、個々の微生物を検出し得る。従って、ある種の実施形態において、上記方法は、サンプルに存在する上記微生物の≦１０個の細胞（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個の微生物）を検出し得る。例えば、ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に高度に特異的である。一実施形態において、組換えバクテリオファージは、他のタイプの細菌の存在下で、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を区別し得る。ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、サンプル中の特異的タイプの単一細菌を検出するために使用することができる。ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、サンプル中の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個程度の少なさの特異的細菌を検出する。
従って、本発明の局面は、インジケーター部分を介して試験サンプル中の微生物の検出のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記目的の微生物が細菌である場合、上記インジケーター部分は、感染性因子（例えば、インジケーターバクテリオファージ）と関連づけられ得る。上記インジケーター部分は、基質と反応して、検出可能なシグナルを放射してもよいし、内因性のシグナル（例えば、蛍光タンパク質）を放射してもよい。いくつかの実施形態において、上記検出感度は、試験サンプル中の上記目的の微生物の５０個、２０個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、もしくは２個程度の少なさの細胞の存在を明らかにし得る。いくつかの実施形態において、上記目的の微生物の実に１個の細胞が、検出可能なシグナルを生じ得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ４様またはＶｉＩ様バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージに由来する。ある種の実施形態において、組換えＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に高度に特異的である。
いくつかの実施形態において、上記感染性因子によってコードされる上記インジケーター部分は、上記感染性因子の複製の間もしくは後に検出可能であり得る。インジケーター部分としての使用に適した検出可能な生体分子の多くの異なるタイプが、当該分野で公知であり、多くは市販されている。いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、酵素を含み、これは上記インジケーター部分として働く。いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージのゲノムは、可溶性タンパク質をコードするように改変される。いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、検出可能な酵素をコードする。上記インジケーターは、光を放射し得る、および／または転化された基質における色の変化によって検出可能であり得る。種々の適切な酵素は、市販されている（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、もしくはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、上記インジケーター部分として働き得る。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、上記インジケーター部分である。他の工学技術で作製されたルシフェラーゼもしくは検出可能なシグナルを生成する他の酵素はまた、適切なインジケーター部分であり得る。
従って、いくつかの実施形態において、本方法、システムまたはキットの組換えバクテリオファージは、野生型Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージから調製される。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、内因性シグナルを放射するタンパク質、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質など）をコードする。上記インジケーターは光を放射し得る、および／または色の変化によって検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、基質と相互作用してシグナルを発生する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする。いくつかの実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施形態において、上記ルシフェラーゼ遺伝子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼまたは工学技術で作製されたルシフェラーゼ、例えばＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）、Ｒｌｕｃ８．６−５３５またはオレンジナノ−ランタンのうちの１つである。
上記インジケーターを検出する工程は、光の放射を検出する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、ルミノメーターは、基質とのインジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）の反応を検出するために使用され得る。ＲＬＵの検出はルミノメーターで達成することができ、または、他の機械もしくはデバイスもまた、使用され得る。例えば、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラが、色の変化および他の光の放射を検出し得る。検出にとって絶対ＲＬＵが重要であるが、単一細胞または少数の細胞が確実に検出されるためにはシグナル対バックグラウンド比も高い（例えば、＞２．０、＞２．５または＞３．０）ことが必要である。
いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、上記ファージが特異的に認識しかつ感染する細菌の感染の際にのみ生成される酵素（例えば、ルシフェラーゼ）の遺伝子を含むように遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、上記インジケーター部分は、ウイルス生活環において後期に発現される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される場合、上記インジケーターは、可溶性タンパク質（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）であり、そのコピー数を制限するファージ構造タンパク質と融合されない。
従って、インジケーターファージを利用するいくつかの実施形態において、本発明は、目的の微生物を検出するための方法を包含し、上記方法は、少なくとも１個のサンプル細菌を捕捉する工程；該少なくとも１個の細菌を、複数のインジケーターファージとともにインキュベートする工程；子孫ファージを生成し、可溶性インジケーター部分を発現するための、感染および複製の時間を与える工程；ならびに上記子孫ファージ、好ましくは上記インジケーターを検出する工程であって、ここで上記インジケーターの検出は、上記細菌が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。
例えば、いくつかの実施形態において、試験サンプル細菌は、プレートの表面に結合することによって、または上記サンプルを細菌学的フィルター（例えば、０．４５μｍ孔サイズのスピンフィルターまたはプレートフィルター）を介してろ過することによって、捕捉され得る。一実施形態において、上記感染性因子（例えば、インジケーターファージ）は、最小限の体積で、上記フィルター上に直接捕捉されたサンプルに添加される。一実施形態において、上記フィルターまたはプレート表面上に捕捉された微生物は、その後、過剰な結合されていない感染性因子を除去するために、１回または複数回洗浄される。一実施形態において、培地（例えば、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（本明細書でＬＢとも称される）、緩衝化ペプトン水（本明細書でＢＰＷとも称される）、またはＴｒｙｐｔｉｃ ＳｏｙブロスもしくはＴｒｙｐｔｏｎｅ Ｓｏｙブロス（本明細書でＴＳＢとも称される））を、さらなるインキュベーション時間のために添加して、細菌細胞およびファージの複製、ならびに上記インジケーター部分をコードする遺伝子の高レベル発現を可能にし得る。しかし、試験アッセイのいくつかの実施形態の驚くべき局面は、インジケーターファージによる上記インキュベーション工程が単一のファージ生活環にとって十分長いことのみが必要であるということである。バクテリオファージを使用することの増幅力は、上記ファージが数サイクルにわたって複製するように、より時間を要すると以前は考えられていた。インジケーターファージの単一の複製サイクルが、本発明のいくつかの実施形態に従って高感度かつ迅速検出を容易にするために十分であり得る。
いくつかの実施形態において、細菌を含む試験サンプルのアリコートをスピンカラムに適用し得、組換えバクテリオファージでの感染および任意の過剰なバクテリオファージを除去するための任意選択の洗浄後に、検出される可溶性インジケーターの量は、感染した細菌によって生成されるバクテリオファージの量に比例する。
上記細菌の溶解の際に周囲の液体へと放出された可溶性インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）は、次いで、測定および定量され得る。一実施形態において、上記溶液は、フィルターを通して遠心され、その濾液はアッセイ（例えば、ルミノメーターでの）のために新しい容器に収集され、その後、上記インジケーター酵素のための基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）が添加される。あるいは、インジケーターシグナルは、フィルター上で直接測定され得る。
種々の実施形態において、上記精製された親インジケーターファージは、上記検出可能なインジケーター自体を含まない。なぜなら上記親ファージは、これが試験サンプルとともにインキュベーションするために使用される前に精製され得るからである。後期（クラスＩＩＩ）遺伝子の発現は、ウイルス生活環において後期に起こる。本発明のいくつかの実施形態において、親ファージは、いかなる存在するインジケータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をも排除するために精製され得る。いくつかの実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる。従って、多くの実施形態において、上記検出工程の前に親ファージを子孫ファージから分離することは必須ではない。一実施形態において、上記微生物は、細菌であり、上記インジケーターファージは、バクテリオファージである。一実施形態において、上記インジケーター部分は、可溶性ルシフェラーゼであり、これは、上記宿主微生物の溶解の際に放出される。
従って、代替の一実施形態において、上記インジケーター基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）は、フィルター上にあるままであるかまたはプレート表面に結合したままである上記サンプルの一部とともにインキュベートされ得る。よって、いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、９６ウェルフィルタープレート（もしくは通常の９６ウェルプレート）であり、上記基質反応は、上記プレートを上記ルミノメーターの中に直接置くことによって検出され得る。
例えば、一実施形態において、本発明は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するための方法を包含し得、上記方法は、９６ウェルフィルタープレート上に捕捉された細胞に、感染の際にルシフェラーゼを発現し得る複数の親インジケーターファージを感染させる工程；過剰なファージを洗い流す工程；ＬＢブロスを添加し、ファージが複製しかつ上記特定のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．標的を溶解する時間を与える工程（例えば、３０〜１２０分）；およびルシフェラーゼ基質を添加し、上記９６ウェルプレートにおいて直接、ルシフェラーゼ活性を測定することによって上記インジケータールシフェラーゼを検出する工程であって、ここでルシフェラーゼ活性の検出は、上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するための方法を包含し得、上記方法は、９６ウェルプレート中の液体溶液もしくは懸濁物中の細胞に、感染の際にルシフェラーゼを発現し得る複数の親インジケーターファージを感染させる工程；ファージが複製しかつ上記特定のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．標的を溶解する時間（例えば、３０〜１２０分）を与える工程；およびルシフェラーゼ基質を添加し、上記９６ウェルプレートにおいて直接、ルシフェラーゼ活性を測定することによって、上記インジケータールシフェラーゼを検出する工程であって、ここでルシフェラーゼ活性の検出は、上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。このような実施形態において、捕捉する工程は、必須ではない。いくつかの実施形態において、上記液体溶液もしくは懸濁物は、消費可能な試験サンプル（例えば、野菜洗浄液）であり得る。いくつかの実施形態において、上記液体溶液または懸濁物は、濃縮されたＬＢブロス、Ｔｒｙｐｔｉｃ／Ｔｒｙｐｔｏｎｅ Ｓｏｙブロス、ペプトン水または栄養ブロスで強化した野菜洗浄物であり得る。いくつかの実施形態において、上記液体溶液または懸濁物は、ＬＢブロス中で希釈した細菌であり得る。
いくつかの実施形態において、上記細菌の溶解は、上記検出工程の前、その間、もしくはその後に起こり得る。実験は、感染した溶解されていない細胞が、いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ基質の添加の際に検出可能であり得ることを示唆する。おそらくは、ルシフェラーゼは、完全な細胞溶解なしに、細胞から出ていき得る、および／またはルシフェラーゼ基質が細胞に入り得る。従って、スピンフィルターシステムを利用する実施形態のために、上記溶解物へと放出されルシフェラーゼのみ（かつルシフェラーゼはさらに無傷の細菌の中にない）が、上記ルミノメーターにおいて分析される場合、溶解は、検出のために必要とされる。しかし、溶液もしくは懸濁物のサンプルとともにフィルタープレートもしくは９６ウェルプレートを利用する実施形態のために、無傷の細胞および溶解した細胞で満ちている元のプレートが上記ルミノメーターにおいて直接アッセイされる場合、溶解は、検出に必須ではない。
いくつかの実施形態において、インジケーター部分（例えば、ルシフェラーゼ）と基質との反応は、３０分またはそれより長くにわたって続き得、種々の時点での検出は、感度を最適化するために望ましいことであり得る。例えば、上記固体支持体として９６ウェルフィルタープレートを、および上記インジケーターとしてルシフェラーゼを使用する実施形態において、ルミノメーター読み取りは、最初に、および１０分もしくは１５分の間隔
で、上記反応が完了するまで行われ得る。
驚くべきことに、試験サンプルに感染させるために利用される高濃度のファージは、非常に短い時間枠で、標的微生物の非常に少数の検出を成功裏に達成した。ファージを試験サンプルとともにインキュベートすることは、いくつかの実施形態において、単一のファージ生活環にとって十分長いことのみを必要とする。いくつかの実施形態において、このインキュベートする工程のためのバクテリオファージの濃度は、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１．０×１０７、１．１×１０７、１．２×１０７、１．３×１０７、１．４×１０７、１．５×１０７、１．６×１０７、１．７×１０７、１．８×１０７、１．９×１０７、２．０×１０７、３．０×１０７、４．０×１０７、５．０×１０７、６．０×１０７、７．０×１０７、８．０×１０７、９．０×１０７、もしくは１．０×１０８ ＰＦＵ／ｍＬより高い。
ファージのこのような高濃度での成功は驚くべきことである。なぜならファージの多数が、「非感染溶菌」と以前に関連しており、これは、標的細胞を死滅させ、それによって、より早期のファージアッセイからの有用なシグナルの生成を妨げたからである。本明細書で記載される調製されたファージストックの浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）は、この問題を軽減する助けとなると考えられる（例えば、塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離による浄化）。なぜなら上記ファージと関連付けられたいかなる汚染するルシフェラーゼをも除去する工程に加えて、この浄化はまた、ゴースト粒子（ｇｈｏｓｔ ｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＤＮＡを失った粒子）を除去し得るからである。上記ゴースト粒子は、「非感染溶菌」を介して細菌細胞を溶解し得、上記細胞を早期に死滅させ、それによってインジケーターシグナルの生成を防止することができる。電子顕微鏡法は、粗製のファージ溶解物（すなわち、塩化セシウム浄化前）が５０％より多いゴーストを有し得ることを明らかに示す。これらのゴースト粒子は、細胞膜に穴をあける多くのファージ粒子の作用を通じて、上記微生物の早期の死滅に寄与し得る。従って、ゴースト粒子は、高いＰＦＵ濃度が有害であると報告された以前の問題の一因であった可能性がある。さらに、非常にきれいなファージ調製物は、上記アッセイが洗浄工程なしで行われることを可能にし、このことは、初期濃縮工程なしで上記アッセイが行われることを可能にする。いくつかの実施形態は初期濃縮工程を含み、いくつかの実施形態において、この濃縮工程はより短い富化インキュベーション時間を可能にする。
試験方法のいくつかの実施形態は、確認アッセイをさらに含み得る。初期の結果を通常後の時点で確認するために、様々なアッセイが当該分野で公知である。例えば、サンプルが培養され得（例えば、実施例に記載されるＣＨＲＯＭＡＧＡＲ（登録商標）、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）アッセイ）、微生物ＤＮＡの存在を確認するためにＰＣＲが利用され得、または、初期の結果を確認するために他の確認アッセイが使用され得る。
ある種の実施形態において、本発明の方法は、感染性因子での検出に加えて、上記サンプルから目的の微生物（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）を精製および／または濃縮するために、結合剤（例えば、抗体）の使用を組み合わせ得る。例えば、ある種の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物を検出するための方法を包含し、上記方法は、上記微生物を上記サンプルから、上記目的の微生物（例えば、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）に特異的な捕捉抗体を使用して、先の支持体上に捕捉する工程；上記サンプルを、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで上記組換えバクテリオファージは、上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製に間の上記インジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程；および上記インジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．が上記サンプル中に存在することを示す工程を含む。
例えば、図８は、本発明の一実施形態に従う改変されたバクテリオファージを使用して目的の細菌を検出するためのハイブリッドイムノファージ（ＨＩＰ）アッセイを示す。上記サンプルを、第１に、細菌特異的抗体８０２で被覆されたマイクロタイタープレートウェルに適用する。次いで、上記プレートを遠心分離して、上記捕捉抗体８０４への上記細菌の結合を促進する。完全な細菌捕捉を可能にするために十分な時間の後に、細菌特異的ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ファージを含む溶液を、各サンプル８０６に添加する。上記ファージとのインキュベーションは、上記捕捉された細菌８０８への単一のまたは複数のファージの結合および付着を生じる。最後に、上記サンプルを、ファージ複製およびルシフェラーゼ発現を促進するためにインキュベートする。これは、細胞溶解および可溶性ルシフェラーゼ８１０の放出をもたらす。
いくつかの実施形態において、合成ファージは、病原体検出アッセイにおける使用のための望ましい形質を最適化するために設計される。いくつかの実施形態において、遺伝的改変のバイオインフォマティクスおよび以前の分析は、望ましい形質を最適化するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、ファージテールタンパク質をコードする遺伝子は、特定の種の細菌を認識しかつこれに結合するために最適化され得る。他の実施形態において、ファージテールタンパク質をコードする遺伝子は、細菌の属全体、または属内の特定の種のグループを認識しかつこれらに結合するために最適化され得る。このようにして、上記ファージは、病原体のより広いまたはより狭いグループを検出するために最適化され得る。いくつかの実施形態において、上記合成ファージは、上記レポーター遺伝子の発現を改善するために設計され得る。さらにおよび／または代わりに、場合によっては、上記合成ファージは、検出を改善するために上記ファージのバーストサイズを増大させるために設計され得る。
いくつかの実施形態において、上記ファージの安定性は、貯蔵期間を改善するために最適化され得る。例えば、酵素生命的溶解度（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）は、その後のファージ安定性を増大させるために、増大され得る。さらにおよび／または代わりに、ファージ熱安定性が最適化され得る。熱安定性ファージは、貯蔵の間の機能的活性をより良好に保存し、それによって、貯蔵寿命を増大させる。従って、いくつかの実施形態において、上記熱安定性および／またはｐＨ寛容性は、最適化され得る。
いくつかの実施形態において、上記遺伝的に改変されたファージまたは上記合成して導出されたファージは、検出可能なインジケーターを含む。いくつかの実施形態において、上記インジケーターは、ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、上記ファージゲノムは、インジケーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子または検出可能なインジケーターをコードする別の遺伝子）を含む。
本発明のシステムおよびキット
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で開示される方法を行うための構成要素を含むシステム（例えば、自動化システムもしくはキット）を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるシステムまたはキットにはインジケーターファージが含まれる。本明細書に記載される方法は、このようなインジケーターファージシステムまたはキットも利用し得る。本明細書で記載されるいくつかの実施形態は、上記方法を行うために必要とされる試薬および材料の最小限の量を考慮すると、自動化もしくはキットに特に適している。ある種の実施形態において、上記キットの構成要素の各々は、第１の部位から第２の部位へと送達可能である自己充足式ユニットを含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムもしくはキットを含む。上記システムもしくはキットは、ある種の実施形態において、上記サンプルを上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素、および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含み得る。本発明のシステムおよびキットの両方のいくつかの実施形態において、上記感染性因子は、上記目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージであり、上記組換えバクテリオファージは、上記インジケーター部分として上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる。いくつかのシステムは、上記目的の微生物を固体支持体上に捕捉するための構成要素をさらに含む。
他の実施形態において、本発明は、目的の微生物に特異的な感染性因子構成要素を含む、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のための方法、システムまたはキットを含み、ここで、上記感染性因子は、インジケーター部分および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含む。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、またはＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージである。一実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージに由来する。ある種の実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、特定の細菌に対して高度に特異的である。例えば、ある種の実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．に対して高度に特異的である。実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、他のタイプの細菌の存在下でＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を区別し得る。ある種の実施形態において、システムまたはキットは、上記サンプル中の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個程度の少なさの特異的細菌を検出する。
ある種の実施形態において、上記システムおよび／もしくはキットは、上記捕捉された微生物サンプルを洗浄するための構成要素をさらに含み得る。さらにもしくは代わりに、上記システムおよび／もしくはキットは、上記インジケーター部分の量を決定するための構成要素をさらに含み得、ここで検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中の微生物の量に相当する。例えば、ある種の実施形態において、上記システムもしくはキットは、ルシフェラーゼ酵素活性を測定するための、ルミノメーターもしくは他のデバイスを含み得る。
いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、同じ構成要素は、複数工程（multiple steps）のために使用され得る。いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、上記工程は、ユーザーによってコンピューター入力を介して自動化もしくは制御され、そして／または液体取り扱いロボットが少なくとも１つの工程を行う。
従って、ある種の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムまたはキットを包含し得、上記システムまたはキットは、上記サンプルを上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素；上記微生物を上記サンプルから固体支持体上に捕捉するための構成要素；上記捕捉された微生物サンプルを洗浄して、結合されていない感染性因子を除去するための構成要素；および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含む。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、捕捉する工程および／またはインキュベートする工程および／または洗浄する工程のために使用され得る（例えば、フィルター構成要素）。いくつかの実施形態は、上記サンプル中の上記目的の微生物の量を決定するための構成要素であって、ここで検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中の微生物の量に相当する構成要素をさらに含む。このようなシステムは、微生物の迅速検出のための方法に関して上記に記載されるものに類似の種々の実施形態および下位実施形態を含み得る。一実施形態において、上記微生物は、細菌であり、上記感染性因子は、バクテリオファージである。コンピューター化システムにおいて、上記システムは、完全に自動化されていても、半自動化されていても、もしくはコンピューターを介してユーザーによって指示されてもよい（もしくはこれらのいくつかの組み合わせ）。
いくつかの実施形態において、上記システムは、上記サンプル中の他の構成要素から上記目的の微生物を単離するための構成要素を含み得る。
一実施形態において、本発明は、目的の微生物を検出するための構成要素を含むシステムまたはキットを包含し、上記システムは、少なくとも１種の微生物を、上記サンプル中の他の構成要素から単離するための構成要素；上記少なくとも１種の微生物に複数の親感染性因子を感染させるための構成要素；上記少なくとも１種の感染した微生物を溶解して、上記微生物に存在する子孫感染性因子を放出するための構成要素；および上記子孫感染性因子を検出するための構成要素、またはより高い感度で、上記感染性因子によってコードされて発現される可溶性タンパク質を検出するための構成要素であって、ここで該感染性因子または該感染性因子の可溶性タンパク質産物は、上記微生物が上記サンプルに存在することを示す構成要素を含む。上記感染性因子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）インジケーター遺伝子を有するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）バクテリオファージを含み得る。
上記システムまたはキットは、子孫感染性因子の検出のために種々の構成要素を含み得る。例えば、一実施形態において、上記子孫感染性因子（例えば、バクテリオファージ）は、インジケーター部分を含み得る。一実施形態において、上記子孫感染性因子（例えば、バクテリオファージ）における上記インジケーター部分は、複製の間に発現される検出可能な部分（例えば、可溶性ルシフェラーゼタンパク質）であり得る。
他の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのキットを包含し得、上記システムは、上記サンプルを上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素；上記微生物を上記サンプルから固体支持体上に捕捉するための構成要素；上記捕捉された微生物サンプルを洗浄して、結合されていない感染性因子を除去するための構成要素；および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含む。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、捕捉する工程および／もしくはインキュベートする工程および／もしくは洗浄する工程のために使用され得る。いくつかの実施形態は、上記サンプル中の上記目的の微生物の量を決定するための構成要素をさらに含み、ここで検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中の微生物の量に相当する。このようなキットは、微生物の迅速検出の方法に関して上記で記載されるものに類似の種々の実施形態および下位実施形態を含み得る。一実施形態において、上記微生物は細菌であり、上記感染性因子はバクテリオファージである。
いくつかの実施形態において、キットは、上記サンプル中の他の構成要素から上記目的の微生物を単離するための構成要素を含み得る。
本発明のこれらのシステムおよびキットは、種々の構成要素を含む。本明細書で使用される場合、用語「構成要素」とは、広く定義され、記載される方法を実施するための任意の適した装置もしくは適した装置の集まりを含む。上記構成要素は、いかなる特定の方法においても互いに関して一体的に接続される必要も据え付けられる必要もない。本発明は、互いに関して上記構成要素の任意の適切な配置を含む。例えば、上記構成要素は、同じ空間の中に存在する必要はない。しかしいくつかの実施形態において、上記構成要素は、一体ユニットにおいて互いに接続される。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、複数機能を実行し得る。
コンピューターシステムおよびコンピューター可読媒体
上記システムは、現在の技術もしくはその構成要素のうちのいずれかにおいて記載されるように、コンピューターシステムの形態で具現化され得る。コンピューターシステムの代表例としては、汎用コンピューター、プログラムされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラー、周辺集積回路素子、および本技術の方法を構成する工程を実装し得る他のデバイスもしくはデバイスの配置が挙げられる。
コンピューターシステムは、コンピューター、入力デバイス、ディスプレイユニット、および／もしくはインターネットを含み得る。上記コンピューターは、マイクロプロセッサをさらに含み得る。上記マイクロプロセッサは、通信バスへと接続され得る。上記コンピューターはまた、メモリを含み得る。上記メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）およびリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含み得る。上記コンピューターシステムは、記憶デバイスをさらに含み得る。上記記憶デバイスは、ハードディスクドライブもしくはリムーバル記憶デバイス（例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、光学ディスクドライブなど）であり得る。上記記憶デバイスはまた、コンピュータープログラムもしくは他の指示を上記コンピューターシステムへとロードするための他の類似の手段であり得る。上記コンピューターシステムはまた、通信ユニットを含み得る。上記通信ユニットは、Ｉ／Ｏインターフェイスを通じて、上記コンピューターが他のデータベースおよびインターネットに接続することを可能にする。上記通信ユニットは、他のデータベースへの転送、ならびに他のデータベースからのデータの受領を可能にする。上記通信ユニットは、モデム、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）カード、もしくは上記コンピューターシステムをデータベースおよびネットワーク（例えば、ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮおよびインターネット）に接続することを可能にする任意の類似のデバイスを含み得る。上記コンピューターシステムは、従って、Ｉ／Ｏインターフェイスを介して上記システムへとアクセス可能な入力デバイスを通じてユーザーからの入力を容易にし得る。
コンピューティングデバイスは、代表的には、そのコンピューティングデバイスの一般管理およびオペレーションのための実行可能なプログラム指示を提供するオペレーティングシステムを含み、代表的には、サーバーのプロセッサによって実行される場合に、上記コンピューティングデバイスにその意図された機能を行わせる指示を記憶するコンピューター可読記憶媒体（例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリなど）を含む。上記オペレーティングシステムに適した実装および上記コンピューティングデバイスの一般的な機能性は、公知であるかもしくは市販されており、当業者によって、特に本明細書の開示に鑑みて、容易に実装される。
上記コンピューターシステムは、入力データを処理するために、１以上の記憶素子の中に記憶される一群の指示を実行する。上記記憶素子はまた、記載されるとおりのデータもしくは他の情報を保持し得る。上記記憶素子は、処理機械に存在する情報ソースもしくは物理的メモリ素子の形態にあり得る。
環境は、上記で考察されるとおりの種々のデータストアならびに他のメモリおよび記憶媒体を含み得る。これらは、種々の位置に存在し得る（例えば、上記コンピューターのうちの１以上にローカルな（および／もしくは中に存在する）、またはネットワーク全体にわたって記コンピューターのうちのいずれかもしくはすべてから遠隔にある記憶媒体において）。実施形態の特定の一群において、情報は、当業者が精通しているストレージエリアネットワーク（「ＳＡＮ」）に存在し得る。同様に、上記コンピューター、サーバー、もしくは他のネットワークデバイスに帰した機能を行うための任意の必須のファイルは、適切な場合、ローカルにおよび／もしくは遠隔に保存され得る。システムが、コンピューティングデバイスを含む場合、各々のこのようなデバイスは、バスを介して電気的に連結され得るハードウェア要素を含み得、上記要素は、例えば、少なくとも１つの中央処理装置（ＣＰＵ）、少なくとも１つの入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、コントローラー、タッチスクリーン、もしくはキーパッド）、および少なくとも１つの出力デバイス（例えば、ディスプレイデバイス、プリンター、もしくはスピーカー）を含む。このようなシステムはまた、１つ以上の記憶デバイス（例えば、ディスクドライブ、光学記憶デバイス、およびソリッドステート記憶デバイス（例えば、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）もしくはリードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」）、ならびにリムーバブルメディアデバイス、メモリカード、フラッシュカードなどを含み得る。
このようなデバイスはまた、コンピューター可読記憶媒体リーダー、通信デバイス（例えば、モデム、ネットワークカード（無線もしくは有線）、赤外線通信デバイスなど）、および上記のとおりのワーキングメモリを含み得る。上記コンピューター可読記憶媒体リーダーは、遠隔、ローカル、固定、および／もしくはリムーバブル記憶デバイスを代表するコンピューター可読記憶媒体、ならびにコンピューター可読情報を一時的におよび／もしくはより恒久的に含む、記憶する、伝達する、および検索するための記憶媒体と接続され得るかまたはこれらを受容するように構成され得る。上記システムおよび種々のデバイスはまた、代表的には、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラム（例えば、クライアントアプリケーションもしくはウェブブラウザ）を含む、少なくとも１つのワーキングメモリデバイス内に位置した多くのソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービス、もしくは他の要素を含む。代替の実施形態が、上記のものからの多くのバリエーションを有し得ることは認識されるべきである。例えば、カスタマイズされたハードウェアがまた使用され得る、および／または特定の要素が、ハードウェア、ソフトウェア（ポータブルソフトウェア（例えば、アプレット）を含む）、または両方において実装され得る。さらに、他のコンピューティングデバイス（例えば、ネットワーク入力／出力デバイス）への接続が使用され得る。
コード、もしくはコードの一部を含むための非一時的な記憶媒体およびコンピューター可読媒体としては、当該分野で公知であるかもしくは使用される任意の適切な媒体（記憶媒体および通信媒体（例えば、コンピューター可読の指示、データ構造、プログラムモジュール、もしくは他のデータなどの情報の記憶および／または伝達のための任意の方法または技術において実装される、揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブルの媒体が挙げられるが、これらに限定されない）を含む）が挙げられ得、これらとしては、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多目的ディスク（ＤＶＤ）もしくは他の光学記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶もしくは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報を記憶するために使用され得、上記システムデバイスによってアクセスされ得る任意の他の媒体が挙げられる。上記開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、上記種々の実施形態を実装するための他のやり方および／または方法を認識する。
コンピューター可読媒体は、プロセッサにコンピューター可読指示を提供することができる電子式、光学式、磁気、もしくは他の記憶デバイスを含み得るが、これらに限定されない。他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、連想メモリ（「ＣＡＭ」）、ＤＤＲ、フラッシュメモリ（例えば、ＮＡＮＤフラッシュもしくはＮＯＲフラッシュ、ＡＳＩＣ、構成されたプロセッサ、光学記憶媒体、磁気テープもしくは他の磁気記憶媒体、またはコンピュータープロセッサが指示を読み得る任意の他の媒体。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ））の単一タイプを含み得る。他の実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ディスクドライブ、およびキャッシュ）のうちの２またはそれより多くのタイプを含み得る。上記コンピューティングデバイスは、１またはそれより多くの外付けのコンピューター可読媒体（例えば、外付けハードディスクドライブ、または外付けＤＶＤもしくはブルーレイドライブ）と通信状態にあり得る。
上記で考察されるように、上記実施形態は、コンピューター実行可能なプログラム指示を実行および／またはメモリに記憶された情報にアクセスするように構成されているプロセッサを含む。上記指示は、任意の適切なコンピュータープログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、およびＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる）で書かれたコードから、コンパイラおよび／もしくはインタープリターによって生成されたプロセッサ特異的指示を含み得る。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、単一のプロセッサを含む。他の実施形態において、上記デバイスは、２またはそれより多くのプロセッサを含む。このようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および状態機械を含み得る。このようなプロセッサは、プログラマブル電子デバイス（例えば、ＰＬＣ）、プログラマブル割り込みコントローラー（ＰＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電子的にプログラム可能なリードオンリーメモリ（electronically programmable read-only memory）（ＥＰＲＯＭもしくはＥＥＰＲＯＭ）、または他の類似のデバイスをさらに含み得る。
上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスを含む。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、有線もしくは無線の通信リンクを介して通信するように構成されている。例えば、上記ネットワークインターフェイスは、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、ＩＥＥＥ ８０２．１１（Ｗｉ−Ｆｉ）、８０２．１６（Ｗｉ−Ｍａｘ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、赤外線などを介して、ネットワーク上での通信を可能にし得る。別の例として、ネットワークインターフェイスは、ネットワーク（例えば、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＵＭＴＳ、もしくは他の携帯通信ネットワーク（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ））上での通信を可能にし得る。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、別のデバイスでの、例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、１３９４ ＦｉｒｅＷｉｒｅ、シリアル接続もしくはパラレル接続、または類似のインターフェイスを介したポイントツーポイント接続を可能にし得る。適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、１以上のネットワーク上での通信のための２以上のネットワークインターフェイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスに加えてもしくはその代わりに、データストアを含み得る。
適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、多くの外付けもしくは内部デバイス（例えば、マウス、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、オーディースピーカー、１以上のマイクロフォン、または任意の他の入力もしくは出力デバイス）を含み得るかまたはこれらと通信状態にあり得る。例えば、上記コンピューティングデバイスは、種々のユーザーインターフェイスデバイスおよびディスプレイと通信状態にあり得る。上記ディスプレイは、任意の適切な技術（ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＣＲＴなどが挙げられるが、これらに限定されない）を使用し得る。
上記コンピューターシステムによる実行のための指示セットは、特定のタスク（例えば、本技術の方法を構成する工程）を行うための処理機械を指示する種々のコマンドを含み得る。上記指示セットは、ソフトウェアプログラムの形態にあり得る。さらには、上記ソフトウェアは、本技術におけるように、別個のプログラムの集まり、より大きなプログラムを有するプログラムモジュールもしくはプログラムモジュールの一部の形態にあり得る。上記ソフトウェアはまた、オブジェクト指向プログラミングの形態でのモジュラープログラミングを含み得る。処理機械による入力データの処理は、ユーザーコマンド、以前の処理の結果、もしくは別の処理機械によって作成されたリクエストに応じ得る。
本発明は、ある種の実施形態を参照して開示されてきた一方で、記載される実施形態に対する多くの改変、変化および変更は、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく可能である。よって、本発明は、上記記載される実施形態に限定されないことは意図されるが、以下の特許請求の範囲の文言およびその均等物によって定義される全範囲を有する。
以下の実施例に示される結果は、結果までの時間が短縮された、少数の細胞、さらに単一細菌の検出を実証する。
実施例１． Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージからのインジケーターファージの作製および単離
インジケーターファージＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的Ｓａｋａ２．ＮＡＮＯＬＵＣ、Ｓａｋａ４．ＮＡＮＯＬＵＣ、およびＳａｋａ１０．ＮＡＮＯＬＵＣバクテリオファージを、先に記載されたとおりの手順を使用して、相同組換えを通じて作製した。ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒファージＳａｋａ２、Ｓａｋａ４、およびＳａｋａ１０を、下水サンプルから単離した。
これらファージのゲノム配列を、デノボ配列アセンブリを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシステムを使用して全ゲノム配列決定を通じて得た。関連するファージの以前に公知のおよび註釈付きのゲノムに基づいて、後期遺伝子領域および主要カプシドタンパク質遺伝子を、上記新たなファージゲノム上でのその位置を突き止めた。プラスミドを設計し、合成して、相同組換えを促進するために、マッチするファージ配列のおよそ５００ｂｐが隣接する、適切な後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム結合部位とともにＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を挿入した。
標的細菌を、上記相同組換えプラスミドで適切な抗生物質選択下で形質転換し、それらそれぞれの野生型ファージに感染させて、上記プラスミドとの相同組換えを可能にした。上記組換えバクテリオファージゲノムを生成する相同組換えの後に、一連の力価測定工程および富化工程を使用して、以前に記載されるようにＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現する特異的組換えバクテリオファージを単離した。
最後に、大規模生成を行って、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．検出アッセイにおける使用に適切な高力価ストックを得た。塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用して、ファージ粒子を汚染するルシフェラーゼタンパク質から分離し、バックグラウンドを低下させた。
実施例２． 乳児用調製粉乳プロトコール − Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ
Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ細菌懸濁物を、培地中で一晩培養した。一晩の培養後、上記培養物を滅菌水中に所望の濃度まで希釈した。希釈した細胞を、非選択的プレート上で培養して、ＣＦＵを定量した。乳児用調製粉乳（ＰＩＦ）に、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ希釈物を添加した。その接種したＰＩＦを、真空ポンプを使用して高熱設定で乾燥させた。次いで、乾燥し、添加したＰＩＦサンプルを使用して、ＰＩＦの１０ｇ、１００ｇ、または３００ｇ サンプルを種々のＣＦＵレベルで接種した。上記接種したＰＩＦサンプルを、室温で２〜４週間にわたって貯蔵し、その後評価した。
ＰＩＦの１０ｇ、１００ｇ、および３００ｇ サンプルを調製した。１０ｇのＰＩＦサンプルを、９０ｍＬの予め加温した（３７℃）緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）培地と１：９ サンプル：容積比で混合した；１００ｇのＰＩＦを、３００ｍＬの予め加温したＢＰＷ培地と１：３ サンプル：容積比で混合した；そして３００ｇのＰＩＦを、９００ｍＬの予め加温したＢＰＷ培地と１：３ サンプル：容積比で混合した。ＳＴＯＭＡＣＨＥＲ（登録商標）または等価な装置（蠕動ブレンダー）を使用して、上記サンプルを最高設定で１２０秒間ホモジナイズした。上記ホモジナイズしたサンプルを、振盪せずに、１６〜１８時間にわたって３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、上記サンプルを徹底的に混合し、１ｍＬのサンプルを取り出し、遠心分離チューブに移した。上記サンプルを、ＢＰＷ中で１：１０希釈した（１００μｌ サンプル： ９００μｌ ＢＰＷ）。上記希釈サンプルのうちの１５０μｌを、９６ウェルプレートに移した。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージ溶液のバクテリオファージカクテル１０μｌを、各ウェルに添加し、２時間、３７℃でインキュベートした。１０μｌの溶解緩衝液を各ウェルに添加し、続いて、５０μｌの調製したルシフェラーゼ基質を添加し、ルミノメーターで読み取った。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒに関して陽性のサンプルは、５００またはこれより大きい相対的光単位（ＲＬＵ）の読み取り値を有し、陰性サンプルは、５００ ＲＬＵ未満の読み取りを有する。
Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの陽性検出を確認した。サンプルを、３７℃で２４時間、富化した。各富化したサンプルのうちの５０μｌを、Ｂｒｉｌｌｉａｎｃｅプレート（ＯｘｏｉｄＴＭ ＢｒｉｌｌｉａｎｃｅＴＭ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ Ａｇａｒ ｃａｔ＃ ＯＸＣＭ０１２９Ｒ）上で画線培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。青緑色のコロニー増殖によって陽性検出を確認した。
Figure 2021510508
異なるレベルでおよび異なるＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ株を用いて接種した１００ｇ ＰＩＦサンプル（表１）を、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒに関して乳児用調製粉乳アッセイを使用して試験した。１００ｇ サンプルに関して、ＰＩＦ 対 ＢＰＷ（緩衝化ペプトン水）の１：３希釈物を使用した。５００ ＲＬＵ／ｓまたは５：１ シグナル／バックグラウンドより大きい読み取りを有するサンプルを、陽性とみなした。２４時間富化サンプルを、確認のためにＢｒｉｌｌｉａｎｃｅプレートにプレーティングした。
試験したマトリクスは、以下を含む： 乳児用調製粉乳（ミルクベース）、乳児用調製粉乳（大豆ベース）、プレバイオティクスおよびプロバイオティクスを補充した乳児用調製粉乳、コメデンプンを添加した乳児用調製粉乳、または脱脂粉乳。
実施例３． 包含性および排除性研究
包含性株（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ）を、学術研究機関の、政府機関の、および商業的に入手可能な供給源から得た（表２）。各株を、一晩ＴＳＢ培地中で、３７±１℃において定常相になるまで増殖させた。細胞を、１００ ＣＦＵへと０．１ｍＬのＴＳＢ中で希釈し、組換えファージと、２時間、３７±１℃において混合した。感染後、サンプルを溶解緩衝液およびルシフェラーゼ基質と混合し、次いで、ルミノメーターで読み取った。１５０より大きいＲＬＵ値を有するサンプルを、陽性とみなした。排除性株をまた、商業的に入手可能な供給源から得、定常相になるまで一晩増殖させた。排除性株でのアッセイを、一晩の培養物を直接アッセイすることを除いて、包含性株で行ったように行った（表３）。
上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイは、試験した７５種のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ株で１００％ 包含性を示す（表２）。上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイはまた、４１種の試験した非Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ株のうちの３８種で排除性を示す（表３）。上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイによって検出される上記３種の非Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ株は、密接に関連したＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に由来した。上記ファージアッセイからの任意の推定陽性を、合計２４±２時間、３７±１℃で富化させ得、次いで、ＯＸＯＩＤＴＭ ＢＲＩＬＬＩＡＮＣＥＴＭ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｓａｋａｚａｋｉｉ Ａｇａｒ上で画線培養し得、さらに２４±２時間、３７±１℃で確認のためにインキュベートし得る。十分に増殖し（１ｍｍ〜３ｍｍ）かつ青緑色に見えるコロニーの存在は、陽性サンプルを示す。
Figure 2021510508
Figure 2021510508
Figure 2021510508
Figure 2021510508
Figure 2021510508
実施例４． 強度研究
３つのパラメーターを変動させて、アッセイ強度を示した：富化時間（１４時間および２４時間）、組換えファージ濃度（±２０％）およびルシフェラーゼ基質量（±１０％）。簡潔には、１０ｇ ミルクベースの乳児用調製粉乳サンプルを、添加しないままにしたか、または乳児用調製粉乳中で乾燥させた０．２〜２ ＣＦＵ／１０ｇ Ｃ．ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ ＦＳＬ−Ｆ６−０３１を添加し、室温で２〜４週間貯蔵した（２０〜２５℃）。表４に示されるように富化時間、組換えファージ濃度および基質量におけるバリエーションを用いて、上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイプロトコールに倣った。５００より大きいＲＬＵ値を有するサンプルを、陽性とみなした。サンプルを合計２４±２時間富化させ、次いで、ＯＸＯＩＤＴＭ ＢＲＩＬＬＩＡＮＣＥＴＭ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｓａｋａｚａｋｉｉ Ａｇａｒ上にプレーティングすることによって、サンプルを確認した。プレートを、３７±１℃でさらに２４±２時間インキュベートした。十分に増殖した青緑色のコロニーの存在は、陽性サンプルを示した。上記試験のまとめを、表４に示す。
Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイの強度試験は、富化時間、組換えファージ濃度およびルシフェラーゼ基質量におけるバリエーションが、標準的プロトコールと比較して、上記結果を変化させないことを示した。１４時間および２４時間の富化時間、８μＬおよび１２μＬの組換えファージ容積、ならびに４５μＬおよび５５μＬのルシフェラーゼ基質容積は、非接種および低接種物試験サンプルの両方において、１６時間 富化、１０μＬの組換えファージおよび５０μＬのルシフェラーゼ基質の標準的プロトコールと同一の結果を生じた（表４）。これらの結果は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイプロトコールからのこれらの偏差が、最終結果を変化させなかったことを示す。
Figure 2021510508
実施例５． マトリクス研究
マトリクス研究は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ（１０ｇ 試験部分）をＩＳＯ ２２９６４：２００６（１０ｇ 試験部分）と、およびＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ（１００ｇおよび３００ｇ 試験部分）をＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ：２０１２（１００ｇ 試験部分）と比較した。上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ １０ｇ部分を、ペア形式の研究デザインを使用して、ＩＳＯ ２２９６４：２００６と比較した。上記Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ １００ｇおよび３００ｇ 部分を、ペア形式でない研究デザインを使用して、ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９ １００ｇ 部分と比較した。各マトリクスおよび各比較に関して、上記研究は、非接種マトリクス（０ ＣＦＵ／試験部分）の５つの複製試験部分、段階的に（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｌｙ）陽性結果（０．２〜２ ＣＦＵ／試験部分）を得るための低レベルでの２０の複製試験部分、および一貫して陽性結果（２〜１０ ＣＦＵ／試験部分）を得るために高レベルでの５つの複製試験部分を含んだ。
ミルクベースおよびダイズベース両方のＰＩＦを、地域の小売店から購入し、ＩＳＯ ２２９６４：２００６法を使用して、平常の汚染を予めスクリーニングした。接種物を調製するために、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒを、ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙａブロス中で、１８〜２４時間、３７±１℃で増殖させた。上記培養物をＢＰＷ中に希釈し、ＰＩＦの中で再構成し、サンプルが完全に乾燥するまで、４〜８時間の高速真空の中に置いた。乾燥後、乾燥させた接種物を、各研究において使用されるＰＩＦマトリクスの中に希釈して、段階的な陽性結果を得ると予想される低レベルおよび全て陽性結果を得ると予想される高レベルを得、２〜４週間、室温（２０〜２５℃）に静置させて、上記マトリクスにおいて平衡状態を可能にした。上記マトリクスのバルクロットを、試験前に希釈した接種物とともに接種した。
分析当日に、全好気性菌数をＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ３に従って決定し、低レベルおよび高レベルの接種物におけるＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒのレベルを、最確数（ＭＰＮ）分析によって決定した。ペア形式のサンプルに関しては、ＭＰＮ分析を、ＩＳＯ ２２６９４：２００６法を使用して決定した。低レベル接種物に関しては、上記マトリクス研究からの、２５ｇの５つの試験部分、４ｇの５つの試験部分、および１０ｇの２０の試験部分を分析した。高レベル接種物に関しては、上記マトリクス研究からの１０ｇの５つの試験部分、４ｇの５つの試験部分、および１．５ｇの５つの試験部分を分析した。
非ペア形式のサンプルに関しては、ＭＰＮ分析を、ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９法を使用して決定した。低レベル接種物に関しては、上記マトリクス研究からの２００ｇの５つの試験部分、５０ｇの５つの試験部分、および１００ｇの２０の試験部分を分析した。高レベル接種物に関しては、上記マトリクス研究からの１００ｇの５つの試験部分、５０ｇの５つの試験部分、および２５ｇの５つの試験部分を分析した。ＡＯＡＣ ＲＩによって提供されるＬＣＦ ＭＰＮ計算機を使用してＭＰＮを計算するために、陽性の数を使用した。
Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ試験部分を、使用説明書に従って処理した。簡潔には、予め加温したＢＰＷ（３７±１℃）の、９０ｍＬ（１０ｇ 試験部分）、３００ｍＬ（１００ｇ 試験部分）または９００ｍＬ（３００ｇ 試験部分）を、ＰＩＦ試験部分に添加した。サンプルをホモジナイズし、３７±１℃で１６〜１８時間富化した。富化したサンプルを徹底的に混合し、その後、分析のためにアリコートを採取した。サンプルを、予め加温したＢＰＷ（３７±１℃）中で１：１０（１００μｌ サンプル： ９００μｌ ＢＰＷ）希釈し、上記希釈したサンプルのうちの１５０μｌを９６ウェルプレートに移した。次いで、サンプルを、組換えファージに、２時間、３７±１℃で感染させた。溶解緩衝液およびルシフェラーゼ基質を、上記サンプルに添加した。次いで、サンプルをルミノメーターで読み取った。読み取り値 ≧５００ ＲＬＵを陽性とみなした。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイごとに確認するために、サンプルを、合計２４±２時間、３７±１℃で富化した。富化したサンプルを徹底的に混合し、その後、分析のためにアリコートを採取した。５０μＬを、ＯＸＯＩＤＴＭ ＢＲＩＬＬＩＡＮＣＥＴＭ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｓａｋａｚａｋｉｉ Ａｇａｒの上に染みこませ、２４±２時間、３７±１℃でインキュベートした。十分に（１ｍｍ〜３ｍｍ）増殖しかつ青緑色に見えるコロニーの存在は、陽性サンプルを示す。
ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９についての確認のために、第Ｅ節および第Ｆ節を行った。簡潔には、２４時間 富化から、２×４０ｍＬのアリコートを、３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、得られたペレットを、２００μｌの滅菌リン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁した。上記再懸濁したペレットのうちの１００μｌ アリコートを、２枚のＤＦＩ 色素生成アガープレートおよび２枚のＲ＆Ｆ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ色素生成アガープレートにプレーティングした。さらに、各富化物の１白金耳を、２枚のＤＦＩ色素生成アガープレートおよび２枚のＲ＆Ｆ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ色素生成アガープレートに染みこませた。全てのプレートを、３６±１℃で１８〜２４時間インキュベートした。推定陽性コロニーを、ＢＡＭ Ｃｈ． ２９の第Ｆ節に概説されるように、ＰＣＲによって確認した。
ＩＳＯ ２２９６４：２００６（試験時点での最新バージョン）を、マトリクス評価のために方法開発者の研究室で使用した。簡潔には、９０ｍＬのＢＰＷを、１０ｇのＰＩＦに添加した。上記サンプルを、３７±１℃で１８±２時間、インキュベートした。次いで、０．１ｍＬを、ＢＰＷ培養物から１０ｍＬのｍＬＳＴ／バンコマイシン培地へと移し、４４±１℃で２４±２時間、インキュベートした。ｍＬＳＴ／バンコマイシン培養物の１白金耳を、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｇａｒに染みこませ、４４±１℃で２４±２時間、インキュベートした。次いで、１〜５個の推定陽性コロニーを、ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙａアガー（ＴＳＡ）プレートに染みこませ、２５℃で４８±４時間、インキュベートした。黄色に着色したコロニーを、さらなる生化学的確認試験のために選択した。
ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ法に関して、９００ｍＬの滅菌ＢＰＷを、滅菌した２Ｌ エルレンマイヤーフラスコ中で１００ｇ ＰＩＦに添加し、ＰＩＦが均一に懸濁されるまで手で穏やかに撹拌した。試験サンプルを、３６±１℃で２４±２時間インキュベートした。富化後、上記サンプルを徹底的に混合し、各サンプルからの４×４０ｍＬを、５０ｍＬ 遠心分離チューブに移した。上記アリコートを、３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。得られたペレットを、２００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水中で再懸濁した。２つのアリコートを、推定陽性を決定するためのＰＣＲに使用し、２つのアリコートを、必要であれば、培養確認のために使用した。ＰＣＲスクリーンのために、２つのアリコートを１．５ｍＬ 微小遠心分離チューブに移し、３，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、４００μＬのＰＲＥＰＭＡＮ ＵＬＴＲＡ（登録商標）サンプル調製試薬中に再懸濁し、ペレットが完全に再懸濁されるまでボルテックスによって最大速度で混合した。上記サンプルを、ドライバスインキュベーター中、１００℃で１０分間加熱し、次いで、室温へと冷却した。上記サンプルが一旦室温に達したら、上記サンプルを２分間、１５，０００×ｇで遠心分離し、その上清のうちの５０μＬ アリコートを、ＰＣＲ分析のために新しい微小遠心分離チューブに移した。各サンプルに関して、ＰＣＲ分析を内部コントロール（ＩｎＣ）ありまたはなしで行った。上記ＰＣＲ反応構成要素および上記ＰＣＲプロトコールを、ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈａｐｔｅｒ ２９参照方法に概説されるとおりに倣った。推定陽性を、ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９、第Ｅ節および第Ｆ節を使用して確認した。簡潔には、再懸濁したペレットのうちの１００μＬ アリコートを、２枚のＤＦＩ色素生成アガープレートおよび２枚のＲ＆Ｆ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ色素生成アガープレートにプレーティングした。さらに、各富化物のうちの１白金耳を、２枚のＤＦＩ色素生成アガープレートおよび２枚のＲ＆Ｆ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ色素生成アガープレート上で画線培養した。全てのプレートを、３６±１℃で１８〜２４時間インキュベートした。コロニーを、ＢＡＭ Ｃｈ． ２９の第Ｆ節に概説されるように、ＰＣＲによって確認した。
全試験結果を、９５％ 信頼区間（ＣＩ）に対してＰＯＤ統計分析を使用して分析した。ＰＯＤ分析は、付表Ｊの中のＡＯＡＣ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬガイドラインに記載される。上記分析からのデータを、表５〜８に示す。
上記方法開発者研究は、試験した全てのマトリクスに関して、上記アッセイとＩＳＯ ２２９６４：２００６とＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ参考方法との間に差異はないことを示した（表５〜８）。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイによって推定陽性であった全試験部分を、それらそれぞれの参照方法によってＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒを含むことを確認した。偽陰性結果はなかった。上記ＰＯＤ分析は、ペア形式の研究においてＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイとＩＳＯ ２２９６４：２００６参照方法との間に有意差がないことを示した（表５）。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイ推定とＢＡＭ Ｃｈ． ２９確認結果の数の間に統計的な差異はなかった（表６）。Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイ結果およびＢＡＭ Ｃｈ． ２９確認、ならびに推定結果および確認結果の比較はまた、統計的に有意でなかった（表６および７）。ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイとＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９非ペア形式研究との比較は、上記２つの方法の成績において統計的差異がないことを示した（表８）。１つの例外は、１００ｇ ミルクベースのアッセイ 対 ＢＡＭ Ｃｈ． ２９方法比較であった（表８）。上記段階的陽性の間の差異は、統計的に有意であり、この場合、ｄＰＯＤは０．３５であり、ＣＩは（０．０４， ０．５８）であった。上記研究において使用されるＰＩＦの好気性細菌プレート計数は、０ ＣＦＵ／ｇであり、これは、上記ＰＩＦに、富化プロセスの開始時に存在するバックグラウンド細菌叢がなかったか、または非常に低レベルであったことを示す。
独立した実験評価は、ミルクベースのＰＩＦに関して、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイをＩＳＯ ２２９６４：２０１７およびＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈａｐｔｅｒ ２９参照方法と比較するマトリクス研究を含んだ。ＩＳＯ ２２９６４：２０１７に対する方法の比較に関しては、３０ペアの１０ｇ 試験部分を評価した。ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈａｐｔｅｒ ２９に対する方法の比較に関しては、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイの１００ｇおよび３００ｇの試験部分を、参照方法の１００ｇ 試験部分と比較した。各サンプルセット内では、５つの非接種サンプル（０ ＣＦＵ／試験部分）、２０の低レベル接種サンプル（０．２〜２ ＣＦＵ／試験部分）、および５つの高レベル接種サンプル（２〜１０ ＣＦＵ／試験部分）が存在した。上記低接種レベルを、段階的陽性結果（上記候補方法または参照方法は、５〜１５の陽性結果を生じるもの（２５〜７５％））を生成するように設計した。
上記ＰＩＦを地域の流通業者から購入し、ＩＳＯ ２２９６４：２０１７に従って分析物の平常の汚染を予めスクリーニングし、ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈａｐｔｅｒ ３によって全好気性細菌数に関して分析した。スクリーニング後、上記マトリクスに、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ種の株を接種した。検証のために、凍結乾燥した培養物を、上記ＰＩＦに接種するために使用した。上記凍結乾燥した培養物を、５％ ヒツジ血液を含むｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙアガーからブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロスへと単一のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉコロニーを移し、上記培養物を３５±２℃で１８〜２４時間インキュベートすることによって調製した。インキュベート後、上記培養物を滅菌凍結保護物質（再構成した無脂肪粉乳）（ＮＦＤＭ）中に希釈し、凍結乾燥システム上に４８〜７２時間置いた。上記培養物を凍結乾燥システムから取り出した後、上記凍結乾燥培養物を、ＮＦＤＭ中で、段階的陽性結果を生じると予想される低レベルおよび全陽性結果を生じると予想される高レベルへと希釈した。上記マトリクスのバルクロットを接種した。接種後、上記マトリクスを、２週間、室温（２４±２℃）で保持して、上記マトリクスにおける生物の平衡化を可能にした。
全好気性細菌数を、ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ３に従って決定した。低レベル接種物および高レベル接種物におけるＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒのレベルを、分析当日にＭＰＮによって決定した。ペア形式のサンプル分析に関しては、上記低レベルＭＰＮを、５×２５ｇ 試験部分、上記試験からの２０×１０ｇ 試験部分、および５×４ｇ 試験部分を評価することによって決定した。高レベル接種物中のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒのレベルを、上記試験からの５×１０ｇ 試験部分、５×４ｇ 試験部分、および５×１．５ｇ 試験部分を評価することによって決定した。
非ペア形式分析に関しては、上記低レベルＭＰＮを、５×２００ｇ 試験部分、上記研究からの２０×１００ｇ 参照方法試験部分、および５×５０ｇ 試験部分を評価することによって決定した。上記高レベル接種物のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒのレベルを、上記研究からの５×１００ｇ 参照方法試験部分、５×５０ｇ 試験部分、および５×２５ｇ 試験部分を評価することによって決定した。各試験部分をＢＰＷで富化し、参照方法手順によって分析した。ＬＣＦ ＭＰＮ計算機（バージョン１．６）を使用してＭＰＮを計算するために、上記３種の試験レベルからの陽性の数を使用した。
ＩＳＯ ２２９６４：２０１７に関しては、１０ｇのＰＩＦ試験部分を、９０ｍＬのＢＰＷ（ＩＳＯ製剤）で富化し、３７±１℃で１８±２時間、インキュベートした。インキュベーション後、０．１ｍＬの初代富化物を、１０ｍＬのＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ選択ブロス（ＣＳＢ）に移し、４１．５±１℃で２４±２時間インキュベートした。インキュベーション後、上記ＣＳＢのうちの１白金耳を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ （ＣＣＩ）アガーに染みこませ、４１．５±１℃で２４±２時間インキュベートした。上記ＣＣＩプレートのインキュベーション後、１〜５個の代表的Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ種のコロニー（中程度のサイズの、１ｍｍ〜３ｍｍの青緑色から青色のコロニー）を、ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｓｏｙａアガー（ＴＳＡ）に移し、３５±１℃で１８〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、代表的コロニー（黄色に着色した１ｍｍ〜３ｍｍのもの）に対してオキシダーゼ試験を行い、最終の生化学的確認を、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ２０１１．１７に従ってＶＩＴＥＫ（登録商標） ２ ＧＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎカードを使用することによって行った。
ＢＡＭ Ｃｈ． ２９に関しては、１００ｇ ＰＩＦ試験部分を、２Ｌのエルレンマイヤーフラスコに添加し、９００ｍＬの予め加温した（３７℃） ＢＰＷで富化し、３７±１℃で２４±２時間インキュベートした。インキュベーション後、４×４０ｍＬ アリコートを、４×５０ ｍＬ コニカルバイアルに移した。上記アリコートを、３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。各コニカルチューブに関して、上清を吸引し、脂質沈殿物を、滅菌綿棒を使用して除去した。残りのペレットを、２００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水を添加し、懸濁物を最大速度で２０秒間ボルテックスにかけて混合することによって再懸濁した。各サンプルに関して、上記アリコートのうちの２つを、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒのＰＣＲスクリーニングのために使用し、上記アリコートのうちの２つを、培養確認のために使用した。
ＰＣＲスクリーニングに関して、２つのアリコートを、別個の１．５ｍＬ 微小遠心分離チューブに移し、３，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清および脂質層を除去し、ペレットを、４００μＬのＰＲＥＰＭＡＮ ＵＬＴＲＡ（登録商標）サンプル調製試薬を添加し、懸濁が達成されるまで最大速度でボルテックスにかけて混合することによって、再懸濁した。上記サンプルを、ドライバスインキュベーター中、１００℃で１０分間熱処理し、次いで、室温へと冷却した。Ｏｎｃｅ 上記サンプルが一旦室温に達したら、上記サンプルを、２分間、１５，０００×ｇで遠心分離し、その上清のうちの５０μＬ アリコートを、ＰＣＲ分析のために新しい微小遠心分離チューブに移した。各サンプルに関して、ＰＣＲ分析を、内部コントロール（ＩｎＣ）ありおよびなしで行った。上記ＰＣＲ反応構成要素およびＰＣＲプロトコールは、ＦＤＡ ＢＡＭ Ｃｈ． ２９参照方法に概説されるとおりに倣った。
推定ＰＣＲ結果とは関係なく、各サンプルからの１００μＬの懸濁した細胞を、２枚のＤＦＩ色素生成アガープレートおよび２枚のＲ＆Ｆアガープレートに染みこませた。ＤＦＩ色素生成アガープレートおよびＲ＆Ｆアガープレートを、３６±１℃で１８〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＦＩ色素生成アガープレートからの代表的なＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒコロニー（薄い緑色から濃い緑色の褐色がかったコロニー、または中心が緑色で縁部が白色から黄色のコロニー）およびＲ＆Ｆアガープレートからの代表的なＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒコロニー（バックグラウンドが赤い、青色から黒色のまたは青色から灰色のコロニー）を、ＶＩＴＥＫ（登録商標） ２ ＧＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎカード（ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ２０１１．１７）およびＰＣＲ分析によって生化学的に確認した。
全３種のレベルに関して、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイと参照方法との間のＰＯＤ分析は、上記方法によって得られた陽性結果数の間に、５％ レベル統計的有意差がないことを示した（表５〜８）。全３種のレベルに関して、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒアッセイの推定結果と確認された結果との間でのＰＯＤ分析は、分析した全試験部分に関して５％ レベルで統計的有意差がないことを示した（表５〜８）。上記研究において使用したＰＩＦの好気性細菌プレート計数は、４０ ＣＦＵ／ｇであり、これは、上記ＰＩＦが、およそ４００ ＣＦＵ（１０ｇ）、４，０００ ＣＦＵ（１００ｇ）、または１２，０００ ＣＦＵ（３００ｇ）の、プロセス全体の開始時に存在するバックグラウンド細菌叢を有することを示した。
Figure 2021510508
Figure 2021510508
Figure 2021510508
Figure 2021510508

Claims (22)

  1. バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む組換えバクテリオファージであって、ここで前記組換えバクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐに特異的に感染する、組換えバクテリオファージ。
  2. 前記組換えバクテリオファージは、野生型Ｓａｋａ２、Ｓａｋａ４、またはＳａｋａ１０バクテリオファージに由来する、請求項１に記載の組換えバクテリオファージ。
  3. 前記インジケーター遺伝子がコドン最適化され、内因性シグナルを生成する可溶性タンパク質生成物または基質との反応の際にシグナルを生成する可溶性酵素をコードする、請求項１に記載の組換えバクテリオファージ。
  4. 前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に非翻訳領域をさらに含み、該非翻訳領域が、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む、請求項１に記載の組換えバクテリオファージ。
  5. 少なくとも２種の異なるタイプの組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物であって、ここで前記組換えバクテリオファージのうちの少なくとも１種は、請求項１に記載のインジケーター遺伝子を含む、カクテル組成物。
  6. 組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法であって、
    標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、
    インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程、
    該相同組換えプラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、
    形質転換された該標的病原性細菌に、選択された該野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、該プラスミド／ベクターと該バクテリオファージのゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および
    組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程
    を含む、方法。
  7. 相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程は、
    選択された前記バクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然のヌクレオチド配列を決定すること；
    前記ゲノムを注釈し、選択された前記バクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を識別すること；
    前記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計することであって、前記配列がコドン最適化インジケーター遺伝子を含むこと；および
    相同組換えのために設計された前記配列をプラスミド／ベクターに組み込むこと
    を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 配列を設計することが、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を、前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に挿入することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記相同組換えプラスミドが、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記野生型バクテリオファージは、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージであり、前記標的病原性細菌は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．である、請求項８に記載の方法。
  11. 組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程が、前記インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを含む、請求項８に記載の方法。
  12. サンプル中のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するための方法であって、前記方法は：
    前記サンプルを、バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程；および
    前記組換えバクテリオファージによって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで前記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．が前記サンプルに存在することを示す工程、
    を含む方法。
  13. 前記サンプルが、食品サンプル、環境サンプル、水サンプルまたは商業サンプルである、請求項１２に記載の方法。
  14. 食品安全産業のための標準サイズのサンプル中の１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個程度の少なさの細菌を検出する、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記食品サンプルは、食肉、魚肉、野菜、卵、酪農製品、ドライフード製品、または乳児用調製粉乳を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記サンプルは、少なくとも２種の異なるタイプの組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物とともにインキュベートされ、前記組換えバクテリオファージのうちの少なくとも１種は、請求項１２に記載のインジケーター遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記サンプルは、２４時間未満、２３時間未満、２２時間未満、２１時間未満、２０時間未満、１９時間未満、１８時間未満、１７時間未満、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、または２時間未満の富化期間の間、成長を有利にする条件において最初にインキュベートされる、請求項１６に記載の方法。
  18. 結果までの合計時間は、２６時間未満、２５時間未満、２４時間未満、２３時間未満、２２時間未満、２１時間未満、２０時間未満、１９時間未満、１８時間未満、１７時間未満、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、または２時間未満である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記インジケーターを検出する工程によって生成されるシグナル対バックグラウンドの比が、少なくとも２．０または少なくとも２．５である、請求項１２に記載の方法。
  20. Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するためのキット。
  21. 前記組換えバクテリオファージによって発現される可溶性タンパク質生成物を検出するための、インジケーターと反応させるための基質をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
  22. Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を検出するためのシステム。
JP2020538028A 2018-01-12 2019-01-14 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム Pending JP2021510508A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023181817A JP2023182818A (ja) 2018-01-12 2023-10-23 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862616956P 2018-01-12 2018-01-12
US62/616,956 2018-01-12
US201862628616P 2018-02-09 2018-02-09
US62/628,616 2018-02-09
US201862661739P 2018-04-24 2018-04-24
US62/661,739 2018-04-24
PCT/US2019/013541 WO2019140407A1 (en) 2018-01-12 2019-01-14 Methods and systems for the rapid detection of cronobacter using infectious agents

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023181817A Division JP2023182818A (ja) 2018-01-12 2023-10-23 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2021510508A true JP2021510508A (ja) 2021-04-30

Family

ID=65516721

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020538028A Pending JP2021510508A (ja) 2018-01-12 2019-01-14 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム
JP2020538026A Pending JP2021511023A (ja) 2018-01-12 2019-01-14 感染性因子を使用するＳａｌｍｏｎｅｌｌａの迅速検出のための方法およびシステム
JP2023181817A Pending JP2023182818A (ja) 2018-01-12 2023-10-23 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020538026A Pending JP2021511023A (ja) 2018-01-12 2019-01-14 感染性因子を使用するＳａｌｍｏｎｅｌｌａの迅速検出のための方法およびシステム
JP2023181817A Pending JP2023182818A (ja) 2018-01-12 2023-10-23 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20190218590A1 (ja)
EP (2) EP3737745A1 (ja)
JP (3) JP2021510508A (ja)
CN (2) CN111770990A (ja)
AU (2) AU2019208099A1 (ja)
BR (2) BR112020011674A2 (ja)
CA (2) CA3083263A1 (ja)
MX (2) MX2020007054A (ja)
WO (2) WO2019140409A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112022003129A2 (pt) * 2019-08-26 2022-05-17 Laboratory Corp America Holdings Dispositivos e métodos para a detecção de microrganismos usando bacteriófago indicador recombinante deficiente em reprodução
WO2021050939A1 (en) * 2019-09-11 2021-03-18 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for the rapid detection of microorganisms using recombinant infectious agents to express an indicator subunit
US20230330657A1 (en) * 2020-09-25 2023-10-19 Charm Sciences, Inc. Sample preparation and detection systems and methods

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6143998A (ja) * 1984-06-05 1986-03-03 アマーシャム　インターナショナル　パブリック　リミティド　カンパニー 環境中微生物の検出方法
JP2011507494A (ja) * 2007-12-13 2011-03-10 キンバリー クラーク ワールドワイド インコーポレイテッド 院内感染の検出用の組換え型バクテリオファージ
WO2017127434A1 (en) * 2016-01-18 2017-07-27 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19517940A1 (de) 1995-05-18 1996-11-21 Merck Patent Gmbh Nachweis von Listerien mittels rekombinanter Bakteriophagen
CN101204584A (zh) 2007-12-17 2008-06-25 北京娜可长今国际银离子科技开发有限公司 以减毒沙门氏菌为载体的肿瘤疫苗及其制备方法
US10519483B2 (en) * 2012-02-21 2019-12-31 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents
US10913934B2 (en) 2013-02-21 2021-02-09 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents
EP3011062A4 (en) * 2013-06-19 2017-06-14 Sample6 Technologies Inc. Phage-based bacterial detection assay
ES2705716T3 (es) 2014-02-18 2019-03-26 Laboratory Corp America Holdings Métodos y sistemas para la detección rápida de microorganismos utilizando un bacteriófago recombinante
US20180274004A1 (en) * 2014-05-09 2018-09-27 Institute For Environmental Health, Inc. Recombinant phage and methods of detecting listeria
AU2017241592A1 (en) 2016-03-28 2018-10-18 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Bacteriophage engineering methods
GB201615254D0 (en) * 2016-09-08 2016-11-23 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Novel Ligand and use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6143998A (ja) * 1984-06-05 1986-03-03 アマーシャム　インターナショナル　パブリック　リミティド　カンパニー 環境中微生物の検出方法
JP2011507494A (ja) * 2007-12-13 2011-03-10 キンバリー クラーク ワールドワイド インコーポレイテッド 院内感染の検出用の組換え型バクテリオファージ
WO2017127434A1 (en) * 2016-01-18 2017-07-27 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INT. J. FOOD MICROBIOL., vol. 115, JPN6022047434, 2007, pages 195 - 203, ISSN: 0004915590 *
J. FOOD PROT., vol. 74, no. 4, JPN7022005265, 2011, pages 573 - 579, ISSN: 0004915591 *
MOL. BIOTECHNOL., vol. 1, no. 6, JPN6022047433, 2008, pages 532 - 543, ISSN: 0004915589 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111770990A (zh) 2020-10-13
WO2019140409A1 (en) 2019-07-18
CA3084830A1 (en) 2019-07-18
CA3083263A1 (en) 2019-07-18
BR112020011688A2 (pt) 2020-11-17
AU2019208101A1 (en) 2020-06-18
EP3737746A1 (en) 2020-11-18
US20190218590A1 (en) 2019-07-18
US11873524B2 (en) 2024-01-16
MX2020007056A (es) 2020-09-09
AU2019208099A1 (en) 2020-06-18
US20190218589A1 (en) 2019-07-18
BR112020011674A2 (pt) 2020-11-17
JP2021511023A (ja) 2021-05-06
CN111757929A (zh) 2020-10-09
JP2023182818A (ja) 2023-12-26
MX2020007054A (es) 2020-09-09
WO2019140407A1 (en) 2019-07-18
EP3737745A1 (en) 2020-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7210518B2 (ja) 組み換えバクテリオファージを使用する、微生物の迅速検出のための方法及びシステム
US20210238559A1 (en) Methods and Systems for Rapid Detection of Microorganisms Using Infectious Agents
AU2017209041B2 (en) Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents
US20210079443A1 (en) Indicator bacteriophage for selecting and monitoring for efficacy of therapeutics and methods for using same
JP2023182818A (ja) 感染性因子を使用するＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒの迅速検出のための方法およびシステム
JP2021516964A (ja) 微生物検出タンパク質を使用して微生物を検出するための方法および細胞結合構成要素の他の用途
US20230348952A1 (en) Devices and Methods for Detecting Microorganisms Using Recombinant Reproduction-Deficient Indicator Bacteriophage
US20200239860A1 (en) Methods and Systems for the Rapid Detection of Listeria Using Infectious Agents

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20211119

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20221031

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221108

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230207

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230407

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230623

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231023

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20231026

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20231208