CN111770990A - 使用感染因子快速检测克罗诺杆菌属的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本文公开了快速检测样品中的微生物诸如克罗诺杆菌属种的方法和系统。还公开了在晚期基因区内包含指示基因的经遗传修饰的噬菌体。噬菌体诸如克罗诺杆菌属特异性噬菌体的特异性允许检测特定微生物，诸如克罗诺杆菌属种，并且可以放大指示信号以优化测定灵敏度。

Description

使用感染因子快速检测克罗诺杆菌属的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月12日提交的美国临时申请第62/616,956号、2018年2月9日提交的第62/628,616号以及2019年4月24日提交的第62/661,739号的优先权。美国申请第13/773,339号、第14/625,481号、第15/263,619号、第15/409,258号以及美国临时申请第62/616,956号、第62/628,616号和第62/661,739号的公开内容在此通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及使用感染因子检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒。
背景
人们对提高检测生物、食品、水和临床样品中细菌、病毒和其他微生物的速度和灵敏度非常感兴趣。微生物病原体可导致人和家畜的大量死亡，以及巨大的经济损失。此外，鉴于因摄入被某些微生物(例如克罗诺杆菌属种(Cronobacterspp.)、沙门氏菌属种(Salmonella spp.)、李斯特菌属种(Listeriaspp.)或葡萄球菌属种(Staphylococcusspp.))污染的食物而导致的威胁生命或致命疾病的爆发，检测微生物是食品与药物管理局(FDA)、疾病控制中心(CDC)以及美国农业部(USDA)关注的高度优先级事项。
用于检测细菌的常规微生物检验依赖于非选择性和选择性富集培养，随后在选择性培养基上进行铺板，并进一步检验以确认可疑菌落。此类程序可能需要几天时间。已经研究了多种快速方法并将其引入实践中以减少时间需求。然而，这些方法有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链式反应(PCR)测试也包括扩增步骤，因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，能够经济地进行PCR检验的样品量是有限的。对于稀的细菌悬浮液，大多数小的子样品将不含细胞，因此仍然需要纯化和/或长时间的富集步骤。
常规生物富集所需的时间由样品中目标细菌群体的生长率、样品基质的作用和所需的灵敏度决定。实际上，大多数高灵敏度方法采用过夜孵育，总共需要约24小时。由于培养需要时间，因此这些方法可能花费三天时间，这取决于待鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食物、水或其他产品可能已经进入牲畜或人体内。另外，抗生素抗性细菌和生物防御因素的增加使得快速鉴定水、食品和临床样品中的细菌病原体成为全球的关键优先级事项。
因此，需要更快速、简单和灵敏地检测和鉴定微生物，诸如细菌和其他潜在的病原性微生物。
发明内容
本发明的实施方案包括用于检测微生物诸如克罗诺杆菌属种的组合物、方法、系统和试剂盒。本发明可以以多种方式实施。
在一些方面，本发明包括重组噬菌体，其包含插入噬菌体基因组的晚期基因区中的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是经遗传修饰的克罗诺杆菌属特异性噬菌体基因组。在某些实施方案中，重组噬菌体包含经遗传修饰的噬菌体基因组，该基因组来源于特异性识别克罗诺杆菌属种(以前被分类为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii))的噬菌体。在一些实施方案中，用于制备重组噬菌体的噬菌体特异性感染一种或多种克罗诺杆菌。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在其他类型的细菌存在的情况下区分出克罗诺杆菌属种。
在重组指示噬菌体的一些实施方案中，指示基因可以是密码子优化的，并且可以编码产生内在信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。一些重组噬菌体还包含密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，诸如刺虾(Oplophorus)萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者其可以是经遗传工程改造的基因，诸如
Figure BDA0002573137820000031
本文还公开了制备重组指示噬菌体的方法。一些实施方案包括选择特异性感染目标致病菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化到目标致病菌中；用选择的野生型噬菌体感染转化的目标致病菌，从而允许质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；以及分离重组噬菌体的特定克隆。在一些实施方案中，所选的野生型噬菌体是克罗诺杆菌属特异性噬菌体。在一些实施方案中，所选的野生型噬菌体是肌病毒，诸如T4病毒、T4样病毒或Vil样病毒。在一些实施方案中，所选的野生型噬菌体感染克罗诺杆菌属种，诸如噬菌体Saka2或Saka4。克罗诺杆菌属种噬菌体Saka2和Saka4是新分离和测序的噬菌体，可能是肌病毒。在其他实施方案中，所选野生型噬菌体是短尾病毒，诸如T7样病毒或Sp6样病毒。在其他实施方案中，所选的野生型噬菌体是Saka10。Saka10是新分离和测序的噬菌体，可能是与T7噬菌体相关的短尾病毒。
在一些实施方案中，制备同源重组质粒/载体包括确定所选噬菌体基因组的晚期区域的天然核苷酸序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计主要衣壳蛋白基因下游的用于同源重组的序列，其中该序列包含密码子优化的指示基因；以及将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中。设计序列的步骤可包括在密码子优化的指示基因的上游插入包含非翻译区的遗传构建体，所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，所述噬菌体晚期基因启动子是外源启动子，不同于噬菌体基因组中的任何内源启动子。因此，在一些方法中，所述同源重组质粒包含非翻译区，该非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和密码子优化的指示基因上游的核糖体进入位点。
本发明的一些实施方案是包含如本文所述的重组指示噬菌体的组合物。例如，组合物可包括一种或多种野生型或经遗传修饰的感染因子(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可包括不同指示噬菌体的混合物，所述指示噬菌体可编码和表达相同或不同的指示蛋白。
在一些实施方案中，本发明包括用于检测样品中的目标微生物的方法，该方法包括以下步骤：将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育，其中所述重组噬菌体包含插入到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物，以及检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明目标微生物存在于样品中。
在制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案中，野生型噬菌体是克罗诺杆菌属之种的特异性噬菌体，目标致病菌是克罗诺杆菌属种。在一些实施方案中，野生型噬菌体特异性感染先前被分类为阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)的细菌。在一些实施方案中，分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离展示指示基因表达的克隆的有限稀释测定。
本发明的其他方面包括用于检测样品中的细菌诸如克罗诺杆菌属种的方法，其包括以下步骤:将样品与源自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的重组噬菌体一起孵育，并检测由重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明克罗诺杆菌属种存在于样品中。在一些实施方案中，本发明包括使用来源于靶向克罗诺杆菌属种的噬菌体的重组噬菌体检测克罗诺杆菌属种的方法。样品可以是食物或水样品。
在用于检测细菌的方法的一些实施方案中，首先将样品在有利于生长的条件下孵育24小时或更少、23小时或更少、22小时或更少、21小时或更少、20小时或更少、19小时或更少、18小时或更少、17小时或更少、16小时或更少、15小时或更少、14小时或更少、13小时或更少、12小时或更少、11小时或更少，10小时或更少，或9小时或更少，8小时或更少，7小时或更少，6小时或更少，5小时或更少，4小时或更少，3小时或更少，或2小时或更少的富集期。在一些实施方案中，检测之前不富集样品。在一些实施例中，达到结果的总时间少于26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。在一些实施例中，通过检测指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5或至少3.0。在一些实施方式中，该方法在食品安全行业标准尺寸的样品中检测到少至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个特定细菌。
其他实施方案包括用于检测克罗诺杆菌属种的系统和试剂盒，其中所述系统或试剂盒包括源自克罗诺杆菌特异性噬菌体的重组噬菌体。一些实施方案还包括用于与指示剂反应以检测重组噬菌体表达的可溶性蛋白产物的底物。这些系统或试剂盒可包括针对本发明的噬菌体、组合物和方法所描述的特征。在其他实施方案中，本发明包括用于根据本发明的方法或系统的非瞬态计算机可读介质。
附图简述
通过参考以下非限制性的附图，可以更好地理解本发明。
图1描述了根据本发明的一个实施方案的指示噬菌体构建体，其说明了包含萤光素酶基因、噬菌体晚期基因启动子和插入噬菌体晚期(III类)区域的核糖体结合位点(RBS)的基因构建体的插入。所描述的启动子是除了内源性晚期基因(诸如主要衣壳蛋白(MCP)基因)上游的内源性晚期基因启动子以外以及与其分开的启动子。
图2显示了噬菌体SAKA2的基因组，所述噬菌体SAKA2是从污水中获得的肌病毒(与T4噬菌体相关)。与PG7尾鞘蛋白同源的假设基因位于晚期基因区(由编码病毒体蛋白的结构基因组成)的外围。所描述的其他晚期基因是已知的头顶蛋白(head vertex protein)ORF58.1的同源物(可能是主要衣壳蛋白)和已知的外头蛋白(outer head protein)的同源物。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，因此只要使用晚期基因启动子和/或其他类似的控制元件，预期插入该区域的任何基因都可以具有类似的表达水平。
图3显示了两种同源重组质粒构建体设计，所述构建体携带3种不同噬菌体的萤光素酶基因，其中在插入位点的上游和下游具有约500bp的匹配噬菌体序列，以促进同源重组。将
Figure BDA0002573137820000061
萤光素酶插入具有上游非翻译区的pUC57.AmpR质粒主链，所述上游非翻译区含有专门的噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。克罗诺杆菌属噬菌体Saka2和Saka4是新分离和测序的噬菌体，可能是肌病毒。每个构建体由以下序列组成：由主要衣壳蛋白基因的片段组成的500bp的同源序列，随后是T4晚期基因启动子(其是除了噬菌体基因组中主要衣壳蛋白上游的内源晚期基因启动子以外的启动子)、萤光素酶基因，以及约500bp的用于同源重组的下游匹配序列。Saka9和Saka10是新分离和经测序的噬菌体，可能是短尾病毒(与T7噬菌体相关)，其需要T7样晚期基因启动子而不是T4晚期基因启动子。
图4描述了使用一系列连续感染和稀释步骤，从使用诸如图3所示的那些的质粒构建体对噬菌体的修饰中分离重组噬菌体，以鉴定表达指示基因的重组噬菌体。
图5描述了根据本发明的一个实施方案的编码可溶性萤光素酶的指示噬菌体用于检测细菌细胞的用途，这通过检测细菌细胞感染期间从后代噬菌体复制产生的萤光素酶来实现。
图6描述了根据本发明的一个实施方案，使用经修饰的噬菌体检测目标细菌的过滤板测定法，其中将细菌和重组噬菌体在过滤板上孵育，并且在后代噬菌体产生后，直接检测指示蛋白而不去除孵育介质。
图7描述了根据本发明的一个实施方案，使用经修饰的噬菌体检测目标细菌的“无浓缩测定(No Concentration Assay)”。
图8描述了根据本发明的一个实施方案，使用经修饰的噬菌体检测目标细菌的混合免疫噬菌体(HIP)测定(Hybrid Immuno-Phage)，其中在与具有指示基因的重组感染因子孵育之前，使用针对目标微生物的抗体在测定孔表面上捕获微生物。
具体实施方式
本文公开了对测试样品(例如，生物、食物、水和环境样品)中目标微生物诸如克罗诺杆菌属种的检测显示出惊人的灵敏度的组合物、方法和系统。检测可以在比以前在测定中使用经遗传修饰的感染因子的情况下认为可能的时间范围更短的时间范围内完成，所述测定未进行富集培养，或者在一些实施方案中，以微生物可能在其期间繁殖的最短孵育时间进行。同样令人惊讶的是成功地使用了潜在高的感染复数(MOI)或高浓度的噬斑形成单位(PFU)进行与测试样品的孵育。如此高的噬菌体浓度(PFU/mL)以前被认为在细菌检测测定中是有害的，因为它们被认为会导致“自外裂解(lysis from without)”。然而，高浓度的噬菌体可以促进发现、结合和感染少量的靶细胞。
本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可包含用于检测微生物诸如克罗诺杆菌属种的感染因子。在某些实施方案中，本发明可包括包含重组噬菌体的组合物，所述重组噬菌体具有插入到噬菌体的晚期基因区中的指示基因。在某些实施方案中，宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生。在某些实施方案中，可将指示基因插入噬菌体的晚期基因(即，III类)区。噬菌体可来源于诸如T7、T7样的短尾病毒，诸如T4、T4样、ViI、ViI样(或Vi1病毒，根据GenBank/NCBI)的肌病毒、克罗诺杆菌属种特异性噬菌体或另一种野生型或工程化噬菌体。在一些实施方案中，所选野生型噬菌体是Saka2或Saka4。克罗诺杆菌属种噬菌体Saka2和Saka4是新分离和测序的噬菌体，可能是肌病毒。在其它实施方案中，所选野生型噬菌体是短尾病毒，如T7样病毒或Sp6样病毒。在其他实施方案中，所选野生型噬菌体是Saka10。Saka10是新分离和测序的噬菌体，可能是与T7噬菌体相关的短尾病毒。
在一些方面，本发明包括检测目标微生物的方法。该方法可使用感染因子来检测目标微生物，诸如克罗杆菌属种。例如，在某些实施方案中，目标微生物是克罗诺杆菌属种并且所述感染因子是特异性感染克罗诺杆菌属种的噬菌体。因此，在某些实施方案中，该方法可包括通过将样品与感染目标细菌的重组噬菌体一起孵育来检测样品中的目标细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体包含指示基因。在某些实施方案中，可将指示基因插入噬菌体的晚期基因区，使得在宿主细菌感染后的噬菌体复制期间指示基因的表达导致指示蛋白产物的产生。该方法可包括检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在目标细菌。在一些实施方案中，指示蛋白是可溶性的。
在某些实施方案中，本发明可包括系统。该系统可包含至少一些本发明的组合物。此外，该系统还可包括用于进行该方法的至少一些组分。在某些实施方案中，将系统配制成试剂盒。因此，在某些实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中的目标微生物诸如克罗诺杆菌属种的系统，其包括：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组分，其中所述感染因子包含指示剂部分；和用于检测指示剂部分的组分。在其他实施方式中，本发明包括与所述方法或系统一起使用的软件。
因此，本发明的一些实施方案通过使用基于噬菌体的方法来扩增指示细菌存在的可检测信号来解决需求。在某些实施例中，检测到少至单个细菌。本文应用的原理可以应用于多种微生物的检测。由于微生物表面上存在感染因子的许多结合位点，因此在感染过程中产生100个或更多个因子后代的能力，以及编码的指示部分、感染因子或指示部分的高水平表达的潜力，比微生物本身更容易被检测到。这样，本发明的实施方案可以甚至从单个受感染的细胞中实现巨大的信号扩增。
本发明的各方面利用能够与特定微生物结合的结合剂(诸如感染因子的结合组分)的高特异性作为检测和/或定量样品中特定微生物的手段。在一些实施方案中，本发明利用了感染因子诸如噬菌体的高特异性。
在一些实施方案中，通过与对目标微生物特异的结合剂相关的指示部分来实现检测。例如，感染因子可包含指示部分，诸如编码可溶性指示剂的基因。在一些实施方案中，所述指示剂可由感染因子诸如噬菌体编码，并且所述噬菌体被指定为指示噬菌体。
本文公开和描述的本发明的一些实施方案利用了单个微生物能够结合特异性识别剂诸如噬菌体的发现。在噬菌体感染和复制后，后代噬菌体可以通过在噬菌体复制过程中表达的指示部分来检测。该原理允许基于微生物表面受体的特异性识别来扩增来自一个或几个细胞的指示信号。例如，通过将细菌的甚至单个细胞暴露于多个噬菌体，然后允许噬菌体扩增和复制过程中编码的指示基因产物的高水平表达，指示信号得到扩增，使得单个细菌是可检测的。
本发明的方法和系统的实施方案可应用于在多种情况下对多种微生物(例如细菌)的检测和定量，包括但不限于对来自食品、水和商业样品的病原体的检测。本发明的方法快速提供高检测灵敏度和特异性。在一些实施方案中，有可能在噬菌体的单个复制周期内实现检测，这是意想不到的。
定义
除非本文中另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交相关的术语和技术是本领域公知和常用的。已知的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法以及贯穿本说明书讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的进行，除非另有说明。如本领域中通常完成的或如本文所述的，根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术。与本文描述的实验室程序和技术中使用的术语是本领域公知和常用的术语。
除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义:
如本文中所用，除非另外特别指出，否则术语“一个/种(a)”和“该/所述”可以指一个/种或多个/种。
除非明确表示仅指备选方案或备选方案相互排斥，否则术语“或”的使用用于指“和/或”，尽管本公开支持仅指备选方案和“和/或”的定义。如本文中所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
在本申请中，术语“约”用于表示值包括用于测定该值的设备、方法的固有误差变化或存在于样本之间的变化。
术语“固体支持物”或“支持物”意指提供生物分子可以结合于其上的基底和/或表面的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即，诸如微量滴定板或多孔板)，或者固体支持物可以是过滤器、阵列或移动支持物，诸如珠粒或膜(例如，过滤板、胶乳颗粒、顺磁性颗粒或侧向流试纸条)上的位置。
术语“结合剂”是指能够与第二(即，不同的)目标分子特异性和选择性结合的分子。该相互作用可以是非共价的，例如作为氢键合、范德华相互作用或者静电或疏水相互作用的结果，或者其可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物结合(即共价或非共价结合)的结合剂。
如本文中所用，“分析物”是指被测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，目标分析物可以与结合剂相互作用。如本文中所述，术语“分析物”可以指目标蛋白质或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可能没有生物效应。分析物可以包括小分子、糖、寡糖、脂类、肽、肽模拟物、有机化合物等。
术语“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报告分子”或“指示剂”或“指示部分”是指可以在定量测定中测量的分子。例如，指示部分可包含酶，该酶可用于将底物转化为可被测量的产物。指示部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如萤光素酶)。或者，指示部分可以是可被定量的放射性同位素。或者，指示部分可以是荧光团。或者，可使用其他可检测的分子。
如本文中所用，“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括多种细菌病毒中的一种或多种。在本公开中，术语“噬菌体(bacteriophage)”和“噬菌体(phage)”包括病毒，诸如分枝杆菌噬菌体(诸如针对TB和副TB)、真菌噬菌体(例如针对真菌)、支原体噬菌体，以及指能够侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他微观活生物体并使用它们来自我复制的病毒的任何其他术语。此处，“微观”是指最大的尺寸为一毫米或更小。噬菌体是在自然界中进化成利用细菌作为自我复制的手段的病毒。噬菌体通过将其自身附着在细菌上，并将其DNA(或RNA)注射到细菌中，并诱导其复制噬菌体数百次或甚至数千次来达到这一目的。这被称为噬菌体扩增。
如本文中所用，“晚期基因区”是指病毒基因组中在病毒生命周期中的晚期转录的区域。晚期基因区通常包括表达最丰富的基因(例如，组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白)。晚期基因与III类基因同义，包括具有结构和装配功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在噬菌体T7中被转录，例如从感染后8分钟直至裂解，I类(例如，RNA聚合酶)早在从4-8分钟开始，II类从6-15分钟开始，因此II类与III类在时间上有重叠。晚期启动子是在这样的晚期基因区域中天然定位并具有活性的启动子。
如本文中所用，“富集培养”是指在有利于微生物繁殖的培养基中进行的常规培养，诸如孵育，并且不应与“富集”一词的其他可能用途相混淆，诸如通过去除样品的液体组分以浓缩其中包含的微生物而富集，或者不包括微生物繁殖的常规促进的其他富集形式。在本文所述方法的一些实施方案中，可以采用一段时间的富集培养。
如本文中所用，“重组的”是指通常在实验室中进行的遗传(即核酸)修饰，以将原本不会发现在一起的遗传物质聚集在一起。该术语在本文中可与术语“经修饰的”互换使用。
如本文中所用，“RLU”是指通过光度计(例如，
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96)或检测光的类似仪器测量的相对光单位。例如，萤光素酶与合适的底物(例如，
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与
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)之间的反应的检测通常以检测的RLU来报道。
如本文中所用，“至结果的时间”(time to results)是指从样品培养开始到生成结果的总时间量。至结果的时间不包括任何验证性测试时间。数据收集可以在结果生成后的任何时间进行。
样品
本发明的方法和系统的每一个实施方案可以允许快速检测和定量样品中的微生物。例如，根据本发明的方法可以在更短的时期内进行，并具有更好的结果。
本发明可检测的细菌细胞包括但不限于作为食品或水传播病原体的细菌细胞。
样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭子。样品可包括环境材料，诸如水样，或来自空气样品的过滤器或来自旋风收集器的气溶胶样品。样品可以是蔬菜、肉、鱼、家禽、花生酱、加工食品、婴儿配方粉、奶粉、茶、淀粉、鸡蛋、牛奶、奶酪或其他乳制品。
在一些实施例中，可将样品直接用于本发明的检测方法，而无需制备、浓缩或稀释。例如，可将液体样品，包括但不限于牛奶和果汁，直接进行测定。可将样品稀释或悬浮在溶液中，所述溶液可包括但不限于缓冲溶液或细菌培养基。可通过在液体中绞碎、混合或浸渍固体来将固体或半固体样品悬浮在液体中。应将样品保持在促进噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH值范围内。样品还应包含适当浓度的二价和一价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和Ca2+。优选地，将样品保持在保持样品中包含的任何病原体细胞的生存力的温度下。
在检测测定的一些实施方案中，将样品保持在保持样品中存在的任何病原体细胞的生存力的温度下。例如，在噬菌体附着于细菌细胞的步骤中，优选将样品保持在有利于噬菌体附着的温度下。在噬菌体在被感染的细菌细胞内复制或裂解这种被感染的细胞的步骤中，优选将样品保持在促进噬菌体复制和宿主裂解的温度下。此类温度至少为约25摄氏度(℃)，更优选不高于约45℃，最优选约37℃。
测定可包括各种合适的对照样品。例如，可将不含噬菌体的对照样品或不含细菌的含噬菌体对照样品作为用于背景信号水平的对照进行测定。
指示噬菌体
如本文更详细描述的，本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可包含用于检测病原微生物的感染因子。在某些实施方案中，本发明包括重组指示噬菌体，其中噬菌体基因组被遗传修饰以包括指示基因或报告基因。在一些实施方案中，本发明可包括包含重组噬菌体的组合物，所述重组噬菌体具有整合到噬菌体基因组中的指示基因。
重组指示噬菌体可以包括报告基因或指示基因。在感染因子的某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中，指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，可将指示基因插入噬菌体的晚期基因区。晚期基因通常比其他噬菌体基因表达水平更高，因为它们编码结构蛋白。晚期基因区可以是III类基因区，并且可包括主要衣壳蛋白的基因。
一些实施方案包括设计(和任选地制备)主要衣壳蛋白基因下游的用于同源重组的序列。其他实施方案包括设计(和任选地制备)主要衣壳蛋白基因上游的用于同源重组的序列。在一些实施方案中，所述序列包含其前面接有非翻译区的密码子优化的报告基因。非翻译区可包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
在一些实施方案中，指示噬菌体来源于T7噬菌体、T4噬菌体或另一种类似的噬菌体。指示噬菌体也可来源于T4样噬菌体、T7样、ViI噬菌体、ViI样噬菌体、克罗诺杆菌属种特异性噬菌体，或其基因组与下述噬菌体具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的噬菌体：T7噬菌体、T7样噬菌体、T4噬菌体、T4样噬菌体、克罗诺杆菌属种特异性噬菌体、ViI噬菌体或ViI样噬菌体(或ViI病毒样噬菌体，根据GenBank/NCBI)。在一些实施方案中，所选的野生型噬菌体是Saka2或Saka4。克罗诺杆菌属种的噬菌体Saka2和Saka4是新分离和测序的噬菌体，可能是肌病毒。在其它实施方案中，所选野生型噬菌体是短尾病毒，诸如T7样病毒或Sp6样病毒。在其他实施方案中，所选野生型噬菌体是Saka10。Saka10是新分离和测序的噬菌体，可能是与T7噬菌体相关的短尾病毒。在一些实施方案中，指示噬菌体来源于对特定病原微生物高度特异的噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失，因此与许多商购可得的噬菌体相比，经修饰的噬菌体可以保持与野生型感染因子更相似。环境衍生的噬菌体可能对环境中发现的细菌更具特异性，因此在遗传上不同于商购可得的噬菌体。
此外，被认为非必需的噬菌体基因可具有未被识别的功能。例如，明显非必需的基因可在提升突发大小方面有重要的功能，诸如在组装中的精细切割、拟合或修剪功能。因此，删除基因以插入指示剂可能是有害的。大多数噬菌体可以包装比其天然基因组大几个百分点的DNA。考虑到这一点，较小的指示基因可能是修饰噬菌体(尤其是基因组较小的噬菌体)的更合适的选择。OpLuc和
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蛋白只有约20kDa(约500-600bp编码)，而FLuc约62kDa(约1,700bp编码)。相比之下，T7的基因组约为40kbp，而T4基因组约为170kbp，克罗诺杆菌属特异性噬菌体的基因组约为157kbp。此外，报告基因不应由细菌内源性表达(即，不是细菌基因组的一部分)，应产生高的信号背景比，并应易于以及时的方式检测。Promega的
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是经修饰的细角刺虾(Oplophorusgracilirostris)(深海虾)萤光素酶。在一些实施方案中，与Promega的
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(咪唑并吡嗪酮底物(呋喃嗪))组合的
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可提供具有低背景的强劲信号。
在一些指示噬菌体的实施方案中，可将指示基因插入非翻译区，以避免功能基因的破坏，使野生型噬菌体基因保持完整，这可在感染非实验室细菌菌株时导致更好的适应性。另外，在所有三个阅读框架中包含终止密码子可有助于通过减少通读(也称为渗漏表达)来增加表达。这种策略也可消除低水平产生融合蛋白的可能性，所述融合蛋白表现为不能与噬菌体分离的背景信号(例如，萤光素酶)。
指示基因可表达多种生物分子。指示基因是表达可检测的产物或产生可检测的产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可使用各种类型的萤光素酶。在替代实施方案中，如本文更详细描述的，萤光素酶是刺虾萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶或工程萤光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤光素酶基因来源于刺虾。在一些实施方案中，指示基因是遗传修饰的萤光素酶基因，例如NANOLUC。
因此，在一些实施方案中，本发明包含经遗传修饰的噬菌体，所述噬菌体在晚期(III类)基因区中包含非噬菌体指示基因。在一些实施方案中，非天然指示基因处于晚期启动子的控制下。使用病毒晚期基因启动子可确保报告基因(例如，萤光素酶)不仅像病毒衣壳蛋白一样高水平表达，而且不会像内源性细菌基因或甚至早期病毒基因一样关闭。
在一些实施方案中，晚期启动子是T4启动子、T7启动子或ViI样启动子，或与在所选野生型噬菌体(即没有遗传修饰)中发现的启动子相似的另一种噬菌体启动子。晚期基因区可以是III类基因区，噬菌体可来源于T7噬菌体、T4噬菌体、T4样噬菌体、ViI噬菌体、ViI样噬菌体、克罗诺杆菌属种特异性噬菌体，或其基因组与T7噬菌体、T4噬菌体、T4样噬菌体、ViI噬菌体、ViI样噬菌体或克罗诺杆菌属特异性噬菌体具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源性的另一种野生型噬菌体。
对感染因子的遗传修饰可包括核酸小片段、基因主要部分或整个基因的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，插入或取代的核酸包含非天然序列。可将非天然指示基因插入噬菌体基因组，使其处于噬菌体启动子的控制之下。因此，在一些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。也就是说，在一些实施方案中，可以配置遗传修饰，使得指示蛋白产物不包含野生型噬菌体的多肽。在一些实施方案中，指示蛋白产物是可溶性的。在一些实施方案中，本发明包括检测目标细菌的方法，该方法包括用这种重组噬菌体孵育测试样品的步骤。
在一些实施方案中，宿主细菌感染后后代噬菌体中指示基因的表达产生游离的、可溶的蛋白质产物。在一些实施方案中，非天然指示基因不与编码结构噬菌体蛋白的基因相邻，因此不产生融合蛋白。与采用检测部分与衣壳蛋白的融合物(即融合蛋白)的系统不同，本发明的一些实施方案表达可溶性指示剂或报道分子(例如，可溶性萤光素酶)。在一些实施方案中，指示剂或报道分子理想地不含噬菌体结构。也就是说，指示剂或报告物没有附着于噬菌体结构。因此，指示基因或报告基因不与重组噬菌体基因组中的其他基因融合。这可极大地增加测定的灵敏度(低至单个细菌)，并简化测定，对于一些实施方案，允许测定在两小时或更短时间内完成，而产生可检测融合蛋白的构建体因需要额外的纯化步骤而需要几个小时。另外，融合蛋白的活性可能低于可溶性蛋白，这是由于，例如，蛋白折叠限制可能改变酶活性位点的构象或对底物的接近。例如，如果浓度为10个细菌细胞/mL样品，那么低于两个小时就足以进行测定。
此外，根据定义，融合蛋白限制了附接于噬菌体中的蛋白质亚单位的部分的数量。例如，使用被设计为用作融合蛋白的平台的商购可得的系统将产生约415个拷贝的融合部分，对应于每个T7噬菌体颗粒中约415个拷贝的基因10B衣壳蛋白。如果没有这种限制，可以预期被感染的细菌表达的检测部分(例如，萤光素酶)的拷贝数会比可装配在噬菌体上的多得多。另外，大的融合蛋白，诸如衣壳-萤光素酶融合蛋白，可抑制噬菌体颗粒的组装，因此产生较少的噬菌体后代。因此，可溶性非融合的指示基因产物可以是优选的。
在一些实施方案中，指示噬菌体编码报道分子，诸如可检测的酶。指示基因产物可以产生光和/或可通过颜色变化来检测。各种合适的酶是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可用作指示剂部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，
Figure BDA0002573137820000161
是指示部分。产生可检测信号的其他工程萤光素酶或其他酶也可以是合适的指示部分。
在一些实施方案中，可溶性检测部分的使用消除了从感染的样品细胞的裂解物中去除污染性亲代噬菌体的需要。对于融合蛋白系统，任何用于感染样品细胞的噬菌体都将附接有检测部分，并且将无法与也含有检测部分的子噬菌体相区别。由于样品细菌的检测依赖于新产生的(从头合成的)检测部分的检测，因此使用融合构建体需要额外的步骤来从新产生的(子噬菌体)部分中分离旧的(亲代)部分。这可通过以下过程来实现：在噬菌体生命周期完成之前多次洗涤感染的细胞，通过物理或化学手段灭活感染后的过量的亲代噬菌体，和/或用结合部分(诸如生物素)化学修饰亲代噬菌体，然后可结合所述亲代噬菌体并将其分离(诸如通过链霉抗生物素蛋白包被的琼脂糖珠粒)。然而，即使进行了所有这些去除尝试，当使用高浓度的亲代噬菌体来确保少量样品细胞的感染时，亲代噬菌体仍可保留，从而产生背景信号，所述信号可能会使来自感染的细胞后代噬菌体的信号检测变得模糊。
相比之下，对于在本发明的一些实施方案中表达的可溶性检测部分，从最终裂解物中纯化亲代噬菌体是不必要的，因为亲代噬菌体没有任何附着的检测部分。因此，感染后存在的任何检测部分必须是从头产生的，表明存在感染的细菌。为了利用这一益处，亲代噬菌体的生产和制备可包括从任何游离检测部分纯化噬菌体，所述游离检测部分是在细菌培养中于亲代噬菌体的生产过程中产生的。可将标准噬菌体纯化技术用于纯化根据本发明的噬菌体的一些实施方案，诸如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、大小排阻色谱和透析或衍生技术(诸如Amicon品牌浓缩器–Millipore,Inc.)。可将氯化铯等密度超速离心用作本发明重组噬菌体制备的一部分，以将亲代噬菌体颗粒与噬菌体在细菌宿主中繁殖时产生的污染性萤光素酶蛋白分离。这样，本发明的亲代重组噬菌体基本上不含在细菌生产过程中产生的任何萤光素酶。当将重组噬菌体与测试样品一起孵育时，去除噬菌体原液中存在的残留萤光素酶可以显著减少观察到的背景信号。
在经修饰的噬菌体的一些实施方案中，晚期启动子(III类启动子，例如，来自T7、T4、ViI或Saka的)对同一噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和力，所述RNA聚合酶转录组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因。这些蛋白质是由噬菌体制造的最丰富的蛋白质，因为每个噬菌体颗粒包含数十或数百个拷贝的这些分子。使用病毒晚期启动子可以确保萤光素酶检测部分的最佳高水平表达。使用晚期病毒启动子可进一步确保检测部分的最佳表达，所述晚期病毒启动子来源于所述指示噬菌体所源自的原始野生型噬菌体、特异于所述原始野生型噬菌体或在所述原始野生型噬菌体下具有活性(例如，具有基于T4、T7、ViI或Saka的系统的T4、T7、ViI或Saka晚期启动子)。标准细菌(非病毒/非噬菌体)启动子的使用在一些情况下可能对表达有害，因为这些启动子在噬菌体感染期间通常被下调(以便噬菌体优先利用细菌资源来生产噬菌体蛋白)。因此，在一些实施方案中，优选地，使用基因组中不限制噬菌体结构组分的亚单位的数量表达的位置对噬菌体进行工程化，以编码和高水平表达可溶性(游离的)指示部分。
本发明的组合物可以包含一种或多种野生型或经遗传修饰的感染因子(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可包括不同指示噬菌体的混合物，所述指示噬菌体可编码和表达相同或不同的指示蛋白。在一些实施方案中，噬菌体混合物包含至少两种不同类型的重组噬菌体。
制备指示噬菌体的方法
制备指示噬菌体的方法的实施方案从选择用于遗传修饰的野生型噬菌体开始。一些噬菌体对目标细菌是高度特异的。这为高度特异性检测提供了机会。
因此，本发明的方法利用了与感染因子相关的结合剂(所述结合剂识别并结合特定目标微生物)的高特异性作为扩增信号，从而检测样品中存在的低水平微生物(例如，单个微生物)的手段。例如，感染因子(例如，噬菌体)特异性识别特定微生物的表面受体，从而特异性感染这些微生物。因此，这些感染因子可以是靶向目标微生物的合适的结合剂。
本发明的一些实施方案利用重组噬菌体的结合特异性和高水平遗传表达能力进行快速和灵敏的靶向，以感染和促进目标细菌的检测。在一些实施方案中，对克罗诺杆菌属特异性噬菌体进行遗传修饰以包括报告基因。在一些实施方案中，对噬菌体的晚期基因区进行遗传修饰以包括报告基因。在一些实施方案中，报告基因位于主要衣壳基因的下游。在其他实施方案中，报告基因位于主要衣壳基因的上游。在一些实施方案中，插入的遗传构建体还包含其自身的外源性专用启动子，以驱动指示基因的表达。外源启动子是噬菌体基因组中任何内源启动子的补充。由于噬菌体产生多顺反子mRNA转录本，因此转录物中第一个基因/顺反子上游只需要单个启动子。常规重组构建体仅使用内源性噬菌体启动子来驱动插入的基因。相比之下，在报告基因和核糖体结合位点上游添加额外的启动子可通过作为转录的二级起始位点来增加基因表达。复杂而紧凑的病毒基因组通常在不同的框架中，有时在两个不同的方向上具有重叠的基因。
用于制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括选择特异性感染目标致病菌(诸如克罗诺杆菌属种)的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将所述同源重组质粒/载体转化到目标致病菌中；用所选野生型噬菌体感染转化的目标致病菌，从而允许质粒/载体与噬菌体基因组之间发生同源重组；以及分离重组噬菌体的特定克隆。
设计和制备同源重组质粒的各种方法是已知的。用质粒转化细菌的各种方法是已知的，包括热休克、F菌毛介导的细菌接合、电穿孔和其他方法。同源重组后分离特定克隆的各种方法也是已知的。本文所述的一些方法实施方案利用特定的策略。
因此，制备指示噬菌体的方法的一些实施方案包括以下步骤：选择特异性感染目标致病菌的野生型噬菌体；确定所选噬菌体基因组晚期区内的天然序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计与主要衣壳蛋白基因相邻的用于同源重组的序列，其中所述序列包含密码子优化的报告基因；将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中；将所述质粒/载体转化到目标致病菌中；选择转化的细菌；用所选野生型噬菌体感染转化的细菌，从而允许质粒与噬菌体基因组之间发生同源重组；测定所得重组噬菌体裂解物的滴度；以及进行有限稀释测定以富集和分离重组噬菌体。一些实施方案根据需要还包括在第一有限稀释测定后重复有限稀释和滴度步骤，直至重组噬菌体代表混合物的可检测部分。例如，在一些实施方案中，在分离重组噬菌体的特定克隆之前，可重复有限稀释和滴定步骤，直至混合物中至少1/30的噬菌体是重组的。在一些实施方案中，1:30的重组体∶野生型的比率预期产生平均每96个噬菌斑3.2个转导单位(TU)(例如，在96孔板中)。重组噬菌体与野生型噬菌体的初始比率可通过进行基于TCID50(组织培养感染因子量50％)的有限稀释测定来确定，如美国专利申请第15/409,258号中所述。根据泊松分布，1:30的比率有96％的机会在96孔中的某个位置观察到至少一个TU。
图1描述了本发明的重组指示噬菌体的基因组结构的示意图。对于图1所示的实施方案，检测部分由插入晚期(III类)基因区110的萤光素酶基因100编码，其在病毒生命周期的晚期表达。晚期基因通常比其他噬菌体基因表达水平更高，因为它们编码结构蛋白。因此，在图1中所述的重组噬菌体的实施方案中，指示基因(即，萤光素酶)被插入到晚期基因区，正好在主要衣壳蛋白(MCP)基因120之后，并且是包含萤光素酶基因100的构建体。在一些实施方案中，图1中所述的构建体可以在所有3个阅读框中包含终止密码子，以确保萤光素酶不会通过融合蛋白的产生而掺入到MCP基因产物中。同样如图1中所述，所述构建体可以包含额外的专用晚期启动子130，以驱动萤光素酶基因的转录和表达。所述构建体还包含核糖体结合位点(RBS)140。所述构建体确保产生可溶性萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示系统中固有的衣壳蛋白的数量。
如本文中所述，在某些实施方案中，可能优选利用已从环境中分离的感染因子来生产本发明的感染因子。这样，可产生对天然来源的微生物特异的感染因子。
例如，图2显示了噬菌体SAKA2的基因组，所述噬菌体SAKA2是一种能特异性感染克罗诺杆菌属种的野生型噬菌体。如实施例中所论述的，主要衣壳蛋白和各种其他结构基因位于晚期基因区(由编码病毒体蛋白的结构基因组成)内。与PG7尾鞘蛋白基因(核苷酸74424-77221)同源的假设基因位于晚期基因区(由编码病毒体蛋白的结构基因组成)的外围。所描述的其他晚期基因是已知的头顶蛋白的同源物(核苷酸77115-77653)、ORF58.1(核苷酸77693-78610)(可能是主要衣壳蛋白)，以及已知的外头蛋白的同源物(核苷酸80248-81840)。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，因此只要使用晚期基因启动子和/或其他类似的控制元件，可预期插入该区域的任何基因都具有类似的表达水平。
有许多已知的制备质粒的方法和商业产品。例如，可将PCR、定点诱变、限制性消化、连接、克隆和其他技术结合用于制备质粒。还可商业订购(例如，GeneWiz)合成质粒。还可使用粘粒，或者可将CRISPR/CAS9系统用于选择性编辑噬菌体基因组。制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括设计能够容易地与野生型噬菌体基因组重组以产生重组基因组的质粒。在设计质粒时，一些实施方案包括添加密码子优化的报告基因，诸如萤光素酶基因。一些实施方案还包括向上游非翻译区添加元件。例如，在设计与克罗诺杆菌属特异性噬菌体基因组重组的质粒时，可在编码gp23/主要衣壳蛋白的C-末端的序列与
Figure BDA0002573137820000212
报告基因的起始密码子之间添加上游非翻译区。非翻译区可包括启动子，诸如T4启动子、T4样启动子、T7启动子、T7样启动子、克罗诺杆菌特异性噬菌体启动子、ViI启动子或ViI样启动子。非翻译区还可包括核糖体进入/结合位点(RBS)，对于细菌系统也称为“Shine-Dalgarno序列”。可将这些元件之一或两者，或其它非翻译元件，嵌入由随机序列组成的短的上游非翻译区，所述随机序列包含与噬菌体基因组其余部分大致相同的GC含量。随机区不应包括ATG序列，因为其将用作起始密码子。
本发明的组合物可以包含各种感染因子和/或指示基因。例如，图3显示了两种同源重组质粒构建体，用于使指示噬菌体对克罗诺杆菌属具有特异性。制备构建体并将其用于与克罗诺杆菌属种的噬菌体Saka2、克罗诺杆菌属种的噬菌体Saka4或克罗诺杆菌属种的噬菌体Saka10重组，以产生本发明的重组噬菌体。图3中的第一构建体显示了用于将
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萤光素酶同源重组插入克罗诺杆菌属种的噬菌体Saka2和Saka4二者中的重组质粒：同源重组质粒
Figure BDA0002573137820000221
和
Figure BDA0002573137820000222
的一般示意图，所述噬菌体各自具有对应于各自噬菌体的500bp上游和下游同源序列。
图3中的下部构建体显示了用于将
Figure BDA0002573137820000223
萤光素酶同源重组插入Saka10(一种短尾病毒)的重组质粒:同源重组质粒
Figure BDA0002573137820000224
其靶向未被Saka2或Saka4充分感染的克罗诺杆菌属菌株。
在某些实施方案中，质粒被命名为pUC57.HR.Saka2.NanoLuc。检测/指示部分由
Figure BDA0002573137820000225
报告基因300编码。由一系列矩形表示的插入物存在于pUC57 310的标准AmpR形式中。上游同源重组区由500bp的主要衣壳蛋白C末端片段320组成。T4样噬菌体晚期启动子共有序列及5’非翻译区330内的Shine-Dalgarno核糖体进入/结合位点。密码子优化的
Figure BDA0002573137820000226
报告基因300紧随其后。由下游同源重组340组成的非翻译区(UTR)和假设的蛋白质N末端片段位于同源重组区的末端。
在某些实施方案中，质粒被命名为pUC57.HR.Saka10.NanoLuc。检测/指示部分由
Figure BDA0002573137820000227
报告基因380编码。由一系列矩形表示的插入物存在于pUC57 360的标准AmpR形式中。上游同源重组区由500bp的主要衣壳蛋白C末端片段360组成。T7噬菌体晚期启动子共有序列及5’非翻译区内的Shine-Dalgarno核糖体进入/结合位点370。密码子优化的
Figure BDA0002573137820000228
报告基因350紧随其后。由下游同源重组380组成的非翻译区(UTR)和假设的蛋白质N末端片段位于同源重组区的末端。主要衣壳蛋白片段是编码病毒体蛋白的结构基因的一部分。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，因此只要使用晚期基因启动子和/或其他类似的控制元件，可预期插入该区域的任何基因都具有类似的表达水平。
在一些实施方案中，根据本发明的指示噬菌体包含经遗传工程改造以包含报告基因诸如萤光素酶基因的克罗诺杆菌属特异性噬菌体。例如，指示噬菌体可以是克罗诺杆菌属种特异性噬菌体，其中基因组包含
Figure BDA0002573137820000231
基因的序列。重组克罗诺杆菌属特异性NanoLuc噬菌体基因组还可包含T4噬菌体、T7噬菌体、克罗诺杆菌属特异性噬菌体、ViI噬菌体、Saka噬菌体的共有启动子或另一种晚期启动子。在另外的实施方案中，启动子是外源启动子。插入外源启动子来驱动指示基因的表达是有利的，因为表达不受其他噬菌体蛋白(例如，主要衣壳蛋白)表达的限制。
因此，在作为重组结果产生的重组噬菌体的实施方案中，将指示基因(即，
Figure BDA0002573137820000232
)插入到晚期基因区中，正好在编码主要衣壳蛋白的基因的下游，从而产生包含
Figure BDA0002573137820000233
基因的重组噬菌体基因组。所述构建体可另外包含T4噬菌体、T7噬菌体、克罗诺杆菌特异性噬菌体、ViI噬菌体的共有启动子，或另一种晚期启动子或另一种合适的启动子，以驱动萤光素酶基因的转录和表达。该构建体还可包含由几个非翻译区合成的复合非翻译区。所述构建体确保产生可溶性萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示系统中固有的衣壳蛋白的数量。
图4描述了从同源重组产生的野生型和重组噬菌体的混合物中分离重组噬菌体。在第一步402中，用克罗诺杆菌属种的噬菌体Saka2感染用同源重组质粒转化的克罗诺杆菌属种的细菌，产生了具有亲代和重组噬菌体混合物的后代噬菌体，其中野生型与重组噬菌体434的比率非常低。将所得重组噬菌体混合物稀释404到96孔板406中，得到平均每板5个重组转导单位(TU)(9.3PFU/孔)。测定与含有野生型噬菌体的孔440相比96孔板的萤光素酶活性，以鉴定含有重组噬菌体的孔436。添加408细菌438；例如，每个孔可以含有约50μL混浊的克罗诺杆菌属培养物。这允许噬菌体复制并产生萤光素酶442。在如410所示于37℃孵育5小时后，可以筛选孔的萤光素酶442的存在。任何阳性孔都可能已经接种了单个重组噬菌体，并且在该阶段，混合物可包含约10个野生型噬菌体:1个重组体的比率，相对于原始比率得以富集。如果需要(即，如果重组体:总体的比率低于1:30)，可将来自该富集培养物412的后代进行一个或多个额外的有限稀释测定414，以增加重组噬菌体转导单位的比率并测定其实际浓度。例如，如果比率为1:384的重组体:PFU，则可以从先前的阳性孔中分取414每96孔板416约5个重组TU连同1920个污染性总噬菌体(5 x 384＝1920)，导致第二稀释测定板420的每孔约20个大部分野生型噬菌体(1920个PFU/96孔＝20个PFU/孔)的接种。任何阳性萤光素酶孔很可能已经接种了单个重组体连同19个野生型噬菌体。可对这些孔分析萤光素酶442的存在。
在添加细菌和孵育(例如，在37℃下进行5小时)418后，可溶性萤光素酶和噬菌体以约20个总数:1个重组体420存在。该比率可通过重组体的TU50滴定、基于萤光素酶活性而非细胞杀伤的组织培养感染因子量50(TCID50)测定评分的有限稀释测定以及总PFU的噬斑测定来验证。最后，可进行噬斑测定422以筛选表达萤光素酶446的重组体。可在第三多孔板426中单独挑选少量个体(例如，n＝48)斑块，并筛选其萤光素酶活性436。在一个实施方案中，这种方法应该确保筛选足够多的噬斑，以便在基于重组体与总噬菌体的已知比率筛选的噬斑混合物中存在约3个重组体。可将一个噬斑从板中移取至96孔板424的每个孔中，并进行萤光素酶测定426以确定哪些孔包含显示萤光素酶活性的噬菌体442。证明萤光素酶活性的孔428代表纯重组噬菌体434，而无萤光素酶活性的孔430代表纯野生型噬菌体432。
然后可将单个的噬斑悬浮在缓冲液(例如，100μL TMS)或培养基中，并将等分试样(例如，约5μL)加入到含有混浊的克罗诺杆菌属培养物的孔中，并在孵育后进行测定(例如，在37℃下进行约45分钟至1小时)。阳性孔预期包含重组噬菌体的纯培养物。某些实施方案可包括额外轮次的斑块纯化。
因此，如图4所示，可从包含非常小百分比(例如，0.005％)的总噬菌体基因组的混合物中分离设计用于与野生型噬菌体基因组重组的质粒的同源重组产生的重组噬菌体。分离后，可进行大规模生产，以获得适用于克罗诺杆菌属种检测测定的高滴度重组指示噬菌体原液。此外，可将氯化铯等密度梯度离心用于将离噬菌体颗粒与污染性萤光素酶蛋白分离以减少背景。
使用感染因子检测克罗诺杆菌属种的方法。
如本文中所述，在某些实施方案中，本发明可包括使用感染性颗粒检测微生物的方法。本发明的方法可以以多种方式实施。
在一个实施方案中，本发明可包括用于检测样品中的目标细菌的方法，该方法包括以下步骤:将样品与感染目标细菌的噬菌体一起孵育，其中噬菌体包含指示基因，使得在目标细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；以及检测指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在所述目标细菌。
在某些实施方案中，可进行测定以利用可被修改以适应不同样品类型或尺寸以及测定形式的一般概念。采用本发明重组噬菌体(即，指示噬菌体)的实施方案可允许快速检测特定的细菌菌株，诸如克罗诺杆菌属种，其中总测定时间少于1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、3.5小时、4.0小时、4.5小时、5.0小时、5.5小时、6.0小时、6.5小时、7.0小时、7.5小时、8.0小时、8.5小时、9.0小时、9.5小时、10.0小时、10.5小时、11.0小时、11.5小时、12小时、12.5小时、13.0小时、13.5小时、14.0小时、14.5小时、15.0小时、15.5小时、16.0小时、16.5小时、17.0小时、17.5小时、18.0小时、18.5小时、19.0小时、19.5小时、20.0小时、21.0小时、21.5小时、22.0小时、22.5小时、23.0小时、23.5小时、24.0小时、24.5小时、25.0小时、25.5小时或26.0小时，这取决于样品类型、样品尺寸和测定形式。例如，所需的时间量可以稍短或稍长，这取决于噬菌体株和在测定中待检测的细菌菌株、待测试的样品的类型和尺寸、靶标的生存力所需的条件、物理/化学环境的复杂性以及“内源性”非目标细菌污染物的浓度。
图5显示了根据本发明的实施方案的使用产生可溶性萤光素酶的指示噬菌体的策略。在该方法中，可对噬菌体(例如，T7、T4、Saka2、Saka4、Saka9或Saka10噬菌体)进行工程化以在噬菌体复制期间表达可溶性萤光素酶。萤光素酶的表达由病毒衣壳启动子(例如，噬菌体T7或T4晚期启动子)驱动，从而产生高表达。亲代噬菌体不含萤光素酶，因此在测定中检测到的萤光素酶必须来自细菌细胞感染期间后代噬菌体的复制。因此，通常不需要从后代噬菌体中分离出亲代噬菌体。
在这些实验中，将包含待定量的细菌502的样品500的至少一部分置于旋转柱过滤器中，并离心以除去LB肉汤，然后加入适当复数的经遗传工程改造以表达可溶性萤光素酶503的噬菌体504。可将感染的细胞孵育足够长的时间以进行后代噬菌体的复制和细胞裂解(例如，在37℃下30-120分钟)。然后，可以例如通过离心收集裂解物中的亲代噬菌体504和后代噬菌体516加上游离萤光素酶503，并且使用光度计518定量滤液中的萤光素酶水平。或者，可采用高通量方法，其中将细菌样品施加到96孔过滤板上，并且在进行上述所有操作之后，可在原始96孔过滤板中直接测定萤光素酶，而无需最后的离心步骤。
图6描述了根据本发明的一个实施方案，使用经修饰的噬菌体检测目标细菌的过滤板分析。简言之，可将包含目标细菌618的样品616添加到多孔过滤板604的孔602中，并且旋转606以通过从样品中去除液体来浓缩样品。将经遗传修饰的噬菌体620添加到孔中，并与添加的额外培养基一起孵育足够长的时间以进行吸附608，随后感染目标细菌并推进噬菌体生命周期610(例如，约45分钟)。最后，加入萤光素酶底物，其与存在的任何萤光素酶624反应。在检测萤光素酶活性626的光度计614中测量产生的发射。
在某些实施方案中，可以在不将细菌浓缩在捕获表面上或附近的情况下进行测定。图7显示了根据本发明的一个实施方案，使用经修饰的噬菌体检测目标细菌的“无浓缩测定”。将指示噬菌体714的等分试样分配到多孔板704的各个孔702中，然后加入含有细菌712的测试样品等分试样，并孵育706(例如，在37℃下45分钟)一段时间，该时间足以使噬菌体复制并产生可溶性指示物716(例如，萤光素酶)。然后可测定710含有可溶性指示剂和噬菌体的平板孔708，以测量平板718上的指示剂活性(例如，萤光素酶分析)。在该实施方案中，不将测试样品浓缩(例如，通过离心)，而是简单地将其直接与指示噬菌体一起孵育一段时间，随后测定萤光素酶活性。
在一些实施例中，可以在测试之前通过在促进生长的条件下孵育来富集样品。在此类实施方案中，富集期可以是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时或16小时或更长，这取决于样品类型和尺寸。
在一些实施方案中，指示噬菌体包含可检测的指示部分，并且单个病原细胞(例如细菌)的感染可通过经由指示部分产生的扩增信号来检测。因此，所述方法可包括检测在噬菌体复制过程中产生的指示部分，其中指示剂的检测表明样品中存在目标细菌。
在一个实施方案中，本发明可包括用于检测样品中的目标细菌的方法，该方法包括以下步骤:将样品与感染目标细菌的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包含插入噬菌体晚期基因区的指示基因，使得在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；以及检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在目标细菌。在一些实施方案中，检测到的指示部分的量对应于样品中存在的目标细菌的量。
如本文更详细描述的，本发明的方法和系统可以利用一系列浓度的亲本指示噬菌体来感染样品中存在的细菌。在一些实施方案中，将指示噬菌体以足以快速发现、结合和感染样品中以极少量存在的目标细菌(诸如单个细胞)的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，噬菌体浓度可以在少于一小时内发现、结合和感染目标细菌。在其他实施方案中，在向样品中加入指示噬菌体后，这些事件可以在短于两小时或短于三小时内发生。例如，在某些实施方案中，用于孵育步骤的噬菌体浓度大于1 x 105PFU/mL，大于1 x 106PFU/mL或大于1x 107PFU/mL。
在某些实施方案中，可纯化重组感染因子，以便不含任何残留的在感染因子原液生产时可能产生的指示蛋白。因此，在某些实施方案中，可在与样品一起孵育之前使用氯化铯等密度梯度离心来纯化重组噬菌体。当感染因子是噬菌体时，这种纯化可具有除去没有DNA的噬菌体(即，空的噬菌体或“空壳(ghost)”)的额外益处。
在本发明方法的一些实施方案中，可在不从样品中分离或纯化微生物的情况下检测微生物。例如，在某些实施方案中，可将包含一种或几种目标微生物的样品直接应用于测定容器，诸如旋转柱、微量滴定孔或过滤器，并且在测定容器中进行所述测定。本文公开了此类测定的各种实施方案。
可将测试样品的等分试样直接分配到多孔板的孔中，可添加指示噬菌体，并且在足以感染的一段时间后，可添加裂解缓冲液以及指示部分的底物(例如，萤光素酶指示剂的萤光素酶底物)，并且进行测定以检测指示信号。可在滤板上进行该方法的一些实施方案。可在用指示噬菌体感染之前在样品浓缩或不浓缩的情况下进行所述方法的一些实施方案。
例如，在许多实施方案中，将多孔板用于进行测定。平板(或任何其他可在其中进行检测的容器)的选择会影响检测步骤。例如，一些平板可包括彩色或白色背景，这可影响光发射的检测。一般而言，白色平板具有较高的灵敏度，但也产生较高的背景信号。其他颜色的平板可产生较低的背景信号，但灵敏度也稍低。另外，背景信号的一个原因是光从一个孔泄漏到另一个相邻的孔。有些平板有白色的孔，但是平板的其余部分是黑色的。这允许孔内有高信号，但防止孔之间的光泄漏，因此可降低背景。因此，平板或其他检测容器的选择可能会影响检测的灵敏度和背景信号。
本发明的方法可包括增加灵敏度的各种其他步骤。例如，如本文更详细讨论的，该方法可包括在加入噬菌体之后但在孵育之前洗涤捕获和感染的细菌的步骤，以去除污染噬菌体制剂的过量亲代噬菌体和/或萤光素酶或其他报道蛋白。
在一些实施方案中，目标微生物的检测可以在不需要培养样品(作为增加微生物群体的一种方式)的情况下完成。例如，在某些实施方案中，检测所需的总时间少于26.0小时、25.0小时、24.0小时、23.0小时、22.0小时、21.0小时、20.0小时、19.0小时、18.0小时、17.0小时、16.0小时、15.0小时、14.0小时、13.0小时、12.0小时、11.0小时、10.0小时、9.0小时、8.0小时、7.0小时、6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或少于30分钟。在食品和环境病原体检测中，最大限度地缩短至结果的时间至关重要。
与本领域已知的测定法相比，本发明的方法可以检测单个微生物。因此，在某些实施方案中，该方法可检测样品中存在的≤10个微生物细胞(即，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个微生物)。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对克罗诺杆菌属种具有高度特异性。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在其它类型的细菌存在的情况下区分克罗诺杆菌属种。在某些实施方案中，重组噬菌体可用于检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体可以检测样品中少至2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个特定细菌。
因此，本发明的方面提供了通过指示部分检测测试样品中的微生物的方法。在一些实施方案中，当目标微生物是细菌时，指示部分可以与感染因子诸如指示噬菌体相关联。指示部分可以与底物反应以发射可检测的信号，或者可发射内在信号(例如，荧光蛋白)。在一些实施方案中，检测灵敏度可以揭示在测试样品中存在少至50个、20个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个目标微生物细胞。在一些实施方案中，甚至单个目标微生物细胞也可产生可检测的信号。在一些实施方案中，噬菌体是T4样或ViI样噬菌体。在一些实施方案中，重组噬菌体来源于克罗诺杆菌属特异性噬菌体。在某些实施方案中，重组克罗诺杆菌属特异性噬菌体对克罗诺杆菌属种具有高度特异性。
在一些实施方案中，由感染因子编码的指示部分可在感染因子复制期间或之后被检测到。适合用作指示部分的许多不同类型的可检测生物分子在本领域中是已知的，并且许多是商购可得的。在一些实施方案中，指示噬菌体包含酶，其用作指示部分。在一些实施方案中，修饰指示噬菌体的基因组以编码可溶性蛋白。在一些实施方案中，指示噬菌体编码可检测的酶。指示剂可以发光和/或可通过添加的底物的颜色变化来检测。各种合适的酶是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可用作指示部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是所述指示部分。在一些实施方案中，刺虾萤光素酶是所述指示部分。在一些实施方案中，
Figure BDA0002573137820000301
是所述指示部分。其他工程化萤光素酶或产生可检测信号的其他酶也可以是合适的指示部分。
因此，在一些实施方案中，方法、系统或试剂盒的重组噬菌体由野生型克罗诺杆菌属特异性噬菌体制备。在一些实施方案中，指示基因编码发射内在信号的蛋白质，诸如荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质等)。指示剂可以发光和/或可通过颜色变化来检测。在一些实施方案中，指示基因编码与底物相互作用以产生信号的酶(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。在一些实施方案中，萤光素酶基因是刺虾萤光素酶、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、外Gaussia萤光素酶、Lucia萤光素酶或工程化萤光素酶诸如
Figure BDA0002573137820000302
Rluc8.6-535或橙色纳米灯笼(Orange Nano-lantern)中的一种。
检测指示剂可包括检测光的发射。在一些实施方案中，光度计可用于检测指示剂(例如，萤光素酶)与底物的反应。RLU的检测可用光度计来实现，或者也可使用其他机器或设备。例如，分光光度计、CCD照相机或CMOS照相机可检测颜色变化和其他光发射。绝对RLU对于检测是重要的，但为了可靠地检测单个细胞或少量细胞，信号与背景的比率也需要高(例如，>2.0、>2.5或>3.0)。
在一些实施方案中，对指示噬菌体进行遗传工程化以包含酶(诸如萤光素酶)的基因，所述酶仅在噬菌体特异性识别和感染的细菌被感染时产生。在一些实施方案中，指示部分在病毒生命周期的晚期表达。在一些实施方案中，如本文中所述，指示剂是可溶性蛋白(例如，可溶性萤光素酶)，并且不与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。
因此，在利用指示噬菌体的一些实施方案中，本发明包括检测目标微生物的方法，该方法包括以下步骤：捕获至少一种样品细菌；将所述至少一种细菌与多个指示噬菌体一起孵育；让感染和复制有时间产生后代噬菌体并表达可溶性指示部分；以及检测后代噬菌体，或优选检测指示剂，其中指示剂的检测表明样品中存在所述细菌。
例如，在一些实施方案中，可通过与平板的表面结合，或者通过细菌过滤器(例如，0.45μm孔径的旋转过滤器或平板过滤器)过滤样品来捕获测试样品细菌。在一个实施方案中，将感染性试剂(例如指示噬菌体)以最小体积直接添加到过滤器上的捕获样品中。在一个实施方案中，随后将在过滤器或平板表面上捕获的微生物洗涤一次或多次，以除去过量的未结合的感染因子。在一个实施方案中，可以添加培养基(例如，Luria-Bertani肉汤，在本文中也称为LB，缓冲蛋白胨水，在本文中也称为BPW，或胰酶解大豆肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤，在本文中也称为TSB)用于进一步的孵育时间，以允许细菌细胞和噬菌体的复制和编码指示部分的基因的高水平表达。然而，测试测定的一些实施方案的令人惊讶的方面是，与指示噬菌体的孵育步骤只需要对于单个噬菌体生命周期足够长即可。以前认为使用噬菌体的扩增能力需要更多的时间，使得噬菌体可以复制几个周期。根据本发明的一些实施方案，指示噬菌体的单个复制周期足以促进灵敏和快速的检测。
在一些实施方案中，可将含有细菌的测试样品的等分试样施加到旋转柱上，并且在用重组噬菌体感染并任选地洗涤以除去任何过量的噬菌体之后，检测到的可溶性指示剂的量将与由感染的细菌产生的噬菌体的量成比例。
然后可测量和定量细菌裂解时释放到周围液体中的可溶性指示剂(例如，萤光素酶)。在一个实施方案中，将溶液旋转通过过滤器，在添加指示酶的底物(例如，萤光素酶底物)之后，将滤液收集在新的容器中(例如，在光度计中)进行测定。或者，可以直接在过滤器上测量指示信号。
在各种实施方案中，纯化的亲代指示噬菌体不包含可检测的指示剂本身，因为可在将亲代噬菌体用于与测试样品一起孵育之前纯化所述亲代噬菌体。晚期(III类)基因的表达发生在病毒生命周期的晚期。在本发明的一些实施方案中，可以纯化亲代噬菌体以排除任何现有的指示蛋白(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中，指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物。因此，在许多实施方案中，没有必要在检测步骤之前将亲代噬菌体与后代噬菌体分离。在一个实施方案中，微生物是细菌，指示噬菌体是噬菌体。在一个实施方案中，指示部分是可溶性萤光素酶，其在宿主微生物裂解时释放。
因此，在一个替代实施方案中，可将指示底物(例如，萤光素酶底物)与保留在过滤器上或结合到平板表面的样品部分一起孵育。因此，在一些实施方案中，固体支持物是96孔过滤板(或常规的96孔板)，并且可通过将平板直接放置在光度计中来检测底物反应。
例如，在一个实施方案中，本发明可以包括检测克罗诺杆菌属种的方法，所述方法包括以下步骤：用能够在感染时表达萤光素酶的多个亲代指示噬菌体感染捕获在96孔过滤板上的细胞；洗掉过量的噬菌体；加入LB肉汤，并让噬菌体有时间复制和裂解特定的克罗诺杆菌属种靶标(例如，30-120分钟)；以及通过添加萤光素酶底物并直接在96孔板中测量萤光素酶活性来检测指示萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表明所述克罗诺杆菌属种存在于样品中。
在另一个实施方案中，本发明可包括检测克罗诺杆菌属种的方法，所述方法包括以下步骤：用能够在感染时表达萤光素酶的多个亲代指示噬菌体感染96孔板中的液体溶液或悬浮液中的细胞；让噬菌体有时间复制和裂解特定的克罗诺杆菌属种靶标(例如，30-120分钟)；以及通过添加萤光素酶底物并直接在96孔板中测量萤光素酶活性来检测指示萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表明所述克罗诺杆菌属种存在于样品中。在这样的实施方案中，不需要捕获步骤。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是可消费的测试样品，诸如蔬菜清洗液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩的LB肉汤、胰酶解/胰蛋白胨大豆肉汤、蛋白胨水或营养肉汤强化的蔬菜洗液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是稀释在LB肉汤中的细菌。
在一些实施方案中，细菌的裂解可以在检测步骤之前、期间或之后发生。实验表明，在一些实施方案中，加入萤光素酶底物后，可检测到感染的未裂解的细胞。据推测，萤光素酶可以离开细胞和/或萤光素酶底物可以进入细胞而不完全裂解细胞。因此，对于利用旋转过滤系统的实施方案(其中在光度计中仅分析释放到裂解物中的萤光素酶(而不分析仍在完整细菌中的萤光素酶))，需要裂解以进行检测。然而，对于利用其中样品存在于溶液或悬浮液中的滤板或96孔板的实施方案(其中直接在光度计中测定充满完整和裂解细胞的原始平板)，裂解对于检测不是必需的。
在一些实施方案中，指示部分(例如，萤光素酶)与底物的反应可以持续30分钟或更长时间，并且在不同时间点的检测对于优化灵敏度可能是理想的。例如，在使用96孔滤板作为固体支持物以及萤光素酶作为指示剂的实施方案中，可在开始时并且以10分钟或15分钟的间隔获取光度计读数，直至反应完成。
令人惊讶的是，用于感染测试样品的高浓度噬菌体已经成功地在非常短的时间内检测到极低数量的目标微生物。在一些实施方案中，噬菌体与测试样品的孵育只需要对于单个噬菌体的生命周期足够长即可。在一些实施方案中，用于孵育步骤的噬菌体浓度大于7x 106PFU/mL、8 x 106PFU/mL、9 x 106PFU/mL、1.0 x 107PFU/mL、1.1 x 107PFU/mL、1.2 x107PFU/mL、1.3 x 107PFU/mL、1.4 x 107PFU/mL、1.5 x 107PFU/mL、1.6 x 107PFU/mL、1.7 x107PFU/mL、1.8 x 107PFU/mL、1.9 x 107PFU/mL、2.0 x 107PFU/mL、3.0 x 107PFU/mL、4.0 x107PFU/mL、5.0 x 107PFU/mL、6.0 x 107PFU/mL、7.0 x 107PFU/mL、8.0 x 107PFU/mL、9.0 x107PFU/mL或1.0 x 108PFU/mL。
如此高浓度的噬菌体的成功令人惊讶，因为大量的噬菌体先前与“自外裂解”相关，其会杀死靶细胞，从而阻止了从早期噬菌体测定产生有用的信号。本文所述的对制备的噬菌体原液的清除可能有助于缓解该问题(例如，通过氯化铯等密度梯度超速离心进行清除)，因为除了去除任何与噬菌体相关联的污染性萤光素酶以外，这种清除还可以去除空壳颗粒(丢失了DNA的颗粒)。空壳颗粒可通过“自外裂解”来裂解细菌细胞，过早地杀死细胞，从而阻止指示信号的产生。电子显微镜显示，粗噬菌体裂解物(即，氯化铯清除前)可能具有超过50％的空壳。通过许多噬菌体颗粒刺穿细胞膜的作用，这些空壳颗粒可导致微生物的过早死亡。因此，空壳颗粒可能导致了报道高PFU浓度是有害的的先前问题。此外，非常干净的噬菌体制备允许在没有洗涤步骤的情况下进行测定，这使得在没有初始浓缩步骤的情况下进行测定成为可能。一些实施方案确实包括初始浓缩步骤，并且在一些实施方案中，该浓缩步骤允许较短的富集孵育时间。
测试方法的一些实施方案还可包括确认性测定。本领域中已知多种测定用于通常在稍后的时间点确认初始结果。例如，可以培养样品(例如，如实施例中所述的
Figure BDA0002573137820000341
测定)，可利用PCR来确认微生物DNA的存在，或者可使用其他确认性测定来确认初始结果。
在某些实施方案中，除了利用感染因子进行检测以外，本发明的方法还结合使用结合剂(例如，抗体)来从样品中纯化和/或浓缩目标微生物，诸如克罗诺杆菌属种。例如，在某些实施方案中，本发明包括检测样品中目标微生物的方法，该方法包括以下步骤：使用对目标微生物(诸如克罗诺杆菌属种)特异的捕获抗体从先前支持物上的样品中捕获微生物；将样品与感染克罗诺杆菌属种的重组噬菌体一起孵育，其中所述重组噬菌体包含插入到所述噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中所述指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物；以及检测所述指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明克罗杆菌属种存在于样品中。
例如，图8描述了根据本发明的一个实施方案，使用经修饰的噬菌体检测目标细菌的混合免疫噬菌体(HIP)测定法。首先将样品施加到包被有细菌特异性抗体802的微量滴定板的孔上。然后将平板离心以促进细菌与捕获抗体804的结合。在进行允许完全捕获细菌的足够长时间后，将含有细菌特异性
Figure BDA0002573137820000342
-噬菌体的溶液添加到每个样品806中。与噬菌体一起孵育导致单个或多个噬菌体与捕获的细菌808结合和附着至所述细菌。最后，孵育样品以促进噬菌体复制和萤光素酶表达，这导致细胞裂解和可溶性萤光素酶810释放。
在一些实施方案中，合成噬菌体被设计成优化用于病原体检测测定的所需性状。在一些实施方案中，将生物信息学和先前的遗传修饰分析用于优化期望的性状。例如，在一些实施方案中，可优化编码噬菌体尾部蛋白的基因以识别特定种类的细菌并与其结合。在其他实施方案中，可优化编码噬菌体尾部蛋白的基因以识别整个属的细菌或属内特定组的种并与其结合。这样，可优化噬菌体以检测更宽或更窄的病原体组。在一些实施方案中，合成噬菌体可被设计成提高报告基因的表达。另外地和/或可选地，在一些情况下，合成噬菌体可被设计成增加噬菌体的突发大小以改善检测。
在一些实施方案中，可优化噬菌体的稳定性以提高保存期。例如，可增加酶的溶解度以便增加随后的噬菌体稳定性。另外和/或可选地，可优化噬菌体的热稳定性。耐热噬菌体在储存过程中更好地保持功能活性，从而延长保存期。因此，在一些实施方案中，可优化热稳定性和/或pH耐受性。
在一些实施方案中，经遗传修饰的噬菌体或合成衍生的噬菌体包含可检测的指示剂。在一些实施例中，指示剂是萤光素酶。在一些实施方案中，噬菌体基因组包含指示基因(例如，萤光素酶基因或编码可检测的指示剂的另一种基因)。
本发明的系统和试剂盒
在一些实施方案中，本发明包括系统(例如，自动化系统或试剂盒)，所述系统包含用于进行本文公开的方法的组件。在一些实施方案中，根据本发明的系统或试剂盒中包含指示噬菌体。本文所述的方法也可利用这种指示噬菌体系统或试剂盒。鉴于进行所述方法所需的试剂和材料量极少，本文所述的一些实施方案特别适用于自动化和/或试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒中的每个组件可以包括自含式单元，所述单元可以从第一位置递送到第二位置。
在一些实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中目标微生物的系统或试剂盒。在某些实施方案中，所述系统或试剂盒可包含用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组件，其中所述感染因子包含指示部分和用于检测指示部分的组件。在本发明的系统和试剂盒的一些实施方案中，感染因子是感染目标细菌的重组噬菌体，并且所述重组噬菌体包含插入到噬菌体的晚期基因区中作为指示部分的指示基因，使得在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。一些系统还包括用于在固体支持物上捕获目标微生物的组件。
在其他实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中目标微生物的方法、系统或试剂盒，其包含对目标微生物特异的感染因子组分，其中所述感染因子包含指示部分和用于检测指示部分的组分。在一些实施方案中，噬菌体是T4样噬菌体、ViI噬菌体、ViI样噬菌体或克罗诺杆菌属种特异性噬菌体。在一个实施方案中，重组噬菌体来源于克罗诺杆菌属种特异性噬菌体。在某些实施方案中，重组噬菌体对特定细菌具有高度特异性。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对克罗诺杆菌属种具有高度特异性。在一个实施方案中，重组噬菌体可在其它类型的细菌存在的情况下区分克罗诺杆菌属种。在某些实施方案中，系统或试剂盒检测样品中少至2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个特定细菌。
在某些实施方案中，系统和/或试剂盒还可包含用于洗涤捕获的微生物样品的组件。另外地或可选地，所述系统和/或试剂盒还可包含用于测定指示部分的量的组件，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。例如，在某些实施方案中，系统或试剂盒可包括光度计或用于测量萤光素酶活性的其他装置。
在一些系统和/或试剂盒中，相同的组件可用于多个步骤。在一些系统和/或试剂盒中，步骤是自动化的，或由用户通过计算机输入和/或其中液体处理机器人执行至少一个步骤来控制。
因此，在某些实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中目标微生物的系统或试剂盒，其包含：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组件，其中该感染因子包含指示部分；用于从固体支持物上的样品中捕获微生物的组件；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染因子的组件；和用于检测指示部分的组件。在一些实施方案中，相同的组件可用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤(例如，过滤器组件)。一些实施方案另外包括用于测定样品中目标微生物的量的组件，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。此类系统可包括各种实施方案和类似于上文针对微生物快速检测方法所述的那些实施方案的子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌，感染因子是噬菌体。在计算机化系统中，该系统可以是全自动的、半自动的，或者由用户通过计算机(或其某种组合)来指导。
在一些实施方案中，该系统可包括用于将目标微生物与样品中的其他组分分离的组件。
在一个实施方案中，本发明包括包含用于检测目标微生物的组件的系统或试剂盒，其包含：用于将至少一种微生物与样品中的其它组分分离的组件；用于用多个亲代感染因子感染至少一个微生物的组件；用于裂解所述至少一个感染的微生物以释放微生物中存在的后代感染因子的组件；和用于检测后代感染因子或以更高的灵敏度检测由感染因子编码和表达的可溶性蛋白的组件，其中感染因子或感染因子的可溶性蛋白产物的检测表明样品中存在所述微生物。该感染因子可包括携带有该
Figure BDA0002573137820000371
指示基因的克罗诺杆菌属特异性
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噬菌体。
该系统或试剂盒可包含用于检测后代感染因子的多种组件。例如，在一个实施方案中，后代感染因子(例如，噬菌体)可包含指示部分。在一个实施方案中，后代感染因子(例如，噬菌体)中的指示部分可以是在复制过程中表达的可检测部分，诸如可溶性荧光素酶蛋白。
在其他实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中目标微生物的试剂盒，其包括：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组件，其中所述感染因子包括指示部分；用于从固体支持物上的样品中捕获微生物的组件；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染因子的组件；和用于检测指示部分的组件。在一些实施方案中，相同的组件可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤。一些实施方案另外包括用于测定样品中目标微生物的量的组件，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。此类试剂盒可包括类似于上述用于微生物快速检测的方法的那些实施方案的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，所述微生物是细菌，并且所述感染因子是噬菌体。
在一些实施方案中，试剂盒可包含用于将目标微生物与样品中的其他组分分离的组件。
本发明的这些系统和试剂盒包括各种组件。如本文中所用，术语“组件”被宽泛地定义，包括适合于进行所述方法的任何合适的装置或装置的集合。这些组件不需要以任何特定的方式相对于彼此整体连接或定位。本发明包括组件相对于彼此的任何合适的布置。例如，组件不需要在同一个房间里。但是在一些实施方案中，组件在一个整体单元中彼此连接。在一些实施方案中，相同的组件可以进行多种功能。
计算机系统和计算机可读介质
如本技术或其任何组件中所描述的系统，可以以计算机系统的形式来体现。计算机系统的典型实例包括通用计算机、编程微处理器、微控制器、外围集成电路元件以及能够实现构成本技术方法的步骤的其他设备或设备布置。
计算机系统可包括计算机、输入设备、显示单元和/或互联网。计算机还可包括微处理器。微处理器可以连接到通信总线。计算机还可以包括存储器。存储器可以包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机系统还可包括存储设备。存储设备可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器，诸如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备还可以是用于将计算机程序或其他指令加载到计算机系统中的其他类似装置。计算机系统还可包括通信单元。通信单元允许计算机通过I/O接口连接到其他数据库和互联网。通信单元允许向其他数据库传输数据以及从其他数据库接收数据。通信单元可包括调制解调器、以太网卡或使计算机系统能够连接到数据库和网络(诸如LAN、MAN、WAN和互联网)的任何类似设备。因此，计算机系统可以方便用户通过输入设备进行输入，该输入设备可以通过I/O接口接入系统。
计算设备通常将包括为该计算设备的一般管理和操作提供可执行程序指令的操作系统，并且通常将包括计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)存储指令，当由服务器的处理器执行时，所述指令允许计算设备执行其预期功能。操作系统和计算设备的一般功能的合适实现是已知的或是商购可得的，并且可由本领域普通技术人员(特别是根据本文的公开内容)容易地实现。
计算机系统执行存储在一个或多个存储元件中的一组指令，以便处理输入数据。存储元件也可根据需要保存数据或其他信息。存储元件可呈信息源的形式或存在于处理机中的物理存储元件的形式。
该环境可包括如上所述的各种数据存储和其他存储器和存储介质。这些可驻留在各种位置，诸如在一个或多个计算机本地的存储介质上(和/或驻留在所述计算机中)，或者在网络上远离任何或所有计算机。在一组特定的实施方案中，信息可以驻留在本领域技术人员熟悉的存储区域网络(“SAN”)中。类似地，可以适当地将用于执行归属于计算机、服务器或其他网络设备的功能的任何必需文件本地和/或远程存储。在系统包括计算设备的情况下，每个这样的设备可包括可以经由总线电耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入设备(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)和至少一个输出设备(例如，显示设备、打印机或扬声器)。这种系统还可包括一个或多个存储设备，诸如磁盘驱动器、光学存储设备和固态存储设备，诸如随机存取存储器(("RAM"))或只读存储器("ROM”)，以及可移动媒介设备、存储卡、闪存卡等。
此类设备还可包括计算机可读存储介质读取器、通信设备(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通信设备等)，以及如上所述的工作存储器。计算机可读存储介质读取器可与计算机可读存储介质连接，或者被配置为接收计算机可读存储介质，表示远程、本地、固定和/或可移动存储设备以及用于临时和/或更永久地包含、存储、传输和检索计算机可读信息的存储介质。系统和各种设备通常还将包括位于至少一个工作存储器设备内的多个软件应用、模块、服务或其他元件，包括操作系统和应用程序，诸如客户端应用或网络浏览器。应当理解，替代实施方案可具有与上述不同的许多变化。例如，还可使用定制的硬件和/或可在硬件、软件(包括便携式软件，诸如小程序)或两者中实现特定的元件。另外，可使用与诸如网络输入/输出设备等的其他计算设备的连接。
用于包含代码或代码的部分的非瞬态存储介质和计算机可读介质可包括本领域已知或使用的任何合适的介质，包括存储介质和通信介质，诸如但不限于以任何方法或技术实现的易失性和非易失性、可移动和不可移动介质，用于存储和/或传输信息，诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储技术、CD-ROM、数字通用盘(DVD)或其他光学存储设备、盒式磁带、磁带、磁盘存储设备或其他磁存储设备或任何其他可用于存储所需信息并可由系统设备访问的介质。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将理解执行各种实施方案的其他方式和/或方法。
计算机可读介质可包括但不限于能够向处理器提供计算机可读指令的电子、光学、磁性或其他存储设备。其他实例包括但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(“CAM”)、DDR、闪速存储器(诸如NAND或NOR闪速存储器)、ASIC、配置的处理器、光学存储器、磁带或其他磁存储器、或计算机处理器可从中读取指令的任何其他介质。在一个实施方案中，计算设备可包括单一类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)。在其他实施方案中，计算设备可包括两种或更多种类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和高速缓存。计算设备可以与一个或多个外部计算机可读介质(诸如外部硬盘驱动器或外部DVD或蓝光驱动器)通信。
如上所述，所述实施方案包括处理器，所述处理器被配置为执行计算机可执行程序指令和/或访问存储在存储器中的信息。指令可包括由编译器和/或解释器从以任何合适的计算机编程语言编写的代码中生成的处理器专用指令，所述计算机编程语言包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(Adobe Systems,Mountain View,Calif.)。在一个实施方案中，计算设备包括单个处理器。在其他实施方案中，所述设备包括两个或更多个处理器。此类处理器可包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。此类处理器还可包括可编程电子设备，诸如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑设备(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、可电子编程只读存储器(EPROM或EEPROM)或其他类似设备。
计算设备包括网络接口。在一些实施方案中，网络接口被配置为经由有线或无线通信链路进行通信。例如，网络接口可以允许通过以太网、EEE 802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外线等进行网络通信。作为另一个实例，网络接口可以允许在诸如CDMA、GSM、UMTS或其他蜂窝通信网络等的网络上的通信。在一些实施方案中，网络接口可以允许与另一设备的点对点连接，诸如通过通用串行总线(USB)、1394火线、串行或并行连接或类似接口。合适的计算设备的一些实施方案可包括用于在一个或多个网络上通信的两个或更多个网络接口。在一些实施方案中，除了网络接口之外或代替网络接口，计算设备可包括数据存储。
合适的计算设备的一些实施方案可包括多个外部或内部设备或者与多个外部或内部设备通信，所述外部或内部设备为诸如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、音频扬声器、一个或多个麦克风或者任何其他输入或输出设备。例如，计算设备可与各种用户界面设备和显示器通信。显示器可使用任何合适的技术，包括但不限于LCD、LED、CRT等。
由计算机系统执行的指令集可包括指示处理机执行特定任务(诸如构成本技术的方法的步骤)的各种命令。指令集可呈软件程序的形式。另外，软件可呈独立程序的集合、具有较大程序的程序模块或程序模块的一部分的形式，如在本技术中。所述软件还可包括呈面向对象编程的形式的模块化编程。处理机对输入数据的处理可响应于用户命令、先前处理的结果或另一处理机的请求。
虽然已经参考某些实施方案公开了本发明，但有可能在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围和精神的情况下对所描述的实施方案进行许多修改、变更和改变。因此，本发明意欲不限于所描述的实施方案，而是具有由以下权利要求的语言及其等同物所限定的全部范围。
实施例
在以下实施例中描述的结果证明了在缩短的至结果的时间内检测到少量细胞，甚至单个细菌。
实施例1.来自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的指示噬菌体的产生和分离
使用前面描述的程序，通过同源重组产生了指示噬菌体克罗诺杆菌属特异性Saka2.NANOLUC、Saka4.NANOLUC和Saka10.NANOLUC噬菌体。从污水样品中分离出克罗诺杆菌属的噬菌体Saka2、Saka4和Saka10。
这些噬菌体的基因组序列是通过使用Illumina MiSeq系统的全基因组测序和从头序列组装获得的。基于先前已知和注释的相关噬菌体的基因组，晚期基因区和主要衣壳蛋白基因位于新的噬菌体基因组上。设计并合成质粒以插入NANOLUC以及合适的晚期基因启动子和核糖体结合位点，所述插入物两侧是约500bp的匹配噬菌体序列以促进同源重组。
在适当的抗生素选择下用同源重组质粒转化靶细菌，并用其各自的野生型噬菌体感染，以允许与质粒同源重组。在同源重组以产生重组噬菌体基因组之后，使用一系列滴定和富集步骤来分离如前所述表达
Figure BDA0002573137820000421
的特定重组噬菌体。
最后，进行大规模生产以获得适用于克罗诺杆菌属种的检测测定的高滴度原液。将氯化铯等密度梯度离心用于从污染性荧光素酶蛋白中分离噬菌体颗粒以减少背景。
实施例2.婴儿配方粉方案——克罗诺杆菌属
将克罗诺杆菌属细菌悬物在培养基中培养过夜。过夜培养后，将培养物在无菌水中稀释至所需浓度。将稀释的细胞在非选择性平板上培养，以定量CFU。向婴儿配方粉(Powdered infant formula，PIF)中掺入了克罗诺杆菌属稀释液。使用高热定形真空泵干燥接种的PIF。然后使用干燥的加标PIF样品以不同CFU水平接种10g、100g或300gPIF样品。在评估之前将接种后的PIF样品在室温下储存2-4周。
制备10g、100g和300g PIF样品。将10g PIF样品与90mL预热(37℃)的缓冲蛋白胨水(BPW)培养基混合，样品与体积比为1:9；将100g PIF与300mL预热的BPW培养基混合，样品与体积比为1:3；将300g PIF与900mL预热的BPW培养基混合，样品与体积比为以1:3。将
Figure BDA0002573137820000431
或等效装置(一种蠕动式搅拌器)用于在最高设置下均化样品120秒。在不摇动的条件下将均质化的样品在37℃下培养16-18小时。孵育后，将样品充分混合，取出1mL样品并转移至微量离心管中。将样品在BPW以1:10(100μl样品:900μl BPW)稀释。将150μl稀释样品转移到96孔板中。向每个孔中加入10μl克罗诺杆菌属特异性噬菌体溶液的噬菌体混合物，并在37℃下孵育2小时。向每个孔中加入10μl裂解缓冲液，随后加入50μl制备的萤光素酶底物，并在光度计上读取。克罗诺杆菌属阳性样品的读数值为500相对光单位(RLU)或更高，阴性样品的读数小于500RLU。
克罗诺杆菌属的阳性检测得到确认。将样品在37℃下富集24小时。将50μl每份富集的样品划线至Brilliance平板(OxoidTM BrillianceTM阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)琼脂，目录号OXCM0129R)上，并在37℃下孵育24小时。蓝绿色菌落生长证实了阳性检测。
表1.克罗诺杆菌属菌株的混合物(100g样品，1:3稀释，100g PIF:300mL BPW)
Figure BDA0002573137820000432
Figure BDA0002573137820000441
使用克罗诺杆菌的婴儿配方粉测定测试以不同水平和用不同克罗诺杆菌属菌株接种的100g PIF样品(表1)。对于100g样品，使用PIF至BPW(缓冲蛋白胨水)中的1:3稀释液。读数大于500RLU/s或5:1信号/背景的样品被视为阳性。将24小时富集的样品平铺在Brilliance板上以进行确认。
测试的基质包括：婴儿配方粉(奶基)、婴儿配方粉(大豆基)、补充有益生元和益生菌的婴儿配方粉、添加大米淀粉的婴儿配方粉或干脱脂奶粉。
实施例3包含性和排除性研究
包含性菌株(克罗诺杆菌属)获自学术、政府和商业可用资源(表2)。将每个菌株在TSB培养基中于37±1℃下培养过夜，直至稳定期。将细胞在0.1mL TSB中稀释至100CFU，并在37±1℃下与重组噬菌体混合2小时。感染后，将样品与裂解缓冲液和萤光素酶底物混合，然后在光度计中读取。RLU值大于150的样品被视为阳性。排除性菌株也可获自商业可用资源，并将其过夜生长至稳定期。除了直接测定过夜培养物之外，对排除性菌株的测定与对包含性菌株的测定一样进行(表3)。
克罗诺杆菌属测定证明了75种所测试的克罗诺杆菌属菌株的100％包含性(表2)。克罗诺杆菌测定法也证明了38/41的所测试非克罗诺杆菌菌株的排除性(表3)。通过克罗诺杆菌属测定法检测的3个非克罗诺杆菌属菌株来自密切相关的肠杆菌属。可在37±1℃下使来自噬菌体测定的任何假定阳性富集总共24±2h，然后将其划线到OXOIDTM BRILLIANCETM阪崎克罗诺杆菌琼脂上，并在37±1℃下再孵育24±2小时进行确认。生长良好(1mm-3mm)且呈蓝绿色的菌落的存在表明样品呈阳性。
表2.克罗诺杆菌属种的包容性菌株。
Figure BDA0002573137820000451
Figure BDA0002573137820000461
Figure BDA0002573137820000471
Figure BDA0002573137820000481
Figure BDA0002573137820000491
a美国典型培养物保藏中心，Manassas,VA.
b未知的：没有关于该菌株来源的信息。
c美国，食品和药物管理局，食品安全和应用营养中心，College Park,ND.
d康奈尔大学科内尔食品安全实验室,Ithaca,NY.
e疾病控制和预防中心,Atlanta,GA.
f国家典型培养物保藏中心,PortonDwn,Salisbury,UK.
表3.克罗诺杆菌属种的排除性菌株。
Figure BDA0002573137820000492
Figure BDA0002573137820000501
Figure BDA0002573137820000511
Figure BDA0002573137820000521
a美国典型培养物保藏中心，Manassas,VA.
b未知的：没有关于该菌株来源的信息。
b康奈尔大学博纳食品安全实验室,Ithaca,NY
实施例4.稳健性研究
改变3个参数以证明测定的稳健性：富集时间(14和24小时)、重组噬菌体浓度(±20％)和萤光素酶底物量(±10％)。简言之，在10g奶基婴儿配方粉样品中不掺加或掺加0.2–2CFU/10g的莫金斯克罗诺杆菌FSL-F6-031(于婴儿配方粉中干燥并于室温(20-25℃)下储存2-4周)。遵循克罗诺杆菌属测定方案，其中富集时间、重组噬菌体浓度和底物量的变化如表4所示。RLU值大于500的样品被视为阳性。通过让样品富集总共24±2小时，然后将其铺板在OXOIDTM BRILLIANCETM阪崎克罗诺杆菌琼脂上来确认样品。将平板在37±1℃下再孵育24±2小时。生长良好的蓝绿色菌落的存在表明样品呈阳性。测试概述示于表4中。
克罗诺杆菌属试验的稳健性测试表明，与标准方案相比，富集时间、重组噬菌体浓度和萤光素酶底物量的变化不会改变结果。富集时间为14和24小时，重组噬菌体体积为8和12μL，萤光素酶底物体积为45和55μL，在未接种的测试样品和低接种物测试样品中均产生与16小时富集、10μL重组噬菌体和50μL萤光素酶底物的标准方案相同的结果(表4)。这些结果表明，这些与克罗诺杆菌属测定方案的偏差并没有改变最终结果。
表4.稳健性研究:不同富集时间、噬菌体浓度、萤光素酶底物浓度对克罗诺杆菌属测定结果的影响–POD比较
Figure BDA0002573137820000531
Figure BDA0002573137820000541
a将每个测试条件与标称测试条件进行比较。注意：测试条件1-4(14小时富集)和测试条件5-8(24小时富集)与不同实验中的标称条件进行了比较。
bN＝每个条件下的测试份数。
cx＝每种情况下阳性试验部分的数量。
dPODT＝阳性结果除以每个条件的试验总数。
e标称条件＝16小时富集，10μl噬菌体，50μl荧光素酶底物。
fPODN＝阳性结果除以每个标称条件下的试验总数。
gdPODTN＝测试条件与标称条件之间的POD差异。
h95％CI＝如果dPOD的置信区间不包含零，则差异在5％水平上具有统计学意义。
实施例5.基质研究
基质研究将克罗诺杆菌属(10g测试份)与ISO 22964:2006(10g测试份)以及将克罗诺杆菌属(100g和300g测试份)与FDA BAM第29章克罗诺杆菌属:2012(100g测试份)进行了比较。使用配对研究设计，将克罗诺杆菌属10g份与ISO 22964:2006进行了比较。使用非配对研究设计将克罗诺杆菌属100g和300g份与FDA BAM第29章100g份进行了比较。对于每个基质和每个比较，研究包括五个未接种的基质的重复测试份(0CFU/测试份)，20个在低水平下产生部分阳性结果的重复测试份(0.2–2CFU/测试份)和五个在高水平下产生一致的阳性结果的重复测试份(2-10CFU/测试份)。
奶基和大豆基PIF均从当地零售店购买，并使用ISO 22964:2006法预筛分其自然污染物。为了制备接种物，将克罗诺杆菌属在胰蛋白胨大豆肉汤中于37±1℃下生长18–24h。将培养物在BPW中稀释，于PIF中复溶，并置于高速真空中4–8h，直至样品完全干燥。干燥后，将干燥的接种物稀释到每个研究中使用的PIF基质中，以获得预期会产生部分阳性结果的低水平，和预期会产生所有阳性结果的高水平，并在室温(20-25℃)下放置2-4周以在基质中平衡。在测试之前，用稀释的接种物接种大量基质。
在分析当天，根据FDA BAM第3章确定了菌落总数，并通过最可能数(mostprobable number，MPN)分析确定低水平和高水平接种物中的克罗诺杆菌属水平。对于配对样品，使用ISO 22694:2006法确定MPN分析。对于低水平接种物，分析了来自基质研究的5个25g的测试份、5个4g的测试份和20个10g的测试份。对于高水平接种物，分析了来自基质研究的5个10g的测试份、5个4g的测试份和5个1.5g的测试份。
对于未配对的样品，使用FDA BAM第29章法进行MPN分析。对于低水平接种物，分析了来自基质研究的5个200g测试份、5个50g测试份和20个100g测试份。对于高水平接种物，分析了来自基质研究的5个100g测试份、5个50g测试份和5个25g测试份。使用AOAC RI提供的LCF MPN计算器，将阳性数目用来计算MPN。
根据使用说明处理克罗诺杆菌属测试份。简言之，将90mL(10g测试份)、300mL(100g测试份)或900mL(300g测试份)的预温热的BPW(37±1℃)添加到PIF测试份中。将样品匀浆并在37±1℃下富集16–18h。将富集的样品充分混合，然后取等分试样进行分析。将样品在预温热的BPW(37±1℃)中按1:10稀释(100μl样品:900μl BPW)稀释，并将150μl的稀释样品转移到96孔板中。然后在37±1℃下用重组噬菌体感染样品。将裂解缓冲液和萤光素酶底物添加到样品中。然后在光度计上读取样品。≥500RLU的读数被认为是阳性。为了按照克罗诺杆菌属测定进行确认，使样品在37±1℃下富集总共24±2h。将富集的样品充分混合，然后取等分试样进行分析。将五十(50)μL敲打到OXOIDTM BRILLIANCETM阪崎克罗诺杆菌琼脂上，并在37±1℃下孵育24±2h。生长良好(1mm-3mm)并呈蓝绿色的菌落的存在表示阳性样品。
对于按照FDA BAM第29章的确认，进行第E和F节。简言之，从24小时富集中取2 X40mL等分试样以3,000x g离心10分钟。弃去上清液，将所得沉淀重悬于200μl无菌磷酸盐缓冲盐水中。将一百(100)μl重悬沉淀的等分试样铺板在两个DFI生色琼脂和两个R&FCronobacter属生色琼脂平板上。另外，将一接种环量的每种富集物敲打至两个DFI生色琼脂和两个R&F Cronobacter生色琼脂平板上。将所有平板在36±1℃下孵育18–24h。如BAM第29章的部分所述，通过PCR确认推定的阳性菌落。
ISO 22964:2006是测试时的最新版本，已在方法开发人员实验室中用于基质评估。简言之，将90mL BPW添加到10g PIF中。将样品在37±1℃下孵育18±2h。然后将0.1mL从BPW培养物中转移到10mL mLST/万古霉素培养基中，并在44±1℃下孵育24±2h。将一接种环量的mLST/万古霉素培养物敲打至阪崎肠杆菌分离琼脂上，并在44±1℃下孵育24±2h。然后将1至5个推定的阳性菌落敲打至胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板上，并在25℃下孵育48±4h。选择黄色着色的菌落用于进一步的生化确认测试。
对于FDA BAM第29章克罗诺杆菌属法，将900mL无菌BPW加入到2L无菌锥形烧瓶中的100g PIF中，并用手轻轻搅动直至PIF均匀悬浮。将测试样品在36±1℃下孵育24±2h。富集后，将样品充分混合，并将来自每个样品的4 X 40mL转移到50mL离心管中。将等分试样以3,000x g离心10分钟，弃去上清液。将所得沉淀重悬于200μl磷酸盐缓冲盐水中。如果需要的话，将两个等分试样用于PCR以确定推定的阳性，并且将两个等分试样用于培养确认。对于PCR筛分，将两个等分试样转移到1.5mL微量离心管中，并以3,000x g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于400μL
Figure BDA0002573137820000561
样品制备试剂中，并以最大速度涡旋混合直至沉淀完全重悬。将样品在干浴培养箱中于100℃下加热10分钟，然后冷却至室温。一旦样品达到室温，就将样品以15,000x g离心2分钟，然后将50μL的上清液等分试样转移到新的微量离心管中进行PCR分析。对于每个样品，在内部对照(InC)存在和不存在的情况下进行PCR分析。PCR反应成分和PCR方案遵循如FDA BAM第29章参考方法中所概述的。使用FDA BAM第29章第E和F节确认推定的阳性。简言之，将100μL重悬沉淀的等分试样铺板在两个DFI生色琼脂和两个R&F Cronobacter生色琼脂平板上。另外，将一接种环量的每种富集物划线到两个DFI生色琼脂和两个R&F Cronobacter生色琼脂平板上。将所有平板在36±1℃下孵育18–24h。如BAM第29章第F节所概述的，通过PCR确认菌落。
使用POD统计分析将所有测试结果分析至95％的置信区间(CI)。附录J中的AOACINTERNATIONAL指南中描述了POD分析。表5-8中显示了来自分析的数据。
方法开发人员的研究表明，对于所有测试的基质，所述测定与ISO 22964:2006和FDA BAM第29章克罗诺杆菌参考方法之间没有差异(表5-8)。通过克罗诺杆菌属测定法推测为阳性的所有测试部分均通过其各自的参考方法确认含有克罗诺杆菌属。没有假阴性结果。POD分析表明在配对研究中，克罗诺杆菌属测定法与ISO 22964:2006参考方法之间没有统计学意义(表5)。克罗诺杆菌属测定的推定数与BAM第29章确认结果之间没有统计学差异(表6)。克罗诺杆菌测定结果与BAM第29章确认以及推定的结果与确认结果之间的比较也无统计学意义(表6和表7)。克罗诺杆菌属测定法与FDA BAM第29章未配对研究的比较表明，两种方法的性能没有统计学差异(表8)。一个例外是100g奶基测定对比BAM第29章方法的比较(表8)。部分阳性之间的差异具有统计学意义，其中dPOD为0.35，CI为(0.04，0.58)。该研究中使用的PIF的菌落总数为0CFU/g，表明在富集过程开始时PIF没有或只有极低水平的背景菌群存在。
独立实验室评估包括针对奶基PIF的基质研究，其将克罗诺杆菌属测定与ISO22964:2017和FDA BAM第29章参考方法进行了比较。为了与ISO 22964:2017进行方法比较，评估了30对成对的10g测试份。为了与FDA BAM第29章进行方法比较，将100g和300g克罗诺杆菌属测定的测试份与100g参考方法的测试份进行比较。在每个样品组中，有5个未接种的样品(0CFU/测试份)，20个低水平接种的样品(0.2-2CFU/测试份)和5个高水平接种的样品(2-10CFU/测试份)。低接种水平被设计成产生部分阳性结果，其中候选方法或参考方法产生5–15个阳性结果(25–75％)。
PIF从当地经销商处购买，按照ISO 22964:2017预先对分析物的自然污染进行了筛选，并通过FDA BAM第3章对菌落总数进行了分析。筛选后，用克罗诺杆菌属种的菌株接种基质。为了验证，使用冻干培养物接种PIF。通过以下步骤制备冻干培养物：将来自含5％羊血的胰蛋白胨大豆琼脂中的单个阪崎克罗诺杆菌菌落转移至脑心浸液(BHI)肉汤中，并在35±2℃下培养18–24h。孵育后，将培养物在无菌冷冻保护剂中稀释，重构为脱脂奶粉(NFDM)，并置于冷冻干燥系统中48-72小时。在从冻干系统中取出培养物后，将冻干的培养物在NFDM中稀释至预期产生部分阳性结果的低水平和预期产生所有阳性结果的高水平。接种了大量基质。接种后，将基质在室温(24±2℃)下放置2周，以使基质中的生物体达到平衡。
根据FDA BAM第3章确定菌落总数。在分析当天，通过MPN测定低水平接种物和高水平接种物中的克罗诺杆菌属水平。对于配对样品分析，通过评估5 x 25g测试份，来自研究的20 x 10g测试份和5 x 4g测试份来确定低水平MPN。通过评估来自研究的5 x 10g测试份、5 x 4g测试份和5 x 1.5g测试份来确定高浓度接种物中的克罗诺杆菌属的水平。
对于未配对分析，通过评估5 x 200g测试份、来自研究的20 x 100g参考方法测试份和5 x 50g测试份来确定低水平MPN。通过评估来自研究的5 x 100g参考方法测试份、5 x50g测试份和5 x 25g测试份，确定高浓度接种物中的克罗诺杆菌水平。每个测试份都富含BPW，并通过参考方法进行分析。使用LCF MPN计算器(1.6版)，使用来自3个测试水平的阳性数来计算MPN。
对于ISO 22964:2017，使10g PIF测试份富含90mL BPW(ISO配方)并在37±1℃下孵育18±2h。孵育后，将0.1mL的初级富集液转移至10mL克罗诺杆菌选择性肉汤(CSB)中，并在41.5±1℃下孵育24±2h。孵育后，将一接种环量的CSB敲打至生色克罗诺杆菌属分离(CCI)琼脂上，并在41.5±1℃下孵育24±2h。在CCI平板孵育后，将1-5个典型的克罗诺杆菌属种的菌落(中等大小的菌落，1mm至3mm，蓝绿色到蓝色)转移到胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)中，并在35±1℃下孵育18至24h。孵育后，对典型菌落(黄色着色的，1mm至3mm)进行氧化酶测试，并遵循AOAC官方方法2011.17，使用
Figure BDA0002573137820000591
2GN生化标识卡进行最终生化确认。
对于BAM第29章，将100g PIF测试份添加到2L锥形瓶中，并加入900mL预温热的(37℃)BPW，并在37±1℃下孵育24±2h。孵育后，将4 x 40mL等分试样转移到4 x 50mL锥形瓶中。将等分试样以3,000x g离心10分钟。对于每个锥形管，吸出上清液，并使用无菌棉签去除脂质沉淀。通过加入200μL磷酸盐缓冲盐水，将剩余的沉淀重新悬浮，并以最大速度涡旋混合悬浮液20秒。对于每个样品，将两个等分试样用于克罗诺杆菌属的PCR筛分，将两个等分试样用于培养确认。
为了进行PCR筛分，将两个等分试样转移到单独的1.5mL微量离心管中，并以3,000x g离心5分钟。除去上清液和脂质层，通过加入400μL
Figure BDA0002573137820000592
样品制备试剂并以最大速度涡旋混合直至实现悬浮来重悬沉淀。将样品在干浴培养箱中于100℃下热处理10分钟，然后冷却至室温。一旦样品达到室温，就将样品以15,000x g离心2分钟，然后将50μL的上清液等分试样转移到新的微量离心管中进行PCR分析。对于每个样品，在内部对照(InC)存在和不存在的情况下进行PCR分析。PCR反应成分和PCR方案遵循如FDABAM第29章参考方法所概述的。
无论推定的PCR结果如何，都将来自每个样品的100μL悬浮细胞敲打至两个DFI生色琼脂平板和两个R&F琼脂平板上。将DFI生色琼脂平板和R&F琼脂平板在36±1℃下孵育18-24小时。孵育后，通过
Figure BDA0002573137820000602
2GN生化识别卡(AOAC官方方法2011.17)和PCR分析生化确认来自DFI生色琼脂(弱至深绿色，褐色菌落或带有白色至黄色边界的绿色居中菌落)和R&F琼脂平板(蓝色至黑色或蓝色至灰色菌落，带有红色背景)的典型克罗诺杆菌属菌落。
对于所有3个水平，克罗诺杆菌测定法与参考方法之间的POD分析表明，在5％的水平上，通过该方法获得的阳性结果数之间的差异无统计学意义(表5-8)。对于所有3个水平，克罗诺杆菌属测定的推定结果与确认结果之间进行的POD分析表明，对于所有分析的测试份，在5％的水平下均无统计学意义的差异(表5-8)。该研究中使用的PIF的菌落总数为40CFU/g，表明PIF在富集过程的开始时存在约400CFU(10g)、4,000CFU(100g)或12,000CFU(300g)的背景菌群。
表5.克罗诺杆菌属测定对比ISO 22964法的比较结果
Figure BDA0002573137820000601
Figure BDA0002573137820000611
a将基质研究配对。
bMPN＝最有可能的数字基于使用最低成本配方MPN计算器的参考方法测试份的POD，置信区间为95％。
cN＝测试份的数量。
dx＝阳性测试份的数量
ePODC＝证实为阳性的候选方法推定的阳性结果。
fPODR＝参考方法确认的阳性结果除以试验总数。
gdPODC＝候选方法与参考方法POD值之间的差异。
h95％CI＝如果dPOD的置信区间不包含零，则该差异在5％的水平上具有统计学意义。
iN/A＝不适用。
表6.克罗诺杆菌属测定推定的结果对比确认的结果(根据BAM第29章)-POD结果
Figure BDA0002573137820000612
Figure BDA0002573137820000621
aMPN＝最有可能的数字基于使用最低成本配方MPN计算器的参考方法测试份的POD，置信区间为95％。
bN＝测试份的数量。
cx＝阳性测试份的数量。
dPODCP＝候选方法推定的阳性结果除以试验总数。
ePODCC＝候选方法确认的阳性(根据BAM第29章)结果除以试验总数。
fdPODCP＝候选方法推定的结果与候选方法确认的结果POD值之间的差异。
g95％CI＝如果dPOD的置信区间不包含零，则该差异在5％的水平上具有统计学意义。
hN/A＝不适用。
i由独立实验室测试的基质。
表7.克罗诺杆菌属测定推定的结果对比确认的结果(根据确认方法)-POD结果
Figure BDA0002573137820000622
Figure BDA0002573137820000631
aMPN＝最有可能的数字基于使用最低成本配方MPN计算器的参考方法测试份的POD，置信区间为95％。
bN＝测试份的数量。
cx＝阳性测试份的数量。
dPODCP＝候选方法推定的阳性结果除以试验总数。
ePODCC＝候选方法确认的阳性(根据确认方法)结果除以试验的总数。
fdPODCP＝候选方法推定的结果与候选方法确认的结果POD值之间的差异。
g95％CI＝如果dPOD的置信区间不包含零，则该差异在5％的水平上具有统计学意义。
hN/A＝不适用。
i由独立实验室测试的基质。
表8.克罗诺杆菌属测定对比BAM第29章法的比较结果–POD结果
Figure BDA0002573137820000641
Figure BDA0002573137820000651
a列出了用于克罗诺杆菌属方法的基质测份。将所述份与BAM第29章100g测试份进行比较。
bMPN＝最有可能的数字基于使用最低成本配方MPN计算器的参考方法测试份的POD，置信区间为95％。
cN＝测试份的数量。
dx＝阳性测试份的数量
ePODC＝使用两种确认方法确认为阳性的候选方法推定的阳性结果是相同的，因此在此报告一个结果。
fPODR＝参考方法确认的阳性结果除以试验总数。
gdPODC＝候选方法与参考方法POD值之间的差异。
h95％CI＝如果dPOD的置信区间不包含零，则该差异在5％的水平上具有统计学意义。
iN/A＝不适用。
j由独立实验室测试的Matrix。

Claims (22)

1.一种重组噬菌体，其包含插入所述噬菌体基因组的晚期基因区内的指示基因，其中所述重组噬菌体特异性感染克罗诺杆菌属种(Cronobacter spp.)。
2.权利要求1的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体源自野生型Saka2、Saka4或Saka10噬菌体。
3.权利要求1的重组噬菌体，其中所述指示基因是密码子优化的，并编码产生内在信号的可溶性蛋白产物或与底物反应后产生信号的可溶性酶。
4.权利要求1的重组噬菌体，其还包括所述密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
5.一种包含至少两种不同类型的重组噬菌体的混合组合物，其中至少一种所述重组噬菌体包含根据权利要求1的指示基因。
6.一种制备重组指示噬菌体的方法，其包括:
选择特异性感染目标致病菌的野生型噬菌体；
制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；
将所述同源重组质粒/载体转化到目标致病菌中；
用所选野生型噬菌体感染所述转化的目标致病菌，从而允许所述质粒/载体与所述噬菌体基因组之间发生同源重组；以及
分离重组噬菌体的特定克隆。
7.权利要求6的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括:
确定所选噬菌体的基因组的晚期区中的天然核苷酸序列；
注释所述基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；
设计所述主要衣壳蛋白基因下游的用于同源重组的序列，其中所述序列包含密码子优化的指示基因；以及
将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中。
8.权利要求7的方法，其中设计序列还包括在密码子优化的指示基因上游插入包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点的非翻译区。
9.权利要求8的方法，其中所述同源重组质粒在所述密码子优化的指示基因的上游包含非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
10.权利要求8的方法，其中所述野生型噬菌体是克罗诺杆菌属特异性噬菌体，并且所述目标致病菌是克罗诺杆菌属种。
11.权利要求8的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括分离显示所述指示基因表达的克隆的有限稀释测定。
12.一种检测样品中克罗诺杆菌属种的方法，其包括：
将所述样品与源自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的重组噬菌体一起孵育，所述噬菌体包含插入所述噬菌体基因组的晚期基因区内的指示基因；以及
检测由所述重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测表明克罗诺杆菌属种存在于样品中。
13.权利要求12的方法，其中所述样品是食品、环境、水或商业样品。
14.权利要求12的方法，其中所述方法在食品安全行业标准尺寸的样品中检测少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个细菌。
15.权利要求14的方法，其中所述食品样品包括肉、鱼、蔬菜、鸡蛋、乳制品、干食品或婴儿配方粉。
16.权利要求12的方法，其中将所述样品与包含至少两种不同类型的重组噬菌体的混合组合物一起孵育，其中至少一种所述重组噬菌体包含根据权利要求12的指示基因。
17.权利要求16的方法，其中首先将所述样品在有利于生长的条件下孵育少于24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时的富集期。
18.权利要求16的方法，其中获得结果的总时间少于26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。
19.权利要求12的方法，其中通过检测所述指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。
20.一种检测克罗诺杆菌属种的试剂盒，其包含源自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
21.权利要求20的试剂盒，其还包含用于与指示剂反应以检测由所述重组噬菌体表达的可溶性蛋白产物的底物。
22.一种检测克罗诺杆菌属种的系统，其包含源自克罗诺杆菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
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