JP2022547218A - 指標サブユニットを発現するように組換え感染病原体を使用して微生物を迅速に検出するための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
本明細書では、試料において細菌等の微生物を迅速に検出するための方法およびシステムが開示される。指標タンパク質の1つのサブユニットをコードする指標遺伝子を含む、遺伝子改変されたバクテリオファージも開示される。バクテリオファージの特異性は、目的の特定の細菌の検出を可能にし、指標シグナルを増幅して、アッセイ感度を最適化することができる。一部の態様では、本開示は、バクテリオファージゲノムに挿入された指標遺伝子を含み、この指標遺伝子が、指標タンパク質(指標タンパク質産物)のペプチドサブユニットをコードする組換え指標バクテリオファージを含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2019年9月11に出願された米国仮特許出願第62/898,945号に基づく優先権を主張している。米国出願第13/773,339号、第14/625,481号、第15/263,619号、および第15/409,258号の開示は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年9月11に出願された米国仮特許出願第62/898,945号に基づく優先権を主張している。米国出願第13/773,339号、第14/625,481号、第15/263,619号、および第15/409,258号の開示は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本開示は、感染病原体を使用して微生物を検出するための組成物、方法、システム、およびキットに関する。
本開示は、感染病原体を使用して微生物を検出するための組成物、方法、システム、およびキットに関する。
背景
生体、食物、水および臨床試料における細菌、ウイルスおよび他の微生物の検出のスピードおよび感度の改善に強い関心が集まっている。微生物病原体は、ヒトおよび飼育動物の間の実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。また、微生物の検出は、ある特定の微生物、例えば、Escherichia coli、Cronobacter spp.、Salmonella spp.、Listeria spp.、またはStaphylococcus spp.で汚染された食物の経口摂取によって引き起こされる、命を脅かすまたは致死的な疾病の大流行を考えると、食品医薬品局(Food and Drug Administration)(FDA)および疾病管理センター(Centers for Disease Control)(CDC)ならびに米国農務省(United States Department of Agriculture)(USDA)にとっても優先度が高い。
生体、食物、水および臨床試料における細菌、ウイルスおよび他の微生物の検出のスピードおよび感度の改善に強い関心が集まっている。微生物病原体は、ヒトおよび飼育動物の間の実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。また、微生物の検出は、ある特定の微生物、例えば、Escherichia coli、Cronobacter spp.、Salmonella spp.、Listeria spp.、またはStaphylococcus spp.で汚染された食物の経口摂取によって引き起こされる、命を脅かすまたは致死的な疾病の大流行を考えると、食品医薬品局(Food and Drug Administration)(FDA)および疾病管理センター(Centers for Disease Control)(CDC)ならびに米国農務省(United States Department of Agriculture)(USDA)にとっても優先度が高い。
細菌の検出のための伝統的な微生物学的検査は、非選択的および選択的集積培養と、それに続く選択的培地での平板培養、ならびに疑われる(suspect)コロニーを確認するためのさらなる検査に頼る。斯かる手順は、数日間を要求する場合がある。種々の迅速な方法が研究され、時間要件を低下させるための実践に導入されてきた。しかし、これらの方法には弱点がある。例えば、直接的なイムノアッセイまたは遺伝子プローブが関与する技法は一般に、適当な感度を得るために一晩の富化ステップを要求する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)検査もまた、増幅ステップを含み、したがって、非常に高い感度および選択性の両方が可能である;しかし、PCR検査に経済的に供することができる試料サイズは、限定されている。希薄な細菌懸濁物では、多数の小さなサブ試料は、細胞を含まず、したがって、精製および/または長い富化ステップがやはり要求される。
伝統的な生物学的富化に要求される時間は、試料の標的細菌集団の成長速度によって、試料マトリックスの効果によって、および要求される感度によって決まる。実際に、最も高い感度の方法は、一晩インキュベーションを用い、全体で約24時間を要する。培養に要求される時間が原因で、これらの方法は、同定されるべき生物および試料の供給源に応じて、最大3日間を要する場合がある。この遅延時間は一般に不適であるが、その理由としては、汚染された食物、水または製品が、家畜またはヒトへとすでに進入していることが可能になることが挙げられる。加えて、抗生物質耐性細菌および生体防御(biodefense)の検討事項の増加により、水、食物および臨床試料における細菌病原体の迅速な同定は、世界中で、重大な意味を持つ優先事項となっている。
したがって、細菌および他の潜在的に病原性の微生物等の微生物の、より迅速、単純かつ高感度な検出および同定の必要がある。
概要
本開示の実施形態は、細菌等の微生物の検出のための組成物、方法、システムおよびキットを含む。本開示は、種々の仕方で具体化することができる。
本開示の実施形態は、細菌等の微生物の検出のための組成物、方法、システムおよびキットを含む。本開示は、種々の仕方で具体化することができる。
一部の態様では、本開示は、バクテリオファージゲノムに挿入された指標遺伝子を含み、この指標遺伝子が、指標タンパク質(指標タンパク質産物)のペプチドサブユニットをコードする組換え指標バクテリオファージを含む。ある特定の実施形態では、指標バクテリオファージは、目的の特定の細菌を特異的に認識するバクテリオファージ由来の、遺伝子改変されたバクテリオファージゲノムを含む。
組換え指標バクテリオファージの一部の実施形態では、ペプチドサブユニット(標識用サブユニット)は、分割レポーター酵素システムの一部であって、レポーター酵素(すなわち、指標タンパク質)は、ルシフェラーゼである。ルシフェラーゼは、Oplophorusルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、LuciaルシフェラーゼもしくはRenillaルシフェラーゼ等の、自然に存在するものでもよいし、またはNANOLUC(登録商標)等の遺伝子操作されたルシフェラーゼでもよい。
本明細書には、指標バクテリオファージを調製する方法も開示される。一部の実施形態は、標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択するステップと、指標遺伝子を含む相同組換えプラスミド/ベクターを調製するステップと、相同組換えプラスミド/ベクターを標的病原性細菌に形質転換するステップと、形質転換された標的病原性細菌を、選択された野生型バクテリオファージに感染させることによって、プラスミド/ベクターとバクテリオファージゲノムとの間に相同組換えを生じさせるステップと、組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離するステップとを含む。
別の態様では、本開示は、試料における目的の特定の細菌を検出する方法を含み、試料を、指標タンパク質の第1のサブユニットをコードする指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージと共にインキュベートすることによって、第1のサブユニットを発現する、所定量の子孫ファージが生成されるステップと、試料中で細菌を溶解させて前記量の子孫ファージおよび第1のサブユニットを遊離させるステップと、溶解した試料を、指標タンパク質の第2のサブユニットを含む検出試薬の存在下でインキュベートすることによって、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットが再構築されて指標タンパク質複合体を形成することを可能にするステップと、指標タンパク質複合体を検出するステップであって、指標タンパク質複合体の陽性検出によって、試料中に目的の特定の細菌が存在することが示されるステップとを含む。
細菌を検出する方法の一部の実施形態では、試料は、増殖に好適な条件下で、24時間もしくはそれ未満、23時間もしくはそれ未満、22時間もしくはそれ未満、21時間もしくはそれ未満、20時間もしくはそれ未満、19時間もしくはそれ未満、18時間もしくはそれ未満、17時間もしくはそれ未満、16時間もしくはそれ未満、15時間もしくはそれ未満、14時間もしくはそれ未満、13時間もしくはそれ未満、12時間もしくはそれ未満、11時間もしくはそれ未満、10時間もしくはそれ未満、9時間もしくはそれ未満、8時間もしくはそれ未満、7時間もしくはそれ未満、6時間もしくはそれ未満、5時間もしくはそれ未満、4時間もしくはそれ未満、3時間もしくはそれ未満または2時間もしくはそれ未満の集積期間をかけて最初にインキュベートされる。一部の実施形態では、試料は検出の前に濃縮されない。一部の実施形態では、結果までの合計時間は、26時間、25時間、24時間、23時間、22時間、21時間、20時間、19時間、18時間、17時間、16時間、15時間、14時間、13時間、12時間、11時間、10時間、9時間、8時間、7時間、6時間、5時間、4時間、3時間または2時間未満である。一部の実施形態では、指標の検出によって生成される、シグナルのバックグラウンドに対する比は、少なくとも2.0、または少なくとも2.5、または少なくとも3.0である。一部の実施形態では、方法は、食品安全業界の標準サイズの試料において、わずか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90または100個の特異的な細菌を検出する。
追加の実施形態は、目的の特定の細菌を検出するためのシステムおよびキットを含み、システムまたはキットは、目的の特定の細菌に特異的なバクテリオファージ由来の指標バクテリオファージを含む。こうしたシステムまたはキットは、本開示のバクテリオファージ、組成物、および方法について記載されている特色を含み得る。さらに他の実施形態では、本開示は、本開示に係る方法またはシステムと一緒に使用するための非一時コンピュータ可読媒体を含む。
本開示は、次の非限定的な図面を参照することにより、よりよく理解することができる。
開示の詳細な説明
本明細書では、検査試料(例えば、生体、食物、水、および環境)における、Escherichia coli、Cronobacter spp.、Salmonella spp.、Listeria spp.またはStaphylococcus spp.等の目的の微生物の検出について、驚くべき感度を示す組成物、方法、およびシステムが開示される。検出は、富化のための培養なしで行われるアッセイにおいて遺伝子改変された感染因子を使用して以前に可能と考えられていたよりも短い時間枠で、または一部の実施形態では、微生物が潜在的に増えることができる最小のインキュベーション時間で達成することができる。同様に驚くべきことに、検査試料とのインキュベーションのための、潜在的に高い感染多重度(MOI)または高濃度のプラーク形成単位(PFU)の使用に成功した。斯かる高いファージ濃度(PFU/mL)は、「外からの溶菌(lysis from without)」を引き起こすと言われていたため、細菌検出アッセイにおいて有害であると以前に言われていた。しかし、高濃度のファージは、少数の標的細胞を見出し、結合し、感染することを容易にすることができる。
本明細書では、検査試料(例えば、生体、食物、水、および環境)における、Escherichia coli、Cronobacter spp.、Salmonella spp.、Listeria spp.またはStaphylococcus spp.等の目的の微生物の検出について、驚くべき感度を示す組成物、方法、およびシステムが開示される。検出は、富化のための培養なしで行われるアッセイにおいて遺伝子改変された感染因子を使用して以前に可能と考えられていたよりも短い時間枠で、または一部の実施形態では、微生物が潜在的に増えることができる最小のインキュベーション時間で達成することができる。同様に驚くべきことに、検査試料とのインキュベーションのための、潜在的に高い感染多重度(MOI)または高濃度のプラーク形成単位(PFU)の使用に成功した。斯かる高いファージ濃度(PFU/mL)は、「外からの溶菌(lysis from without)」を引き起こすと言われていたため、細菌検出アッセイにおいて有害であると以前に言われていた。しかし、高濃度のファージは、少数の標的細胞を見出し、結合し、感染することを容易にすることができる。
本開示の組成物、方法、システム、およびキットは、バクテリオファージゲノムに挿入された、指標タンパク質のペプチドサブユニットをコードする指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージである、Escherichia coli、Cronobacter spp.、Salmonella spp.、Listeria spp.、またはStaphylococcus spp.等の微生物の検出において使用するための感染病原体を含むことができる。ある特定の実施形態では、宿主細菌の感染後、バクテリオファージ複製の間に指標遺伝子が発現される結果、指標タンパク質の可溶性ペプチドサブユニットが産生される。代替実施形態では、指標タンパク質の融合されたペプチドサブユニットである。ある特定の実施形態では、指標遺伝子は、バクテリオファージの後期遺伝子(すなわち、クラスIII)領域に挿入される場合がある。
一部の実施形態では、本開示は、試料における目的の特定の細菌を検出する方法であって、試料を、指標タンパク質の第1のサブユニットをコードする指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージと共にインキュベートすることによって、第1のサブユニットを発現する、所定量の子孫ファージが生成されるステップと、その量の子孫ファージを溶解させるステップと、溶解した子孫ファージを、指標タンパク質の第2のサブユニットを含む検出試薬の存在下でインキュベートすることによって、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットが再構築されて指標タンパク質複合体を形成することを可能にするステップと、指標タンパク質複合体を検出するステップであって、指標タンパク質複合体の陽性検出によって、試料中に目的の特定の細菌が存在することが示されるステップとを含む方法を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、システムを含むことができる。本システムは、本開示の組成物の少なくとも一部を含有することができる。また、本システムは、本方法を行うための構成成分の少なくとも一部を含むことができる。ある特定の実施形態では、本システムは、キットとして処方される。よって、ある特定の実施形態では、本開示は、試料における目的の特定の細菌の迅速な検出のためのシステムであって、感染因子が指標部分を含む、目的の微生物に特異的な感染因子と共に試料をインキュベートするための構成成分と、指標部分を検出するための構成成分とを含むシステムを含むことができる。さらに他の実施形態では、本開示は、本方法またはシステムによる使用のためのソフトウェアを含む。
したがって、本開示の一部の実施形態は、細菌の存在を指し示す検出可能なシグナルを増幅するためのバクテリオファージに基づく方法を使用することにより、必要を解決する。ある特定の実施形態では、ほんの1個の細菌が検出される。本明細書に適用される原理は、種々の微生物の検出に適用することができる。微生物の表面における感染因子に対する多数の結合部位、感染の間に百またはそれより多くの作用因子を生産する能力、およびコードされた指標部分の高レベル発現の潜在力のため、感染因子または指標部分は、微生物それ自体よりも容易に検出可能であり得る。このようにして、本開示の実施形態は、単一の感染細胞からであっても膨大なシグナル増幅を達成することができる。
本開示の態様は、試料における特殊微生物の検出および/または定量化の手段として、特定の微生物に結合することのできる結合剤、例えば感染病原体の結合性成分の高い特異性を利用する。一部の実施形態では、本開示は、バクテリオファージ等の感染病原体の高い特異性を利用する。
一部の実施形態では、検出は、目的の微生物に特異的な結合剤と会合する指標部分によって実現される。例えば、感染病原体が、指標タンパク質またはそのサブユニットをコードする遺伝子を含む場合がある。一部の実施形態では、指標は、バクテリオファージ等の感染病原体によってコードされる場合があり、そのバクテリオファージは、指標ファージと呼ばれる。
本明細書において開示および記載されている本開示の一部の実施形態は、単一の微生物が、ファージ等の特異的認識剤に結合し得るという発見を利用する。ファージの感染および複製に続いて、ファージ複製の間に発現された指標遺伝子によって、子孫ファージを検出することができる。この原理によって、微生物表面受容体の特異的認識に基づく、1個または数個の細胞からの指標シグナルの増幅が可能になる。例えば、単一の細菌細胞であっても、複数のファージに曝露し、その後、複製の間に、ファージの増殖、およびコードされた指標遺伝子産物または指標タンパク質のサブユニットの高レベルの発現を可能にし、単一の細菌が検出可能であるように指標シグナルが増幅される。
本開示の方法およびシステムの実施形態は、食物、水および商業的試料からの病原体の検出を含むがこれらに限定されない、種々の状況における種々の微生物(例えば、細菌)の検出および定量化に適用することができる。本発明の方法は、高い検出感度および特異性の検出を迅速に提供する。一部の実施形態では、検出は、バクテリオファージの単一複製サイクル内で可能であって、これは予期されないことである。
定義
定義
本明細書に他に規定がなければ、本開示に関連して使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によってそれ以外のことが要求されなければ、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技法は、当技術分野で周知かつ一般的に使用される命名法および技法である。公知方法および技法は一般に、他に指し示されない限り、当技術分野で周知の、本明細書を通して記述されている様々な一般のおよびより特異的な参考文献に記載されている従来方法に従って行われる。酵素反応および精製技法は、当技術分野で一般的に達成される通り、または本明細書に記載されている通り、製造業者の明細書に従って行われる。本明細書に記載されている研究室手順および技法に関連して使用される命名法は、当技術分野で周知かつ一般的に使用される命名法である。
次の用語は、他に指し示されない限り、次の意味を有すると理解されるものとする:
本明細書で使用される場合、用語「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、それ以外のことが特に言及されていない限り、1つまたは複数を指すことができる。
用語「または」の使用は、二者択一のみを指すまたは二者択一が相互排他的であると明確に指し示されない限り、「および/または」を意味するように使用されるが、本開示は、二者択一のみおよび「および/または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第2のまたはそれよりも多くを意味することができる。
本出願を通して、用語「約」は、ある値が、当該値の決定に用いられるデバイス、方法についての固有の誤差変動、または試料間に存在する変動を含むことを指し示すように使用される。
本明細書で使用する場合、「固体支持体」または「支持体」は、生体分子が結合され得る基材および/または表面を提供する構造体を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル(すなわち、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレート等)であってよい、あるいは固体支持体は、フィルター、アレイ、またはビーズもしくは膜等の可動性支持体(例えば、フィルタープレート、ラテックス粒子、常磁性粒子またはラテラルフローストリップ)上の場所であってよい。
本明細書で使用する場合、用語「結合剤」は、第2の(すなわち、異なる)目的の分子に特異的にかつ選択的に結合することができる分子を指す。相互作用は、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電もしくは疎水性相互作用の結果としての非共有結合性であってよい、あるいは共有結合性であってよい。用語「可溶性結合剤」は、固体支持体と会合(すなわち、共有結合または非共有結合により結合)していない結合剤を指す。
本明細書で使用される場合、用語「生物発光」は、酵素、タンパク質、タンパク質複合体または他の生体分子(例えば、生物発光複合体)によって触媒されるまたは可能になる化学反応による光の生成および放射を指す。典型的な実施形態では、生物発光実体(例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体)の基質は、生物発光実体によって不安定な形態に変換され、その後、基質は光を放射する。
本明細書で使用される場合、用語「相補的」は、2種またはそれよりも多い構造要素(例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子等)の、互いにハイブリッド形成し、二量体化し、または別な形で複合体を形成し合うことのできる特徴を指す。例えば、「相補的なペプチドおよびポリペプチド」は、合わさって複合体を形成することができる。相補的な要素は、(例えば、相互作用要素から)複合体を形成するのに、例えば、要素を補完に適したコンフォメーションにする、相補的な要素を共存させる、補完のために相互作用エネルギーを低下させる等のための助力を要する場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「複合体」は、互いに直接および/または間接的に接触している分子(例えば、ペプチド、ポリペプチド等)の集合体または凝集体を指す。一態様では、「接触」、またはより詳細には、「直接の接触」は、2つまたはそれよりも多くの分子が十分に近くにある結果、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性および疎水性相互作用等の誘引性の非共有結合性相互作用が分子の相互作用を支配することを意味する。このような態様において、分子(例えば、ペプチドおよびポリペプチド)の複合体は、複合体が(例えば、凝集していないまたは複合体化していない、その構成分子の状態に比べて)熱力学的に好都合であるようなアッセイ条件下で形成される。本明細書で使用される場合、用語「複合体」は、そうでないことが記載されていない限り、2つまたはそれよりも多くの分子(例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはその組合せ)の集合体を指す。
本明細書で使用される場合、用語「非発光性」は、(例えば、基質の存在下で)可視スペクトルにある光を検出可能な量で放射しない特徴を示す実体(例えば、ペプチド、ポリペプチド、複合体、タンパク質等)を指す。例えば、所与のアッセイにおいて検出可能な発光を示さない場合、実体は非発光性と称される場合がある。本明細書で使用される場合、用語「非発光性」は、用語「実質的に非発光性」と同義である。例えば、非発光性ポリペプチドは、実質的に非発光性であって、NLpolyのその非発光性補完ペプチドとの複合体に比べて、例えば、10分の1またはそれよりも大きい(例えば、100分の1、200分の1、500分の1、1×103分の1、1×104分の1、1×105分の1、1×106分の1、1×107分の1等)発光の減少を示す。一部の実施形態では、特定のアッセイについてバックグラウンドへの干渉が生じないように光放射が十分に最小限に抑えられている場合、実体は「非発光性」である。
本明細書で使用される場合、用語「非発光性ペプチド」および「非発光性ポリペプチド」は、(例えば、基質の存在下で)実質的に発光を示さない、またはノイズより少ない、もしくは、標準条件(例えば、生理的条件、アッセイ条件等)下で、典型的な機器(例えば、ルミノメーター等)を用いて、有意なシグナル(例えば、発光複合体)と比較したとき、10分の1もしくはそれよりも少ない(例えば、100分の1、200分の1、500分の1、1×103分の1、1×104分の1、1×105分の1、1×106分の1、1×107分の1等)量しか示さないペプチドおよびポリペプチドを指す。一部の実施形態では、このような非発光性ペプチドおよびポリペプチドは、集合して、本明細書に記載の判断基準に従い、生物発光複合体を形成する。本明細書で使用される場合、「非発光性要素」は、非発光性ペプチドまたは非発光性ポリペプチドである。用語「生物発光複合体」は、2つまたはそれよりも多くの非発光性ペプチドおよび/または非発光性ポリペプチドの集合複合体を指す。生物発光複合体は、生物発光複合体の基質の不安定な形態への変換を触媒し、または可能にし、その後、基質は光を放射する。複合体化していないとき、生物発光複合体を形成する2つの非発光性要素は「非発光性対」と称される場合がある。生物発光複合体が、3つまたはそれよりも多くの非発光性ペプチドおよび/または非発光性ポリペプチドによって形成される場合、生物発光複合体の複合体化していない構成要素は、「非発光性群」と称される場合がある。
本明細書で使用される場合、「分析物」は、測定されている分子、化合物または細胞を指す。目的の分析物は、ある特定の実施形態では、結合剤と相互作用することができる。本明細書に記載されている通り、用語「分析物」は、目的のタンパク質またはペプチドを指すことができる。分析物は、アゴニスト、アンタゴニストまたはモジュレーターであってよい。あるいは、分析物は、生物学的効果がない場合がある。分析物は、小分子、糖、オリゴ糖、脂質、ペプチド、ペプチドミメティック(peptidomimetic)、有機化合物その他を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「検出可能部分」または「検出可能生体分子」または「レポーター」または「指標」または「指標タンパク質」または「指標タンパク質産物」「指標タンパク質複合体」または「指標部分」は、定量的アッセイにおいて測定することのできる分子を指す。例えば、指標タンパク質は、基質から測定され得る産物への変換に使用され得る酵素を含むことができる。指標部分は、生物発光放射を生成する反応を触媒する酵素(例えば、ルシフェラーゼ)であってよい。あるいは、指標部分は、定量化され得る放射性同位元素であってよい。あるいは、指標部分は、フルオロフォアであってよい。あるいは、他の検出可能な分子を使用することができる。
本明細書で使用される場合、「バクテリオファージ」または「ファージ」は、複数の細菌ウイルスの1つまたは複数を含む。本開示では、用語「バクテリオファージ」および「ファージ」は、(例えばTBおよびparaTBの)マイコバクテリオファージ、(例えば真菌の)マイコファージ、マイコプラズマファージ等のウイルス、ならびに生きている細菌、真菌、マイコプラスマ、原生動物、酵母、および他の顕微鏡レベルの生きている生物に侵入することができ、それを自らの複製に使用するウイルスを指す他の用語を含む。ここで、「顕微鏡レベルの」は、最大寸法が1ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。バクテリオファージは、自らを複製する手段として細菌を使用するように自然界で進化してきたウイルスである。ファージは、自らを細菌に付着させ、自身のDNA(またはRNA)をその細菌の中に注入し、その細菌にファージを数百倍またはさらには数千倍に複製させることにより、これを行う。これは、をファージ増幅と称される。
本明細書で使用される場合、「後期遺伝子領域」は、ウイルス生活環の後期に転写されるウイルスゲノムの領域を指す。後期遺伝子領域は典型的に、最も豊富に発現される遺伝子(例えば、バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質)を含む。後期遺伝子は、クラスIII遺伝子と同義であり、構造およびアセンブリ機能を有する遺伝子を含む。例えば、後期遺伝子(クラスIIIと同義)は、ファージT7において、例えば、感染8分後から溶解までに、クラスI(例えば、RNAポリメラーゼ)は、初期に4~8分後に、クラスIIは、6~15分後に転写されるため、IIおよびIIIのタイミングには重複が見られる。後期プロモーターは、斯かる後期遺伝子領域に天然に配置された、活性があるプロモーターである。
本明細書で使用される場合、「富化のための培養」は、微生物の増殖に都合がよい培地中のインキュベーション等、伝統的な培養を指すものであり、試料の液体構成成分を除去して、その中に含有される微生物を濃縮することによる富化、または微生物増殖の伝統的な促進を含まない他の形態の富化等、単語「富化」の他の可能な使用と混同されるべきではない。ある期間にわたる富化のための培養は、本明細書に記載されている方法の一部の実施形態において用いることができる。
本明細書で使用される場合、「組換え」は、この操作を行わなければ見出されることがないであろう、遺伝材料を1つにまとめるために研究室において通常行われる、遺伝的(すなわち、核酸)改変を指す。この用語は、本明細書において用語「改変された」と互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「RLU」は、ルミノメーター(例えば、GLOMAX(登録商標)96)または光を検出する同様の機器によって測定される相対的光単位を指す。例えば、ルシフェラーゼおよび適切な基質(例えば、NANO-GLOによるNANOLUC(登録商標))の間の反応の検出は、多くの場合、検出されたRLUで報告される。
本明細書で使用される場合、「結果までの時間」は、試料インキュベーションの開始から生成された結果に至るまでの時間の合計量を指す。結果までの時間は、いかなる確認試験時間も含まない。データ収集は、結果が生成された後のいずれの時点で行ってもよい。
本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」または「指標遺伝子」は、完全な遺伝子または遺伝子の一部分を指す場合がある。例えば、本明細書における指標遺伝子またはレポーター遺伝子の使用は、より小さいペプチドサブユニットをコードする、すなわち、転写および翻訳されて部分的なタンパク質になるヌクレオチド配列を含み得る。
試料
本開示の方法およびシステムの実施形態のそれぞれは、試料における微生物の迅速な検出および定量化を可能にし得る。例えば、本開示に係る方法は、優れた結果を伴いつつ短縮された期間で行うことができる。
本開示の方法およびシステムの実施形態のそれぞれは、試料における微生物の迅速な検出および定量化を可能にし得る。例えば、本開示に係る方法は、優れた結果を伴いつつ短縮された期間で行うことができる。
本発明の方法およびシステムによって検出される微生物には、自然的、商業的、医学的または獣医学的に懸念される病原体が含まれる。そのような病原体には、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびマイコプラスマが含まれる。特定の微生物に特異的である感染病原体が同定されているいずれの微生物も、本発明の方法によって検出することができる。必要な特異的感染病原体/微生物対の利用可能性以外に、本方法の適用に限界がないことは、当業者の認めるところとなる。
本開示によって検出可能な細菌細胞としては、これらに限定されないが、食物または水によって運ばれる病原体である細菌細胞が挙げられる。本発明によって検出可能な細菌細胞として、これらに限定されないが、Salmonellaのすべての種、Escherichia coliのすべての株、Cronobacter、Staphylococcus、これらに限定されないがL.monocytogenesを始めとするListeriaのすべての種、およびCampylobacterのすべての種が挙げられる。本発明によって検出可能な細菌細胞としては、これらに限定されないが、医学的または獣医学的に重要な病原体である細菌細胞が挙げられる。そのような病原体としては、これらに限定されないが、Bacillus spp.、Bordetella pertussis、Camplyobacter jejuni、Chlamydia pneumoniae、Clostridium perfringens、Enterobacter spp.、Klebsiella pneumoniae、Mycoplasma pneumoniae、Salmonella typhi、Shigella sonnei、Staphylococcus aureus、およびStreptococcus spp.が挙げられる。一部の実施形態では、本発明によって検出可能な細菌細胞としては、抗生物質耐性細菌(例えば、メチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA))が挙げられる。
試料は、環境試料、食物試料または水試料であってよい。一部の実施形態は、医学的または獣医学的試料を含むことができる。試料は、液体、固体または半固体であってよい。試料は、固体表面のスワブであってよい。試料は、水試料、または空気試料から得たフィルター、またはサイクロン集塵器(cyclone collector)から得たエアロゾル試料等、環境材料を含むことができる。試料は、野菜、肉、家禽、ピーナッツバター、加工食品、乳児用調製粉乳(powdered infant formula)、粉ミルク、茶、デンプン、卵、ミルク、チーズまたは他の乳製品の試料であってよい。医学的または獣医学的試料は、血液、痰、脳脊髄液、および糞便試料および異なる型のスワブを含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、試料は、調製、濃縮または希釈なしで、本開示の検出方法において直接的に使用することができる。例えば、ミルクおよびジュースを含むがこれらに限定されない、液体試料は、直接的にアッセイすることができる。試料は、緩衝溶液または細菌培養培地を含むことができるがこれらに限定されない溶液に希釈または懸濁することができる。固体または半固体である試料は、固体を液体中で刻む、混合するまたは液浸軟化することにより、液体に懸濁することができる。試料は、宿主細菌細胞へのバクテリオファージ付着を促進するpH範囲内に維持されるべきである。試料はまた、Na+、Mg2+およびK+を含むがこれらに限定されない、適切な濃度の二価および一価カチオンを含有するべきである。好ましくは、試料内に含有されるいずれの病原体細胞の生存率を支える温度で試料を維持する。
好ましくは検出アッセイを通して、試料は、試料中に存在するいずれかの病原体細胞の生存率を維持する温度に維持される。バクテリオファージが細菌細胞に付着するステップにおいて、バクテリオファージ付着を助長する温度に試料を維持することが好ましい。感染した細菌細胞内でバクテリオファージが複製する、またはそうした感染細胞を溶解させるステップにおいては、バクテリオファージ複製および宿主の溶解を促進する温度に試料を維持することが好ましい。斯かる温度は、少なくとも約25摂氏度(℃)、より好ましくは、約45℃以下、最も好ましくは、約37℃である。
アッセイは、様々な適切な対照試料を含み得る。例えば、バクテリオファージを含有しない対照試料または細菌なしでバクテリオファージを含有する対照試料は、バックグラウンドシグナルレベルのための対照としてアッセイすることができる。
指標バクテリオファージ
指標バクテリオファージ
本明細書でより詳細に記載されている通り、本発明の組成物、方法、システム、およびキットは、病原性微生物の検出において使用するための感染病原体を含む場合がある。ある特定の実施形態では、本開示は、バクテリオファージゲノムが、指標またはレポーター遺伝子を含むように遺伝子改変されている、組換え指標バクテリオファージを含む。一部の実施形態では、本発明は、バクテリオファージのゲノムに組み込まれた指標遺伝子であって、指標タンパク質のペプチドサブユニットをコードする指標遺伝子を有する、組換えバクテリオファージを含む組成物を含む場合がある。
組換え指標バクテリオファージは、レポーターもしくは指標遺伝子または指標ペプチドサブユニットを含むことができる。指標バクテリオファージの一部の実施形態では、指標またはペプチドサブユニット遺伝子は、融合タンパク質をコードする。例えば、指標または指標ペプチドサブユニットを、バクテリオファージカプシドタンパク質と融合させて、指標がバクテリオファージカプシドの一部として発現されるようにする場合がある。指標を別のタンパク質と融合させて、可溶性分子として産生させる場合もある。指標バクテリオファージの他の実施形態では、指標遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、ある特定の実施形態では、宿主細菌への感染後、バクテリオファージ複製の間に指標遺伝子が発現される結果、非融合可溶性指標タンパク質産物が生じる。ある特定の実施形態では、指標または指標ペプチドもしくはポリペプチドサブユニット遺伝子は、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入される場合がある。後期遺伝子は、一般に、構造タンパク質をコードするため、他のファージ遺伝子より高いレベルで発現される。後期遺伝子領域は、クラスIII遺伝子領域でよく、主要カプシドタンパク質の遺伝子を含み得る。
一部の実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計(および場合により調製)することを含む。他の実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の上流に相同組換えのための配列を設計(および場合により調製)することを含む。一部の実施形態では、配列は、非翻訳領域の後に配置された、コドン最適化されたレポーター遺伝子を含む。非翻訳領域は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む場合がある。
一部の実施形態では、指標バクテリオファージは、選択された野生型バクテリオファージであるSalmonellaファージSPN1S、Salmonellaファージ10、Salmonellaファージイプシロン15、SalmonellaファージSEA1、SalmonellaファージTSP1、SalmonellaファージTSP12、SalmonellaファージSpn1s、SalmonellaファージP22、ListeriaファージLipZ5、ListeriaファージP40、ListeriaファージvB_LmoM_AG20、ListeriaファージP70、ListeriaファージA511、ListeriaファージP100、ListeriaファージLMA8、ListeriaファージLMA4、StaphylococcusファージP4W、StaphylococcusファージK、StaphylococcusファージTwort、StaphylococcusファージSA97、Escherichia coli O157:H7ファージCBA120、または選択された野生型バクテリオファージであるSalmonellaファージSPN1S、Salmonellaファージ10、Salmonellaファージイプシロン15、SalmonellaファージSEA1、SalmonellaファージTSP1、SalmonellaファージTSP12、SalmonellaファージSpn1s、SalmonellaファージP22、ListeriaファージLipZ5、ListeriaファージP40、ListeriaファージvB_LmoM_AG20、ListeriaファージP70、ListeriaファージA511、StaphylococcusファージP4W、StaphylococcusファージK、StaphylococcusファージTwort、StaphylococcusファージSA97、もしくはEscherichia coli O157:H7ファージCBA120に対する相同性が、少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99%であるゲノムを有する別のバクテリオファージ由来である。一部の実施形態では、指標ファージは、特定の病原性微生物への特異性が高いバクテリオファージ由来である。遺伝子改変は、野生型遺伝子の欠失を回避するものでもよく、したがって、改変されたファージは、市販品として入手可能な多くのファージよりも、野生型感染病原体に似通ったままでよい。環境から得られるバクテリオファージは、環境中に見出される細菌に、より特異的であって、そうした点からも、市販品として入手可能なファージとは遺伝的性質が異なる場合がある。
一部の実施形態では、組換えバクテリオファージは、次のバクテリオファージ、すなわち、SalmonellaファージSPN1S、Salmonellaファージ10、Salmonellaファージイプシロン15、SalmonellaファージSEA1、SalmonellaファージTSP1、SalmonellaファージTSP12、SalmonellaファージSpn1s、SalmonellaファージP22、ListeriaファージLipZ5、ListeriaファージP40、ListeriaファージvB_LmoM_AG20、ListeriaファージP70、ListeriaファージA511、StaphylococcusファージP4W、StaphylococcusファージK、StaphylococcusファージTwort、StaphylococcusファージSA97、またはEscherichia coli O157:H7ファージCBA120のいずれかの結合性ドメインに対する相同性が95%以上である結合性ドメインを含む。
ある特定の例では、指標ファージは、特定の病原性微生物への特異性が高いバクテリオファージ由来である。一部の実施形態では、指標ファージは、T7Select由来である。T7Selectは、市販品として入手可能な、Novagenのファージディスプレイシステムである。T7は、Podoviridae科の、Escherichiaに感染する十分に特徴付けられた原型ファージである。T7ファージのカプシドは、9:1の比の2種のMCPアイソフォーム(gp10aおよびgp10b)から構成される。gp10aおよびgp10bは、翻訳におけるフレームシフトから生じ、このシフトは、異なるgp10a:gp10bアイソフォーム比をもたらすようにモジュレートすることができる。T7Select(登録商標)は、全T7ゲノムを含有するクローニングプラスミドである。ある特定の長さのペプチドまたはタンパク質をgp10bのC末端にクローニングし、バクテリオファージあたり高(415)、中(5~10)、または低(1まで)のコピー数で発現させることができる。
一部の実施形態では、指標ファージは、Salmonella bongori株に特異的なSalmonellaファージであるTSP12由来である。このファージは、Tequatrovirus属に属するEnterobacteriaRB51ファージと最も近縁である。この属は、十分に特徴付けられ、研究されているEscherichiaT4ウイルスを含む。このファージは、タンパク質成分およびコンフォメーションを明示して公表されたいくつかのカプシド構造を有する。TSP12は、これらに限定されないが、主要カプシドタンパク質(gp23)およびアクセサリー小外側カプシド(accessory small outer capsid)タンパク質(gpSoc)を始めとする、標識用ペプチドまたはポリペプチドサブユニットでタグ付けするためのいくつかの候補構造遺伝子を有する。
一部の実施形態では、指標ファージは、SalmonellaファージであるSEA1由来である。SEA1は、Gelderlandvirus属のSalmonellaファージvB_SenM-S16と最も近縁である[GenBank:HQ331142.1]。SEA1は、これらに限定されないが、主要カプシドタンパク質、頭頂(head vertex)タンパク質、頭部外側カプシド(head outer capsid)タンパク質、および小外側カプシド(small outer capsid)タンパク質を始めとする、標識用ペプチドまたはポリペプチドサブユニットでタグ付けするためのいくつかの候補構造遺伝子を有する。主要カプシドタンパク質は、アミン(N)またはカルボキシ(C)末端のいずれかにおいてタグ付けされてもよい。
一部の実施形態では、指標ファージは、SalmonellaファージであるTSP1由来である。TSP1は、SamonellaおよびEscherichia Kuttervirus属のファージと最も近縁である。TSP1ファージは、これらに限定されないが、単一の主要プロヘッドタンパク質(major prohead protein)を始めとする、標識用ペプチドまたはポリペプチドサブユニットでタグ付けするための少なくとも1つの候補遺伝子を有する。
遺伝子改変は、野生型遺伝子の欠失を回避するものでもよく、したがって、改変されたファージは、市販品として入手可能な多くのファージよりも、野生型感染病原体に似通ったままでよい。環境から得られるバクテリオファージは、環境中に見出される細菌に、より特異的であって、そうした点からも、市販品として入手可能なファージとは遺伝的性質が異なる場合がある。
その上、必須でないと考えられているファージ遺伝子が、認識されていない機能を有することもある。例えば、必須でないように見受けられる遺伝子が、組み立てにおける微妙なカッティング、フィッティングまたはトリミング機能等の、バーストサイズの向上において重要な機能を有する場合がある。したがって、指標を挿入するために遺伝子を欠失させることは、不利益になりかねない。ほとんどのファージは、その本来のゲノムより、最高で10パーセント大きいDNAをパッケージングすることができる。ファージを含めて、種々のウイルスは、様々なバーストサイズを有する。バーストサイズは、宿主、感染多重度(MOI)、および増殖条件に大いに左右される。ファージラムダおよび他のファージ(T4、T5およびT7等)は、約100~300のバーストサイズを有する。一部の実施形態では、選択されたバクテリオファージは、少なくとも25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、250、375、400、425、450、475または500PFU/細胞のバーストサイズを有する。例えば、T7は、180PFU/細胞のバーストサイズを有し、T4は、130PFU/細胞のバーストサイズを有し、CBA120は、440PFU/細胞のバーストサイズを有する。バーストサイズが小さいほど、指標タンパク質産物の産生に利用可能となる子孫ファージが少なくなる。したがって、バーストサイズがより大きいファージを使用することが、シグナルの増幅およびアッセイ感度の向上において有利である。
小さいファージは、小さめのゲノムを詰め込み、したがって、追加の導入遺伝子に対する許容度がより低い。小さいレポーター遺伝子の別の推定される利点は、タンパク質の各コピーが、限りある細胞資源をより少ししか必要としないため、より多い数で発現され得ることである。それでも、HiBiTタグだけでは、小さすぎて、正しく発現されず、または正しく折り畳まれない場合がある。
これらの検討事項から、より小型の指標遺伝子は、バクテリオファージ、特に、より小型のゲノムを有するバクテリオファージの改変のためのより適切な選択であってよい。OpLucおよびNANOLUC(登録商標)タンパク質は、わずか約20kDa(コードするためにおよそ500~600bp)であり、一方、FLucは、約62kDa(コードするためにおよそ1,700bp)である。比較のため、T7のゲノムは、40kbp前後であり、一方、T4ゲノムは、約170kbpである。一部の実施形態では、指標遺伝子は、レポータータンパク質(例えば、NANOLUC(登録商標))のサブユニットをコードする。一部の実施形態では、小さめの指標遺伝子(例えば、指標タンパク質のサブユニット)の使用によって、指標遺伝子の複数のコピーをファージゲノムに挿入し、それによって、シグナルをさらに増幅することを可能にする。
タンパク質相補アッセイ(PCA)は、2つの生体分子、例えば、ポリペプチドサブユニットの相互作用を検出するための手段を提供する。PCAは、互いに極めて接近したときに、同じタンパク質、例えば酵素からなる、機能する活性タンパク質に再構築し得る2つのサブユニットを利用するものでもよい。PCAには、目的のタンパク質を検出するのに、少なくとも2つのタンパク質サブユニットの使用が必要である。したがって、組換え指標バクテリオファージの一部の実施形態では、指標遺伝子は、分割レポータータンパク質の1つのサブユニットをコードする。ある特定の例では、分割レポータータンパク質は、機能的酵素(例えば、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼ)である。さらなる実施形態では、ルシフェラーゼは、NANOLUC(登録商標)である。一部の実施形態では、分割レポーター(指標タンパク質)は、第1のポリペプチドサブユニット(標識用サブユニット)および第2のポリペプチドサブユニット(検出サブユニット)を含む。さらに別の実施形態では、標識用サブユニットは、検出サブユニットと相補的である。ある特定の例では、標識用サブユニットは、検出サブユニットに結合して、指標タンパク質複合体を形成することができる。したがって、組換え指標バクテリオファージの一部の実施形態では、バクテリオファージゲノムに挿入された、指標タンパク質のポリペプチドサブユニット(標識用サブユニット)をコードする指標遺伝子。
指標ファージの、ある特定の実施形態では、標識用サブユニットをコードする遺伝子が、ファージゲノムに挿入されている。さらなる実施形態では、指標遺伝子は、目的の細菌への感染後、バクテリオファージ複製の間に、指標タンパク質産物の産生をもたらし、第2のサブユニット(検出サブユニット)とのタンパク質-タンパク質相互作用を可能にする。一部の実施形態では、標識用サブユニットは、検出サブユニットに遭遇して、機能的酵素(例えば、ルシフェラーゼ)を形成する。さらなる実施形態では、機能的酵素は、シグナルを生成する。一部の例では、シグナルの生成には、機能的酵素が基質に接触することが必要である。
図1は、本開示の組換えバクテリオファージの一実施形態である指標ファージTSP12.s.HiBiTのゲノム構造の略図を示す。図1に示す実施形態について、指標タンパク質は、ウイルス生活環の後期に発現される後期(クラスIII)遺伝子領域内に挿入された可溶性HiBiT遺伝子によってコードされる。後期遺伝子は、一般に、構造タンパク質をコードするため、他のファージ遺伝子より高いレベルで発現される。したがって、図1によって描かれる組換えファージの実施形態において、指標遺伝子(すなわち、可溶性HiBiT)は、後期遺伝子領域に、主要カプシドタンパク質(MCP)遺伝子のすぐ後ろにおいて挿入されており、HiBiTルシフェラーゼ遺伝子を含む構築物である。同じく図1によって描かれる通り、構築物は、HiBiT遺伝子の転写および発現を駆動するための後期プロモーターを含む場合もある。構築物は、HiBiTがMCP遺伝子産物に組み込まれないことを確実にするために、いくつかのUTRから合成された混成非翻訳領域、および全3個の読み枠に停止コドンを含む場合もある。この構築物では、可溶性HiBiTの産生が確実になる結果、発現が、ファージディスプレイシステムに固有のカプシドタンパク質の数に限定されなくなる。
図2には、本開示の組換えバクテリオファージである指標ファージTSP12.MCP-PS-HiBiTのゲノム構造の略図を示す。図2に示す実施形態については、HiBiT遺伝子がMCPのC末端において挿入されて、MCP-HiBiT融合タンパク質を生成する。MCPは、ウイルス生活環の後期に発現される後期(クラスIII)遺伝子領域内に配置される。後期遺伝子は、一般に、構造タンパク質をコードするため、他のファージ遺伝子より高いレベルで発現される。したがって、図2によって描かれる組換えファージの実施形態において、指標遺伝子(すなわち、HiBiT)は、後期遺伝子領域に、MCP遺伝子のC末端において挿入されており、HiBiTルシフェラーゼ遺伝子を含む構築物である。同じく図2によって描かれる通り、構築物は、リンカーおよびHRV 3Cプロテアーゼ切断部位を含む場合もある。HRV 3Cプロテアーゼ切断部位によって、ファージ調製の間にHiBitをファージから除去することを可能にする。
一部の実施形態では、NANO-GLO(登録商標)HiBiT検出システム(Promega Corporation)を使用して、酵素成分またはサブユニットの結合相互作用による発光酵素の再構築によって、分子近接が検出される場合がある。NANO-GLO(登録商標)HiBiT検出システムでは、ペプチドタグ(HiBiT)、およびOplophorusルシフェラーゼバリアントであるNANOLUC(登録商標)由来のポリペプチド(LgBiT)が利用される。一部の実施形態では、HiBiT(11アミノ酸)が標識用サブユニットであって、LgBiT(156アミノ酸)が検出サブユニットである。したがって、一部の実施形態では、指標ファージは、HiBiTである指標遺伝子を含む。HiBiTペプチドがLgBiTペプチドに遭遇すると、これらが再構築されて、全長の機能的ルシフェラーゼ酵素を形成する。一部の実施形態では、検出試薬が、補完用ポリペプチドであるLgBiTを含み、LgBiTがHiBiTタグと自発的に相互作用して、明るい発光酵素を再構築する。一部の実施形態では、指標タンパク質複合体が、イミダゾピラジノン基質(フリマジン(furimazine))であるPromegaのNANO-GLO(登録商標)と組み合わさり、低いバックグラウンドで頑強なシグナルを提供することができる。一部の実施形態では、検出試薬は、NANO-GLO(登録商標)を含む。
一部の実施形態では、検出サブユニットは、標識用サブユニットに対して高い親和性を有する。さらなる実施形態では、標識用サブユニットは、検出サブユニットに結合して指標複合体を形成することができる。HiBiTは、LgBiTにしっかりと結合し、したがって、ルシフェラーゼ指標複合体の形成が促進される。一部の実施形態では、標識用サブユニットと検出サブユニットとの結合親和性(平衡解離定数(KD))は、少なくとも0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9または1.0nMである。
一部の実施形態では、各サブユニットは、レポーター活性をほとんど乃至まったく示さない。ある特定の実施形態では、標識用サブユニットおよび検出サブユニットは、非発光性または実質的に非発光性である。他の実施形態では、標識用サブユニットは、発光性である。さらに、レポーター遺伝子は、細菌によって内在性に発現されるべきではなく(すなわち、細菌ゲノムの一部ではない)、高いシグナル対バックグラウンド比を生成するべきであり、時宜を得た様式で容易に検出可能となるべきである。
一部の実施形態では、標識用サブユニットをコードする遺伝子は、指標バクテリオファージゲノムに挿入される。ある特定の実施形態では、標識用サブユニットは、ファージ構造タンパク質と融合タンパク質を形成する。こうしたタンパク質は、各バクテリオファージ粒子がこうした分子の数十または数百のコピーを含むため、ファージによって作られる最も豊富なタンパク質である。一部の実施形態では、標識用サブユニットは、ファージカプシドタンパク質と融合している。他の実施形態では、標識用サブユニットは、ファージ尾部繊維タンパク質と融合している。ある特定の実施形態では、標識用サブユニットをコードする遺伝子は、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入される。後期遺伝子領域は、クラスIII遺伝子領域であってもよく、主要カプシドタンパク質の遺伝子を含み得る。一部の実施形態では、標識用サブユニットは、カプシドタンパク質と融合タンパク質を形成する。例えば、標識用サブユニットは、主要カプシドタンパク質と融合している場合がある。主要カプシドタンパク質は、バクテリオファージ上に、複数のコピーとして存在する。例えば、T4ファージは、主要カプシドタンパク質をおよそ1,000コピー有し、したがって、シグナルのさらなる増幅が可能になる。
レポーターシステムは、相互作用する相手のタンパク質に影響を及ぼしかねないという点で、問題を含み得る。一部の実施形態では、レポーターシステムは、その融合パートナーにかかる立体的負荷が最小限に抑えられている。さらなる実施形態では、レポーターシステムは、相互作用する標的タンパク質の親和性および会合動態に対する影響が最小限に抑えられている。一部の実施形態では、各サブユニットは、構造最適化されている。ある特定の実施形態では、標識用サブユニットは、小さいため、融合パートナーに対する立体的衝突が最小限に抑えられる。一部の例では、検出サブユニットは、安定性について最適化される。一部の実施形態では、標識用サブユニットは検出サブユニットより小さいことが有利である。したがって、ある特定の実施形態では、標識用サブユニットは、50、40、30、20、15、10または5アミノ酸長未満である。さらなる実施形態では、検出サブユニットは、少なくとも50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240または250アミノ酸長である。
感染因子への遺伝子改変は、核酸の小型断片、遺伝子の相当な部分または遺伝子全体の挿入、欠失または置換を含むことができる。一部の実施形態では、挿入または置換された核酸は、非ネイティブ配列を含む。非ネイティブ指標遺伝子は、バクテリオファージプロモーターの制御下に置かれるように、バクテリオファージゲノムに挿入することができる。したがって、一部の実施形態では、非ネイティブ指標遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、一部の実施形態では、遺伝子改変は、指標タンパク質産物が野生型バクテリオファージのポリペプチドを含まないように構成され得る。一部の実施形態では、指標タンパク質産物は、可溶性である。一部の実施形態では、本開示は、検査試料をこのような組換えバクテリオファージと共にインキュベートするステップを含む、目的の細菌を検出する方法を含む。
一部の実施形態では、宿主細菌の子孫バクテリオファージの指標遺伝子の発現は、遊離の可溶性タンパク質産物をもたらす。一部の実施形態では、非ネイティブ指標遺伝子は、構造ファージタンパク質をコードする遺伝子と近接しておらず、したがって、融合タンパク質を生じない。ある特定の例では、非融合タンパク質システムを用いることが有利である。例えば、融合タンパク質であれば、指標ペプチドは、ストックライセートにおいてファージ粒子をペプチドタグ(例えば、HiBiT)から精製する前に、タンパク質分解によって最初に切断される必要がある。カプシドタンパク質への指標タンパク質(すなわち、融合タンパク質)を用いるシステムとは異なり、本発明の一部の実施形態は、可溶性指標またはレポーター(例えば、可溶性ルシフェラーゼ)を発現する。一部の実施形態では、指標またはレポーターは理想的には、バクテリオファージ構造を含まない。すなわち、指標またはレポーターは、ファージ構造に付着していない。したがって、指標またはレポーターのための遺伝子は、組換えファージのゲノムにおける他の遺伝子と融合されていない。このことは、アッセイの感度を大幅に増加させ(単一の細菌に至るまで)、アッセイを単純化し、検出可能な融合タンパク質を産生する構築物により要求される追加的な精製ステップが原因の数時間とは反対に、一部の実施形態について1時間未満でアッセイを完了させることができる。さらに、例えば、酵素活性部位のコンフォメーションまたは基質へのアクセスを変更し得るタンパク質フォールディング制約が原因で、融合タンパク質は、可溶性タンパク質よりも活性が低くなる場合がある。
他の実施形態では、宿主細菌への感染後に、後代バクテリオファージにおいて、標識用ユニットを含む融合したタンパク質が発現される。ある特定の例では、標識用サブユニット遺伝子は、構造ファージタンパク質をコードする遺伝子と近接しており、したがって、融合タンパク質を生じる。融合タンパク質は、結果としてフォールディングの制約となる場合があり、制約によって、酵素活性部位のコンフォメーションまたは基質へのアクセスが変更される場合がある。
非融合タンパク質システムの利点を残し、導入遺伝子挿入物を小さいままにするために、一部の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドタグ(例えば、HiBiT)を、安定化ドメインとして働き得る小さいタンパク質と融合させる。これは、ペプチドタグ(例えば、HiBiT)を、公知のより大きいタンパク質を切り詰めたものと融合させる、またはペプチドタグ(例えば、HiBiT)を公知の小さいタンパク質と融合させることによって実現できる。例えば、小さいタンパク質には、(177ヌクレオチドによってコードされる)6.5kDaのアプロチニンまたは(372ヌクレオチドによってコードされる)14kDaのアルファラクトアルブミンが含まれる。ある特定の実施形態では、ドメイン間に、短いアミノ酸リンカーが存在する。リンカー領域と合わせても(例えば、gly-ser-gly-serリンカーと合わせたHiBiTは、48ヌクレオチド長である)、こうした可溶性融合タンパク質遺伝子は、当技術分野で公知の他の発光タンパク質(例えば、516ヌクレオチド長のNANOLUC(登録商標))より小さくなる。一部の実施形態では、指標ファージは、検出可能酵素等のレポーターのサブユニットをコードする。レポーター(指標複合体)は、光を発するものでもよいし、かつ/または色の変化によって検出可能なものでもよい。アルカリホスファターゼ(AP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)またはルシフェラーゼ(Luc)等の種々の適切な酵素が市販品として入手可能である。一部の実施形態では、こうした酵素は、レポーターとして働き得る。一部の実施形態では、ホタルルシフェラーゼがレポーターである。一部の実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼがレポーターである。他の操作されたルシフェラーゼ、または検出可能シグナルを発する他の酵素も、適切な指標タンパク質産物となり得る。
一部の実施形態では、可溶性指標タンパク質産物の使用によって、感染させた試料細胞のライセートから、混入している親ファージを除去する必要が省かれる。融合タンパク質システムでは、試料細胞を感染させるのに使用した任意のバクテリオファージに指標タンパク質産物が付着していることになり、同じく指標タンパク質産物を含有する娘バクテリオファージと区別がつかないことになる。試料細菌の検出は、新たに作られた(新規合成された)指標タンパク質産物の検出に依拠するため、融合構築物を使用するには、古い(親)部分(指標タンパク質)を、新たに作られた(娘バクテリオファージ)部分(指標タンパク質)から分離するための追加のステップが必要となる。これは、バクテリオファージ生活環が完了する前に、感染細胞を何回も洗浄する、感染後の過剰な親ファージを、物理的もしくは化学的手段によって不活性化する、および/または親バクテリオファージを、(例えば、ストレプトアビジンでコートされたセファロースビーズによって)その後結合および分離することのできる(ビオチン等の)結合性部分で化学修飾することにより、実現される場合がある。しかし、除去のこうしたすべての試みをもってしても、少ない数の試料細胞を確実に感染させるために高濃度の親ファージが使用されると、親ファージが残存し、感染細胞子孫ファージからのシグナルの検出を不明瞭にし得るバックグラウンドシグナルを引き起こす場合がある。
それに対し、本開示の一部の実施形態において発現される可溶性指標タンパク質産物では、親ファージには指標タンパク質産物が付着していないため、最終ライセートからの親ファージの精製が必要ない。したがって、感染した1つまたは複数の細菌の存在を示す、感染後に存在する任意の指標タンパク質産物は、新規に生じたものでなければならない。この便益を利用するために、親ファージの産生および調製は、細菌培養物における親バクテリオファージの産生の際に産生された任意の遊離指標タンパク質からのファージの精製を含む場合がある。ショ糖密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、および透析または派生技術(例えば、Amiconブランドの濃縮器-Millipore,Inc.)等の、標準のバクテリオファージ精製技術を、本発明に係るファージの一部の実施形態の精製に用いることができる。塩化セシウム等密度超遠心分離を、本発明の組換えファージ調製の一環として用いると、親ファージ粒子を、細菌宿主中でファージを増殖させた際に産生された、混入しているルシフェラーゼタンパク質から分離することができる。このようにすると、本発明の親組換えバクテリオファージは、細菌中で産生される間に生成されたいかなるルシフェラーゼも実質的に含まない。ファージストック中に存在する残留ルシフェラーゼを除去することで、組換えバクテリオファージを検査試料と共にインキュベートしたときに観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に減少させることができる。
ショ糖密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、および透析または派生技術(例えば、Amiconブランドの濃縮器-Millipore,Inc.)等の、標準のバクテリオファージ精製技術を、本開示に係るファージの一部の実施形態の精製に用いることができる。塩化セシウム等密度超遠心分離を、本開示の組換えファージ調製の一環として用いると、親ファージ粒子を、細菌宿主中でファージを増殖させた際に産生された、混入しているルシフェラーゼタンパク質から分離することができる。このようにすると、本開示の親組換えバクテリオファージは、細菌中で産生される間に生成されたいかなるルシフェラーゼも実質的に含まない。ファージストック中に存在する残留ルシフェラーゼを除去することで、組換えバクテリオファージを検査試料と共にインキュベートしたときに観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に減少させることができる。
一部の実施形態では、後期プロモーターは、T7、T4、T4様、ファージK、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1プロモーター、または選択された野生型ファージにおいて見出される、すなわち、遺伝子改変なしのプロモーターと同様の別のファージプロモーターである。後期遺伝子領域は、クラスIII遺伝子領域であってもよく、バクテリオファージは、T7、T4、T4様、ファージK、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、StaphylococcusもしくはS.aureus特異的バクテリオファージ、またはT7、T4、T4様、ファージK、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、StaphylococcusもしくはS.aureus特異的バクテリオファージに対する相同性が少なくとも70、75、80、85、90もしくは95%であるゲノムを有する別の天然バクテリオファージ由来のものでもよく、あるいは、バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質の遺伝子を転写する、同じバクテリオファージのRNAポリメラーゼに対して高い親和性を有する。ウイルス後期プロモーターの使用によって、ルシフェラーゼ指標タンパク質産物の最適に高いレベルの発現を確実なものにすることができる。指標ファージが由来する本来の野生型バクテリオファージに由来する、それに特異的な、またはその下で活性がある後期ウイルスプロモーター(例えば、T4、T7、ViIまたはSakaに基づくシステムによるT4、T7、ViIまたはSaka後期プロモーター)の使用は、指標タンパク質産物の最適な発現をさらに確実にすることができる。標準細菌(非ウイルス/非バクテリオファージ)プロモーターの使用は、一部の場合では、発現に有害となり得るが、その理由として、これらのプロモーターが、多くの場合、バクテリオファージ感染の際に下方調節されることが挙げられる(バクテリオファージが、ファージタンパク質産生のための細菌資源に優先順位を付けるために)。よって、一部の実施形態では、ファージは、好ましくは、ファージ構造構成成分のサブユニットの数に発現を限定しないゲノムにおける設置を使用して、可溶性(遊離)指標タンパク質をコードしこれを高レベルで発現するように操作される。
本開示の組成物は、1種または複数の野生型または遺伝子改変された感染病原体(例えば、バクテリオファージ)と、1種または複数の指標遺伝子とを含むものでもよい。一部の実施形態では、組成物が、同じまたは異なる指標タンパク質をコードおよび発現し得る異なる指標ファージのカクテルを含む場合がある。一部の実施形態では、バクテリオファージのカクテルは、少なくとも2種の異なる型の組換えバクテリオファージを含む。
指標バクテリオファージを調製する方法
指標バクテリオファージを調製する方法
指標バクテリオファージを作製するための方法の実施形態は、遺伝子改変するための野生型バクテリオファージの選択から始まる。一部のバクテリオファージは、標的細菌に高度に特異的である。これは、高度に特異的な検出のための機会を提示する。
したがって、本開示の方法は、目的の特定の微生物を認識し、それに結合する感染病原体と会合する結合剤の高い特異性を、シグナルを増幅する手段として利用し、それによって、試料中に存在する低レベルの微生物(例えば、単一微生物)を検出する。例えば、感染病原体(例えば、バクテリオファージ)は、特定の微生物の表面受容体を特異的に認識し、したがって、そうした微生物に特異的に感染する。そうした点から、こうした感染病原体は、目的の微生物を標的化するのに相応しい結合剤となり得る。本明細書で論述する通り、バクテリオファージは、細菌の内部で複製して、何百もの子孫ファージを生成し得る。バクテリオファージゲノムに挿入された指標遺伝子の産物の検出を、試料中の細菌の測定尺度として使用することができる。
本開示の一部の実施形態は、組換えバクテリオファージの結合の特異性および高レベル遺伝的発現能力を迅速かつ高感度な標的化に利用して、目的の細菌に感染させ、その検出を容易にする。一部の実施形態では、指標バクテリオファージは、レポーター遺伝子を含むように遺伝子改変される。一部の実施形態では、バクテリオファージの後期遺伝子領域が、指標(レポーター)遺伝子を含むように遺伝子改変される。一部の実施形態では、指標遺伝子が主要カプシド遺伝子の下流に配置される。他の実施形態では、指標遺伝子が主要カプシド遺伝子の上流に配置される。一部の実施形態では、挿入された遺伝子構築物は、指標遺伝子の発現を駆動するためのそれ自らの外因性の専用のプロモーターをさらに含む。外因性プロモーターは、ファージゲノムにおけるいずれかの内在性プロモーターに追加されるものである。バクテリオファージは、ポリシストロニックmRNA転写物を産生するため、転写物における第1の遺伝子/シストロンの上流に、単一のプロモーターのみが要求される。従来の組換え構築物では、挿入された遺伝子を駆動するのに、内在性バクテリオファージプロモーターのみを使用する。対照的に、レポーター遺伝子およびリボソーム結合部位の上流に追加のプロモーターが加えられると、転写の二次的な開始部位として働くことにより、遺伝子発現が増大し得る。ウイルスの複雑で緻密なゲノムは、異なる枠の中に、時として異なる2方向で、オーバーラップ遺伝子を有することが多い。
組換え指標バクテリオファージを調製するための方法の一部の実施形態は、Escherichia coli、Cronobacter spp.、Salmonella spp.、Listeria spp.、またはStaphylococcus spp.等の標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択するステップと、指標遺伝子を含む相同組換えプラスミド/ベクターを調製するステップと、相同組換えプラスミド/ベクターを標的病原性細菌に形質転換するステップと、形質転換された標的病原性細菌を、選択された野生型バクテリオファージに感染させることによって、プラスミド/ベクターとバクテリオファージゲノムとの間に相同組換えを生じさせるステップと、組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離するステップとを含む。
相同組換えプラスミドを設計および調製するための様々な方法が公知である。熱ショック、F線毛媒介性細菌接合、電気穿孔および他の方法を含む、プラスミドで細菌を形質転換するための様々な方法が公知である。相同組換え後に特定のクローンを単離するための様々な方法も公知である。本明細書に記載されている実施形態の一部の方法は、特定の戦略を利用する。
したがって、指標バクテリオファージを調製する方法の一部の実施形態は、標的病原性細菌を特異的に感染させる野生型バクテリオファージを選択するステップと、選択されたバクテリオファージのゲノムの後期領域にある天然配列を決定するステップと、ゲノムに注釈を付け、選択されたバクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を特定するステップと、主要カプシドタンパク質遺伝子に隣接した相同組換えのための配列を設計するステップであって、配列は、コドン最適化されたレポーター遺伝子を含むステップと、相同組換えのために設計された配列をプラスミド/ベクターに組み込むステップと、プラスミド/ベクターを標的病原性細菌に形質転換するステップと、形質転換された細菌を選択するステップと、形質転換された細菌を、選択された野生型バクテリオファージに感染させることによって、プラスミドとバクテリオファージゲノムとの間に相同組換えを生じさせるステップと、結果として生じる組換えバクテリオファージライセートの力価を決定するステップと、限界希釈アッセイを行って、組換えバクテリオファージを集積および単離するステップとを含む。一部の実施形態は、第1の限界希釈アッセイの後に、必要に応じて、組換えバクテリオファージが混合物の検出可能画分を表すまで、限界希釈および力価測定(titer)ステップをさらに反復するステップを含む。例えば、一部の実施形態では、限界希釈および力価測定ステップは、組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する前に、混合物中のバクテリオファージの少なくとも1/30が組換え体になるまで反復することができる。1:30の組換え体:野生型の比は、一部の実施形態では、96個のプラーク(例えば、96ウェルプレートにおける)当たり平均3.2形質導入単位(TU)を生じると予想される。組換え体の野生型ファージに対する初期比は、米国特許出願第15/409,258号に以前に記載された通り、TCID50(組織培養感染量50%)に基づく限界希釈アッセイを行うことにより決定することができる。ポアソン分布によって、1:30比は、96ウェルのいずれかにおける少なくとも1TUを観察する96%の確率を生成する。
本明細書に言及される通り、ある特定の実施形態では、本開示の感染病原体の産生のために環境から単離された感染病原体を利用することが好ましい場合がある。このようにすると、天然由来微生物に特異的である感染病原体を生成することができる。
プラスミドを調製するための多数の公知方法および商業的製品がある。例えば、PCR、部位特異的変異誘発、制限酵素消化、ライゲーション、クローニングおよび他の技法を組み合わせて使用して、プラスミドを調製することができる。合成プラスミドを商業的に注文することもできる(例えば、GeneWiz)。コスミドを用いることもできる、またはCRISPR/CAS9システムを使用して、バクテリオファージゲノムを選択的に編集することができる。組換え指標バクテリオファージを調製する方法の一部の実施形態は、野生型バクテリオファージゲノムと容易に組み換えて組換えゲノムを生成することができるプラスミドを設計するステップを含む。プラスミドの設計において、一部の実施形態は、ルシフェラーゼ遺伝子等のコドン最適化されたレポーター遺伝子の付加を含む。一部の実施形態は、上流非翻訳領域へのエレメントの付加をさらに含む。例えば、指標バクテリオファージゲノムと組み換えるためのプラスミドの設計において、gp23/主要カプシドタンパク質のC末端をコードする配列と、HiBiT指標遺伝子等の指標サブユニットの開始コドンとの間に、上流非翻訳領域を付加することができる。非翻訳領域は、T7、T4、T4様、ファージK、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1プロモーター等のプロモーターを含んでもよい。非翻訳領域は、細菌システムによる「シャイン・ダルガーノ配列」としても公知のリボソーム進入/結合部位(RBS)を含むこともできる。これらのエレメントのいずれか一方もしくは両方、または他の非翻訳エレメントは、ファージゲノムの残りとほぼ同じGC含量を含むランダム配列でできた短い上流非翻訳領域内に埋め込むことができる。ATG配列は開始コドンとして作用することになるため、ランダム領域は、ATG配列を含むべきではない。
MCP断片は、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子の一部である。こうしたビリオンタンパク質は、非常に高レベルで発現されるため、この領域に挿入された任意の遺伝子は、後期遺伝子プロモーターおよび/または他の同様の制御エレメントが使用される限り、同様の発現レベルを有すると見込むことができる。ある特定の例では、指標(例えば、HiBiT)を主要カプシドタンパク質と融合させる。一部の実施形態では、ペプチドタグ(すなわち、HiBiT)を、MCPのN末端と融合させる。他の実施形態では、ペプチドタグを、MCPのC末端と融合させる。
一部の実施形態では、指標バクテリオファージが、ルシフェラーゼ遺伝子のサブユニット等の指標遺伝子を含むように遺伝子操作される。例えば、ゲノムがHiBit遺伝子の配列を含む指標ファージが、目的の特定の細菌に特異的である場合がある。組換え指標HiBitバクテリオファージゲノムが、T7、T4、T4様、ファージK、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、ViI、または別の後期プロモーターであるコンセンサスプロモーターをさらに含む場合もある。さらなる実施形態では、プロモーターは、外因性プロモーターである。指標遺伝子の発現を駆動するための外因性プロモーターの挿入は、他のファージタンパク質(例えば、主要カプシドタンパク質)の発現によって発現が制限されないという点で有利である。
したがって、組換えの結果として生成される組換えファージの実施形態において、指標遺伝子またはサブユニット遺伝子(例えば、HiBiT)は、主要カプシドタンパク質をコードする遺伝子のすぐ下流の後期遺伝子領域に挿入され、そうして、HiBiT遺伝子を含む組換えバクテリオファージゲノムが作り出される。構築物は、T7、T4、T4様、ファージK、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、ViI、もしくは別の後期プロモーター、またはルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現の駆動に適する別のプロモーターであるコンセンサスプロモーターをさらに含む場合もある。構築物は、いくつかのUTRから合成された混成非翻訳領域も含む場合がある。この構築物では、可溶性ルシフェラーゼの産生が確実になる結果、発現が、ファージディスプレイシステムに固有のカプシドタンパク質の数に限定されなくなる。
野生型ファージゲノムとの組換えのために設計されたプラスミドの相同組換えによって生成した組換えファージは、非常に少ないパーセンテージ(例えば、0.005%)の総ファージゲノムを含む混合物から単離することができる。単離した後、大規模産生を行って、検出アッセイにおける使用に適する高力価の組換え指標ファージストックを得ることができる。さらに、バックグラウンドを減少させるために、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用して、混入しているルシフェラーゼタンパク質からファージ粒子を分離してもよい。
細菌を検出するために感染病原体を使用する方法
細菌を検出するために感染病原体を使用する方法
本明細書に言及される通り、ある特定の実施形態では、本開示は、微生物を検出するために感染性粒子を使用する方法を含む場合がある。本開示の方法は、様々な仕方で具体化することができる。
一実施形態では、本発明は、試料における目的の細菌を検出する方法であって、試料を、目的の細菌に感染するバクテリオファージと共にインキュベートするステップであって、バクテリオファージは、指標遺伝子または指標遺伝子のサブユニットを含むため、目的の細菌に感染後、バクテリオファージ複製の間に指標遺伝子またはサブユニットを発現するようになる結果、指標タンパク質産物が産生されるステップと、指標タンパク質産物を検出するステップであって、指標タンパク質産物の陽性検出によって、試料中に目的の細菌が存在することが示されるステップとを含む方法を含む場合がある。一部の実施形態では、指標タンパク質産物は、融合タンパク質である。他の実施形態では、指標タンパク質産物は、可溶性の非融合タンパク質である。
ある特定の実施形態では、アッセイを行って、異なる試料の型またはサイズおよびアッセイ形式に適応するように改変され得る一般概念を利用することができる。本開示の指標バクテリオファージを用いる実施形態は、Escherichia coli、Cronobacter spp.、Salmonella spp.、Listeria spp.またはStaphylococcus spp.試料の型、試料サイズおよびアッセイ形式に応じて、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5または26.0時間を下回る総アッセイ時間で、特異的細菌株の迅速な検出を可能にすることができる。例えば、要求される時間量は、バクテリオファージの株およびアッセイにおいて検出されるべき細菌の株、検査されるべき試料の型およびサイズ、標的の生存度に要求される条件、物理的/化学的環境の複雑さ、ならびに「内在性」非標的細菌夾雑物の濃度に応じて、若干より短くまたはより長くなることができる。
一部の実施形態では、ファージ(例えば、SEA1、TSP1、TSP12、T7、T4、T4様、ファージK、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1ファージ)は、ファージが複製する間に指標遺伝子またはサブユニットを発現するように操作される場合がある。指標遺伝子の発現は、ウイルスカプシドプロモーター(例えば、バクテリオファージT7またはT4後期プロモーター)によって駆動され、高い発現がもたらされる。
親ファージは、指標タンパク質またはサブユニット(例えば、HiBit)を発現する。したがって、一般に、アッセイにおけるシグナルが、親ファージからでなく、細菌細胞に感染している間の子孫ファージの複製から生じるように、子孫ファージから親ファージを分離する、または親バクテリオファージから指標タンパク質もしくはサブユニットを除去する必要がある。
一部の実施形態では、親バクテリオファージからのバックグラウンドシグナルは存在しない、またはバックグラウンドシグナルは実質的に存在しない。ある特定の例では、指標またはサブユニット(例えば、HiBiT)は、非発光性または実質的に非発光性である。さらなる実施形態では、指標またはサブユニットは、アッセイにおいて検出されるシグナルが、細菌細胞に感染している間の子孫ファージの複製から生じるに相違ないように、基質に加えられる前に親バクテリオファージから除去される。親ファージから指標またはサブユニット(例えば、HiBiT)を除去するには、当技術分野で一般に公知のいずれの方法を使用してもよい。例えば、プロテアーゼによって切断可能なリンカー(切断タグ)が親ファージにクローニングされる場合がある。適切な切断タグの選択は、選択されたバクテリオファージ次第である。例えば、切断タグは、3C(PreScission)(LEVLFQ/GP)、EKT(エンテロキナーゼ)(DDDDK/)、FXa(FXa因子)(IEGR/)、TEV(タバコエッチウイルス)(ENLYFQ/G)、およびトロンビン(LVPR/GS)を含む群から選択される場合がある。各切断タグの主な切断部位を「/」で示している。したがって、一部の実施形態では、指標ファージは、プロテアーゼ切断部位を含む。例えば、指標ファージは、プロテアーゼ切断部位を含有する指標サブユニット(ペプチド)-カプシドタンパク質の融合体を含む場合がある。プロテアーゼ切断部位は、組換えによるもの、すなわち、遺伝子改変過程において付加または作製されたものでもよい。さらなる実施形態では、親バクテリオファージにプロテアーゼが加えられる。一部の実施形態では、プロテアーゼは、ファージ調製の間に加えられて、親バクテリオファージから指標サブユニットが除去され、その結果、可溶性指標サブユニット(ペプチド)が生成される。さらなる実施形態では、プロテアーゼは、ファージを濃縮した後に加えられる。ある特定の例では、プロテアーゼは、精製する前に加えられ、精製されて、感染病原体ストックの生産後に生成され得る任意の残留指標タンパク質が除去される。
選択されるプロテアーゼは、切断タグに特異的である。3C、EKT、FXa、TEV、およびトロンビン切断タグは、それぞれ、ヒトライノウイルス(HRV)、エンテロキナーゼ、FXa因子、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、およびトロンビンによって切断され得る。各切断酵素の特異性はまちまちである。例えば、HRVは、切断タグにおけるGlu残基とGly残基との間を切断する、特異性の高いプロテアーゼである。エンテロキナーゼは、通常はトリプシンのプロテアーゼ切断に関与する、腸の酵素である。この酵素は、認識配列中のリシン(K)の後を切断する。Xa因子は、Arg残基の後を切断するが、二次的な塩基性部位も、より少ない頻度で切断することができる。そうした事象の頻度は、タンパク質特異的であるとはいえ、この酵素の最も一般的な二次的切断部位は、自らの認識部位におけるGly残基とArg残基との間である。TEVによる切断は、Glu残基とGly残基との間において生じる。TEVは、EKT、トロンビン、またはXa因子に比べて、その認識部位に対する特異性がより良好であると報告されることが多い。トロンビンは、Arg残基とGly残基との間を優先的に切断する。非特異的部位において、通常は、混入しているプロテアーゼによる、オフターゲット切断が起こる場合もある。タンパク質の完全性を確実に最大化するために、酵素試薬は、非常に純粋でなければならない。
一部の実施形態では、試料は、成長を促す条件下でのインキュベーションによって、検査に先立ち富化することができる。斯かる実施形態では、富化期間は、試料の型およびサイズに応じて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15もしくは16時間またはそれよりも長くなることができる。
一部の実施形態では、指標バクテリオファージは、指標遺伝子を含み、指標遺伝子の発現を介して生成されたシグナルの増幅によって、単一病原性細胞(例えば、細菌)の感染を検出することができる。したがって、方法は、ファージ複製の間に産生された指標タンパク質を検出することを含む場合があり、指標タンパク質の検出によって、試料中に目的の細菌が存在することが示される。
一実施形態では、本開示は、試料における目的の細菌を検出する方法であって、試料を、目的の細菌に感染する指標バクテリオファージと共にインキュベートするステップであって、指標バクテリオファージは、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入された指標遺伝子を含むため、宿主細菌に感染後、バクテリオファージ複製の間に指標遺伝子が発現される結果、指標タンパク質産物が産生されるようになるステップと、指標タンパク質産物を検出試薬と共にインキュベートするステップであって、検出試薬は、指標タンパク質産物と相補的なポリペプチドを含み、指標タンパク質産物およびその相補的なポリペプチドによって、指標複合体が形成されるステップと、指標複合体を検出するステップであって、指標複合体の陽性検出によって、試料中に目的の細菌が存在することが示されステップとを含む方法を含む場合がある。一部の実施形態では、指標の検出量が、試料中に存在する目的の細菌の量に対応する。
本明細書においてより詳細に記載されている通り、本開示の方法およびシステムは、ある濃度範囲の親指標バクテリオファージを利用して、試料中に存在する細菌を感染させることができる。一部の実施形態では、指標バクテリオファージが、単一の細胞等、極めて少ない数で試料中に存在する標的細菌を迅速に見出し、結合し、感染するのに十分な濃度で試料に添加される。一部の実施形態では、ファージ濃度は、1時間未満で標的細菌を見出し、結合し、感染するのに十分であってよい。他の実施形態では、これらの事象は、試料への指標ファージの添加後に2時間未満または3時間未満で生じ得る。例えば、ある特定の実施形態では、インキュベートステップのためのバクテリオファージ濃度は、1×105PFU/mL超、1×106PFU/mL超または1×107PFU/mL超である。
ある特定の実施形態では、感染因子は、感染因子ストックの産生の際に生成され得るいかなる残渣指標タンパク質も含まないように精製することができる。したがって、ある特定の実施形態では、指標バクテリオファージは、試料と共にインキュベートする前に、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用して精製される場合がある。感染病原体がバクテリオファージであるとき、この精製には、DNAをもたないバクテリオファージ(すなわち、空ファージまたは「ゴースト」)を除去するという便益も加わる場合がある。
本開示の方法の一部の実施形態では、微生物は、試料からの微生物のいかなる単離または精製も用いずに検出することができる。例えば、ある特定の実施形態では、1個または数個の目的の微生物を含有する試料は、スピンカラム、マイクロタイターウェルまたはフィルター等のアッセイ容器に直接的に添加することができ、アッセイは、このアッセイ容器において実行される。斯かるアッセイの様々な実施形態は、本明細書に開示されている。
検査試料のアリコートは、マルチウェルプレートのウェルに直接的に分配することができ、ファージが添加され、感染に十分な期間の後、溶解緩衝液を指標タンパク質のための基質(例えば、ルシフェラーゼ指標のためのルシフェラーゼ基質)と共に添加し、指標シグナルの検出についてアッセイすることができる。本方法の一部の実施形態は、フィルタープレートにおいて行うことができる。本方法の一部の実施形態は、指標ファージによる感染前に、試料の濃縮ありまたはなしで行うことができる。
例えば、多くの実施形態では、マルチウェルプレートはアッセイを実施するために使用される。プレート(または検出を行うことができる他のいずれかの容器)の選択は、検出ステップに影響を与えることができる。例えば、一部のプレートは、光放射の検出に影響を与え得る、有色または白色のバックグラウンドを含むことができる。一般的に言えば、白色プレートは、より高い感度を有するが、より高いバックグラウンドシグナルも生じる。他の色のプレートは、より低いバックグラウンドシグナルを生成することができるが、ややより低い感度も有する。その上、バックグラウンドシグナルの理由の1つは、あるウェルから別の隣接するウェルへの光の漏出である。白色ウェルを有するいくつかのプレートがあるが、残りのプレートは黒色である。このことは、ウェル内側の高いシグナルを可能にするが、ウェル間の光漏出を防止し、よって、バックグラウンドを減少させることができる。よって、プレートまたは他のアッセイ容器の選択は、アッセイの感度およびバックグラウンドシグナルに影響され得る。
本開示の方法は、感度を増加させる様々な他のステップを含むことができる。例えば、本明細書においてより詳細に記述される通り、方法は、過剰な親バクテリオファージおよび/またはルシフェラーゼ、またはバクテリオファージ調製物を混入した他のレポータータンパク質を除去するために、バクテリオファージを添加した後に、ただしインキュベートする前に、捕捉され感染した細菌を洗浄するためのステップを含むことができる。
一部の実施形態では、目的の微生物の検出は、微生物の集団を増加させる仕方として試料を培養する必要なく完了することができる。例えば、ある特定の実施形態では、検出に要求される総時間は、26.0、25.0、24.0、23.0、22.0、21.0、20.0、19.0、18.0、17.0、16.0時間、15.0時間、14.0時間、13.0時間、12.0時間、11.0時間、10.0時間、9.0時間、8.0時間、7.0時間、6.0時間、5.0時間、4.0時間、3.0時間、2.5時間、2.0時間、1.5時間、1.0時間、45分間未満または30分間未満である。結果を得るまでの時間の最小化は、様々な適用、例えば、病原体に関する食物および環境検査において重要である。
当技術分野で公知のアッセイとは対照的に、本開示の方法は、個々の微生物を検出することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、試料中に存在する微生物の≦10個の細胞(すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8、9個の微生物)を検出することができる。例えば、ある特定の実施形態では、指標バクテリオファージは、目的の特定の細菌に高度に特異的である。一実施形態では、組換えバクテリオファージは、他の型の細菌の存在下で、目的の細菌を区別し得る。ある特定の実施形態では、試料において、特異的な型の単一の細菌を検出するのに、組換えバクテリオファージを使用することができる。ある特定の実施形態では、組換えバクテリオファージによって、試料中のわずか2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90または100個の特異的な細菌が検出される。
したがって、本開示の態様は、検査試料において、指標複合体を介して微生物を検出するための方法を提供する。一部の実施形態では、目的の微生物が細菌である場合において、指標複合体の1つまたは複数のサブユニットが、指標バクテリオファージ等の感染病原体と会合し得る。指標複合体は、基質と反応して、検出可能シグナルを発する場合もあり、または内在性シグナル(例えば、蛍光タンパク質)を発する場合もある。一部の実施形態では、検出感度は、検査試料中の目的の微生物のわずか50、20、10、9、8、7、6、5、4、3または2個の細胞の存在を明らかにし得るものである。一部の実施形態では、目的の微生物の単一の細胞であっても、検出可能シグナルを生じる場合がある。一部の実施形態では、バクテリオファージは、T4様またはViI様バクテリオファージである。
一部の実施形態では、感染病原体によってコードされる指標タンパク質は、感染病原体の複製中または複製後に検出可能になる場合がある。指標部分としての使用に適する、異なる型の多数の検出可能生体分子が当技術分野で公知であって、多くが市販品として入手可能である。一部の実施形態では、指標ファージは、指標タンパク質として働く酵素をコードする指標遺伝子を含む。他の実施形態では、指標ファージは、指標部分として働く、酵素のサブユニットをコードする指標遺伝子を含む。一部の実施形態では、指標ファージのゲノムは、可溶性の非融合タンパク質をコードするように改変される。他の実施形態では、指標ファージのゲノムは、融合タンパク質をコードするように改変される。一部の実施形態では、指標ファージは、検出可能酵素(すなわち、指標タンパク質産物)のサブユニットをコードする。一部の実施形態では、検出可能酵素のサブユニットは、検出可能酵素の相補的なサブユニットの存在下でインキュベートされる結果、これらが再構築されて、機能的酵素(すなわち、指標複合体)を形成する。指標複合体は、光を放射するものでもよいし、かつ/または加えられた基質の色の変化によって検出可能なものでもよい。アルカリホスファターゼ(AP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)またはルシフェラーゼ(Luc)等の種々の適切な酵素が市販品として入手可能である。一部の実施形態では、こうした酵素が指標タンパク質として働く場合がある。一部の実施形態では、ホタルルシフェラーゼが、検出可能酵素である。一部の実施形態では、Oplophorusルシフェラーゼが、検出可能酵素である。一部の実施形態では、NANOLUC(登録商標)が、検出可能酵素である。一部の実施形態では、HiBiT-LgBiT複合体が、検出可能酵素である。一部の実施形態では、が検出可能酵素である。他の操作されたルシフェラーゼ、または検出可能シグナルを生成する他の酵素も、本明細書で詳述する実施形態と共に使用してもよい。
一部の実施形態では、指標遺伝子は、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質他)等の、内在性シグナルを発することのできるタンパク質のサブユニットをコードする。指標タンパク質のサブユニット(標識用サブユニット)は、タンパク質の第2のサブユニット(検出サブユニット)と再構築されて、指標複合体を形成し得る。指標複合体は、光を放射するものでもよいし、かつ/または色の変化によって検出可能なものでもよい。一部の実施形態では、指標複合体は、基質と相互作用してシグナルを発する、機能的酵素(例えば、ルシフェラーゼ)である。一部の実施形態では、標識用サブユニットは、ルシフェラーゼ遺伝子のサブユニットである。一部の実施形態では、ルシフェラーゼ遺伝子は、Oplophorusルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Renillaルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼ、Luciaルシフェラーゼ、またはNANOLUC(登録商標)、NANOBIT(登録商標)、Rluc8.6-535もしくは橙色ナノ-ランタン等の操作されたルシフェラーゼのうちの1つである。
指標の検出は、光の放射の検出を含む場合がある。一部の実施形態では、ルミノメーターを使用して、指標(例えば、ルシフェラーゼ)と基質との反応を検出することができる。RLUの検出は、ルミノメーターにより達成することができる、または他の機械もしくはデバイスを使用することもできる。例えば、分光光度計、CCDカメラまたはCMOSカメラは、色の変化および他の光放射を検出することができる。絶対的RLUは、検出に重要であるが、単一の細胞または少数の細胞が確実に検出されるためには、シグナル対バックグラウンド比も高い(例えば、>2.0、>2.5または>3.0)必要がある。
一部の実施形態では、指標ファージは、ルシフェラーゼ等の酵素の遺伝子のサブユニットを含有するように遺伝子操作される。したがって、酵素(例えば、ルシフェラーゼ)は、ファージが特異的に認識および感染する細菌の感染後、かつ後代バクテリオファージ上に発現された標識用サブユニットが検出サブユニットと再構築した後でのみ産生される。ある特定の例では、指標部分は、ウイルス生活環における後期に発現される。一部の実施形態では、指標は、融合タンパク質である。他の実施形態では、本明細書に記載されている通り、指標は、可溶性タンパク質(例えば、可溶性ルシフェラーゼ)であって、そのコピー数を制限するファージ構造タンパク質と融合していない。
したがって、指標ファージを利用する一部の実施形態では、本開示は、目的の微生物を検出するための方法であって、少なくとも1つの試料細菌を捕捉するステップと、少なくとも1つの細菌を複数の指標ファージと共にインキュベートするステップと、子孫ファージが生じ、指標部分が発現されるように感染および複製のための時間を与えるステップと、指標部分を検出サブユニットと再構築させることによって、指標複合体を生成するステップと、子孫ファージ、または好ましくは、指標複合体を検出するステップであって、指標複合体の検出によって、試料中に細菌が存在することが示されるステップとを含む方法を含む。
例えば、一部の実施形態では、検査試料細菌は、プレートの表面に結合させることによりまたは細菌学的フィルター(例えば、0.45μm孔径スピンフィルターまたはプレートフィルター)を通して試料を濾過することにより捕捉することができる。ある実施形態では、感染因子(例えば、指標ファージ)は、フィルターにおいて直接的に捕捉された試料に最小体積で添加される。ある実施形態では、フィルターまたはプレート表面に捕捉された微生物をその後、1または複数回洗浄して、過剰な結合していない感染因子を除去する。ある実施形態では、培地(例えば、本明細書でLBとも呼ばれるルリア・ベルターニ(Luria-Bertani)ブロス、本明細書でBPWとも呼ばれる緩衝ペプトン水、または本明細書でTSBとも呼ばれるトリプシン大豆ブロスもしくはトリプトン大豆ブロス)を、さらなるインキュベーション時間にわたり添加して、細菌細胞およびファージの繁殖および指標部分をコードする遺伝子の十分に高レベルの発現を可能にすることができる。しかし、検査アッセイの一部の実施形態の意外な態様は、指標ファージとのインキュベーションステップには、単一のファージ生活環に足る長さしか必要ないことである。以前は、バクテリオファージ使用の増幅力には、ファージが数サイクルにわたって複製するためには、より多くの時間が必要になると考えられていた。本開示の一部の実施形態に係る高感度で迅速な検出を容易にするには、指標ファージの単一の複製サイクルで十分となり得る。
一部の実施形態では、細菌を含む検査試料のアリコートは、スピンカラムに添加することができ、組換えバクテリオファージによる感染およびいずれか過剰な繁殖欠損指標ファージを除去するための必要に応じた洗浄後に、検出される可溶性指標の量は、感染した細菌によって生産されるバクテリオファージの量に比例するであろう。
一部の実施形態では、子孫ファージを、検出サブユニットを含む検出試薬と共にインキュベーションする前に溶解させる。一部の実施形態では、検出試薬は、基質をさらに含む。例えば、Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System技術を利用する検出システムでは、HiBiTを発現する後代バクテリオファージを、相補的なポリペプチドであるLgBiTをHiBiTにアクセスさせるために、溶解させなければならない。HiBiTがLgBiTに遭遇すると、これらが再構築されて、機能性ルシフェラーゼ酵素を形成する。
次に、細菌の溶解の際に周囲の液体中に放出される可溶性指標を測定および定量化することができる。ある実施形態では、フィルターを通して溶液をスピンし、指標酵素のための基質(例えば、ルシフェラーゼ基質)の添加後に、新たなレセプタクル(例えば、ルミノメーター内の)内にアッセイのために濾液を収集する。その代わりに、指標シグナルは、フィルターにおいて直接的に測定することができる。
種々の実施形態において、精製された親指標ファージは、検査試料とのインキュベーションに使用される前に精製することができるため、検出可能指標それ自体を含まない。後期(クラスIII)遺伝子の発現は、ウイルス生活環の後期に起こる。本開示の一部の実施形態では、親ファージを精製して、存在する指標タンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)を排除することができる。一部の実施形態では、宿主細菌への感染後、バクテリオファージ複製の間に指標遺伝子が発現する結果、可溶性指標タンパク質産物が生じる。したがって、多くの実施形態では、検出するステップの前に、子孫ファージから親を分離する必要がない。一実施形態では、微生物は、細菌であって、指標ファージは、バクテリオファージである。一実施形態では、指標タンパク質は、宿主微生物が溶解すると放出される可溶性ルシフェラーゼである。
したがって、代替的な実施形態では、指標基質(例えば、ルシフェラーゼ基質)は、フィルター上に残るまたはプレート表面に結合した試料の部分と共にインキュベートすることができる。したがって、一部の実施形態では、固体支持体は、96ウェルフィルタープレート(または通常の96ウェルプレート)であり、基質反応は、ルミノメーター内に直接的にプレートを置くことにより検出することができる。
例えば、一実施形態では、本開示は、Salmonella spp.を検出するための方法であって、96ウェルフィルタープレート上に捕捉された細胞を、感染するとルシフェラーゼを発現し得る複数の親指標ファージに感染させるステップと、余分なファージを洗い落とすステップと、LBブロスを加え、ファージが複製し、特異的なSalmonella spp.標的を溶解させるための時間(例えば、30~120分)を与えるステップと、ルシフェラーゼ基質を加え、96ウェルプレートにおいて直接ルシフェラーゼ活性を測定することによって指標ルシフェラーゼを検出するステップであって、ルシフェラーゼ活性の検出によって、試料中にSalmonella spp.が存在することが示されるステップとを含む方法を含む場合がある。
別の実施形態では、本開示は、Salmonella spp.を検出するための方法であって、96ウェルプレートにおける液体溶液または懸濁液中の細胞を、感染すると指標遺伝子を発現し得る複数の親指標ファージに感染させるステップと、ファージが複製し、特異的なSalmonella spp.標的を溶解させるための時間(例えば、30~120分)を与えるステップと、ルシフェラーゼ基質を加え、96ウェルプレートにおいて直接ルシフェラーゼ活性を測定することによって指標ルシフェラーゼを検出するステップであって、ルシフェラーゼ活性の検出によって、試料中にSalmonella spp.が存在することが示されるステップとを含む方法を含む場合がある。斯かる実施形態では、捕捉ステップは必要ない。一部の実施形態では、液体の溶液または懸濁物は、濃縮LBブロス、トリプシン/トリプトン大豆ブロス、ペプトン水または栄養素ブロスで強化された野菜洗浄液であってよい。一部の実施形態では、液体の溶液または懸濁物は、LBブロスに希釈された細菌であってよい。
一部の実施形態では、指標タンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)と基質との反応は、30分間またはそれよりも多く継続することができ、様々な時点での検出が、感度の最適化に望ましくなることができる。例えば、固体支持体として96ウェルフィルタープレートを、また、指標としてルシフェラーゼを使用した実施形態では、ルミノメーター読み取り値は、最初に、および反応が完了するまで10または15分間間隔で取ることができる。
驚くべきことに、検査試料の感染に利用される高濃度のファージは、非常に短い時間枠での極めて少ない数の標的微生物の検出の達成に成功した。検査試料とファージとのインキュベーションは、一部の実施形態では、単一のファージ生活環に十分な長さであることのみを必要とする。一部の実施形態では、このインキュベートステップのためのバクテリオファージ濃度は、7×106、8×106、9×106、1.0×107、1.1×107、1.2×107、1.3×107、1.4×107、1.5×107、1.6×107、1.7×107、1.8×107、1.9×107、2.0×107、3.0×107、4.0×107、5.0×107、6.0×107、7.0×107、8.0×107、9.0×107または1.0×108PFU/mLを超える。
多数のファージが、標的細胞を死滅させ、これにより、早期のファージアッセイからの有用なシグナルの生成を防止した「外からの溶菌」に以前に関連付けられたため、そのような高濃度のファージによる成功は驚くべきものである。本明細書に記載されている調製されたファージストックのクリーンアップ(clean-up)は、この問題の軽減に役立つことができる(例えば、塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離によるクリーンアップ)。なぜなら、ファージに関連するあらゆる混入指標遺伝子の除去に加えて、このクリーンアップは、ゴースト粒子(DNAを失った粒子)を除去することもできる。ゴースト粒子は、「外からの溶菌」により細菌細胞を溶解し、細胞の早発性の死滅を引き起こし、これにより、指標シグナルの生成を防止することができる。電子顕微鏡は、粗ファージライセート(すなわち、塩化セシウムクリーンアップ前の)が、50%超のゴーストを有し得ることを実証する。これらのゴースト粒子は、細胞膜を穿刺する多くのファージ粒子の作用により、微生物の早発性の死滅に寄与することができる。よって、ゴースト粒子は、高いPFU濃度が有害であると報告された以前の問題に寄与していた可能性がある。さらに、非常に清浄なファージの調製物は、アッセイが、洗浄ステップなしで行われることを可能にし、これにより、アッセイを初期濃縮ステップなしで行うことが可能になる。一部の実施形態は、初期濃縮ステップを含み、一部の実施形態では、この濃縮ステップが、より短い富化インキュベーション時間を可能にすることを理解されたい。
方法を検査する実施形態は、確認アッセイをさらに含むことができる。通常より後期の時点で初期結果を確認するための種々のアッセイが、当技術分野で公知である。例えば、試料を培養することができ(例えば、CHROMAGAR(登録商標)、DYNABEADS(登録商標)アッセイ)、PCRを利用して、微生物DNAの存在を確認することができる、または他の確認アッセイを使用して、初期結果を確認することができる。
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、感染因子による検出に加えて、試料から目的の微生物を精製および/または濃縮するための結合剤(例えば、抗体)の使用を組み合わせる。例えば、ある特定の実施形態では、本開示は、試料において目的の微生物を検出するための方法であって、目的の微生物に特異的な捕捉抗体を使用して、試料からの微生物を、先に存在する(prior)支持体上に捕捉するステップと、試料を、指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージと共にインキュベートするステップであって、指標遺伝子は、指標タンパク質の第1のサブユニットをコードすることによって、第1のサブユニットを発現する、所定量の子孫ファージが生じるステップと、その量の子孫ファージを溶解させるステップと、溶解した子孫ファージを、検出試薬の存在下でインキュベートするステップであって、検出試薬は、指標タンパク質の第2のサブユニットを含み、その結果、第1のサブユニットと第2のサブユニットが再構築されて、指標タンパク質複合体を形成することを可能にするステップと、指標タンパク質複合体を検出するステップであって、指標タンパク質複合体の陽性検出によって、試料中に目的の特定の細菌が存在することが示されるステップとを含む方法を含む。一部の実施形態では、病原体検出アッセイにおける使用に望ましい特性が最適化されるように、合成ファージが設計される。一部の実施形態では、遺伝子改変のバイオインフォマティクスおよび以前の解析を用いて、望ましい形質を最適化する。例えば、一部の実施形態では、ファージ尾部タンパク質をコードする遺伝子は、特定の種の細菌を認識し、これに結合するように最適化することができる。他の実施形態では、ファージ尾部タンパク質をコードする遺伝子は、属全体の細菌または属内の種の特定の群を認識し、これに結合するように最適化することができる。このようにして、ファージは、病原体のより広いまたはより狭い群を検出するように最適化することができる。一部の実施形態では、合成ファージは、レポーター遺伝子の発現を改善するように設計することができる。その上および/またはその代わりに、一部の例では、合成ファージは、検出を改善するためにファージのバーストサイズを増加させるように設計することができる。
一部の実施形態では、ファージの安定性は、有効期間を改善するように最適化することができる。例えば、その後のファージ安定性を増加させるために、エンザイバイオティック(enzybiotic)溶解度を増加させることができる。その上および/またはその代わりに、ファージの熱安定性を最適化することができる。熱安定性ファージは、貯蔵中の機能的活性をよりよく保存し、これにより、有効期間を増加させる。よって、一部の実施形態では、熱安定性および/またはpH耐性を最適化することができる。
本開示のシステムおよびキット
本開示のシステムおよびキット
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている方法を行うための構成成分を含むシステム(例えば、自動化されたシステムまたはキット)を含む。一部の実施形態では、指標ファージが、本発明に係るシステムまたはキットに含まれる。本明細書に記載されている方法は、斯かる指標ファージシステムまたはキットを利用することもできる。本明細書に記載されている一部の実施形態は、本方法を行うために要求される最小量の試薬および材料を考慮すると、自動化および/またはキットに特に適する。ある特定の実施形態では、キットの構成成分のそれぞれは、第1の部位から第2の部位へと送達可能な内蔵型ユニットを含むことができる。
一部の実施形態では、本開示は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットを含む。本システムまたはキットは、ある特定の実施形態では、目的の微生物に特異的な感染因子と共に試料をインキュベートするための構成成分であって、感染因子が指標遺伝子を含む、構成成分と、指標タンパク質を検出するための構成成分とを含むことができる。本開示のシステムおよびキット両方の一部の実施形態では、感染病原体は、目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージであって、組換えバクテリオファージは、指標タンパク質のペプチドまたはポリペプチドサブユニットをコードする指標遺伝子を含む。一部の実施形態では、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入される指標遺伝子は、宿主細菌への感染後、バクテリオファージ複製の間に指標遺伝子が発現される結果、指標タンパク質産物のサブユニットを生じるような、指標部分である。したがって、一部のシステムは、検出試薬をさらに含み、検出試薬は、ペプチドサブユニットと再構築されて指標タンパク質複合体を形成する、指標タンパク質のポリペプチドサブユニット、および指標タンパク質複合体と反応させて指標タンパク質複合体を検出するための基質を含む。加えて、一部のシステムは、固体支持体上に目的の微生物を捕捉するための成分をさらに含む。
他の実施形態では、本開示は、試料における目的の微生物の迅速な検出のための方法、システムまたはキットであって、目的の微生物に特異的な感染因子成分であって、感染因子が指標タンパク質を含む、感染因子成分と、指標部分を検出するための構成成分とを含む方法、システムまたはキットを含む。ある特定の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、特定の細菌に高度に特異的である。
ある特定の実施形態では、システムおよび/またはキットは、捕捉された微生物試料を洗浄するための構成成分をさらに含むことができる。その上またはその代わりに、本システムおよび/またはキットは、指標部分の量を決定するための構成成分であって、検出された指標部分の量が、試料中の微生物の量に対応する、構成成分をさらに含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、本システムまたはキットは、ルミノメーターまたはルシフェラーゼ酵素活性を測定するための他のデバイスを含むことができる。
一部のシステムおよび/またはキットでは、同じ構成成分を複数のステップのために使用することができる。一部のシステムおよび/またはキットでは、ステップは、自動化されている、またはコンピュータ入力によりユーザーによって制御される、および/または液体取り扱いロボットが、少なくとも1ステップを行う。
よって、ある特定の実施形態では、本開示は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットであって、目的の微生物に特異的な感染因子と共に試料をインキュベートするための構成成分であって、感染因子が指標部分を含む、構成成分と、固体支持体上で試料から微生物を捕捉するための構成成分と、捕捉された微生物を洗浄して、結合していない感染因子を除去するための構成成分と、指標部分を検出するための構成成分とを含むシステムまたはキットを含むことができる。一部の実施形態では、同じ構成成分を、捕捉および/またはインキュベートおよび/または洗浄するステップのために使用することができる(例えば、フィルター構成成分)。一部の実施形態はその上、試料中の目的の微生物の量を決定するための構成成分であって、検出された指標部分の量が、試料中の微生物の量に対応する、構成成分を含む。斯かるシステムは、微生物の迅速な検出方法のための上に記載されているものに類似した様々な実施形態および下位実施形態(subembodiment)を含むことができる。ある実施形態では、微生物は、細菌であり、感染因子はバクテリオファージである。コンピュータ化されたシステムにおいて、本システムは、完全に自動化されていても、半自動化されていても、コンピュータを介してユーザーによって指示されてもよい(またはこれらのいくつかの組合せ)。
一部の実施形態では、本システムは、試料中の他の構成成分から目的の微生物を単離するための構成成分を含むことができる。
ある実施形態では、本開示は、目的の微生物を検出するための構成成分を含むシステムまたはキットであって、試料中の他の構成成分から少なくとも1個の微生物を単離するための構成成分と、少なくとも1個の微生物を複数の親感染因子に感染させるための構成成分と、少なくとも1個の感染した微生物を溶解させて、微生物中に存在する子孫感染因子を放出させるための構成成分と、子孫感染因子を、またはより優れた感度で、感染因子によってコードされ発現された可溶性タンパク質を検出するための構成成分であって、感染因子または感染因子のタンパク質産物、またはそのサブユニットの検出が、微生物が試料中に存在することを指し示す、構成成分とを含むシステムまたはキットを含む。一部の実施形態では、システムまたはキットは、感染病原体のタンパク質産物のサブユニットが再構築されて、検出可能指標タンパク質複合体を形成するための成分をさらに含む場合がある。感染病原体は、HiBiT指標遺伝子を運ぶバクテリオファージを含むものでもよい。
他の実施形態では、本開示は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのキットであって、目的の微生物に特異的な感染因子と共に試料をインキュベートするための構成成分であって、感染因子が指標タンパク質のサブユニットを含む、構成成分と、固体支持体上で試料から微生物を捕捉するための構成成分と、捕捉された微生物試料を洗浄して、結合していない感染因子を除去するための構成成分と、指標タンパク質(すなわち、検出試薬)を検出するための構成成分とを含むシステムを含むことができる。一部の実施形態では、検出試薬は、ペプチドサブユニットと再構築されて指標タンパク質複合体を形成する、指標タンパク質のポリペプチドサブユニット、および指標タンパク質複合体と反応させて指標タンパク質複合体を検出するための基質を含む。同じ構成成分を捕捉および/またはインキュベートおよび/または洗浄するステップのために使用することができる。一部の実施形態はその上、試料中の目的の微生物の量を決定するための構成成分であって、検出された指標タンパク質複合体の量が、試料中の微生物の量に対応する、構成成分を含む。斯かるキットは、微生物の迅速な検出方法のための上に記載されているものに類似した様々な実施形態および下位実施形態を含むことができる。一実施形態では、微生物は、細菌であって、感染病原体は、バクテリオファージである。
一部の実施形態では、キットは、目的の微生物を捕捉するための成分を含む場合がある。
一部の実施形態では、キットは、目的の微生物を試料中の他の成分から単離するための成分を含む場合がある。
本開示のこれらのシステムおよびキットは、様々な構成成分を含む。本明細書で使用される場合、用語「構成成分」は、広く定義されており、列挙された方法の実行に適したいずれか適した装置または装置の集合を含む。構成成分は、いずれか特定の仕方で、互いに対して一体的に接続または位置付けされている必要はない。本開示は、互いに対する構成成分のいずれか適した配置を含む。例えば、構成成分は、同じ部屋にある必要はない。しかし一部の実施形態では、構成成分は、一体的ユニットにおいて互いに接続されている。一部の実施形態では、同じ構成成分が、複数の機能を果たすことができる。
コンピュータシステムおよびコンピュータ可読媒体
本技法に記載されているシステム、またはその構成成分のいずれかは、コンピュータシステムの形態で具体化することができる。コンピュータシステムの典型的な例は、汎用コンピュータ、プログラムされたマイクロプロセッサー、マイクロコントローラー、周辺集積回路エレメント、および本技法の方法を構成するステップを実装することができる他のデバイスまたはデバイスの配置を含む。
本技法に記載されているシステム、またはその構成成分のいずれかは、コンピュータシステムの形態で具体化することができる。コンピュータシステムの典型的な例は、汎用コンピュータ、プログラムされたマイクロプロセッサー、マイクロコントローラー、周辺集積回路エレメント、および本技法の方法を構成するステップを実装することができる他のデバイスまたはデバイスの配置を含む。
コンピュータシステムは、コンピュータ、入力デバイス、ディスプレイユニットおよび/またはインターネットを含むことができる。コンピュータは、マイクロプロセッサーをさらに含むことができる。マイクロプロセッサーは、通信バスに接続され得る。コンピュータは、メモリを含むこともできる。メモリは、ランダムアクセスメモリ(RAM)およびリードオンリーメモリ(ROM)を含むことができる。コンピュータシステムは、記憶デバイスをさらに含むことができる。記憶デバイスは、フロッピー(登録商標)ディスクドライブ、光ディスクドライブ等、ハードディスクドライブまたはリムーバブル記憶ドライブであってよい。記憶デバイスは、コンピュータシステムにコンピュータプログラムまたは他の命令をローディングするための他の同様の手段であってもよい。コンピュータシステムは、通信ユニットを含むこともできる。通信ユニットは、コンピュータを、I/Oインターフェースを介して他のデータベースおよびインターネットに接続させる。通信ユニットは、データの他のデータベースへの転送と共に、他のデータベースからのデータの受信を可能にする。通信ユニットは、モデム、イーサネット(登録商標)カード、またはLAN、MAN、WANおよびインターネット等のデータベースおよびネットワークにコンピュータシステムを接続させることができるいずれか同様のデバイスを含むことができる。よって、コンピュータシステムは、I/Oインターフェースを介してシステムにアクセス可能な入力デバイスを介したユーザーからの入力を容易にすることができる。
コンピューティングデバイスは典型的に、当該コンピューティングデバイスの一般管理および演算のための実行可能プログラム命令を提供するオペレーティングシステムを含み、典型的に、サーバーのプロセッサーによって実行されると、コンピューティングデバイスにその意図される機能を遂行させる命令を記憶するコンピュータ可読記憶媒体(例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ等)を含むであろう。オペレーティングシステムに適した実装およびコンピューティングデバイスの一般機能性は、公知であるまたは市販されており、特に、本明細書における開示を踏まえて、当業者によって容易に実装される。
コンピュータシステムは、入力データを処理するために、1個または複数の記憶エレメントに記憶された命令のセットを実行する。記憶エレメントは、所望に応じて、データまたは他の情報を保持することもできる。記憶エレメントは、処理機械に存在する情報源または物理メモリエレメントの形態であってよい。
環境は、上に記述されている通り、種々のデータ記憶ならびに他のメモリおよび記憶媒体を含むことができる。これらは、コンピュータのうち1個もしくは複数にとってローカルな(および/またはその中に存在する)、またはネットワークを通じてコンピュータのいずれかもしくは全てからリモートにある記憶媒体上等、種々の場所に存在することができる。特定のセットの実施形態では、情報は、当業者によく知られている記憶領域ネットワーク(「SAN」)に存在することができる。同様に、コンピュータ、サーバーまたは他のネットワークデバイスに帰属する機能を遂行するための任意の必要なファイルは、適宜ローカルにおよび/またはリモートに記憶することができる。システムが、コンピューティングデバイスを含む場合、斯かるデバイスのそれぞれは、バス経由で電気的にカップルされ得るハードウェアエレメントを含むことができ、このエレメントは、例えば、少なくとも1個の中央処理ユニット(CPU)、少なくとも1個の入力デバイス(例えば、マウス、キーボード、コントローラー、タッチスクリーンまたはキーパッド)および少なくとも1個の出力デバイス(例えば、ディスプレイデバイス、プリンターまたはスピーカー)を含む。斯かるシステムは、ランダムアクセスメモリ(「RAM」)またはリードオンリーメモリ(「ROM」)等、ディスクドライブ、光記憶デバイスおよびソリッドステート記憶デバイス等、1個または複数の記憶デバイス、ならびにリムーバブル媒体デバイス、メモリカード、フラッシュカード等を含むこともできる。
斯かるデバイスは、上に記載されている通り、コンピュータ可読記憶媒体リーダー、通信デバイス(例えば、モデム、ネットワークカード(無線または有線)、赤外線通信デバイス等)およびワーキングメモリを含むこともできる。コンピュータ可読記憶媒体リーダーは、リモート、ローカル、固定および/またはリムーバブル記憶デバイスを表すコンピュータ可読記憶媒体、ならびにコンピュータ可読情報を一時的におよび/またはより永続的に含有、記憶、送信および検索するための記憶媒体と接続され得る、またはこれを受信するように構成され得る。システムおよび様々なデバイスはまた、典型的に、クライアントアプリケーションまたはウェブブラウザー等のオペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラムを含む少なくとも1個のワーキングメモリデバイス内に位置する多数のソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービスまたは他のエレメントを含むであろう。代替実施形態が、上に記載されているものの多数の変形形態を有することができることを認めるべきである。例えば、カスタマイズされたハードウェアが使用されてもよい、および/または特定のエレメントが、ハードウェア、ソフトウェア(アプレット等のポータブルソフトウェアを含む)もしくは両方において実装され得る。さらに、ネットワーク入力/出力デバイス等、他のコンピューティングデバイスへの接続が用いられてよい。
コードまたはコードの部分を含有するための非一過性記憶媒体およびコンピュータ可読媒体は、RAM、ROM、EEPROM、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、CD-ROM、デジタル多用途ディスク(DVD)もしくは他の光記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶もしくは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報の記憶に使用され得、システムデバイスによってアクセスされ得る他のいずれかの媒体を含む、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータ等、情報の記憶および/または伝送のためのいずれかの方法または技術において実装される揮発性および非揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体等が挙げられるがこれらに限定されない、記憶媒体および通信媒体を含む、当技術分野で公知のまたは使用されるいずれか適切な媒体を含むことができる。本明細書に提供される開示および教示に基づき、当業者であれば、様々な実施形態を実装するための他の仕方および/または方法を認めるであろう。
コンピュータ可読媒体は、プロセッサーにコンピュータ可読命令を提供することができる電子、光、磁気または他の記憶デバイスを含むことができるがこれらに限定されない。他の例は、フロッピー(登録商標)ディスク、CD-ROM、DVD、磁気ディスク、メモリチップ、ROM、RAM、SRAM、DRAM、コンテントアドレッサブルメモリ(「CAM」)、DDR、NANDフラッシュもしくはNORフラッシュ等のフラッシュメモリ、ASIC、構成されたプロセッサー、光記憶、磁気テープもしくは他の磁気記憶、またはコンピュータプロセッサーが命令を読み取ることができる他のいずれかの媒体を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、コンピューティングデバイスは、ランダムアクセスメモリ(RAM)等、単一の型のコンピュータ可読媒体を含むことができる。他の実施形態では、コンピューティングデバイスは、ランダムアクセスメモリ(RAM)、ディスクドライブおよびキャッシュ等、2またはそれよりも多い型のコンピュータ可読媒体を含むことができる。コンピューティングデバイスは、外部ハードディスクドライブまたは外部DVDもしくはブルーレイドライブ等、1個または複数の外部コンピュータ可読媒体と通信することができる。
上に記述されている通り、実施形態は、コンピュータ実行可能プログラム命令を実行するようにおよび/またはメモリに記憶された情報にアクセスするように構成されたプロセッサーを含む。命令は、例えば、C、C++、C#、Visual Basic、Java(登録商標)、Python、Perl、JavaScript(登録商標)およびActionScript(Adobe Systems、Mountain View、Calif.)を含むいずれか適したコンピュータプログラミング言語で書き込まれたコードからのコンパイラおよび/またはインタープリターによって生成されたプロセッサー特異的命令を含むことができる。ある実施形態では、コンピューティングデバイスは、単一のプロセッサーを含む。他の実施形態では、デバイスは、2個またはそれよりも多いプロセッサーを含む。斯かるプロセッサーは、マイクロプロセッサー、デジタルシグナルプロセッサー(DSP)、特定用途向け集積回路(ASIC)、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)および状態機械を含むことができる。斯かるプロセッサーは、PLC、プログラマブル割り込みコントローラー(PIC)、プログラマブル論理デバイス(PLD)、プログラマブルリードオンリーメモリ(PROM)、電気的にプログラマブルなリードオンリーメモリ(EPROMまたはEEPROM)または他の同様のデバイス等のプログラマブル電子デバイスをさらに含むことができる。
コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェースを含む。一部の実施形態では、ネットワークインターフェースは、有線または無線通信リンク経由で通信するために構成されている。例えば、ネットワークインターフェースは、イーサネット(登録商標)、IEEE 802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、ブルートゥース(登録商標)、赤外線等経由のネットワーク上の通信を可能にすることができる。別の例として、ネットワークインターフェースは、CDMA、GSM(登録商標)、UMTSまたは他のセルラー通信ネットワーク等のネットワーク上の通信を可能にすることができる。一部の実施形態では、ネットワークインターフェースは、ユニバーサルシリアルバス(USB)、1394 FireWire(登録商標)、シリアルもしくはパラレル接続、または同様のインターフェース経由等、別のデバイスとのポイントツーポイント接続を可能にすることができる。適したコンピューティングデバイスの一部の実施形態は、1個または複数のネットワーク上の通信のための2個またはそれよりも多いネットワークインターフェースを含むことができる。一部の実施形態では、コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェースに加えてまたはこれに代えて、データ記憶を含むことができる。
適したコンピューティングデバイスの一部の実施形態は、マウス、CD-ROM、DVD、キーボード、ディスプレイ、オーディオスピーカー、1個もしくは複数のマイクロホン、または他のいずれかの入力もしくは出力デバイス等の多数の外部または内部デバイスを含むことができる、またはこれと通信することができる。例えば、コンピューティングデバイスは、様々なユーザーインターフェースデバイスおよびディスプレイと通信することができる。ディスプレイは、LCD、LED、CRTその他を含むがこれらに限定されない、いずれか適した技術を使用することができる。
コンピュータシステムによる実行のための命令のセットは、本技法の方法を構成するステップ等の特異的タスクを行うように処理機械に命令する様々なコマンドを含むことができる。命令のセットは、ソフトウェアプログラムの形態であってよい。さらに、ソフトウェアは、本技法に見られるように、別々のプログラムの集合、より大型のプログラムを有するプログラムモジュールまたはプログラムモジュールの部分の形態であってよい。ソフトウェアは、オブジェクト指向プログラミングの形態のモジュラープログラミングを含むこともできる。処理機械による入力データの処理は、ユーザーコマンド、以前の処理の結果、または別の処理機械によって為される要求に応答することができる。
本開示は、ある特定の実施形態を参照して開示されてきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本開示の範囲および精神から逸脱することのない、記載されている実施形態に対する多数の改変、変更および変化が可能である。したがって、本開示が、記載されている実施形態に限定されないが、その全範囲が、次の特許請求の範囲およびその均等の文言によって定義されることが意図される。
以下の実施例は方法について記載している。以下の実施例に示す結果から、結果までの短縮された時間での少数の細胞、さらにいえば単一の細菌の検出が証明される。
(実施例1)
Salmonellaにおける可溶性TSP12.Hibit発現
(実施例1)
Salmonellaにおける可溶性TSP12.Hibit発現
可溶性HiBiT TSP12構築物をpUC57.Ampプラスミドにクローニングし、TSP12.HR.HiBiTを得た。プラスミドをSalmonella bongori ATCC43975に形質転換し、形質転換体を、LBカルベニシリン選択寒天において選択した。良好に単離されたコロニーを選択し、選択的ブロスに接種し、2時間インキュベートした。インキュベーション後、HiBiT Lytic Assayキットを製造者の使用説明書に従って使用しながら、5μLの培養物をアッセイしてHiBiT発現を決定した。検出されたシグナルは、11,000~100,000RLU/培養物5uLの範囲にあった(表1)。プラスミドは、S.bongori 43975における可溶性HiBiT発現に必要なすべてのエレメント(プロモーター/RBSおよびコード配列)を含有していた。
次いで、HiBitシグナルが最も高いS.bongori形質転換体を、野生型TSP12に感染多重度(MOI)0.1で感染させた。ファージライセートを清澄化し、濾過し、緩衝液交換した(buffered exchanged)。ファージ、および宿主細胞を伴うファージの段階希釈を行った。次いで、TU50アッセイを使用して段階希釈物を分析し、PFU力価を決定した(表2)。
(実施例2)
SalmonellaにおけるTSP12.MCP-PS-HiBit発現
SalmonellaにおけるTSP12.MCP-PS-HiBit発現
TSP12主要カプシドタンパク質(MCP)HiBiT融合構築物をpUC57.Ampプラスミドにクローニングした。GeneWizを使用して、クローニングおよび配列検証を行った。プラスミドを再構築し、凍結乾燥させた。次いで、再構築され、凍結乾燥されたプラスミドを、Salmonella bongori ATCC43975に形質転換した。形質転換体を培養し、LBカルベニシリン選択寒天において選択した。単離されたコロニーを選択し、選択的ブロスに接種し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、HiBiT Lytic Assayキットを製造者の使用説明書に従って使用しながら、5uLの培養物をアッセイしてHiBiT発現を決定した。検出された、形質転換体からのHiBiTシグナルは、およそ800RLU/培養物5uLであった(表3)。プラスミドは、S.bongori ATCC43975における効率的なMCP-HiBiT発現に必要なすべてのエレメントを含有していなかった。HiBit融合タンパク質の完全な発現を起こすには、プラスミドがTSP12ファージと組み換えられていなければならない。
次いで、HiBitシグナルが最も高いS.bongori形質転換体を、野生型TSP12に感染多重度(MOI)0.1で感染させた。ファージライセートを清澄化し、濾過し、緩衝液交換した。ファージ、および宿主細胞を伴うファージの段階希釈を行った。次いで、TU50アッセイを使用して段階希釈物を分析し、PFU力価を決定した(表4)。組換えファージは、バックグラウンドシグナルの20~80倍で検出された(細胞対照なし)。シグナルは、用量依存的であって、ファージの数の増加と共に増大した。
(実施例3)
相同組換え構築物
相同組換え構築物
相同組換え産物を図4に示す。親ファージは、組換えに使用した野生型インプットファージを示す。融合タンパク質は、HiBiTとの融合パートナーに使用した目的のタンパク質(POI)を識別する。HRドナープラスミドは、HR宿主に形質転換されたプラスミドの名称を提供する。ベクターバックボーンは、HR領域のクローニングに使用したベクター(GENEWIZが提供するベクター)の名称を提供する。GENEWIZクローンIDは、GENEWIZがクローンを追跡し、QCデータを報告するために使用する一意の識別子である。切断部位は、HiBiTと融合パートナーをつなぐのにどのプロテアーゼ切断部位が使用されたかを示す。HR宿主/株は、組換えおよび単離感染(isolation infection)において使用した種および株を示す。ファージロットは、ファージが完全に単離された場合、貯蔵されることになった(NA)、または大規模調製が行われた(ファージロット番号)ことを示す。不完全は、a)組換え体が安定しなかった、またはb)完全に単離することができなかった、またはc)組換えが試みられなかったことを示した。
(実施例4)
HiBiTアッセイ最適化
(実施例4)
HiBiTアッセイ最適化
マイクロタイターアッセイウェルに試料を加えた。試料を含有する各マイクロタイターアッセイウェルに、HiBiT lyticキット製造者の使用説明書に従って、表5に示す成分が加えられた。反応液をニューテイター(nutator)で10分間混合した後、ルミノメーターで読み取った。本発明者らの形質転換HR宿主およびHR感染ライセートの最初の実験では、培地のみで比較的高い(約500RLU)バックグラウンドシグナルが明らかになった。
その後の実験によって、バックグラウンドの上昇が、培地を含有する試料に起因し得ることが判明した。バックグラウンドレベルの上昇は、S-M緩衝液、水またはS-M緩衝液中のファージを使用するアッセイでは検出されなかった。高いバックグラウンドの出所を同定しようと努めて、いくつかの培地を滅菌脱イオン水に2倍段階希釈し、各100uLを上記の通りにアッセイし、表6に報告した。
加えて、いくつかの培地成分を、推奨濃度の2倍(2×)で滅菌水に溶解させ、2倍連続希釈し、上述の通りにHiBiTアッセイにかけた(表7)。
結果から、検査したすべての培地が高いバックグラウンドを有し、BHIおよびTryptone(Sigma)は、共に非常に高いバックグラウンド(2000~6000RLU)を有することが示された。シグナルは、培地/成分が8倍希釈されても、飽和状態にあると思われる。BHIと併せたLytic kitアッセイのどの成分が非常に高いRLUの原因であるかを見分けるために、HiBiTなしで実験を行った。表8は、LgBiT成分が、フリマジン基質の存在下でBHIと相互作用して高いRLUバックグラウンドをもたらすことを示している。ここでは、緩衝液のみにおけるLgBiTおよびフリマジンの真のバックグラウンドも、110~180RLUと高かったことも注目される。
まさしくLgBiT、培地、および基質と関連する高いバックグラウンドを低減するために、LgBiTの濃度を5~10分の1に下げた(表9)。
表9には、LgBiTを、製造者推奨の0.5μL/反応液に対して、0.05μL/反応液に減らしたとき、バックグラウンドシグナルがおよそ6分の1に減少することが示されている。その後のすべてのHiBiTアッセイについては、LgBiT成分を少なくとも0.1μL/反応液に減らして、培地と関連するバックグラウンドRLUを弱めた。
(実施例5)
組換えファージ生成
組換えファージ生成
可溶性HiBiTまたは構造タンパク質と融合したHiBiTタグのいずれかを発現する組換えファージを、相同組換えドナープラスミドを含有する宿主細菌の標準的な感染によって作製した。相同組換え(HR)プラスミドを、電気穿孔法によって、好ましい宿主細菌に形質転換した。プラスミドを含有する形質転換体を、抗生物質選択用プレートで増殖させることによって選択した。宿主を選択的圧力下で早期~中期対数期まで増殖させ、HiBiT活性を培養物中で測定した。
選択に耐え抜き、HiBiT活性を示す細菌細胞を、次いで、HR感染のための宿主として使用した。対数細胞を、抗生物質を含んだ培地に希釈して、細胞およそ1.0E+07個/mLとした。自然/野生型ファージを約0.05~1.0のMOIで加え、感染物を、震盪しながら好ましい温度で3~5時間インキュベートした。インキュベーション後、5000×gで5分間の遠心分離によって、残存する細菌宿主細胞および細胞デブリをペレット化した。ライセートを収集し、0.45ミクロンフィルターで濾過して、任意の残存する宿主細胞を排除した。
次いで、推定組換え/プラーク力価を決定するために、終点希釈およびプラークアッセイのためのファージライセートを調製した。ファージライセートを、追加の4体積の洗浄緩衝液と共に100,000ダルトン分子量カットオフスピンフィルターに通すことにより緩衝液交換して、組み込まれていない/宿主由来のすべてのHiBiTを除去した。得られるファージを0.5mLの緩衝液/培地に懸濁させ、培地への8段階の10倍希釈を行った。
次いで、TU50アッセイ(形質導入単位50%)を使用して、HiBiT組換え体についてHRライセートを滴定することにより、ファージ力価を決定した。バックグラウンド(ファージおよび培地のみ)を超えるHiBiT活性を示さないウェルを陰性と記録し、RLUがバックグラウンドの3倍であるウェルを陽性と記録した。TU50力価の算出は、Reed-Muench法に準拠した。同じ段階希釈物をプラークアッセイによって滴定した。TU50力価をプラークアッセイ力価と比較して、組換え/総ファージ力価比を決定した。
組換え/総ファージ力価比が1/30未満であった場合、比が1/30になる、またはそれを超えるまで、限界希釈集積を行った。限界希釈集積は、5mLの培地中に1~10形質導入単位を含むようにライセートを希釈することによって行った。次いで、低いMOIの希釈されたファージに、自然宿主細菌を加え、96ウェル培養プレートのウェルに分配した。ファージ感染物を25~37℃で3~16時間インキュベートした。各ウェルの10%をHiBiTアッセイにかけ、上位陽性ウェルを上述のファージ力価アッセイにかけた。組換え/総ファージ力価比が1/30未満になるまで、段階限界希釈集積を行った。
好適な組換え/総力価比に達したら、組換えファージのプラーク単離を行う。個々のプラークを単離し、HiBiT活性についてスクリーニングした。陽性プラークを少なくとも3回継代して純粋にする。完全に単離された組換え体を、大規模感染によって産生し、セシウムまたはスクロース勾配遠心分離によって精製した。
(実施例6)
TSP1.sHiBiT(可溶性非融合HiBiTモノマーを有するTSP1)のファージ濃度最適化
(実施例6)
TSP1.sHiBiT(可溶性非融合HiBiTモノマーを有するTSP1)のファージ濃度最適化
Salmonella typhimurium(ATCC19585)を、TSBにおいて37℃で16~18時間培養した。細胞を希釈して、10、20、50、100、1000、10000、および100,000CFU/mLとした。希釈された細胞100μLを、ピペットで白色96ウェルプレートに移して、1、2、5、10、100、1000、および10000CFU/ウェルとした。各ウェルに、1.2×104~108PFU/mLのTSP1.sHiBitファージ10μLを加えた(表10)。
プレートを37℃で2時間または3時間インキュベートした。50μLのマスターミックス(50μLのアッセイ緩衝液(NanoGlo HiBiT緩衝液)、1μLのNanoGlo HiBit基質、および0.1μLのLgBiTタンパク質)を各ウェルに加え、ニューテイターに載せて室温でインキュベートし、GloMax/Navigatorで1秒間読み取った。2時間のインキュベーションについてのシグナル/バックグラウンド値を図5に示す。3時間のインキュベーションについてのシグナル/バックグラウンド値を図6に示す。3時間のインキュベーション時間は、シグナル/バックグラウンド比が改善されていた。
(実施例7)
可溶性HiBiTペプチドを発現するTSP12であるTSP12.sHiBiTのファージ濃度最適化
(実施例7)
可溶性HiBiTペプチドを発現するTSP12であるTSP12.sHiBiTのファージ濃度最適化
Salmonella bongori(ATCC43975)を、TSBにおいて37℃で16~18時間培養した。細胞を希釈して、10、20、50、100、1000、10000、および100,000CFU/mlとした。希釈された細胞100μLを、ピペットで白色96ウェルプレートに移して、1、2、5、10、100、1000、および10000CFU/ウェルとした。各ウェルに、1.2×104~108PFU/mLのTSP12.sHiBitファージ10μLを加えた(表10)。プレートを37℃で2時間または4時間インキュベートした。50μLのマスターミックス(50μLのアッセイ緩衝液(NanoGlo HiBiT緩衝液)、1μLのNanoGlo HiBit基質、および0.1μLのLgBiTタンパク質)を各ウェルに加え、ニューテイターに載せて室温でインキュベートし、GloMax/Navigatorで1秒間読み取った。4時間のインキュベーションについてのシグナル/バックグラウンド値を図7に示す。3時間のインキュベーションについてのシグナル/バックグラウンド値を図8に示す。4時間のインキュベーション時間は、シグナル/バックグラウンド比が改善されていた。
(実施例8)
TSP12.HiBiT-PS-Socのファージ濃度最適化
(実施例8)
TSP12.HiBiT-PS-Socのファージ濃度最適化
Salmonella bongori(ATCC43975)を、TSBにおいて37℃で16~18時間培養した。細胞を希釈して、10、20、50、100、1000、10000、および100,000CFU/mlとした。希釈された細胞100μLを、ピペットで白色96ウェルプレートに移して、1、2、5、10、100、1000、および10000CFU/ウェルとした。各ウェルに、1.2×104~108PFU/mLのTSP12.HiBit-PS-Socファージ10μLを加えた(表10)。プレートを37℃で2時間インキュベートした。50μLのマスターミックス(50μLのアッセイ緩衝液(NanoGlo HiBiT緩衝液)、1μLのNanoGlo HiBit基質、および0.1μLのLgBiTタンパク質)を各ウェルに加え、ニューテイターに載せて室温でインキュベートし、GloMax/Navigatorで1秒間読み取った。2時間のインキュベーションについてのシグナル/バックグラウンド値を図9に示す。
(実施例9)
TSP12.HiBiT-PS-Socの検出のレベル
(実施例9)
TSP12.HiBiT-PS-Socの検出のレベル
Salmonella bongori(ATCC43975)を、TSBにおいて37℃で16~18時間培養した。細胞を希釈して、10、20、50、100、1000、10000、および100,000CFU/mlとした。希釈された細胞100μLを、ピペットで白色96ウェルプレートに移して、1、2、5、10、100、1000、および10000CFU/ウェルとした。各ウェルに、1.2×107PFU/mLのTSP12-HTSまたはTSP12-HPSファージ10μLを加えた(表10)。プレートを37℃で2時間インキュベートした。50μLのマスターミックス(50μLのアッセイ緩衝液(NanoGlo HiBiT緩衝液)、1μLのNanoGlo HiBit基質、および0.1μLのLgBiTタンパク質)を各ウェルに加え、ニューテイターに載せて室温で10分間インキュベートし、GloMax/Navigatorで1秒間読み取った。シグナル/バックグラウンド値を図10に示す。
Claims (22)
- バクテリオファージゲノムに挿入された指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージであって、前記指標遺伝子は、指標タンパク質のペプチドまたはポリペプチドサブユニットをコードする、組換え指標バクテリオファージ。
- プロテアーゼ切断部位をさらに含む、請求項1に記載の組換えバクテリオファージ。
- 前記ペプチドまたはポリペプチドサブユニットが、第1のサブユニットであって、前記指標タンパク質の第2のポリペプチドサブユニットと相補的である、請求項1に記載の組換えバクテリオファージ。
- 前記指標タンパク質がルシフェラーゼである、請求項1に記載の組換えバクテリオファージ。
- コドン最適化された前記指標遺伝子の上流に、非翻訳領域をさらに含み、前記非翻訳領域は、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む、請求項1に記載の組換えバクテリオファージ。
- 少なくとも2つの異なる型の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物であって、前記組換えバクテリオファージのうち少なくとも1つは、請求項1に記載の指標遺伝子を含む、カクテル組成物。
- 組換え指標バクテリオファージを調製する方法であって、
標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択するステップと、
指標遺伝子を含む相同組換えプラスミド/ベクターを調製するステップと、
前記相同組換えプラスミド/ベクターを標的病原性細菌に形質転換するステップと、
形質転換された前記標的病原性細菌を、選択された前記野生型バクテリオファージに感染させることによって、前記プラスミド/ベクターと前記バクテリオファージゲノムとの間に相同組換えを生じさせるステップと、
組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離するステップと
を含む方法。 - 相同組換えプラスミド/ベクターを調製するステップが、
選択された前記バクテリオファージのゲノムの後期領域にある天然ヌクレオチド配列を決定することと、
前記ゲノムに注釈を付け、前記選択されたバクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を特定することと、
前記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に、相同組換えのための配列を設計することであって、前記配列は、コドン最適化された指標遺伝子を含むことと、
相同組換えのために設計された前記配列をプラスミド/ベクターに組み込むことと
を含む、請求項7に記載の方法。 - 配列を設計することが、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を、前記コドン最適化された指標遺伝子の上流に挿入することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記相同組換えプラスミドが、前記コドン最適化された指標遺伝子の上流に、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を含む、請求項9に記載の方法。
- 組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離するステップが、前記指標遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを含む、請求項9に記載の方法。
- 試料における目的の特定の細菌を検出する方法であって、
前記試料を、指標タンパク質の第1のサブユニットをコードする指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージと共にインキュベートすることによって、前記第1のサブユニットを発現する、所定量の子孫ファージが生成されるステップと、
前記量の子孫ファージを溶解させるステップと、
溶解した前記子孫ファージを、指標タンパク質の第2のサブユニットを含む検出試薬の存在下でインキュベートすることによって、前記第1のサブユニットおよび第2のサブユニットが再構築されて指標タンパク質複合体を形成することを可能にするステップと、
前記指標タンパク質複合体を検出するステップであって、前記指標タンパク質複合体の陽性検出によって、前記試料中に前記目的の特定の細菌が存在することが示されるステップと
を含む方法。 - 前記試料が、食物試料、環境試料、水試料または商品見本である、請求項12に記載の方法。
- 食品安全業界の標準サイズの試料において、わずか10、9、8、7、6、5、4、3、2個または単一の細菌を検出する、請求項12に記載の方法。
- 食物試料が、肉、魚、野菜、卵、乳製品、乾燥食品、または乳児用調乳粉乳を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記試料が、増殖に好適な条件下で、24時間、23時間、22時間、21時間、20時間、19時間、18時間、17時間、16時間、15時間、14時間、13時間、12時間、11時間、10時間、9時間、8時間、7時間、6時間、5時間、4時間、3時間または2時間未満の集積期間をかけて最初にインキュベートされる、請求項12に記載の方法。
- 結果までの合計時間が、26時間、25時間、24時間、23時間、22時間、21時間、20時間、19時間、18時間、17時間、16時間、15時間、14時間、13時間、12時間、11時間、10時間、9時間、8時間、7時間、6時間、5時間、4時間、3時間または2時間未満である、請求項12に記載の方法。
- 前記指標の検出によって生成される、シグナルのバックグラウンドに対する比が、少なくとも2.0または少なくとも2.5である、請求項12に記載の方法。
- 目的の特定の細菌を検出するためのキットであって、指標タンパク質の第1のペプチドまたはポリペプチドサブユニットをコードする指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージを含むキット。
- 検出試薬をさらに含み、前記検出試薬は、
前記第1のペプチドまたはポリペプチドサブユニットと再構築されて指標タンパク質複合体を形成する、指標タンパク質の第2のポリペプチドサブユニットと、
指標タンパク質複合体と反応させて前記指標タンパク質複合体を検出するための基質と
を含む、請求項19に記載のキット。 - 溶解緩衝剤をさらに含む、請求項19に記載のキット。
- 目的の特定の細菌を検出するためのシステムであって、指標タンパク質のペプチドまたはポリペプチドサブユニットをコードする指標遺伝子を含む組換え指標バクテリオファージを含むシステム。
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