CN101375163B - 用噬菌体检测微观活生物体的装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在原始样品中检测一或多种靶细菌(14)的方法，其中：向原始样品中加入特异于每种靶细菌的噬菌体(18，102)，温育测试样品，并将测试样品与基材接触(64，220)，如果存在噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质，则基材改变颜色。所述基材含有与每种噬菌体特异性结合的抗体(44，228)。向暴露于噬菌体的样品中加入微生物溶菌酶(22)可以裂解测试样品中的细菌。在检测方法前标记(105)亲代噬菌体(102)，这样它们就可以与子代噬菌体(106)分开。在温育方法后噬菌体可解离(94，124)，然后检测样品(99，116)中各个衣壳蛋白(97，72)或噬菌体核酸(74)的存在。本发明可用于(140)测试靶细菌的抗生素抗性。

Description

用噬菌体检测微观活生物体的装置与方法

发明领域

1.发明领域

本发明一般地涉及检测微观(microscopic)活生物体的领域，更具体地涉及利用噬菌体检测细菌。

2.问题陈述

检测微生物的标准微生物学方法依赖于基于基材的分析(substrate-based assay)以检测特异性细菌病原体的存在。见Robert H.Bordner，John A.Winter and Pasquale Scarpino，MicrobiologicalMethods For Monitoring The Environment，EPA Report No.EPA-600/8-78-017，U.S.Environmental Protection Agency，Cincinnati，Ohio，45268，December 1978所述。通常这种技术容易进行，不需要昂贵的供应或实验室装置，并提供高水平的选择性。然而这些方法过慢。基于基材的分析需要先生长或培养纯的靶生物体的培养物，其可能会花费24小时甚至更长，因而这一分析受到限制。这种时间的约束严重限制了对微生物毒力株的存在提供快速反应的有效性。

分子生物学技术很快被认可为标准微生物学检测的有价值的替代方法。血清学方法已广泛应用于评价大量靶微生物基质。见David T.Kingsbury and Stanley Falkow，Rapid Detection And Identification ofInfectious Agents，Academic Press，Inc.，New York，1985和G.M.Wyatt，H.A.Lee and M.R.A.Morgan，Chapman & Hall，New York，1992所述。这些检测都集中于在复杂的生物学混合物中利用抗体首先捕获靶微生物然后将其从其它的组分中分离出来。一旦被分离，这些被捕获的微生物可以被浓缩，无需培养生物分析物即可通过多种不同的技术检测出来。这种方法之一被命名为“免疫磁性分离法”(immunomagneticseparation，IMS)，包括将抗体固定于球形的、微小的磁性或顺磁性珠上，然后用这些磁珠从液体介质中捕获靶微生物。这些珠在磁场的影响下很容易被控制，便于回收和浓缩靶微生物。而且，这些珠的大小和形态微小可以使其均匀散布于样品中，加速珠与靶微生物的相互作用速度。这些良好的性状使分析时间缩短，有助于分析过程流线化，更适用于较高样品通量和自动化操作。

目前与IMS应用的下游检测方法包括ELISA(Kofitsyo S.Cudjoe，Therese Hagtvedt，and Richard Dainty，″Immunomagnetic Separation ofSalmonella From Foods And Their Detection Using ImmunomagneticParticle″，International Journal of Food Microbiology，271(995)11-25)、点印迹分析(dot blot assay)(Eystein Skjerve，Liv Marit Rorvik，andOrjan Olsvick，″Detection Of Listeria Monocytogenes In Foods ByImmunomagnetic Separation″，Applied and Environmental Microbiology，Nov.1990，pp.3478-3481)、电化学发光(HaoYu and John G.Bruno，Immunomagnetic-Electrochemiluminescent Detection Of Escherichia coliO157 and Salmonella typhimurium In Foods and Environmental WaterSamples″，Applied and Environmental Microbiology，Feb.1996，pp.587-562)和流式细胞术(Barry H.Pyle，Susan C.Broadway，and GordonA.McFeters，″Sensitive Detection of Escherichia coli O157：H7 In Foodand Water By Immunomagnetic Separation And Solid-Phase LaserCytometry″，Applied and Environmental Microbiology，May 1999，pp.1966-1972)。尽管这些检测方法提供了令人满意的结果，但是它们做起来很费力，给出“是或否”的二元性反应，这种反应极易出现由于非靶分析物的交叉反应性所出现的假阳性结果。另一种鉴定全细胞微生物的方法是应用IMS结合基质辅助激光解吸/电离(matrix-assistedlaser desorption/ionization，MALDI)飞行时间(TOF)质谱分析法(MS)(Holland etal.，1996；van Barr，2000；Madonna et al.，2000)。

所有这些较新的方法都可以提供比传统微生物学方法更快的结果。然而，它们无法获得基于基材的分析所达到的灵敏水平，且更昂贵，且典型地需要比传统的基于基材的分析更训练有素的技术人员。

近来得到大量关注的其它分子生物学技术是聚合酶链反应方法(PCR)。PCR方法检测一个样品中的特异性微生物包括在样品中提取遗传物质(RNA和/或DNA)、扩增特异于感兴趣的微生物的靶基因序列，然后检测扩增的遗传物质。PCR技术可提供归功于被检测遗传物质的独特性的高选择性、由于靶遗传物质的实质扩增的高灵敏性及归功于潜在的快速扩增过程的快速结果。然而，PCR设备及试剂相当昂贵且需要训练有素的技术人员来进行检测。到目前为止，PCR设备无法获得所期待的灵敏性及特异性。

有些人尝试应用噬菌体感染和/或扩增在基于基材的传统细菌检测方法上作了改进。噬菌体是在自然界进化为利用细菌作为自我复制的方式的病毒。噬菌体通过将自己吸附在细菌上并将自身遗传物质注入细菌内、诱导其复制数十至数千倍的噬菌体。一些称为裂解性噬菌体的噬菌体致使宿主细菌破裂，向外界环境中释放大量的子代噬菌体寻找其它的细菌。噬菌体感染细菌、噬菌体在细菌体内增殖(扩增)及裂解后子代噬菌体释放的全部温育时间依赖于噬菌体、细菌和环境情况可能仅需1个小时这么短。微生物学家已经分离及定性了5000余种的噬菌体种类，包括很多特异性靶向种或者甚至是株水平的细菌的噬菌体。美国专利5,985,596和6,461,833(Wilson)描述了这种基于噬菌体的检测方法。其包括用裂解性噬菌体感染可能含有感兴趣细菌的样品。然后从样品中去除游离噬菌体，靶细菌裂解，接着由子代噬菌体感染第二个细菌，其中第二个细菌倍增时间比靶细菌的短。准备好的样品在培养基上生长，出现噬菌斑提示在原始样品中存在靶细菌。这种方法可以缩短传统基于基材的分析的分析时间，但是这些分析会由于必需的培养温育次数而仍需数小时至数日的时间。这个方法的另一个问题是它只应用于检测这样的细菌，对于所述细菌只存在非特异性的噬菌体且所述非特异性噬菌体感染的是比靶细菌更快倍增的细菌。应用非特异噬菌体会产生与测试样品中的至少第二种细菌交叉反应的可能性。因此，这种基于噬菌体的、噬菌斑分析方法速度不快，仅在可利用适当的非特异性噬菌体时应用，倾向于出现交叉反应问题，且必须在实验室中进行。

其它的细菌病原体检测方法已经完全弃用基于基材的噬菌斑检测方法学。这些方法多数利用已被lux基因进行遗传修饰的噬菌体，lux基因仅在样品中有靶细菌存在且随后被修饰的噬菌体感染时表达。美国专利4,861,709(Ulitzur)是一个典型的例子。特异感染靶病原体的噬菌体被修饰为包括lux基因。当修饰的噬菌体加入含有靶细菌的样品中时，噬菌体感染细菌，细菌中产生萤光素酶，发出光。美国专利5,824,468(Scherer等)描述了一个类似的方法。除了产生萤光素酶的基因标记，Scherer等描述了表达为可检测蛋白或核酸的基因标记。美国专利5,656,424(Jurgensen等)描述了一种方法，利用萤光素酶(或β-半乳糖苷酶)报道噬菌体来检测分枝杆菌。它进一步描述了检测抗生素敏感性。美国专利6,300,061(Jacobs Jr.等)也描述了另一种用遗传修饰的噬菌体检测分枝杆菌的方法，这种方法在细菌感染后产生几个报道分子之一，包括萤光素酶。美国专利6,555,312B1(Nakayama)描述了一种方法，其利用产生荧光蛋白标记物而不是发光标记的基因。所有这些方法都是应用噬菌体在感染细菌体内扩增来完成。对于样品中被感染的每一个靶细菌来讲，在子代噬菌体产生的过程中标记基因被表达多次。美国专利6,544,729(Sayler等)增加了一个额外的扩增过程。噬菌体DNA被修饰为包括lux基因。一个生物报道(bioreporter)细胞也被修饰为包括lux基因。遗传修饰的噬菌体和生物报道细胞被加入样品中。如果噬菌体感染靶细菌，靶细菌被诱导不仅产生萤光素酶而且产生酰基高丝氨酸内酯N-(3-氧己酰基)高丝氨酸内酯(AHL)(acylen homoserine lactone N-(3-oxohexanoyl)homoserine lactone)。AHL进入生物报道细胞，刺激产生额外的荧光及额外的AHL，这些额外的AHL又会进入额外的生物报道细胞从而产生更多的荧光。因此，噬菌体感染靶细菌引发了扩大的光信号。大体上，采用遗传修饰噬菌体的所有这些方法可以：1)高选择性，因为其利用选择性感染的噬菌体；2)高灵敏性，因为标记基因产物可在低水平被检测；以及3)结果比基于基材的方法快，因为信号在一个或两个噬菌体感染循环中检测。它们有两个非常显著的缺点。第一，它们价格昂贵、实施困难，因为对于每一个需要检测的病原体都需要合适的噬菌体被遗传修饰。第二，它们通常都需要装置来检测标记信号(光)，提高了利用遗传修饰噬菌体检测的费用。

美国专利5,888,725(Sanders)描述了利用非修饰的、高特异性裂解性噬菌体感染样品中靶细菌的方法。噬菌体诱导的裂解从细菌中释放出某些核苷酸，如ATP，其可用已知技术检测。噬菌体感染后检测出样品中增加的核苷酸浓度可显示样品中存在靶细菌。美国专利6,436,661B1(Adams等)描述了一种方法，即用噬菌体感染和裂解样品中的靶细菌，释放出胞内酶，其可与固定的酶底物反应，从而产生可检测的信号。尽管这些方法有未修饰噬菌体的优势，但是它们并不能从噬菌体扩增过程中获得任何益处。检测的标记物(核苷酸或酶)的浓度与样品中靶细菌浓度直接呈正比。

美国专利5,498,525(Rees等)描述了一种病原体检测方法，其使用未修饰的噬菌体和噬菌体扩增来增加检测信号。这种方法要求向样品中加入高浓度的裂解噬菌体，样品要温育足够长的时间以使得噬菌体感染样品中的靶细菌。在裂解前，处理样品以除去、破坏或者失活样品中的游离噬菌体而不影响子代噬菌体在被感染的细菌中的复制。如果需要，接着继续处理样品以中和以前加入到样品内的抗病毒剂的作用。裂解释放的子代噬菌体用子代噬菌体的直接检测方法检测或者通过使用遗传修饰的生物报道细菌产生显示样品中存在子代噬菌体的信号来检测。在任一种情况中，被检测的信号都与子代噬菌体的数量而非原始样品中靶细菌的数量呈比例，并因此由于噬菌体扩增而增强。这种方法的一个重要的缺点是它需要将处理样品中的游离噬菌体破坏、除去或者失活，随后逆转杀病毒状态以便于子代噬菌体在裂解后存活。这些额外的过程使得利用该方法变得复杂而且更加昂贵。

所需要是同时具备基于基材的分析的灵敏性、简便性和/或低成本及通过分子生物学诊断检测方法提供的快速结果的检测方法。

发明概述

本发明通过利用噬菌体扩增的原理提供检测活微生物的方法和装置解决了上述问题和现有技术的其它问题。在一个优选的实施方案中，将对靶微生物具有特异性的噬菌体导入需检测的样品中。被导入的噬菌体量优选地是低于噬菌体检测限度的量。如果靶微生物存在，噬菌体感染微生物并在其体内增殖。优选地，微生物被裂解，这是噬菌体增殖或者是通过主动裂解过程的自然结果，例如如果微生物是细菌，则使用细菌溶菌酶。在一个优选的实施方案中，噬菌体优选通过加入噬菌体解离剂而解离。另一个实施方案中，亲代噬菌体被标记以便于它们可以在检测过程前被物理除去或与子代噬菌体分离开，从而增加该方法的潜在灵敏性和/或降低总分析时间。然后检测样品中的噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质。如果有任何噬菌体或生物学物质被检测到，那么显示靶微生物存在。如果没有噬菌体或生物学物质被检测到，那么显示靶微生物不存在。由感染、复制和裂解组成的整个温育过程仅需要几分钟。所有的前述实施方案可以用于确定细菌或其它微生物的抗生素抗性或敏感性。噬菌体或生物学物质可以以任何适当的方式被检测，比如用侧向流动条(lateral flow strip)、SILAS表面或者通过MALDI质谱仪。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了在待测样品中检测微生物是否存在的方法，该方法包括：将样品与能感染靶微生物的亲代噬菌体组合以产生暴露于噬菌体的样品；对暴露于噬菌体的样品提供条件，所述条件足以允许噬菌体感染靶微生物并在靶微生物体内增殖产生子代噬菌体；及产生可用于检测的解离的噬菌体物质；及分析暴露于噬菌体的样品以确定噬菌体物质的存在与否，以做为样品中是否存在靶微生物的指示。在上述概述中，应理解的是噬菌体物质可以是解离的(dissociated)噬菌体物质，同时也可以是与噬菌体相关的。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了检测被测样品中是否含有微生物的方法，该方法包括：将样品与能感染靶微生物的亲代噬菌体组合以产生暴露于噬菌体的样品；(b)对暴露于噬菌体的样品提供条件，所述条件足以允许噬菌体感染靶微生物并在靶微生物体内增殖，以在暴露于噬菌体的样品中产生可检测量的噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质；(c)主动裂解微生物；和(d)分析暴露于噬菌体的样品，检测噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质是否存在以便确定靶微生物的存在情况。优选地，主动裂解包括向暴露于噬菌体的样品中加入微生物溶菌酶。优选地，主动裂解包括选自如下一组的方法：向暴露于噬菌体的样品中加入氯仿、用酸处理暴露于噬菌体的样品、及对暴露于噬菌体的样品进行物理加工。

优选地，上述方法通过使用其中扩增的噬菌体在基材上产生颜色变化的装置和方法来实施。在这个优选的实施方案中，本发明提供了检测靶微生物的装置，该装置包含：基材、基材上的固定区，固定区包含设计为固定噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质的固定剂，及设计为与噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质相互作用的颜色调节剂(moderator)，从而噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质的存在会引起固定区变色。优选地，固定区包含抗体。优选地，颜色调节剂包含着色珠(colored beads)。另一个实施方案中，颜色调节剂包含反应剂和酶，其在反应时形成沉淀。在相应方法的优选实施方案中，暴露于噬菌体的样品被施加于一种基材，如果在所述暴露于噬菌体的样品中存在噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质，那么该基材的至少一部分改变颜色。

本发明也提供了确定待测样品中是否存在靶微生物的试剂盒，该试剂盒包括：第一个容器，其含有可感染靶微生物的噬菌体；和一种基材，如果在暴露于噬菌体的样品中存在噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质，则该基材的至少一部分会发生变色。优选地，该试剂盒还包括含有缓冲液的第二个容器。优选地，基材包括侧向流动条或SILAS表面。优选地，第一个容器包括设计用来释放预定大小的液滴的点滴器(dropper)。

本发明也提供了制造微生物、优选细菌检测基材的方法，该方法包括：提供一种基材和能够附着于噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质的生物学材料；在基材上形成生物学材料带；及以与该带基本垂直方向切割基材，形成检测基材。优选地，基材是一种多孔膜。优选地，生物学材料是一种抗体。

本发明的一个目的是提供一种检测微生物的噬菌体扩增方法，其中在暴露于噬菌体的样品中亲代噬菌体不被破坏、除去、中和或失活。

本发明的一个目的是提供高特异性的细菌检测方法。

本发明进一步的目的是提供广谱的细菌检测方法。

本发明的另一个目的是提供能够用于在低浓度下检测细菌的细菌检测方法。

本发明的另外目的是提供可以在很大的浓度范围内检测细菌的细菌检测方法。

本发明的另一目的是提供比多数现有的检测方法更快速得到结果的细菌检测方法。

本发明的另外目的是提供比现有的细菌检测方法更廉价的细菌检测方法。

本发明的另外目的是提供容易操作的、不需要高度训练有素的技术人员或复杂的装置的细菌检测方法。

本发明的另一目的是提供可以在野外或现场实时进行的细菌检测方法。

本发明的另一目的是提供易于多重化(multiplexed)的细菌检测方法，以便在一个测试样品中检测出多种细菌。

本发明的另外目的是提供用特异的噬菌体生物标记物作为检测样品中存在的靶细菌的替代检的细菌检测方法。

本发明的另外目的是提供利用高特异性的噬菌体感染靶细菌来检测样品中存在靶细菌的细菌检测方法。

本发明的另外目的是提供用于检测其中存在适宜噬菌体的任何细菌的细菌检测方法。

本发明的另外目的是提供利用非遗传修饰噬菌体的细菌检测方法。

本发明的另外目的是提供利用遗传修饰噬菌体的微生物检测方法。例如，噬菌体被遗传修饰后增强感染过程中需要的特性、过表达可检测的生物标记、表达一种酶或在衣壳蛋白中表达靶。

本发明的另一目的是提供利用噬菌体扩增作为获得高灵敏性的手段的一种细菌检测方法。

本发明的另一目的是提供一种细菌检测方法，其中通过检测与噬菌体相关的特异生物标记物例如噬菌体的衣壳鞘(capsid sheath)来检测噬菌体。

本发明的另一目的是提供一种细菌检测方法，其中噬菌体生物标记物是来自噬菌体的单独的、解离的蛋白质。

本发明的另一目的是提供一种细菌检测方法，其中噬菌体生物标记物为噬菌体核酸。

本发明的另一目的是提供一种细菌检测方法，其利用在检测方法前包括解离噬菌体的第二次扩增过程。

本发明的另外目的是提供一种细菌检测方法，其利用标记的亲代噬菌体，该标记的亲代噬菌体可以与产生于噬菌体扩增的子代噬菌体相区分。

本发明的另一目的是提供用抗体结合噬菌体生物标记物产生抗体—噬菌体复合物的细菌检测方法。

本发明的另一目的是提供一种细菌检测方法，其利用现有的免疫分析技术检测特异的抗体-抗原结合作为检测抗体—噬菌体复合物的一种手段，从而检测样品中存在的靶细菌。

本发明的另一目的是提供利用侧向流动条检测噬菌体从而检测样品中存在的靶细菌的细菌检测方法。

本发明的另一目的是提供检测抗生素抗性细菌菌株的方法。

上述概述意在例证本发明的目的、特征、优点等的实施例，由此更好理解本发明。在本发明的一些实施方案中，所述目的中可能只有一个被实现，在其它的发明中多数的这种目的会实现。然而上述目的是举例性的，不是全部，因而可能在特殊的实施方案中，上述目的无一被实现。例如，本发明的方法和装置不仅可以检测细菌而且可以检测微生物，如真菌、支原体、原生动物和其它微观活生物体。因此，在上述目的中“细菌”这个词更多的被更广义的术语“微生物”所取代，表达出本发明的目的。本发明大量的其它的特征、目的和优点将会在阅读说明书和相关的附图时表现得更明显。

附图说明

图1阐明本发明的第一个实施方案，其中噬菌体被加入样品，使得样品中出现低于检测限度的初始浓度。

图2阐明噬菌体感染、扩增和细胞裂解的温育过程。

图3A、3B和3C阐明侧向流动装置(lateral flow device)在待检样品中检测噬菌体的用途。

图4是图3A流动装置的侧向横断面图。

图5是噬菌体的图解。

图6阐明了本发明的第二个实施方案，其中噬菌体被加入样品，使得样品中出现低于检测限度的初始浓度，并且解离噬菌体以检测噬菌体亚组分生物标记物。

图7阐明第三个实施方案，其中标记的噬菌体被加入样品中。

图8阐明本发明的第四个实施方案，其中标记的亲代噬菌体被加入样品中，子代噬菌体被解离，以检测噬菌体亚组分生物标记物。

图9阐明用本发明检测抗生素抗性细菌。

图10阐明噬菌体扩增过程。

图11是MALDI光谱，显示噬菌体T4的质量：强度，阐明一些可能的生物标记物。

图12-16阐明利用SILAS表面的基于噬菌体的分析过程。

图17阐明图12-16分析的阴性结果。

图18阐明图12-16分析的阳性结果。

图19展示本发明的检测试剂盒。

图20展示使用图19的检测试剂盒的示例性说明书以及阐明检测试剂盒的用途。

图21阐明了依照本发明使用遗传修饰的噬菌体提高感染过程所需特性的示例性分析。

图22阐明了依照本发明使用遗传修饰的噬菌体过表达可检测生物标记物的示例性分析。

图23阐明了依照本发明使用遗传修饰的噬菌体表达一种酶的示例性分析。

图24阐明了依照本发明使用遗传修饰的噬菌体在衣壳蛋白上表达靶的示例性分析。

优选实施方案详述

1.介绍

本发明的方法依赖于利用噬菌体来检测样品中靶微观活生物体(微生物)例如细菌的存在。在本发明中，术语噬菌体包括噬菌体(bacteriophage)、噬菌体(phage)、分枝杆菌噬菌体(mycobacteriophage)(例如TB或para TB噬菌体)、真菌噬菌体(mycophage)(例如真菌的噬菌体)、支原体噬菌体和其它指代一种能够侵犯活的细菌、真菌、支原体、原生动物和其它微观活生物体并利用它们自我复制的病毒的术语。这里“微观(microscopic)”指最大的尺寸是1mm或更小。噬菌体是指在自然状况下演化为利用细菌进行自我繁殖的病毒。噬菌体将自己附着到细菌、并将其DNA注入细菌内、诱导其复制上百至上千倍的噬菌体。一些噬菌体，叫做裂解性噬菌体，导致宿主细菌破裂，将子代噬菌体释放到环境中来寻求新的细菌。噬菌体感染细菌、在细菌内增殖或扩增直至裂解细菌的全部温育时间仅几分钟至几小时，这个时间依赖于被讨论的噬菌体、细菌和环境状况。

本发明的方法是集特异性、灵敏性、简单性、速度和/或成本优于任何目前已知的微观生物体检测方法于一身的检测方法。这里讲述的方法依赖于利用噬菌体在样品中间接检测一或多种靶细菌的存在。典型的噬菌体70，在这里为MS2-大肠杆菌(MS2-E.coli)在图5中示出。在结构上，噬菌体70包含蛋白外壳或衣壳72，有时也指头部，其包装病毒核酸74，即DNA和/或RNA。噬菌体可能也包括内部蛋白(internal proteins)75、颈(neck)76、尾鞘(tail sheath)77、尾纤维(tail fiber)78、终板79和pin 80。衣壳72由一个或多个蛋白重复拷贝构成。图10中提及当噬菌体150感染细菌152时，它将自己附着在细菌壁或膜151上的特定位点并将其核酸154注入细菌内，诱导其复制数十至数千拷贝的噬菌体。这个过程在图10的原理图中显示。DNA发展为早期mRNAS 155及早期蛋白156，它们中的一些沿着线157成为膜成分，另外一些利用宿主染色体159的细菌核酸酶沿着线164成为DNA前体。其它沿着方向170迁移变为头部前体，其将沿着线166掺入DNA。膜成分沿着途径160发展形成鞘、终板和pin。其它蛋白沿着途径172发展形成尾纤维。头部一旦形成即从膜151释放，沿着途径174结合尾鞘，然后尾鞘和头部在176结合尾纤维形成噬菌体70。一些称作裂解性噬菌体的噬菌体如180所示使宿主细菌破裂，释放子代噬菌体到环境中来寻求其它的细菌。裂解性噬菌体典型地用于本文所述的方法中。然而，非裂解性噬菌体也可被应用，特别是如果当子代噬菌体感染宿主细菌后它们或细菌可被激活释放子代噬菌体或子代噬菌体的一部分。

噬菌体感染细菌、在细菌内噬菌体增殖或扩增直至裂解细菌的全部循环时间仅几分钟至几小时，这依赖于被讨论的噬菌体和细菌以及环境状况。例如，MS2噬菌体感染大肠杆菌菌株，在附着于靶细胞后的40分钟内即可产生10,000到20,000个自身的拷贝。MS2噬菌体的衣壳包含180个同样蛋白的拷贝。这就意味着对于每一个被MS2感染的大肠杆菌，1.8×10⁶个以上的单独衣壳蛋白被产生。因此噬菌体感染过程称为噬菌体扩增，其中每次感染时产生大量噬菌体以及同样大量的衣壳蛋白。

微生物学家已经分离和定性了数千种的噬菌体种类，包括大多数人类细菌病原体的特异噬菌体。存在着感染细菌科、个别种甚至是特异株的个别噬菌体。表1列举了一些这样的噬菌体及它们感染的细菌。

表1

本发明利用了噬菌体已有的特性，例如高特异性的噬菌体—细菌感染、噬菌体扩增和短温育时间，产生的细菌检测方法对靶细菌高度特异、非常灵敏、快速、简便易操作，和/或非常经济。此外，不像是其它基于噬菌体的细菌检测方法，这里介绍的优选方法是利用未经遗传修饰而包括生物报道基因和诱导物基因的噬菌体。利用这种方法可以大大降低特异细菌检测的时间及成本。

2.详细描述

图1说明了利用本方法检测样品中特异细菌的第一个实施方案10。在第一个“加入噬菌体”的过程12，将感染靶细菌14的亲代噬菌体18与细菌14的原始样品11组合。在这个优选的实施方案中，将噬菌体优选制成悬浊液或溶液16，加入预定浓度的细菌14的原始样品11中。这里，“原始样品(raw sample)”这个术语指加入噬菌体前的样品。原始样品/噬菌体组合在这里指“测试样品24”或“暴露于噬菌体的样品24”。如果该方法的目的是检测物种或株水平的特异性细菌，体的样品24”。如果该方法的目的是检测物种或株水平的特异性细菌，那么本方法将使用相对特异的噬菌体。例如，

A1122噬菌体可以用于特异性检测鼠疫耶尔森氏菌。相反，较低特异性的噬菌体可以用来检测样品中较宽范围的细菌。MS2噬菌体可以感染许多不同种类的大肠杆菌菌种以及肠道球菌，因此非常适于检测水的排泄物污染。

为检测多种细菌，与每一个靶细菌相关的一个噬菌体物种被加入到原始样品中，得到一个单一的待测样品，这个样品中含有所有的靶细菌和相关的噬菌体。为了简单起见，本方法此后将描述为用于检测单一细菌。本领域技术人员会清楚该方法的每个程序是如何同时在一个测试样品中利用独特的细菌/噬菌体组合来检测每种靶细菌的。

含有靶细菌14的原始样品11通常是液体形式，但是也可以是固体或粉末形式。原始样品可能是含有许多不同有机化合物和无机化合物的混合物或悬浮液。它可能已经经过多种方式的预处理以备检测。例如，原始样品可能已经被提纯或过滤以除去不必要的成分或浓缩靶细菌。它也可能在培养基中培养以利于靶细菌的温育或诱导靶细菌进入更有活力的状态。原始样品也许处于相对未处理的状态，例如可能是唾液、血液或水样。本领域技术人员清楚预测试样品制品可能包括多种适宜的方法之一，原始样品可能是多种不同的形式。

噬菌体自身可能以多种不同的形式被加入样品中。它可能以干的状态被加入。噬菌体可能被混合或悬浮于液体试剂混合物中。它可能在原始样品加入的小瓶内悬浮。它也可能采取任何其它的适当形式。这里加入到原始样品中的噬菌体指“亲代噬菌体”。

回到图1，待测样品24被温育，优选温育一段预定的时间。对于这种方法，在温育过程前待测样品应该优选处于有利于噬菌体感染靶细菌的条件下。本领域技术人员熟知多种完成这个程序的方法。例如，亲代噬菌体可与一种试剂混合，当被加入原始样品中时，导致待测样品易于被感染。待测样品可通过多种不同方法预备，以确定利于噬菌体感染的条件。

温育过程20在图2中显示。亲代噬菌体18通过将自身附着于靶细菌壁并注入病毒核酸来产生感染细菌23来感染32靶细菌14。如图10所示，子代噬菌体在宿主细菌内复制。如果应用裂解性噬菌体，宿主在裂解过程36中被破裂，释放子代噬菌体37进入待测样品，在那里它们可以感染其它靶细菌。这个温育过程可能进行一个或多个感染、扩增和裂解循环。假设在原始样品中有靶细菌，那么在温育过程中，对于每一种感染的细菌，待测样品会含有大量的子代噬菌体。

温育过程结束时，一些被感染的靶细菌可能未被裂解。在这种情况下，很多或者甚至全部的子代噬菌体将仍然保留在宿主细菌内，因此不能被直接检测。为了解决这个潜在的问题，如图1所示，进行一个任选的方法21和25裂解细菌，通过向待测样品21中加入特定微生物的微生物溶菌酶22，在方法25引起待测样品24中存在的基本所有特定微生物例如细菌的细胞壁破裂，从而释放其中含有的基本所有子代噬菌体。微生物的应用，或者更具体地，细菌溶菌酶的应用可以缩短进行本文所述方法所费的时间，因为不需要等候靶细菌自动裂解。对于较慢温育的噬菌体，这可能产生实质性差异。对于本发明的目的，术语“溶菌酶”应该指通过其可使微生物宿主被诱导破裂、因而释放子代噬菌体进入待测样品中的任何物质、装置或方法，包括但不限于化学手段，如传统的溶菌酶、氯仿或酸处理或者是物理方法，如改变渗透压。

方法28，检测噬菌体，即图1中阐明的实施方案，包括检测与噬菌体相关的生物标记物。如果这个生物标记物被检测到，那么间接的证实原始样品中存在靶细菌。对于本方法的实施方案，加入到原始样品中的亲代噬菌体和子代噬菌体(若在温育过程中产生的话)是相同的。这意味着，即使待测样品中没有靶细菌，在检测方法28的过程中仍会有噬菌体存在，这样能产生相关的背景信号。解决这个问题的一个方法是控制待测样品中起始的亲代噬菌体的浓度，这样它们产生的背景信号在检测方法28中就不会被检测到。因此，如果待测样品中无靶细菌存在，就不会出现噬菌体扩增，在结束实验时就不会有可检测的信号。较高浓度的亲代噬菌体仍然可被使用，只要背景信号可与亲代加子代噬菌体联合产生的信号相区分。方法28中产生的信号可与背景信号区分开的最低的细菌浓度代表本方法的灵敏性限度。做到这样的最简便的方式是在已知无靶细菌存在的参考样品上进行检测。这样产生了可与待测样品的相应结果比较的参考结果。如果待测样品的检测结果明显显示出比参考样品高的信号水平，那么说明靶细菌存在。

为了本发明的目的，任何与噬菌体相关的生物标记物都可以用来作为间接检测原始样品中靶细菌的手段。这包括了在图5和10所示的噬菌体任何部分。例如图11展示了噬菌体T4的MALDI光谱200，表示相对于质量(mass)的百分比强度的图谱。光谱200显示了明显的裂解holin蛋白峰201，头部蛋白峰204，hoc外衣壳蛋白峰206，和纤维蛋白(fibritin)峰208。这些大的峰暗示出在MALDI检测方法中这些噬菌体部分都可以用作生物标记物，这些我们将在下面讨论。一个非常有用的噬菌体生物标记物是噬菌体衣壳72。这个衣壳包含一个或多个蛋白的很多拷贝，经常超过一百。因此在每个噬菌体颗粒周围都有多个同样的结合位点，这可以用于检测目的。这可以增加来自于待测样品中含有的每一个噬菌体颗粒的潜在信号。检测噬菌体或与噬菌体相关的生物标记物不同于直接检测与裂解的靶细菌结合的生物标记物，其优点是大大增加了灵敏性。在温育的待测样品中，噬菌体的浓度因为噬菌体扩增要远高于原始样品中靶细菌的浓度。噬菌体扩增可以与使得原始样品中存在的每一个细菌相关的信号增大好几个数量级，即10的次方。因此，与那些不采用噬菌体扩增的方法相比，用本方法可以检测较低浓度的细菌。

任何检测这些与噬菌体相关的生物标记物的方法或装置都可以满足这个方法28。优选的方法是利用抗体结合事件产生可检测信号的免疫分析方法，包括ELISA、流式细胞术、western印迹、基于aptamer的分析、放射免疫分析、免疫荧光和侧向泳动免疫层析法(LFI)。其它的方法是基质辅助激光解吸/电离和飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)，这里称为MALDI，以及应用可以改变颜色的SILAS表面的作为检测指示剂。一种免疫分析方法LFI在下面连同图3、5和19一起详细讨论；SILAS颜色指示剂方法在下面连同图12-18一起详细讨论；MALDI方法连同图11和24-27一起详细讨论。

图3阐述任何用侧向流动条40进行LFI检测待测样品中噬菌体的存在。图4显示侧向流动条40的横断面视图。优选地，侧向流动条40包括加样垫(sample application pad)41，结合垫(conjugate pad)43，形成检测线46和内部对照线48组成的基材64，和吸收垫(absorbentpad)52，全部安装在背板(backing)62上，优选背板是塑料。基材64优选是多孔网或膜。它是在很长的基材薄片上由形成线43、46和任选的线48组成，然后在与这些线垂直的方向切割基材，形成多个基材64。结合垫43含有着色珠45，这些着色珠每一个都与第一抗体44缀合，这里指的是第一抗体，形成第一抗体—珠缀合物42。第一抗体44选择性地与待测样品中的噬菌体51结合。检测线46和控制线48都是反应物线且各自形成固定区；即，它们含有一种材料，这种材料可以适当方式与噬菌体或其它生物学标记物相互作用。在一个优选的实施方案中，这种相互作用是固定噬菌体或其它生物学标记物的相互作用。检测线46包含固定的第二抗体47，具有沿条(strip)流动方向垂直的抗体线46，密度足够在流体中捕获噬菌体的显著部分。第二抗体47也特异结合噬菌体51。第一抗体44和第二抗体47可能一样或也可能不一样。这两个可能是多克隆或单克隆抗体。任选地，条40可能包括第二反应物线48，其包括第三抗体49。第三抗体49可能与或不与一个或多个第一抗体及第二抗体一样。第二反应物线48可能作为内部对照带检测分析功能是否适当。

一或多滴待测样品50如图3A所示加入样品垫内。待测样品50优选含有亲代噬菌体，及在原始样品中若含有靶细菌则还含有子代噬菌体。待测样品沿侧向流动条40向条另外一端的吸收垫52流动。当噬菌体颗粒沿着结合垫向膜流动时，它们遇到一个或多个第一抗体—珠缀合物42，形成噬菌体—珠复合物54，如图3B所示。当噬菌体—珠复合物流过第二抗体47的行(row)46时，它们形成了固定的、浓缩的第一抗体—珠—噬菌体—第二抗体复合物58，如图3C所示。如果足够的噬菌体—珠复合物结合固定的第二抗体的行46，那么肉眼即可见到色彩线59。可视线59显示原始样品中存在靶细菌。若这条线未形成，那么靶细菌在原始样品中不存在或浓度过低而不能用侧向流动条40检测到。对于该检测方法的可靠性，需要向原始样品中加入的亲代噬菌体浓度足够低，以至于亲代噬菌体单独不能足够产生侧向流动条上的可视线。抗体—珠缀合物45是颜色调节剂，它设计为与噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质相互作用。当它们固定在固定区46时，其引起固定区改变颜色。

图6阐述了依据本发明检测靶细菌方法的第二个实施方案90，本方法90提高了灵敏性。方法12、20和任选方法21由加入噬菌体、温育和裂解细菌组成，这与图1中描述的相关过程是相同的。在任选方法21之后，如果原始样品中含有靶细菌，那么待测样品会有大量的噬菌体颗粒。

如图6所示，第二实施方案90的方法94，解离噬菌体，包括向待测样品中加入噬菌体解离剂92。噬菌体解离剂92破坏噬菌体变成其组成成分97，包括各个衣壳蛋白和病毒核酸。噬菌体解离剂的例子是酸处理、尿素、变性剂和酶。任何适当的噬菌体解离剂均可应用。在这个方法中，产生了解离的噬菌体物质97。

图6中阐明实施方案的方法99，检测噬菌体亚成分，包括检测生物标记物，即解离的噬菌体物质97，与解离的噬菌体亚成分结合。关于前述讨论，可以理解噬菌体物质既可以是解离的噬菌体物质同时也可以与噬菌体结合。即，短语“解离的噬菌体物质”意味着不再是整个噬菌体一部分的物质，然而术语“与噬菌体相关”意味着该物质同时是噬菌体一部分或是在噬菌体复制的过程中产生的。由于噬菌体解离剂在方法94中的应用，在方法99中即可检测到大量的单独的衣壳蛋白97。像第一个实施方案一样，这些可以用已有的基于抗原抗体的免疫分析技术检测。除此之外，暴露的病毒遗传物质可以用其它已存在的技术检测，包括PCR、基因探针生物传感器、photoaptamers、分子信号(molecular beacons)或凝胶电泳。任何适当的噬菌体生物标记物检测方法和装置都可以使用。

保持亲代噬菌体在待测样品中的浓度在背景检测限度以下有利于简化试验方法：向原始样品中加入噬菌体，温育，然后检测噬菌体生物标记物。然而，仍存在潜在的缺点。亲代噬菌体潜在的低浓度可能导致测试样品中亲代噬菌体与靶细菌的比例小于1的状况，即感染复数(MOI)低。为了确保待测样品中所有靶细菌具有被感染的高可能性，方法20的温育时间可以延长，例如，时间为两个或几个感染和裂解循环。因此，检测简便性由于潜在的较长的检测时间而抵销。如果与亲代噬菌体相关的信号可以被去除或显著降低，即可克服这个潜在的限制，可以利用较高浓度的使亲代噬菌体-MOI’s大于5。如果子代噬菌体的信号提高那么也可以克服这个问题，例如用衣壳蛋白作为生物标记物或者利用遗传增强的噬菌体，这两种方法在这里都被详细描述。

图7阐述了本发明检测样品中靶细菌的方法的第三个实施方案100，其中可以更快速的获得结果。在本发明的这个实施方案中，与原始样品组合的亲代噬菌体102被标记，在104指出标记符号，这样接下来它们就可以在分析前从待测样品中移出，从检测噬菌体的待测样品部分中分离出来，或者另外被中和，以便未标记的子代噬菌体产生检测信号。例如，在一个实施方案中，生物素酰化的噬菌体用作亲代噬菌体。生物素酰化的噬菌体被强力附着于链霉抗生物素蛋白。随后应用这种强亲和力从测试样品中分离标记的亲代噬菌体，如下所述。标记的亲代噬菌体也可以附着于物理基材，如通过包被探针或具有亲代噬菌体的网状结构或通过化学结合噬菌体在基材上。通过从待测样品中移出基材或在从移出基材分离出的那部分测试样品中检测噬菌体来从子代噬菌体中分离标记的噬菌体。

方法105、107和108，加入噬菌体，温育和裂解细菌，分别与图1和图6中的方法12、20和21一样，除了在方法105中加入原始样品中的亲代噬菌体103溶液含有标记的噬菌体102之外，这样暴露于噬菌体的样品109既含有细菌外的标记噬菌体102又含有细菌内的未标记子代噬菌体106。因此，裂解溶液112同时含有标记和未标记的噬菌体。在方法114即提取标记噬菌体中，通过提取或者将标记的亲代噬菌体从测试样品中分离出来或者将亲代噬菌体从子代噬菌体中分离出来而从子代噬菌体中分离标记的亲代噬菌体，以便它们不会产生分析信号。如果标记的亲代噬菌体在方法105加入到原始样品时附着于物理基材，那么优选将这个基材和相关的亲代噬菌体从方法114的测试样品中去除。那些未附着于物理基材上的生物素酰化的噬菌体也可以很容易从待测样品中分离或去除。在一个实施方案中，链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠被加入到待测样品中，其中它们迅速聚集生物素酰化的亲代噬菌体。然后用一个磁体从测试样品中聚集和移出磁性珠及结合的亲代噬菌体。相关的磁性提取见下面图28的介绍。同样，在另一个实施方案中，链霉抗生物素蛋白包被网通过待测样品被搅动，从待测样品中收集基本所有的生物素酰化的亲代噬菌体。也可以使用其它非网的物理基材和探针。在另一个实施方案中，侧向流动装置被应用。在利用抗体条46前先将链霉抗生物素蛋白注入网状基材64的部分66(图4)，包被网状纤维。链霉抗生物素蛋白包被网通过将亲代噬菌体在其到达抗体条46前将其结合到部分66来聚集和固定标记的亲代噬菌体。子代噬菌体不结合链霉抗生物素蛋白，因此自由流过条而被检测到。同样，侧向流动装置的其它部分也可以包被或注入链霉抗生物素蛋白，例如滴入测试样品的样品垫41。

这里描述的方法并不限于标记亲代噬菌体及随后在待测样品中将它们移出或分离的这些例子。

图7中阐述的本实施方案的方法116，检测噬菌体，即分析待测样品以检测作为靶细菌在原始样品中存在标志的、与子代噬菌体相关的生物标记物。这个实施方案所用的检测方法分别与实施方案10和90的方法28和29所述的那些相同，如图1和6所述。作为较早的实施方案，任何适当检测方法和装置都可使用。

图8阐述了检测样品中靶细菌方法的第四个实施方案120，其中方法120会更快速的获得结果而且提高灵敏性。实施方案120是已讲述的实施方案90和100的组合。方法105、107、108和114分别与实施方案100和图7的阐述那些一致，即加入噬菌体、温育、任选裂解细菌和提取标记噬菌体。特别地，实施方案120在方法105整合了标记的亲代噬菌体以及在方法114整合了移出或分离亲代噬菌体。

方法121，解离噬菌体，噬菌体解离剂122被加入到待测样品124中，如实施方案90的方法94及图6中所述。在一个优选的实施方案中，在方法114将标记的亲代噬菌体自待测样品中物理去除，而不是简单的分离，这样它就不会在方法121中暴露于噬菌体解离剂。因此，待测样品124仅含有子代噬菌体，解离的待测样品126中含有只来自于子代噬菌体的生物学标记物，如衣壳蛋白128。这样，解离噬菌体衣壳蛋白128相关的扩增将组合方法107的噬菌体扩增，导致更高的总体扩增。例如，如果每个细菌的噬菌体扩增过程产生1000倍的扩增及噬菌体具有100个拷贝的特定衣壳蛋白，那么待测样品中每个被感染的靶细菌的组合扩增会是10³×10²或10⁵。如果亲代噬菌体未被去除，那么总体扩增只是方法107的噬菌体扩增；即10³，因为来自解离噬菌体的扩增不仅发生在亲代噬菌体而且发生在子代噬菌体，因此会抵偿第二次扩增过程。

图6所示的实施方案120的检测噬菌体亚成分方法130优选与前述实施方案的方法28、99和116相同。

图9阐述了方法140，通过其本发明的任何实施方案都可以检测靶细菌，如果靶细菌存在，确定它是否对一或多种抗生素有抗性。可能含有靶细菌的样品142被分为两部分，第一个样品A，由144表示，第二个样品B，由145表示。第一种抗生素146被加入到样品B中，如果样品B中的靶细菌对第一种抗生素无抗性的话，那么它们会被杀死。接着样品A和B在148和149被分析，来检测每一个样品中的存活靶细菌，得到结果A和结果B。本发明教导的任何方法都可以用于这个分析中。如果结果A是阳性的，那么显示原始样品中存在靶细菌。如果结果B也是阳性的，那么显示靶细菌对第一种抗生素有抗性。另一方面，如果结果B是阴性的，那么靶细菌对第一种抗生素无抗性。为了同时筛选对一系列抗生素中的任一种抗生素的抗性，在分析靶细菌之前将所有的感兴趣的抗生素都加入到样品B中。如果靶细菌在纯样品和抗生素处理样品中都被检测到，则显示样品中的靶细菌对加入的抗生素中的一种有抗性。这个方法也可以用来测定细菌对抗生素或其它净化剂的敏感性。它也可以用来检测细菌的净化方法是否成功。通过将样品分为对照部分和检测部分，可以检测细菌学方法和材料的有效性。本领域技术人员将认识到本发明方法可用在需要确定是否存在活细菌的几乎每种情况中。

图12到18阐述了检测方法28、99、116和130的另一个实施方案。这个方法应用SILAS表面220。SILAS表面220包含半导体或绝缘晶片221，该晶片具有用附着聚合物224包被的光学涂层222。如本领域已知，SILAS表面被设计为反射特定波长的光并经干涉作用削弱其它的。这些表面通过光与表面上形成的薄膜的直接相互作用产生可视信号。薄膜包括光学涂层和/或通过特异靶分子与表面结合产生的生物膜。阳性结果通常是看到颜色从金色变为紫色，因为光的光学路径被表面上积累的生物学物质延长。膜的厚度和折射率决定了观测到的独特的颜色和阴影。一般来说，与入射光同相的、从表面反射的光的波长会加合，或经历相长干涉，因此变为可见。与入射光异相的、从表面反射的光的波长经相消干涉而被削弱，并且不会从膜上出现。优选地，晶片221包含硅，光学涂层包含氮化硅，附着聚合物包含疏水聚合物。图13到16描述了怎样用SILAS表面显示噬菌体标记物的存在，其利用一个单个的显著增大的抗体/噬菌体/抗体缀合物231表现大量的基本均一分布于附着聚合物224表面的这种结构。在图13中，特异于噬菌体标记物如衣壳蛋白的第一抗体228附着在附着聚合物上，其表面225变成固定区。样品溶液接触表面224。如果特异的噬菌体生物标记物230存在，那么如图14所示它附着在第一抗体228上。在图15中，第二检测抗体232接触表面224，且如果生物标记物存在，其附着于生物标记物230。第二抗体232被反应剂标记，例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶。然后将一种酶如3，3′，5，5′四甲基联苯胺(TMB)，施加236于表面，其与HRP反应形成沉淀238，其形成薄膜层240(图16)，这将改变表面的颜色。如图16所示，依赖于薄膜层240是否存在，在表面245上碰撞的光242反射不同，如244和246所示。因此，反应剂标记的第二抗体232、酶和光学涂层222的组合作为与噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质相互作用的颜色调节剂235，从而噬菌体或与噬菌体相关的生物学物质的存在将引起固定区225变色。

图17和图18阐述了作为阴性结果的无薄膜层240(图17)的SILAS表面与作为阳性结果的有薄膜层240(图18)的SILAS表面反射系数的差异。在阴性结果中桔红色波长的反射系数较高，产生金色；在阳性结果中深蓝色波长的反射系数较高，产生紫色。SILAS表面可采用Thermo Electron Corporation，81 Wyman Street，Waltham，MA02454-9046获得。SILAS方法的描述可在Thermo Electron Corporation网点如http://www.thermo.com上找到。

图19示出了检测微观活生物体的示例性检测试剂盒254以及应用该试剂盒的典型说明。也见图20。优选地，检测试剂盒254包括缓冲液258的容器256、反应容器260、被包括在一个保护壳263中的一或多个检测元件266(图20)、使用该试剂盒的说明270和盛放上述试剂盒各个部分的容器272。保护壳(protective case)263也可以包括参考检测元件276，这个元件在细菌不存在时产生预期的结果267。例如，如果检测元件是侧向流动条，那么参考检测元件可以是相同的侧向流动条，在无细菌存在时在其上施加噬菌体参考样品。反应容器260包括容器体267和容器关闭物264。优选地，反应容器容器体是一个瓶267，容器关闭物是一个瓶盖264。反应容器260含有噬菌体268。噬菌体268优选包含预定量的噬菌体，其附着在反应容器体267的内壁269上。盖264优选是带有与瓶267顶部的螺纹吻合的内部螺纹262的螺旋盖。盖264优选包含加样器(dispenser)265，其优选是设计为释放预定大小的液滴的点滴器头(dropper head)。在这个实施方案中，检测元件266是侧向流动条266，但是也可以是图12至16描绘的SILAS表面元件。流动条266包括样品垫274(图20)和检测窗278。优选地，容器272包括塑料袋272，这个塑料袋有双重目的，即可以盛放检测试剂盒部分并且在检测结束后提供方便的废物容器。

图20显示了使用检测试剂盒254的一套示例说明270。说明270优选包含一页纸的显示检测方法的印刷好的文本和图。说明270也阐述了检测微观活生物体的示例方法280。方法280包括方法281、282、284和286。在第一个方法281中，通过移开盖264和点滴器头265并加入5mL样品而将反应瓶267倒出。然后加入缓冲液258。在方法282，将点滴器头265和盖264放回到瓶267上，这个盖好盖子的反应容器260优选摇晃一段时间，如一分钟，然后温育溶液优选一段时间如一小时以使其静置。将盖264移走，然后把一定量的温育样品放置在样品垫278上。使用者等候优选一段预定的时间，如三分钟。在方法286，使用者要观察检测窗287等待结果。如上所述，如果样品中含有检测试剂盒特异性的细菌，第一个颜色的第一线288，如蓝色出现。如果第一颜色线未出现，检测为阴性。任选地，优选第二种颜色的第二线290出现证明结果有效。第一线288相应于图3的反应剂线46，而第二线290相应于图3中的内部对照带48。若应用参考检测元件276(图19)，那么第一线288可与参考线277相比较以确定试验结果是阳性或阴性。例如，如果第一线288是比参考线277明显更深的蓝色，那么显示出现阳性结果。

图21阐述了一个本发明的示例分析300，其利用经遗传修饰而增强所需感染过程性质的噬菌体302。这里“遗传修饰的噬菌体”包括DNA被以某种方式修饰或操作的噬菌体以及被选择性培养以强调某些特征的噬菌体。所需性质可以是破裂量(burst volumn)、破裂时间(burst time)和感染性。破裂量是复制的噬菌体的量，破裂时间指噬菌体使靶细菌破裂的时间，感染性是指噬菌体感染细菌的效率，也就是被一定量噬菌体感染的细菌的百分比。噬菌体可被遗传修饰以提高一个或多个这样的所需性质，和/或其它所需性质。如图21所示，遗传修饰的噬菌体302与未修饰的噬菌体以同样方式用于检测微观生物体。即一定量的、优选在检测限度以下的遗传修饰的噬菌体302被加入303到宿主微生物304的样品中，感染和温育305，以产生子代噬菌体306，其被检测307。因为亲代噬菌体302通过遗传修饰来提高感染过程的性质，所以检测可以更快速、更灵敏和/或更可信。

图22阐述了一个根据本发明的示例分析310，其利用遗传修饰的噬菌体312来过表达可检测的生物标记物，如一种蛋白。如图22所示，遗传修饰的噬菌体312与未修饰的噬菌体以相同方式用于检测微观生物体。即一定量的、优选在检测限度下的遗传修饰的噬菌体312被加入313宿主微生物314的样品中，感染和温育315，以产生子代噬菌体316，其被检测317。因为亲代噬菌体302被遗传修饰以过表达可检测的生物标记物，这个生物标记物更易于被检测，因此检测可以更快速进行和/或更灵敏，即可以检测更低水平的细菌。或者，这允许使用较少量的亲代噬菌体。

图23阐述了一个根据本发明的示例分析331，其利用遗传修饰的噬菌体来过表达一种酶。如图23所示，一定量的、优选在检测限度下的遗传修饰的噬菌体322被加入323到宿主微生物324的样品中，感染和温育325，以产生酶326。细菌可被裂解或不被裂解。基材328被加入327，它与酶反应329产生酶产物330或其它可检测的酶作用。这种遗传修饰也可以提供可选择的更简单易行的方法，可以更快速的进行和/或更灵敏，或允许使用较少量的亲代噬菌体。

图24阐述了一个根据本发明的示例分析，其利用遗传修饰的噬菌体在衣壳蛋白上表达靶。如图24所示，一定量的、优选在检测限度下的遗传修饰的噬菌体332被加入333到宿主微生物334的样品中，感染和温育355，以产生子代338，其包括衣壳蛋白335的表面上的生物学标记物336。因为生物标记物在衣壳的外部，它比其它标记物更容易被检测到，和/或无需噬菌体解离程序即可被检测到，这可以加速检测。

3.实施例

A.侧向流动实施例

在下列的例子中，在图1的方法中MS2噬菌体被用来检测大肠杆菌(E.coli)。如图3和图4所述，侧向流动条用特异性结合MS2噬菌体的多克隆抗体来制备。

确定侧向流动条的MS2检测限度—噬菌体MS2(ATCC15597-B1)从铺满平板上感染的大肠杆菌来制备。通过噬菌斑分析，这个制品的存活MS2的浓度是2×10⁷pfu/mL。这个MS2储存液的稀释系列被制成从1×10⁷pfu/mL至1×10⁵pfu/mL。MS2用侧向流动条检测。结果见表2。

表2

MS2稀释度	MS2浓度(pfu/mL)	侧向流动结果(线强度)
			1/2	1×107	+
1/20	1×106	+/-
			1/200	1×105	-

在样品加入到侧向流动条15分种后测定线强度。线强度按“++”表示最大线强度至“-”表示未检测到的强度排序。“+/-“表示几乎检测不到的线。这个分析结果显示这些测试的侧向流动条检测MS2的限度是1×10⁶pfu/mL。

确定大肠杆菌检测限度和总测试时间—将饱和培养物的大肠杆菌(ATCC 15597)稀释以产生具有1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³和1×10²个细胞/mL浓度的原始样品。将MS2加入每个原始样品中以使待测样品具有1×10⁶pfu/mL浓度的MS2。待测样品在37℃温育1至5小时。温育后，将待测样品以10∶1的比例稀释，以便于亲代MS2的浓度为1×10⁵pfu/mL-低于已有的检测限度。然后将待测样品用侧向流动条分析。结果见表3。

表3

这些结果显示应用本发明4小时后检测到100个大肠杆菌。1小时后检测到较高水平的大肠杆菌(1×10⁵个细胞或更多)。

相似地，运用上述的侧向流动条方法，利用PRD-1噬菌体成功地检测猪霍乱沙门氏菌(salmonella choleraesuis)细菌，利用γ噬菌体可以检测炭疽芽孢杆菌，利用B-30噬菌体可以检测B族链球菌(group B Streptococcus)。

B.SILAS表面实施例

方法：运用Thermo Electron Corporation，81 Wyman Street，Waltham，MA 02454-9046开发的标准方法制备包被表面和HRP缀合的抗体。简而言之，表面在含有4ug/ml兔抗MS2抗体的pH7.8的HEPES缓冲溶液中包被48小时。包被后，晶片被冲洗并用糖∶蛋白防腐剂过度包被(over-coated)，随后被分成7mm²的芯片。

缀合是根据Thermo Electron改良的Nakane的方法进行的。用高碘酸钠激活HRP以将醛导入蛋白质的碳水化合物部分。激活的HRP与兔抗MS2抗体混合并温育。缀合物通过加入硼氢化钠还原Schiffs碱而稳定。

进行测试来确定检测所提供的MS2的能力。最初的形式(format)包括同步(simultaneous)和依次(sequential)形式。同步形式由混合样品和缀合物(在缀合物稀释剂中以1∶100稀释)，并将样品加入到包被的OIA芯片表面上。温育后，冲洗和干燥表面，之后加入酶底物(TMB)。第一次和第二次温育保持5或10分钟。依次分析与同步的相似，除了样品和缀合物未被混合而是分别加至芯片上。温育步骤被冲洗和印迹步骤分隔开。依次分析的所有步骤的保温时间均为10分钟。

结果：这里介绍的非优化的方法明显能够在10⁷检测到MS2样品，但是对于10⁴，结果是阳性、阴性结果混合的。所有情况中颜色的改变均从深金橙色到深紫色。用同步形式，在温育2个10分种后，未稀释样品中的检测结果是弱的、几乎看不见的。用依次方法，在10⁷可得到较强的信号。在三次10分钟的温育后，10⁷的信号变得清楚，10⁴的信号可见但是非常弱。将10⁷样品用盐水两倍稀释制成稀释系列。10⁷样品稀释至1∶16仍可检测出阳性结果。这粗略地相当于6.25×10⁵。

C.抗生素抗性

在这个实施例中，通过MALDI-MS扩增噬菌体快速确定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)中抗生素的最低抑制浓度(MIC)。这个MIC是抑制特定金黄色葡萄球菌菌株生长的抗生素的最低浓度。若这个菌株在检测浓度对抗生素敏感，那么由于抗生素的抑制、随后抑制噬菌体扩增，MALDI-MS无法检测到噬菌体生物标记物信号。相反，如果噬菌体生物标记物信号被检测到，那么MIC未达到并代表在该点抗生素无效。在本研究中选择链霉素和四环素确定MIC。

金黄色葡萄球菌(ATCC 27709，Manassas VA)在BHI肉汤中，在含有和不含有抗生素(链霉素和四环素)情况下培养24小时。噬菌体187和金黄色葡萄球菌在MALDI的检测限度下被稀释，随后用噬菌体感染宿主，噬菌体扩直至细胞破裂。随后样品被冲洗和浓缩以进行分析。用干燥小滴法(dried droplet method)，将样品铺板在疏水靶平板上以进行分析，所述平板具有与甲酸、乙腈和HPLC级水的溶液混合的15mg/mL阿魏酸基质。质谱用MALDI-TOF-MS PerSeptive BiosystemsVoyager-DE STR Biospectrometry Workstation(Framingham，MA)以线性模式获得。

在抗生素中金黄色葡萄球菌菌株的生长状况来看，抗生素的浓度可能足以破坏细菌细胞或者无法破坏。如果细菌细胞能够存活，意味着它们未受到抗生素影响，那么细胞被感染时发生噬菌体扩增。结果是噬菌体的蛋白质标记物可以在质谱中看见。另一方面，如果质谱中未见生物标记物，那么表示已经达到或超过最低抑制浓度。结论是细胞已经被破坏，因此无噬菌体扩增发生。

MALDI分析前使用半纯化技术来过滤和浓缩样品。因为装置对盐不耐受，样品用100Kda截断值离心过滤。噬菌体187的质谱显示一特有的15,245Da的蛋白质生物标记物。噬菌体187也被超速离心和氯化铯梯度纯化，这样可以确认半纯化过滤技术确定的生物标记物。MALDI MS检测限度被确立，对于细菌和噬菌体分别为10⁶个细胞/mL和10⁸个噬菌体/mL。为了检验信号来自扩增的噬菌体，在试验过程中细菌和噬菌体的浓度都要保持在MALDI的检测限度以下。在低浓度的抗生素下，噬菌体的蛋白峰出现在MALDI谱中，显示细菌生长和噬菌体繁殖仍然发生。在较高浓度，谱中无蛋白峰，显示已达到或超过MIC。

本发明的优选实施方案的一个特征是在暴露于噬菌体的样品中亲代噬菌体未被破坏、去除、中和或失活。在现有技术方法中，细胞外噬菌体即在被感染的细菌或其它微生物体外的噬菌体在某些时候被破坏、去除、中和或失活。在本发明中这是不必要的。特别地，优选不加入可杀死噬菌体的反应剂来使细胞外噬菌体被破坏、中和或失活，因为如果该试剂不被去除或中和，则其将使该方法变得不必要地复杂并可以影响到子代噬菌体。

已经描述了微生物检测方法，其对于选择的生物体是特异的、灵敏的、简便的、快速的和/或经济的，并具有大量的新特征。本发明可以被广泛应用，包扩人类临床诊断学、兽医诊断学、食品病原体检测、环境检测和生物战检测。应该明确的是在说明书附图和描述中所显示的特殊实施方案是举例的目的，不能被解释为限制本发明，这些在下面的权利要求中会被描述。此外，很明显本领域技术人员可以对所述特异实施方案进行大量的应用和改进，而不偏离本发明的精神。等同的结构和方法可以替代所述的不同结构和方法；在一些例子中，本发明方法的子方法可以在不同的顺序下进行；或者可能应用多种不同的材料和元件。

Claims (16)

1.特异于靶细菌的噬菌体在制备用于确定测试样品中是否存在活的所述靶细菌的方法的物质中的用途，所述方法包括：将所述样品与特异于所述靶细菌的噬菌体组合及温育所述样品以产生暴露于噬菌体的样品，所述温育足以允许所述噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌中增殖以产生子代噬菌体；所述方法的特征是：

提供包括样品垫和多孔网或膜的侧向流动条，所述样品垫与所述多孔网或膜接触，所述多孔网或膜具有在检测固定区中的所述多孔网或膜中含有的固定物质，所述固定物质能够附着所述噬菌体或抗体-珠缀合物；

将所述子代噬菌体施加于所述样品垫；

形成抗体-珠-噬菌体复合物；

将所述抗体-珠-噬菌体复合物流动经过所述多孔网或膜至所述检测固定区；及

测定在所述固定区是否存在足够量的固定的抗体-珠-噬菌体复合物以确定是否存在所述靶细菌。

2.权利要求1的用途，其中所述多孔网或膜包括结合垫，且在所述侧向流动条中进行所述形成。

3.权利要求1的用途，其中所述提供侧向流动条包括将在所述多孔网或膜中含有抗体而形成所述检测固定区。

4.权利要求1的用途，其中所述提供包括将对照固定材料包括在所述多孔网或膜中的对照固定区中，所述对照固定材料包括与所述噬菌体或其它标记相互作用以固定其的材料。

5.权利要求1的用途，所述方法特征在于：

(b)将所述样品分为第一个样品和第二个样品；

(c)向所述第二个样品中加入抗生素；

(d)所述组合包括将所述第一个和第二个样品的每个与能够感染所述靶微生物的噬菌体组合以产生第一个暴露于噬菌体的样品和第二个暴露于噬菌体的样品；

(e)所述温育包括为所述暴露于噬菌体的样品提供足以允许所述噬菌体感染所述靶微生物并在所述靶微生物中增殖的条件以产生可检测量的所述噬菌体或与所述暴露于噬菌体的样品中所述噬菌体相关的生物学物质；

(f)所述提供包括提供两个所述样品垫，每个垫均与所述多孔网或膜之一接触；

(g)所述施加包括施加所述第一个温育样品于所述样品垫之一和施加所述第二个温育样品于另一个所述样品垫；及

(h)比较所述第一个和第二个样品的所述施加的结果以确定所述靶微生物对所述抗生素的所述抗性或敏感性。

6.权利要求5的用途，特征在于所述添加包括添加多种所述抗生素。

7.一种确定测试样品中是否存在活的靶细菌的非诊断性方法，所述方法包括：将所述样品与特异于所述靶细菌的噬菌体组合及温育所述样品以产生暴露于噬菌体的样品，所述温育足以允许所述噬菌体感染所述靶细菌并在所述靶细菌中增殖以产生子代噬菌体；所述方法的特征是：

提供包括样品垫和多孔网或膜的侧向流动条，所述样品垫与所述多孔网或膜接触，所述多孔网或膜具有在检测固定区中的所述多孔网或膜中含有的固定物质，所述固定物质能够附着所述噬菌体或抗体-珠缀合物；

将所述子代噬菌体施加于所述样品垫；

形成抗体-珠-噬菌体复合物；

将所述抗体-珠-噬菌体复合物流动经过所述多孔网或膜至所述检测固定区；及

测定在所述固定区是否存在足够量的固定的抗体-珠-噬菌体复合物以确定是否存在所述靶细菌。

8.权利要求7的方法，其中所述多孔网或膜包括结合垫，且在所述侧向流动条中进行所述形成。

9.权利要求7的方法，其中所述提供侧向流动条包括将在所述多孔网或膜中含有抗体而形成所述检测固定区。

10.权利要求7的方法，其中所述提供包括将对照固定材料包括在所述多孔网或膜中的对照固定区中，所述对照固定材料包括与所述噬菌体或其它标记相互作用以固定其的材料。

11.权利要求7的方法，所述方法特征在于：

(b)将所述样品分为第一个样品和第二个样品；

(c)向所述第二个样品中加入抗生素；

(d)所述组合包括将所述第一个和第二个样品的每个与能够感染所述靶微生物的噬菌体组合以产生第一个暴露于噬菌体的样品和第二个暴露于噬菌体的样品；

(e)所述温育包括为所述暴露于噬菌体的样品提供足以允许所述噬菌体感染所述靶微生物并在所述靶微生物中增殖的条件以产生可检测量的所述噬菌体或与所述暴露于噬菌体的样品中所述噬菌体相关的生物学物质；

(f)所述提供包括提供两个所述样品垫，每个垫均与所述多孔网或膜之一接触；

(g)所述施加包括施加所述第一个温育样品于所述样品垫之一和施加所述第二个温育样品于另一个所述样品垫；及

(h)比较所述第一个和第二个样品的所述施加的结果以确定所述靶微生物对所述抗生素的所述抗性或敏感性。

12.权利要求11的方法，特征在于所述添加包括添加多种所述抗生素。

13.一种确定测试样品中是否存在活的靶细菌的装置，所述装置包括：

特异于所述细菌的噬菌体；

所述噬菌体的可检测的抗体-珠缀合物；

接收可能含有所述靶细菌的测试样品的样品垫；及

与所述样品垫接触并具有检测固定区的多孔网或膜，所述检测固定区包括在所述多孔网或膜中含有的检测固定材料，所述检测固定材料包括能够附着所述噬菌体或所述抗体-珠缀合物的材料。

14.权利要求13的装置，其中所述检测固定材料包括所述噬菌体的抗体。

15.权利要求13的装置，其中所述多孔网或膜还包括其中含有所述抗体-珠缀合物的结合垫，所述结合垫在所述多孔网或膜中位于所述样品垫和所述检测固定区之间。

16.权利要求13的装置，进一步包括对照区，其包括对照固定材料，所述对照固定材料包括能够固定所述噬菌体或其它生物标记物的材料。

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