CN115052991A - 使用重组感染因子以表达指示亚基来快速检测微生物的方法和系统 - Google Patents

使用重组感染因子以表达指示亚基来快速检测微生物的方法和系统 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于快速检测样品中的微生物例如细菌的方法和系统。还公开了一种遗传修饰的噬菌体，其包含编码指示蛋白的一个亚基的指示基因。噬菌体的特异性允许检测特定目标细菌，并且可以放大指示信号以优化测定灵敏度。

Description

使用重组感染因子以表达指示亚基来快速检测微生物的方法 和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月11日提交的美国临时申请号62/898,945的优先权。美国申请号13/773,339、14/625,481、15/263,619和15/409,258的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及用于使用感染因子检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒。
背景技术
对改善检测生物、食物、水和临床样品中的细菌、病毒和其他微生物的速度和灵敏度有着浓厚的兴趣。微生物病原体可导致人类和家畜中严重的发病率，以及巨大的经济损失。此外，鉴于通过摄入被某些微生物污染的食物引起危及生命或致命疾病的爆发，微生物检测是食品和药物管理局(FDA)和疾病控制中心(CDC)以及美国农业部(USDA)的高度优先事项，所述微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)、克罗诺杆菌属物种(Cronobacterspp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、李斯特菌属物种(Listeria spp.)或葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)。
用于检测细菌的传统微生物测试依赖于非选择性和选择性富集培养物，然后在选择性培养基上铺板并进一步测试以确认可疑菌落。此类程序可能需要几天时间。已经研究了多种快速方法并将其引入实践以减少时间要求。然而，这些方法有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链式反应(PCR)测试还包括扩增步骤，并因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，可以经济地进行PCR测试的样品量是有限的。使用稀释的细菌悬浮液，大多数小的子样品将不含细胞，并因此仍需要纯化和/或冗长的富集步骤。
传统生物富集所需的时间取决于样品中靶标细菌群的生长速率、样品基质的影响以及所需的灵敏度。在实践中，大多数高灵敏度方法采用过夜孵育并且总共需要大约24小时。由于培养所需的时间，这些方法可能需要长达三天的时间，具体取决于要鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食物、水或其他产品可能已经进入牲畜或人类体内。此外，抗生素抗性细菌的增加和生物防御方面的考虑使得快速鉴定水、食品和临床样品中的细菌病原体成为全球的关键优先事项。
因此，需要更快速、简单和灵敏地检测和鉴定微生物，例如细菌和其他潜在病原微生物。
发明内容
本公开内容的实施方案包括用于检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒，例如，本公开内容可以以多种方式体现。
在一些方面，本公开内容包括重组指示噬菌体，其包含插入噬菌体基因组中的指示基因，其中指示基因编码指示蛋白(指示蛋白产物)的肽亚基。在某些实施方案中，指示噬菌体包含遗传修饰的噬菌体基因组，该基因组来源于特异性识别特定目标细菌的噬菌体。
在重组指示噬菌体的一些实施方案中，肽亚基(标记亚基)是分裂报告酶系统的一部分，其中报告酶(即指示蛋白)是萤光素酶。萤光素酶可以是天然存在的，例如Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者它可以是基因工程改造的萤光素酶例如
Figure BDA0003620488110000021
本文还公开了制备指示噬菌体的方法。一些实施方案包括选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化到靶病原菌中；用所选野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而使质粒/载体与噬菌体基因组之间发生同源重组；和分离重组噬菌体的特定克隆。
在另一方面，本公开内容包括用于检测样品中特定目标细菌的方法，其包括以下步骤：将样品与包含指示基因的重组指示噬菌体孵育，其中所述指示基因编码指示蛋白的第一亚基，从而产生一定量的子代噬菌体并表达第一亚基；裂解样品中的细菌以释放一定量的子代噬菌体和第一亚基；在检测试剂存在下孵育裂解的样品，其中检测试剂包含指示蛋白的第二亚基，从而允许第一亚基和第二亚基重构而形成指示蛋白复合物；和检测指示蛋白复合物，其中指示蛋白复合物的阳性检测表明样品中存在特定目标细菌。
在用于检测细菌的方法的一些实施方案中，样品首先在有利于生长的条件下孵育24小时或更少、23小时或更少、22小时或更少、21小时或更少、20小时或更少、19小时或更少、18小时或更少、17小时或更少、16小时或更少、15小时或更少、14小时或更少、13小时或更少、12小时或更少、11小时或更少、10小时或更少、或9小时或更少、8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少或者2小时或更少的富集期。在一些实施方案中，样品在检测之前没有被富集。在一些实施方案中，获得结果的总时间少于26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。在一些实施方案中，通过检测指示物产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5或至少3.0。在一些实施方案中，所述方法检测到在食品安全行业标准尺寸样品中少至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个特定细菌。
另外的实施方案包括用于检测特定目标细菌的系统和试剂盒，其中所述系统或试剂盒包括源自对特定目标细菌特异的噬菌体的指示噬菌体。这些系统或试剂盒可以包括针对本公开内容的噬菌体、组合物和方法描述的特征。在其他实施方案中，本公开内容包括用于根据本公开内容的方法或系统的非瞬态计算机可读介质。
附图说明
通过参考以下非限制性附图可以更好地理解本公开内容。
图1描绘了根据本公开内容的实施方案的指示噬菌体构建体，其示例说明了包含启动子、RBS和指示基因(可溶性HiBiT)的遗传构建体的插入，插入到TSP12噬菌体中主要衣壳蛋白下游。
图2描绘了根据本公开内容的实施方案的指示噬菌体构建体，其示例说明了包含接头、HRV 3C位点和指示基因(HiBiT)的遗传构建体的插入，插入到TSP12噬菌体中主要衣壳蛋白下游。
图3描绘了根据本公开内容的实施方案的指示噬菌体构建体，其示例说明了包含接头、PS蛋白酶位点和指示基因(HiBiT)的遗传构建体的插入，插入到TSP12噬菌体中Soc蛋白的N末端上。
图4提供了详述根据本公开的实施方案使用亲本噬菌体TSP1、TSP12、SEA1和T7Select制备的同源重组构建体的表格。
图5示例说明了根据本公开内容的实施方案，通过2小时孵育用于检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的TSP1.sHiBiT噬菌体浓度的优化。
图6示例说明了根据本公开内容的实施方案，通过3小时孵育用于检测鼠伤寒沙门氏菌的TSP1.sHiBiT噬菌体浓度的优化。
图7示例说明了根据本公开内容的实施方案，通过2小时孵育用于检测邦戈里沙门氏菌(Salmonella bongori)的TSP12.sHiBiT噬菌体浓度的优化。
图8示例说明了根据本公开内容的实施方案，通过4小时孵育用于检测邦戈里沙门氏菌的TSP12.sHiBiT噬菌体浓度的优化。
图9示例说明了根据本公开内容的实施方案，通过2小时孵育用于检测邦戈里沙门氏菌的TSP12.HiBiT-PS-Soc噬菌体浓度的优化。
图10示例说明了根据本公开内容的实施方案，通过2小时孵育用于检测邦戈里沙门氏菌的TSP12.HiBiT-PS-Soc噬菌体浓度的优化。
发明详述
本文公开的是组合物、方法和系统，其显示出对检测测试样品(例如生物、食物、水和环境)中的目标微生物(例如大肠杆菌、克罗诺杆菌属物种、沙门氏菌属物种、李斯特菌属物种或葡萄球菌属物种)的令人惊讶的灵敏度。可以比以前在没有富集培养进行的测定中使用遗传修饰的感染因子或者在微生物潜在繁殖的最少孵育时间的一些实施方案中所认为的更短的时间范围内实现检测。同样令人惊讶的是成功使用潜在的高感染复数(MOI)或高浓度的噬斑形成单位(PFU)与测试样品孵育。以前认为如此高的噬菌体浓度(PFU/mL)在细菌检测测定法中是有害的，因为据称它们会导致“自外溶菌作用”。然而，高浓度的噬菌体有助于发现、结合和感染少量靶细胞。
本公开内容的组合物、方法、系统和试剂盒可包含用于检测微生物例如大肠杆菌、克罗诺杆菌属物种、沙门氏菌属物种、李斯特菌属物种或葡萄球菌属物种的感染因子。包含插入噬菌体基因组中的指示基因的重组指示噬菌体，其中指示基因编码指示蛋白的肽亚基。在某些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致指示蛋白的可溶性肽亚基的产生。在替代实施方案中，是指示蛋白的融合肽亚基。在某些实施方案中，指示基因可以插入噬菌体的晚期基因(即III类)区域中。
在一些实施方案中，本公开内容包括用于检测样品中特定目标细菌的方法，其包括以下步骤：将样品与包含指示基因的重组指示噬菌体孵育，其中所述指示基因编码指示蛋白的第一亚基，从而产生一定量的表达第一亚基的子代噬菌体；裂解一定量的子代噬菌体；在检测试剂的存在下孵育裂解的子代噬菌体，其中检测试剂包含指示蛋白的第二亚基，从而允许第一亚基和第二亚基重构而形成指示蛋白复合物；和检测指示蛋白复合物，其中指示蛋白复合物的阳性检测表明样品中存在特定目标细菌。
在某些实施方案中，本公开内容可以包括系统。所述系统可以包含至少一些本公开内容的组合物。此外，所述系统可以包括至少一些用于执行所述方法的组分。在某些实施方案中，系统被配制成试剂盒。因此，在某些实施方案中，本公开内容可包括用于快速检测样品中特定目标细菌的系统，其包括：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子孵育的组分，其中所述感染因子包括指示部分；和用于检测指示部分的组分。在另外的其他实施方案中，本公开内容包括用于所述方法或系统的软件。
因此，本公开内容的一些实施方案通过使用用于放大指示细菌存在的可检测信号的基于噬菌体的方法来解决需求。在某些实施方案中，检测到少至单个细菌。本文应用的原理可应用于多种微生物的检测。由于微生物表面上有感染因子的许多结合位点，在感染过程中产生一百个或更多感染因子子代的能力，以及编码的指示部分高水平表达的潜力，感染因子或指示部分可以比微生物本身更容易被检测到。这样，本公开内容的实施方案可以甚至从单个感染细胞实现巨大的信号放大。
本公开的一些方面利用可以结合特定微生物的结合剂的高特异性，例如感染因子的结合组分，作为检测和/或量化样品中特定微生物的工具。在一些实施方案中，本公开内容利用诸如噬菌体的感染因子的高特异性。
在一些实施方案中，通过与对目标微生物特异的结合剂相关的指示部分实现检测。例如，感染因子可以包含编码指示蛋白或其亚基的基因。在一些实施方案中，指示物可以由感染因子(例如噬菌体)编码，并且噬菌体被指定为指示噬菌体。
本文公开和描述的本公开内容的一些实施方案利用了单个微生物能够结合特异性识别剂(例如噬菌体)的发现。在噬菌体感染和复制之后，可以通过在噬菌体复制期间表达的指示基因检测子代噬菌体。该原理允许基于微生物表面受体的特异性识别而放大来自一个或几个细胞的指示信号。例如，通过将细菌的单个细胞暴露于多个噬菌体，然后在复制过程中允许噬菌体扩增和编码的指示基因产物或指示蛋白的亚基的高水平表达，指示信号得到放大使得单个细菌是可检测的。
本公开内容的方法和系统的实施方案可应用于在多种情况下检测和量化多种微生物(例如细菌)，包括但不限于检测来自食物、水和商业样品的病原体。本公开内容的方法提供了快速的高检测灵敏度和特异性。在一些实施方案中，可以在噬菌体的单个复制周期内进行检测，这是出乎意料的。
定义
除非本文另有定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般而言，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明，否则已知的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的实验室程序和技术结合使用的命名法是本领域熟知和常用的。
以下术语，除非另有说明，应理解为具有以下含义：
如本文所用，除非另有特别说明，否则术语“一个”、“一种”和“该”可以指代一个或多个/一种或多种。
术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代备选方案或备选方案相互排斥，尽管本公开内容支持仅指代备选方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多。
在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括设备的固有误差变化、用于确定该值的方法或样品之间存在的变化。
如本文所用，“固体支持物”或“支持物”是指提供可结合生物分子的基底和/或表面的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即，例如微量滴定板或多孔板)，或者固体支持物可以是过滤器、阵列或移动支持物例如珠子或膜(例如，滤板、胶乳颗粒、顺磁性颗粒或横向流动条)上的位置。
如本文所用，“结合剂”是指可以特异性地和选择性地结合第二(即，不同的)目标分子的分子。该相互作用可以是非共价的，例如，由于氢键、范德华相互作用或者静电或疏水相互作用，或者它可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物缔合(即共价或非共价结合)的结合剂。
如本文所用，术语“生物发光”是指通过由酶、蛋白质、蛋白质复合物或其他生物分子(例如，生物发光复合物)催化或促成的化学反应来产生和发射光。在典型的实施方案中，生物发光实体(例如，生物发光蛋白或生物发光复合物)的底物被生物发光实体转化为不稳定形式；底物随后发射光。
如本文所用，术语“互补的”是指两个或更多个结构元件(例如肽、多肽、核酸、小分子等)能够彼此杂交、二聚化或以其他方式形成复合物的特征。例如，“互补肽和多肽”能够在一起形成复合物。互补元件可能需要帮助以形成复合物(例如，来自相互作用元件)，例如，将元件放置在互补的适当构象中、共定位互补元件、降低互补的相互作用能量等。
如本文所用，术语“复合物”是指彼此直接和/或间接接触的分子(例如，肽、多肽等)的集合体或聚集体。一方面，“接触”，或更具体地，“直接接触”是指两个或更多个分子足够接近使得有吸引力的非共价相互作用，例如范德华力、氢键、离子和疏水相互作用等，主导分子的相互作用。在这样的一个方面，分子(例如，肽和多肽)的复合物在测定条件下形成，使得复合物在热力学上是有利的(例如，与其组成分子的非聚集或非复合状态相比)。如本文所用，除非另有说明，否则术语“复合物”是指两种或更多种分子(例如，肽、多肽或其组合)的组装。
如本文所用，术语“不发光的”是指表现出不发射可检测量的可见光谱中的光(例如，在有底物的情况下)的特征的实体(例如肽、多肽、复合物、蛋白质等)。例如，如果实体在给定的测定中没有表现出可检测的发光，则可以将其称为不发光的。如本文所用，术语“不发光”与术语“基本上不发光”同义。例如，不发光多肽基本上不发光，表现出与NLpoly与其不发光补体肽的复合物相比例如10倍或更多(例如，100倍、200倍、500倍、1×10Sup3/Sup-倍、1×10Sup4/Sup-倍、1×10Sup5/Sup-倍、1×10Sup6/Sup-倍、1×10Sup7/Sup-倍等)的发光减少。在一些实施方案中，如果任何光发射足够小以至于不会为特定测定产生干扰背景，则实体是“不发光的”。
如本文所用，术语“不发光肽”和“不发光多肽”是指与标准条件(例如生理条件、测定条件等)下和用典型仪器(例如、光度计等)的显著信号(例如发光复合物)相比，表现出基本上不发光(例如，在底物存在下)或发光量低于噪声，或低10倍或更多(例如，100倍、200倍、500倍、1×10Sup3/Sup-倍、1×10Sup4/Sup-倍、1×10Sup5/Sup-倍、1×10Sup6/Sup-倍、1×10Sup7/Sup-倍等)的肽和多肽。在一些实施方案中，此类不发光肽和多肽根据本文所述的标准组装以形成生物发光复合物。如本文所用，“不发光元件”是不发光肽或不发光多肽。术语“生物发光复合物”是指两种或更多种不发光肽和/或不发光多肽的组装复合物。生物发光复合物催化或能够将生物发光复合物的底物转化为不稳定形式；底物随后发射光。当未复合时，形成生物发光复合物的两个不发光元件可称为“不发光对”。如果生物发光复合物由三个或更多个不发光肽和/或不发光多肽形成，则生物发光复合物的未复合成分可以称为“不发光基团”。
如本文所用，“分析物”是指被测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，目标分析物可以与结合剂相互作用。如本文所述，术语“分析物”可以指目标蛋白质或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可以不具有生物学效应。分析物可以包括小分子、糖、寡糖、脂质、肽、肽模拟物、有机化合物等。
如本文所用，“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报告子”或“指示物”或“指示蛋白”或“指示蛋白产物”“指示蛋白复合物”或“指示部分”是指可以在定量测定中测量的分子。例如，指示蛋白可包含可用于将底物转化为可以测量的产物的酶。指示部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶)。或者，指示部分可以是可以量化的放射性同位素。或者，指示部分可以是荧光团。或者，可以使用其他可检测分子。
如本文所用，“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括多种细菌病毒中的一种或多种。在本公开内容中，术语“噬菌体”和“噬菌体”包括病毒，例如分枝杆菌噬菌体(例如对于TB和副TB)、真菌噬菌体(例如对于真菌)、支原体噬菌体，以及指代可以侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他微观活生物体并利用它们进行自我复制的病毒的任何其他术语。这里，“微观”是指最大尺寸为一毫米或更小。噬菌体是在自然界中进化到利用细菌作为自我复制手段的病毒。噬菌体通过将自身附着至细菌并将其DNA(或RNA)注射到细菌中，并诱导它复制噬菌体数百甚至数千次来实现这一点。这被称为噬菌体扩增。
如本文所用，“晚期基因区域”是指病毒基因组中在病毒生命周期后期转录的区域。晚期基因区域通常包括表达最丰富的基因(例如，组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白)。晚期基因与III类基因同义，包括具有结构和组装功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在噬菌体T7中转录，例如，从感染后8分钟直到裂解，I类(例如RNA聚合酶)早至从4-8分钟开始，和II类从6-15分钟开始，所以II和III的时间有重叠。晚期启动子是在这种晚期基因区域中自然定位并具有活性的启动子。
如本文所用，“富集培养”是指传统培养，例如在有利于微生物繁殖的培养基中孵育，并不应与“富集”一词的其他可能用法相混淆，例如通过去除样品的液体组分以浓缩其中所含的微生物，或不包括传统促进微生物繁殖的其他形式的富集。在本文所述的方法的一些实施方案中可以采用培养一段时间以进行富集。
如本文所用，“重组的”是指通常在实验室中进行的遗传(即，核酸)修饰，以将原本不会被发现的遗传物质聚集在一起。该术语与本文中的术语“修饰的”可互换使用。
如本文所用，“RLU”是指通过光度计(例如，
Figure BDA0003620488110000101
96)或检测光的类似仪器测量的相对光单位。例如，萤光素酶与适当底物(例如
Figure BDA0003620488110000111
与
Figure BDA0003620488110000112
)之间反应的检测通常在所检测的RLU中报告。
如本文所用，“获得结果的时间”是指从样品孵育开始到产生结果的时间总量。获得结果的时间不包括任何确认测试时间。生成结果后，可以随时进行数据收集。
如本文所用，“报告基因”或“指示基因”可以指完整基因或基因的一部分。例如，本文使用的指示基因或报告基因可以包括编码较小肽亚基的核苷酸序列，即，其被转录和翻译成部分蛋白质。
样品
本公开内容的方法和系统的每个实施方案可以允许快速检测和量化样品中的微生物。例如，根据本公开内容的方法可以在缩短的时间段内执行并具有优异的结果。
通过本发明的方法和系统检测的微生物包括具有天然、商业、医学或兽医关注的病原体。此类病原体包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和支原体。可以通过本发明的方法检测已经鉴定出对特定微生物特异的感染因子的任何微生物。本领域技术人员将理解，除了必要的特定感染因子/微生物对的可用性之外，对本方法的应用没有限制。
本公开内容可检测的细菌细胞包括但不限于作为食物或水传播病原体的细菌细胞。本发明可检测的细菌细胞包括但不限于沙门氏菌属的所有物种，大肠杆菌、克罗诺杆菌属、葡萄球菌属的所有菌株，李斯特菌属的所有物种，包括但不限于单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)和弯曲杆菌属(Campylobacter)的所有物种。本发明可检测的细菌细胞包括但不限于作为具有医学或兽医意义的病原体的细菌细胞。此类病原体包括但不限于芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、空肠弯曲杆菌(Camplyobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、松内志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和链球菌属物种(Streptococcus spp.)。在一些实施方案中，本发明可检测的细菌细胞包括抗生素抗性细菌(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))。
样品可以是环境样品或食物样品或水样品。一些实施方案可以包括医学或兽医样品。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭子。样品可以包括环境材料，例如水样品，或来自空气样品的过滤器或来自旋风收集器的气溶胶样品。样品可以是蔬菜、肉、鱼、家禽、花生酱、加工食品、婴儿配方奶粉、奶粉、茶、淀粉、蛋、奶、奶酪或其他乳制品。医学或兽医样品包括但不限于血液、痰、脑脊液和粪便样品以及不同类型的拭子。
在一些实施方案中，样品可直接用于本公开内容的检测方法，无需制备、浓缩或稀释。例如，可以直接测定液体样品，包括但不限于奶和果汁。样品可以稀释或悬浮在溶液中，该溶液可以包括但不限于缓冲溶液或细菌培养基。固体或半固体样品可通过切碎、混合或将固体浸渍在液体中而悬浮在液体中。样品应保持在促进噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH范围内。样品还应包含适当浓度的二价和单价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和Ca2+。优选地，将样品维持在支持包含在样品中的任何病原体细胞的活力的温度下。
优选地，在整个检测测定中，将样品维持在维持样品中存在的任何病原体细胞的活力的温度下。在其中噬菌体附着于细菌细胞的步骤期间，优选的是将样品维持在有利于噬菌体附着的温度下。在其中噬菌体在受感染的细菌细胞内复制或裂解这种受感染的细胞的步骤期间，优选的是将样品维持在促进噬菌体复制和宿主裂解的温度下。这样的温度为至少约25摄氏度(C)，更优选不大于约45摄氏度，最优选约37摄氏度。
测定可以包括各种合适的对照样品。例如，不含噬菌体的对照样品或不含细菌而含有噬菌体的对照样品可以作为背景信号水平的对照进行测定。
指示噬菌体
如本文中更详细描述的，本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可包含用于检测病原微生物的感染因子。在某些实施方案中，本公开内容包括重组指示噬菌体，其中噬菌体基因组经遗传修饰以包括指示基因或报告基因。在一些实施方案中，本发明可以包括包含重组噬菌体的组合物，该重组噬菌体具有掺入到噬菌体基因组中的指示基因，其中指示基因编码指示蛋白的肽亚基。
重组指示噬菌体可以包括报告基因或指示基因或指示肽亚基。在指示噬菌体的一些实施方案中，指示物或肽亚基基因编码融合蛋白。例如，指示物或指示肽亚基可以与噬菌体衣壳蛋白融合，使得指示物作为噬菌体衣壳的一部分表达。指示物也可以与另一种蛋白质融合以作为可溶性分子产生。在指示噬菌体的其他实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致非融合可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，指示物或指示肽或多肽亚基基因可插入噬菌体的晚期基因区域中。晚期基因通常以比其他噬菌体基因更高的水平表达，因为它们编码结构蛋白。晚期基因区域可以是III类基因区并且可以包括主要衣壳蛋白的基因。
一些实施方案包括设计(和任选地制备)用于主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列。其他实施方案包括设计(和任选地制备)用于主要衣壳蛋白基因上游的同源重组的序列。在一些实施方案中，序列包含密码子优化的报告基因，其前面是非翻译区。非翻译区可以包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
在一些实施方案中，指示噬菌体来源于所选野生型噬菌体沙门氏菌噬菌体SPN1S、沙门氏菌噬菌体10、沙门氏菌噬菌体ε15、沙门氏菌噬菌体SEA1、沙门氏菌噬菌体TSP1、沙门氏菌噬菌体TSP12、沙门氏菌噬菌体Spn1s、沙门氏菌噬菌体P22、李斯特菌噬菌体LipZ5、李斯特菌噬菌体P40、李斯特菌噬菌体vB_LmoM_AG20、李斯特菌噬菌体P70、李斯特菌噬菌体A511、李斯特菌噬菌体P100、李斯特菌噬菌体LMA8、李斯特菌噬菌体LMA4、葡萄球菌噬菌体P4W、葡萄球菌噬菌体K、葡萄球菌噬菌体Twort、葡萄球菌噬菌体SA97、大肠杆菌O157:H7噬菌体CBA120，或者另一种噬菌体，其具有与所选野生型噬菌体沙门氏菌噬菌体SPN1S、沙门氏菌噬菌体10、沙门氏菌噬菌体ε15、沙门氏菌噬菌体SEA1、沙门氏菌噬菌体TSP1、沙门氏菌噬菌体TSP12、沙门氏菌噬菌体Spn1s、沙门氏菌噬菌体P22、李斯特菌噬菌体LipZ5、李斯特菌噬菌体P40、李斯特菌噬菌体vB_LmoM_AG20、李斯特菌噬菌体P70、李斯特菌噬菌体A511、葡萄球菌噬菌体P4W、葡萄球菌噬菌体K、葡萄球菌噬菌体Twort、葡萄球菌噬菌体SA97、大肠杆菌O157:H7噬菌体CBA120至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的基因组。在一些实施方案中，指示噬菌体来源于对特定病原微生物高度特异的噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失，因此修饰的噬菌体可以比许多可商购获得的噬菌体更类似于野生型感染因子。环境衍生的噬菌体可能对环境中发现的细菌更具特异性，因此在遗传上不同于可商购获得的噬菌体。
在一些实施方案中，重组噬菌体包含与任何以下噬菌体的结合结构域具有≥95％同源性的结合结构域：沙门氏菌噬菌体SPN1S、沙门氏菌噬菌体10、沙门氏菌噬菌体ε15、沙门氏菌噬菌体SEA1、沙门氏菌噬菌体TSP1、沙门氏菌噬菌体TSP12、沙门氏菌噬菌体Spn1s、沙门氏菌噬菌体P22、李斯特菌噬菌体LipZ5、李斯特菌噬菌体P40、李斯特菌噬菌体vB_LmoM_AG20、李斯特菌噬菌体P70、李斯特菌噬菌体A511、葡萄球菌噬菌体P4W、葡萄球菌噬菌体K、葡萄球菌噬菌体Twort、葡萄球菌噬菌体SA97或大肠杆菌O157:H7噬菌体CBA120。
在某些情况下，指示噬菌体来源于对特定病原微生物高度特异的噬菌体。在一些实施方案中，指示噬菌体来源于T7Select。T7Select是来自Novagen的可商购获得的噬菌体展示系统。T7是一种良好表征的原型噬菌体，感染埃希氏菌属(Escherichia)，来自短尾病毒科(Podoviridae)。T7噬菌体的衣壳由MCP的2种同种型(gp10a和gp10b)的9:1比例组成。gp10a和gp10b是由翻译中的移码引起的，并且这种移码可以被调制以产生不同比例的gp10a:gp10b异构体。
Figure BDA0003620488110000151
是一种包含整个T7基因组的克隆质粒。可以将一定长度的肽或蛋白质克隆到gp10b的C末端中，并以每个噬菌体的高(415)中(5-10)或低(最多1)拷贝数表达。
在一些实施方案中，指示噬菌体来源于TSP12，一种对邦戈里沙门氏菌菌株特异的沙门氏菌噬菌体。该噬菌体与属于Tequatrovirus属的肠杆菌RB51噬菌体最密切相关。该属包括经过充分表征和研究的埃希氏菌T4病毒。该噬菌体具有许多衣壳结构，已发表详细说明蛋白质组分和构象。TSP12具有几个结构候选基因用于使用肽或多肽标记亚基进行加标签，包括但不限于主要衣壳蛋白(gp23)和辅助小外衣壳蛋白(gpSoc)。
在一些实施方案中，指示噬菌体来源于沙门氏菌噬菌体SEA1。SEA1与Gelderlandvirus属的沙门氏菌噬菌体vB_SenM-S16[GenBank:HQ331142.1]的关系最为密切。SEA1具有几个结构候选基因用于使用肽或多肽标记亚基进行加标签，包括但不限于主要衣壳蛋白、头部顶点蛋白、头部外衣壳蛋白和小外衣壳蛋白。主要衣壳蛋白可以在氨基(N)或羧基(C)末端进行加标签。
在一些实施方案中，指示噬菌体来源于沙门氏菌噬菌体TSP1。TSP1与沙门氏菌属和埃希氏菌库特病毒(Kuttervirus)属的噬菌体关系最为密切。TSP1噬菌体具有至少一个候选基因用于使用肽或多肽标记亚基进行加标签，包括但不限于单个主要前头蛋白。
遗传修饰可避免野生型基因的缺失，因此经修饰的噬菌体与许多可商购获得的噬菌体相比可保持与野生型感染因子更相似。环境衍生的噬菌体可能对环境中发现的细菌更具特异性，因此在遗传上不同于可商购获得的噬菌体。
此外，被认为是非必需的噬菌体基因能够具有未被识别的功能。例如，明显非必需的基因能够在提高裂解量方面具有重要功能，例如装配中的细微切割、拟合或修剪功能。因此，删除基因以插入指示物可能是有害的。大多数噬菌体可以包装比其天然基因组大多至10％的DNA。包括噬菌体在内的不同病毒具有不同的裂解量。裂解量在很大程度上取决于宿主、感染复数(MOI)和生长条件。λ噬菌体和其他噬菌体(如T4、T5和T7)的裂解量为约100-300。在一些实施方案中，所选噬菌体具有至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、250、375、400、425、450、475或500PFU/细胞的裂解量。例如，T7具有180PFU/细胞的裂解量；T4具有130PFU/细胞的裂解量；和CBA120具有440PFU/细胞的裂解量。较小的裂解量意味着较少的子代噬菌体可用于产生指示蛋白产物。因此，使用具有较大裂解量的噬菌体有利于放大信号和提高测定灵敏度。
小噬菌体包装更小的基因组，因此对额外转基因的耐受性较低。小报告基因的另一个可能优势是它可以以更高的数量表达，因为蛋白质的每个拷贝需要更少的有限细胞资源。然而，单独的HiBiT标签可能太小而无法正确表达或正确折叠。
考虑到这些考虑，较小的指示基因可能是用于修饰噬菌体，尤其是具有较小基因组的噬菌体的更合适的选择。OpLuc和
Figure BDA0003620488110000161
蛋白仅约20kDa(约500-600bp用于编码)，而FLuc约62kDa(约1,700bp用于编码)。相比之下，T7的基因组为约40kbp，而T4的基因组为约170kbp。在一些实施方案中，指示基因编码报告蛋白(例如，
Figure BDA0003620488110000162
)的亚基。在一些实施方案中，使用较小的指示基因(例如指示蛋白的亚基)允许将指示基因的多个拷贝插入噬菌体基因组中，从而进一步放大信号。
蛋白质互补测定(PCA)提供了一种检测两个生物分子(例如，多肽亚基)相互作用的方法。PCA可以利用相同蛋白质的两个亚基，例如酶，当它们彼此靠近时，可以重构为有功能的活性蛋白质。PCA涉及使用蛋白质的至少两个亚基来检测目标蛋白质。因此，在重组指示噬菌体的一些实施方案中，指示基因编码分裂报告蛋白的一个亚基。在某些情况下，分裂报告蛋白是功能性酶(例如，萤光素酶或β-半乳糖苷酶)。在进一步的实施方案中，萤光素酶是
Figure BDA0003620488110000163
在一些实施方案中，分裂报告子(指示蛋白)包含第一多肽亚基(标记亚基)和第二多肽亚基(检测亚基)。在更进一步的实施方案中，标记亚基与检测亚基互补。在某些情况下，标记亚基能够结合检测亚基以形成指示蛋白复合物。因此，在重组指示噬菌体的一些实施方案中，指示基因插入噬菌体基因组中，其中指示基因编码指示蛋白的多肽亚基(标记亚基)。
在指示噬菌体的某些实施方案中，将编码标记亚基的基因插入噬菌体基因组中。在进一步的实施方案中，在感染目标细菌后噬菌体复制期间，指示基因导致指示蛋白产物的产生，从而允许与第二亚基(检测亚基)的蛋白质-蛋白质相互作用。在一些实施方案中，标记亚基遇到检测亚基以形成功能性酶(例如，萤光素酶)。在进一步的实施方案中，功能性酶产生信号。在某些情况下，信号的产生需要功能性酶接触底物。
图1描绘了本公开内容的重组噬菌体指示噬菌体TSP12.s.HiBiT的一个实施方案的基因组结构的示意图。对于图1所示的实施方案，指示蛋白由插入晚期(III类)基因区域内的可溶性HiBiT基因编码，该基因在病毒生命周期的晚期表达。晚期基因的表达水平通常高于其他噬菌体基因，因为它们编码结构蛋白。因此，在图1所示的重组噬菌体的实施方案中，指示基因(即，可溶性HiBiT)被插入晚期基因区域中，就在主要衣壳蛋白(MCP)基因之后，并且是包含HiBiT萤光素酶基因的构建体。同样如图1所示，构建体可以包含晚期启动子以驱动HiBiT基因的转录和表达。构建体还可以包含从几个UTR合成的复合非翻译区和所有3个阅读框中的终止密码子以确保HiBiT不掺入MCP基因产物中。该构建体确保产生可溶性HiBiT，使得表达不受噬菌体展示系统中固有的衣壳蛋白数量的限制。
图2描绘了本公开内容的重组噬菌体指示噬菌体TSP12.MCP-PS-HiBiT的基因组结构的示意图。对于图2所示的实施方案，将HiBiT基因插入MCP的C末端以产生MCP-HiBiT融合蛋白。MCP位于晚期(III类)基因区域内，该基因区域在病毒生命周期的晚期表达。晚期基因的表达水平通常高于其他噬菌体基因，因为它们编码结构蛋白。因此，在图2所示的重组噬菌体的实施方案中，指示基因(即，HiBiT)被插入晚期基因区域中，在MCP基因的C末端，并且是包含HiBiT萤光素酶基因的构建体。还如图2所示，构建体可以包含接头和HRV 3C蛋白酶切割位点。HRV 3C蛋白酶切割位点允许在噬菌体制备期间从噬菌体中去除HiBit。
在一些实施方案中，
Figure BDA0003620488110000181
HiBiT检测系统(Promega Corporation)可用于通过酶组分或亚基的结合相互作用重构发光酶来检测分子接近度。
Figure BDA0003620488110000182
HiBiT检测系统利用来源于Oplophorus萤光素酶变体
Figure BDA0003620488110000183
的肽标签(HiBiT)和多肽(LgBiT)。在一些实施方案中，HiBiT(11个氨基酸)是标记亚基并且LgBiT(156个氨基酸)是检测亚基。因此，在一些实施方案中，指示噬菌体包含指示基因，其中指示基因是HiBiT。当HiBiT肽遇到LgBiT肽时，它们重构以形成全长的功能性萤光素酶。在一些实施方案中，检测试剂包含互补多肽LgBiT，其自发地与HiBiT标签相互作用以重构明亮的发光酶。酶。在一些实施方案中，指示蛋白复合物与Promega的
Figure BDA0003620488110000184
(一种咪唑并吡嗪酮底物(furimazine))组合，可提供具有低背景的稳健信号。在一些实施方案中，检测试剂包含
Figure BDA0003620488110000185
在一些实施方案中，检测亚基对标记亚基具有高亲和力。在进一步的实施方案中，标记亚基能够与检测亚基结合以形成指示复合物。HiBiT与LgBiT紧密结合，从而促进萤光素酶指示复合物的形成。在一些实施方案中，标记亚基和检测亚基之间的结合亲和力(平衡解离常数(KD))为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0nM。
在一些实施方案中，每个亚基表现出很少或没有报告子活性。在某些实施方案中，标记亚基和检测亚基是不发光的或基本上不发光的。在其他实施方案中，标记亚基是发光的。此外，报告基因不应由细菌内源性表达(即，不是细菌基因组的一部分)，应产生高信号背景比，并且应易于及时检测。
在一些实施方案中，将编码标记亚基的基因插入指示噬菌体基因组中。在某些实施方案中，标记亚基与噬菌体结构蛋白形成融合蛋白。这些蛋白质是噬菌体制造的最丰富的蛋白质，因为每个噬菌体颗粒都包含数十或数百个拷贝的这些分子。在一些实施方案中，标记亚基与噬菌体衣壳蛋白融合。在其他实施方案中，标记亚基与噬菌体尾纤维蛋白融合。在某些实施方案中，将编码标记亚基的基因插入噬菌体的晚期基因区域中。晚期基因区域可以是III类基因区并且可以包括主要衣壳蛋白的基因。在一些实施方案中，标记亚基与衣壳蛋白形成融合蛋白。例如，标记亚基可以与主要衣壳蛋白融合。主要衣壳蛋白以多个拷贝存在于噬菌体上。例如，T4噬菌体具有大约1,000个拷贝的主要衣壳蛋白，因此可以进一步放大信号。
报告子系统可能存在问题，因为它们会影响与其相互作用的蛋白质。在一些实施方案中，报告子系统对其融合伴侣具有最小的空间负担。在进一步的实施方案中，报告子系统对相互作用靶蛋白的亲和力和缔合动力学的影响最小。在一些实施方案中，每个亚基已经在结构上进行了优化。在某些实施方案中，标记亚基很小，从而使融合伴侣上的空间冲突最小化。在一些情况下，检测亚基针对稳定性进行了优化。在一些实施方案中，标记亚基比检测亚基小是有利的。因此，在某些实施方案中，标记亚基长度小于50、40、30、20、15、10或5个氨基酸。在进一步的实施方案中，检测亚基长度为至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸。
对感染因子的遗传修饰可以包括核酸的小片段、基因的主要部分或整个基因的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，插入或取代的核酸包含非天然序列。可以将非天然指示基因插入噬菌体基因组中，使其处于噬菌体启动子的控制之下。因此，在一些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。即，在一些实施方案中，可以配置遗传修饰使得指示蛋白产物不包含野生型噬菌体的多肽。在一些实施方案中，指示蛋白产物是可溶的。在一些实施方案中，本公开内容包括用于检测目标细菌的方法，其包括将测试样品与这种重组噬菌体孵育的步骤。
在一些实施方案中，在宿主细菌感染后在子代噬菌体中指示基因的表达产生游离的可溶性蛋白产物。在一些实施方案中，非天然指示基因与编码结构噬菌体蛋白的基因不连续，因此不产生融合蛋白。在某些情况下，使用非融合蛋白系统是有利的。例如，融合蛋白需要先通过蛋白水解将指示肽切割掉，然后从储备裂解物中的肽标签(例如，HiBiT)中纯化噬菌体颗粒。与采用指示蛋白与衣壳蛋白融合(即融合蛋白)的系统不同，本发明的一些实施方案表达可溶性指示物或报告子(例如，可溶性萤光素酶)。在一些实施方案中，指示物或报告子理想地不含噬菌体结构。也就是说，指示物或报告子不附着至噬菌体结构。因此，指示物或报告子的基因不与重组噬菌体基因组中的其他基因融合。这可以大大增加测定的灵敏度(低至单个细菌)，并简化测定，允许在一些实施方案中在不到一小时内完成测定，而不是由于构建体需要额外的纯化步骤而需要几个小时产生可检测的融合蛋白。此外，由于例如可能改变酶活性位点的构象或对底物接近的蛋白质折叠限制，融合蛋白的活性可能低于可溶性蛋白质。
在其他实施方案中，包含标记单元的融合蛋白在宿主细菌感染后在子代噬菌体中表达。在某些情况下，标记亚基基因与编码结构噬菌体蛋白的基因相邻，因此产生融合蛋白。融合蛋白可能会导致折叠限制，这可能会改变酶活性位点的构象或对底物接近。
为了保持非融合蛋白系统的优点，并保持转基因插入物小，在一些实施方案中，肽或多肽标签(例如，HiBiT)融合到可以充当稳定结构域的小蛋白质上。这可以通过将肽标签(例如，HiBiT)融合到已知较大蛋白质的截短形式，或将肽标签(例如，HiBiT)融合到已知的小蛋白质来实现。例如，小蛋白质包括6.5kDa抑肽酶(由177个核苷酸编码)或14kDaα乳清蛋白(由372个核苷酸编码)。在某些实施方案中，结构域之间存在短氨基酸接头。即使具有接头区域(例如，具有gly-ser-gly-ser接头的HiBiT是48个核苷酸长)，这些可溶性融合蛋白基因也将小于本领域已知的其他发光蛋白(例如，516个核苷酸长的
Figure BDA0003620488110000201
)。在一些实施方案中，指示噬菌体编码报告子(例如可检测的酶)的亚基。报告子(指示复合物)可以产生光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶是可商购获得的，例如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作报告子。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是报告子。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是报告子。产生可检测信号的其他工程改造的萤光素酶或其他酶也可以是合适的指示蛋白产物。
在一些实施方案中，可溶性指示蛋白产物的使用消除了从受感染的样品细胞的裂解物中去除污染性亲本噬菌体的需要。使用融合蛋白系统，用于感染样品细胞的任何噬菌体都将附着有指示蛋白产物，并且与也含有指示蛋白产物的子噬菌体无法区分。由于样品细菌的检测依赖于新产生的(从头合成的)指示蛋白产物的检测，因此使用融合构建体需要额外的步骤来将旧的(亲本)部分(指示蛋白)与新产生的(子噬菌体)部分(指示蛋白)分开。这可以通过在完成噬菌体生命周期之前多次洗涤受感染的细胞、在感染后通过物理或化学方式灭活多余的亲本噬菌体和/或用结合部分(例如生物素)化学修饰亲本噬菌体，然后可以结合和分离(例如通过链霉亲和素包被的琼脂糖珠)来实现。然而，即使进行了所有这些去除尝试，当使用高浓度的亲本噬菌体以确保感染少量样品细胞时，亲本噬菌体仍会保留，从而产生能够掩盖来自受感染的细胞子代噬菌体的信号的检测的背景信号。
相反，对于在本公开内容的一些实施方案中表达的可溶性指示蛋白产物，从最终裂解物中纯化亲本噬菌体是不必要的，因为亲本噬菌体没有附着任何指示蛋白产物。因此，感染后存在的任何指示蛋白产物必须是从头产生的，表明存在受感染的细菌。为了利用这种益处，亲本噬菌体的产生和制备可以包括从细菌培养中亲本噬菌体产生期间产生的任何游离指示蛋白中纯化噬菌体。可以采用标准噬菌体纯化技术来纯化根据本发明的噬菌体的一些实施方案，例如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度密度梯度离心、HPLC、尺寸排阻色谱和透析或衍生技术(例如Amicon牌浓缩器–Millipore,Inc.)。氯化铯等密度超速离心可用作本发明重组噬菌体制备的一部分，以将亲本噬菌体颗粒与细菌宿主中噬菌体增殖时产生的污染性萤光素酶蛋白分离。以这种方式，本发明的亲本重组噬菌体基本上不含在细菌产生期间产生的任何萤光素酶。去除存在于噬菌体原液中的残留萤光素酶可以显著降低当重组噬菌体与测试样品孵育时观察到的背景信号。
标准噬菌体纯化技术可用于纯化根据本公开内容的一些实施方案的噬菌体，例如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、尺寸排阻色谱和透析或衍生技术(例如Amicon牌浓缩器–Millipore,Inc.)。氯化铯等密度超速离心可用作本公开内容的重组噬菌体制备的一部分，以将亲本噬菌体颗粒与在细菌宿主中噬菌体繁殖时产生的污染性萤光素酶蛋白分离。以这种方式，本公开内容的亲本重组噬菌体基本上不含在细菌中在产生期间生成的任何萤光素酶。去除存在于噬菌体原液中的残留萤光素酶可以显著降低当重组噬菌体与测试样品孵育时观察到的背景信号。
在一些实施方案中，晚期启动子是T7、T4、T4样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1启动子或与类似于所选野生噬菌体(即没有基因修饰)中发现的另一种噬菌体启动子。晚期基因区域可以是III类基因区域，噬菌体可以来源于T7、T4、T4样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、葡萄球菌或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体，或另一种天然噬菌体，其基因组与T7、T4、T4样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、葡萄球菌或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体具有至少70、75、80、85、90或95％的同源性，或者对转录用于组装成噬菌体颗粒的结构蛋白的基因的相同噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和力。使用病毒晚期启动子可以确保萤光素酶指示蛋白产物的最佳高水平表达。使用源自指示噬菌体所源自的原始野生型噬菌体、对其具有特异性或在其下具有活性的病毒晚期启动子(例如，具有基于T4-、T7-、ViI-或Saka的系统的T4、T7、ViI或Saka晚期启动子)可以进一步确保指示蛋白产物的最佳表达。在某些情况下，使用标准的细菌(非病毒/非噬菌体)启动子可能对表达有害，因为这些启动子在噬菌体感染期间通常会被下调(以便噬菌体优先考虑细菌资源用于噬菌体蛋白的产生)。因此，在一些实施方案中，优选地对噬菌体进行工程改造以编码和高水平表达可溶性(游离)指示蛋白，使用基因组中的不限制表达至噬菌体结构组分的亚基数量的位置。
本公开内容的组合物可以包含一种或多种野生型或遗传修饰的感染因子(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可以包括可以编码和表达相同或不同指示蛋白的不同指示噬菌体的混合物。在一些实施方案中，噬菌体的混合物包含至少两种不同类型的重组噬菌体。
制备指示噬菌体的方法
制备指示噬菌体的方法的实施方案从选择用于遗传修饰的野生型噬菌体开始。一些噬菌体对靶标细菌高度特异。这为高度特异性检测提供了机会。
因此，本公开内容的方法利用结合剂的高特异性，与识别和结合特定目标微生物的感染因子缔合，作为放大信号并由此检测存在于样品中的低水平微生物(例如，单个微生物)的方法。例如，感染因子(例如噬菌体)特异性地识别特定微生物的表面受体，从而特异性地感染这些微生物。因此，这些感染因子可以是用于靶向目标微生物的合适的结合剂。如本文所讨论的，噬菌体可以在细菌内部复制以产生数百个子代噬菌体。插入噬菌体基因组中的指示基因产物的检测可用作样品中细菌的量度。
本公开内容的一些实施方案利用重组噬菌体的结合特异性和高水平基因表达能力用于快速和灵敏的靶向以感染和促进目标细菌的检测。在一些实施方案中，指示噬菌体被遗传修饰以包括报告基因。在一些实施方案中，噬菌体的晚期基因区域被遗传修饰以包括指示(报告)基因。在一些实施方案中，指示基因位于主要衣壳基因的下游。在其他实施方案中，指示基因位于主要衣壳基因的上游。在一些实施方案中，插入的基因构建体还包含其自身的外源专用启动子以驱动指示基因的表达。外源启动子是噬菌体基因组中任何内源启动子的补充。由于噬菌体产生多顺反子mRNA转录物，因此在转录物的第一个基因/顺反子上游只需要单个启动子。常规重组构建体仅使用内源性噬菌体启动子来驱动插入的基因。相反，在报告基因和核糖体结合位点上游添加额外的启动子可以通过充当转录的二级起始位点来增加基因表达。病毒复杂而紧凑的基因组通常在不同的框架中有重叠的基因，有时在两个不同的方向上。
用于制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括选择特异性感染靶病原菌例如大肠杆菌、克罗诺杆菌属物种、沙门氏菌属物种、李斯特菌属物种或葡萄球菌属物种的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化到靶病原菌中；用所选野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而使质粒/载体与噬菌体基因组之间发生同源重组；和分离重组噬菌体的特定克隆。
设计和制备同源重组质粒的各种方法是已知的。使用质粒来转化细菌的各种方法是已知的，包括热休克、F pilus介导的细菌结合、电穿孔和其他方法。在同源重组后分离特定克隆的各种方法也是已知的。本文描述的一些方法实施方案利用特定策略。
因此，用于制备指示噬菌体的方法的一些实施方案包括以下步骤：选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；确定所选噬菌体基因组的晚期区域的天然序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计与主要衣壳蛋白基因相邻的用于同源重组的序列，其中该序列包含密码子优化的报告基因；将设计用于同源重组的序列掺入质粒/载体中；将质粒/载体转化到靶病原菌中；选择转化的细菌；用所选野生型噬菌体感染转化的细菌，从而使质粒和噬菌体基因组之间发生同源重组；确定所得重组噬菌体裂解物的滴度；并进行有限稀释测定以富集和分离重组噬菌体。一些实施方案包括在第一次有限稀释测定之后根据需要进一步重复有限稀释和滴定步骤，直到重组噬菌体代表混合物的可检测级分。例如，在一些实施方案中，在分离重组噬菌体的特定克隆之前，可以重复有限稀释和滴定步骤直到混合物中至少1/30的噬菌体是重组的。在一些实施方案中，预计1:30的重组:野生型的比率会产生平均3.2个转导单位(TU)/96个噬斑(例如，在96孔板中)。如先前在美国申请号15/409,258中描述的，可以通过基于TCID50(组织培养感染剂量50％)进行有限稀释测定来测定重组与野生型噬菌体的起始比率。根据泊松分布，1:30的比率产生96％的机会在96孔中的某处观察到至少一个TU。
如本文所述，在某些实施方案中，可能优选利用已经从环境中分离的感染因子来产生本公开内容的感染因子。以这种方式，可以产生对天然衍生的微生物特异的感染因子。
有许多用于制备质粒的已知方法和商业产品。例如，可以组合使用PCR、定点诱变、限制性消化、连接、克隆和其他技术来制备质粒。合成质粒也可以通过商业方式订购(例如GeneWiz)。也可以使用粘粒，或者可以使用CRISPR/CAS9系统选择性地编辑噬菌体基因组。制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括设计可以容易地与野生型噬菌体基因组重组以产生重组基因组的质粒。在设计质粒时，一些实施方案包括添加密码子优化的报告基因，例如萤光素酶基因。一些实施方案还包括将元件添加到上游非翻译区中。例如，在设计与指示噬菌体基因组重组的质粒时，可以在编码gp23/主要衣壳蛋白C末端的序列和指示亚基(例如HiBiT指示基因)的起始密码子之间添加上游非翻译区。非翻译区可以包括启动子，例如T7、T4、T4样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1启动子。非翻译区还可以包括核糖体进入/结合位点(RBS)，也称为细菌系统的“Shine-Dalgarno序列”。这些元件中的一个或两个，或其他非翻译元件，可以嵌入短的上游非翻译区内，该区域由随机序列组成，其包含与噬菌体基因组的其余部分大致相同的GC含量。随机区域不应包含ATG序列，因为它将充当起始密码子。
MCP片段是编码病毒体蛋白的结构基因的一部分。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，因此可以预期只要使用晚期基因启动子和/或其他类似的控制元件，插入该区域内的任何基因具有相似的表达水平。在某些情况下，指示物(例如，HiBiT)与主要衣壳蛋白融合。在一些实施方案中，肽标签(即，HiBiT)融合到MCP的N末端。在其他实施方案中，肽标签融合到MCP的C末端。
在一些实施方案中，指示噬菌体经基因工程改造以包含指示基因，例如萤光素酶基因的亚基。例如，指示噬菌体可以对特定目标细菌具有特异性，其中基因组包含HiBit基因的序列。重组指示HiBit噬菌体基因组可以进一步包含T7、T4、T4样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、ViI或其他晚期启动子的共有启动子。在进一步的实施方案中，启动子是外源启动子。插入外源启动子以驱动指示基因的表达是有利的，因为该表达不受其他噬菌体蛋白(例如，主要衣壳蛋白)的表达的限制。
因此，在重组产生的重组噬菌体的实施方案中，指示基因或亚基基因(例如，HiBiT)被插入晚期基因区域内，就在编码主要衣壳蛋白的基因的下游，从而产生包含HiBiT基因的重组噬菌体基因组。构建体可另外包含T7、T4、T4样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、ViI或另一种晚期启动子或另一种合适的启动子以驱动萤光素酶基因的转录和表达。构建体还可以包含从几个UTR合成的复合非翻译区。该构建体确保产生可溶性萤光素酶，使得表达不受噬菌体展示系统中固有的衣壳蛋白数量的限制。
通过设计用于与野生型噬菌体基因组重组的质粒的同源重组而产生的重组噬菌体可以从包含非常小百分比(例如，0.005％)的总噬菌体基因组的混合物中分离。分离后，可以进行大规模生产以获得适合用于检测测定法的高滴度重组指示噬菌体原液。此外，氯化铯等密度密度梯度离心可用于将噬菌体颗粒与污染性萤光素酶蛋白分离以降低背景。
使用感染因子用于检测细菌的方法
如本文所述，在某些实施方案中，本公开内容可包括使用感染性颗粒来检测微生物的方法。本公开内容的方法可以以多种方式体现。
在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中的目标细菌的方法，其包括以下步骤：将样品与感染目标细菌的噬菌体孵育，其中所述噬菌体包含指示基因或指示基因的亚基，使得在目标细菌感染后噬菌体复制期间指示基因或亚基的表达导致指示蛋白产物的产生；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在目标细菌。在一些实施方案中，指示蛋白产物是融合蛋白。在其他实施方案中，指示蛋白产物是可溶性非融合蛋白。
在某些实施方案中，可以执行测定以利用可以经修改以适应不同样品类型或大小和测定形式的一般概念。使用本公开内容的指示噬菌体的实施方案可以允许快速检测特定的细菌菌株，例如大肠杆菌、克罗诺杆菌属物种、沙门氏菌属物种、李斯特菌属物种或葡萄球菌属物种，总测定时间低于1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5或26.0小时，取决于样品类型、样品大小和测定形式。例如，所需的时间量可能会稍短或稍长，取决于噬菌体菌株和要在测定法中检测的细菌菌株、要测试的样品的类型和大小、靶标存活所需的条件、物理/化学环境的复杂性，以及“内源性”非靶标细菌污染物的浓度。
在一些实施方案中，噬菌体(例如，SEA1、TSP1、TSP12、T7、T4、T4样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1噬菌体)可以经工程改造以在噬菌体复制期间表达指示基因或亚基。指示基因的表达由病毒衣壳启动子(例如，噬菌体T7或T4晚期启动子)驱动，产生高表达。
亲本噬菌体将表达指示蛋白或亚基(例如，HiBit)。因此，通常需要从子代噬菌体中分离出亲本噬菌体或从亲本噬菌体中去除指示蛋白或亚基，以便测定中的信号来自细菌细胞感染期间子代噬菌体的复制，而不是来自亲本噬菌体。
在一些实施方案中，没有来自亲本噬菌体的背景信号或基本上没有来自亲本噬菌体的背景信号。在某些情况下，指示物或亚基(例如，HiBiT)是不发光的或基本上不发光的。在进一步的实施方案中，在添加底物之前从亲本噬菌体中去除指示物或亚基，因此在测定中检测到的信号肯定来自细菌细胞感染期间子代噬菌体的复制。本领域公知的任何方法都可用于从亲本噬菌体中去除指示物或亚基(例如，HiBiT)。例如，可以将蛋白酶可切割的接头(切割标签)克隆到亲本噬菌体中。合适的切割标签的选择取决于所选噬菌体。例如，切割标签可选自3C(PreScission)(LEVLFQ/GP)、EKT(肠激酶)(DDDDK/)、FXa(FXa因子)(IEGR/)、TEV(烟草蚀刻病毒)(ENLYFQ/G)和凝血酶(LVPR/GS)。每个切割标签的主要切割位点用“/”表示。因此，在一些实施方案中，指示噬菌体包含蛋白酶切割位点。例如，指示噬菌体可以包含指示亚基(肽)-衣壳蛋白的融合物，其含有蛋白酶切割位点。蛋白酶切割位点可以是重组的，即在遗传修饰过程中添加或产生。在进一步的实施方案中，将蛋白酶添加到亲本噬菌体。在一些实施方案中，在噬菌体制备期间添加蛋白酶以从亲本噬菌体去除指示亚基，从而产生可溶性指示亚基(肽)。在进一步的实施方案中，在浓缩噬菌体之后添加蛋白酶。在某些情况下，在纯化之前添加蛋白酶，纯化以去除在产生感染因子原液时可能生成的任何残留指示蛋白。
所选蛋白酶对切割标签具有特异性。3C、EKT、FXa、TEV和凝血酶切割标签可分别被人鼻病毒(HRV)、肠激酶、FXa因子、烟草蚀刻病毒蛋白酶和凝血酶所切割。每种切割酶的特异性各不相同。例如，HRV是一种高度特异性的蛋白酶，在切割标签中的Glu和Gly残基之间进行切割。肠激酶是一种肠道酶，通常参与胰蛋白酶的蛋白酶切割。它在识别序列中的赖氨酸(K)后切割。Xa因子在Arg残基之后进行切割，但在二级碱性位点的切割频率也较低。它最常见的二级切割位点位于其自身识别位点的Gly和Arg残基之间，尽管这些事件的频率是蛋白质特异性的。TEV的切割发生在Glu和Gly残基之间。据报道，与EKT、凝血酶或Xa因子相比，TEV对其识别位点具有更好的特异性。凝血酶优先在Arg和Gly残基之间进行切割。脱靶切割可能发生在非特异性位点，通常来自污染性蛋白酶。为了确保最大的蛋白质完整性，酶试剂必须非常纯净。
在一些实施方案中，可以在测试之前通过在促进生长的条件下孵育来富集样品。在这样的实施方案中，富集期可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16小时或更长，这取决于样品类型和大小。
在一些实施方案中，指示噬菌体包含指示基因，并且可以通过指示基因的表达产生的放大信号来检测单个病原细胞(例如，细菌)的感染。因此，所述方法可以包括检测在噬菌体复制期间产生的指示蛋白，其中指示蛋白的检测表明样品中存在目标细菌。
在一个实施方案中，本公开内容可以包括用于检测样品中的目标细菌的方法，其包括以下步骤：将样品与感染目标细菌的指示噬菌体孵育，其中指示噬菌体包含插入噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得指示基因在宿主细菌感染后噬菌体复制期间的表达导致指示蛋白产物的产生；将指示蛋白产物与检测试剂孵育，其中检测试剂包含与指示蛋白产物互补的多肽，并且其中指示蛋白产物及其互补多肽用于指示复合物；和检测指示复合物，其中指示复合物的阳性检测表明样品中存在目标细菌。在一些实施方案中，检测到的指示物的量对应于样品中存在的目标细菌的量。
如本文更详细描述的，本公开内容的方法和系统可以利用一系列浓度的亲本指示噬菌体来感染样品中存在的细菌。在一些实施方案中，将指示噬菌体以足以快速发现、结合和感染在样品中以非常低的数量存在的靶标细菌(例如单个细胞)的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，噬菌体浓度可以足以在少于一小时内发现、结合和感染靶标细菌。在其他实施方案中，这些事件可以在向样品中添加指示噬菌体后少于两小时或少于三小时内发生。例如，在某些实施方案中，用于孵育步骤的噬菌体浓度大于1x105PFU/mL、大于1x106PFU/mL或大于1x107PFU/mL。
在某些实施方案中，可以纯化感染因子以不含在产生感染因子原液时可能生成的任何残留指示蛋白。因此，在某些实施方案中，可以在与样品孵育之前使用氯化铯等密度密度梯度离心来纯化指示噬菌体。当感染因子是噬菌体时，这种纯化可具有去除没有DNA的噬菌体(即空噬菌体或“菌蜕”)的额外益处。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，可以在不从样品中分离或纯化微生物的情况下检测微生物。例如，在某些实施方案中，可以将含有一种或几种目标微生物的样品直接施加到测定容器，例如离心柱、微量滴定孔或过滤器，并且在该测定容器中进行测定。此类测定的各种实施方案在本文中公开。
可以将测试样品的等分试样直接分配到多孔板的孔中，可以添加指示噬菌体，并且在足以感染的一段时间后，可以添加裂解缓冲液以及用于指示蛋白的底物(例如，萤光素酶指示物的萤光素酶底物)并测定指示信号的检测。所述方法的一些实施方案可以在滤板上进行。在用指示噬菌体感染之前，可以在样品浓缩或不浓缩的情况下进行所述方法的一些实施方案。
例如，在许多实施方案中，多孔板用于进行测定。板(或可以在其中进行检测的任何其他容器)的选择可能影响检测步骤。例如，某些板可以包含彩色或白色背景，这可能影响光发射的检测。一般来说，白板具有更高的灵敏度，但也产生更高的背景信号。板的其他颜色可能产生较低的背景信号，但灵敏度也会稍低。此外，背景信号的一个原因是光从一个孔泄漏到另一个相邻的孔。有些板有白色的孔，但板的其余部分是黑色的。这允许在孔内产生高信号，但防止孔间的光泄露，并因此可以降低背景。因此，板或其他测定容器的选择可能影响测定的灵敏度和背景信号。
本公开内容的方法可以包括各种其他步骤以增加灵敏度。例如，如本文更详细讨论的，所述方法可以包括在添加噬菌体之后但在孵育之前洗涤捕获的和感染的细菌的步骤，以去除过量的亲本噬菌体和/或萤光素酶或污染噬菌体制备物的其他报告蛋白。
在一些实施方案中，可以完成目标微生物的检测而不需要培养样品作为增加微生物群的一种方式。例如，在某些实施方案中，检测所需的总时间少于26.0、25.0、24.0、23.0、22.0、21.0、20.0、19.0、18.0、17.0、16.0小时、15.0小时、14.0小时、13.0小时、12.0小时、11.0小时、10.0小时、9.0小时、8.0小时、7.0小时、6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或少于30分钟。最大限度地缩短获得结果的时间对于病原体的食品和环境测试至关重要。
与本领域已知的测定相反，本公开内容的方法可以检测单个微生物。因此，在某些实施方案中，所述方法可以检测样品中存在的≤10个细胞的微生物(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9个微生物)。例如，在某些实施方案中，指示噬菌体对特定目标细菌高度特异。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在存在其他类型细菌的情况下区分目标细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体可用于检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体检测样品中少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个的特定细菌。
因此，本公开内容的方面提供了用于通过指示复合物检测测试样品中的微生物的方法。在一些实施方案中，当目标微生物是细菌时，指示复合物的一个或多个亚基可以与感染因子例如指示噬菌体缔合。指示复合物可与底物反应以发射可检测信号或可发射固有信号(例如荧光蛋白)。在一些实施方案中，检测灵敏度可以揭示测试样品中少至50、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2个细胞的目标微生物的存在。在一些实施方案中，甚至单个细胞的目标微生物也可以产生可检测的信号。在一些实施方案中，噬菌体是T4样或ViI样噬菌体。
在一些实施方案中，由感染因子编码的指示蛋白可以在感染因子的复制期间或之后是可检测的。适合用作指示部分的许多不同类型的可检测生物分子在本领域中是已知的，并且许多是可商购获得的。在一些实施方案中，指示噬菌体包含编码酶的指示基因，酶用作指示蛋白。在其他实施方案中，指示噬菌体包含编码酶的亚基的指示基因，酶的亚基用作指示部分。在一些实施方案中，指示噬菌体的基因组经修饰以编码可溶性非融合蛋白。在其他实施方案中，指示噬菌体的基因组经修饰以编码融合蛋白。在一些实施方案中，指示噬菌体编码可检测酶的亚基(即指示蛋白产物)。在一些实施方案中，可检测酶的亚基在可检测酶的互补亚基的存在下孵育，使得它们重构以形成功能性酶(即指示复合物)。指示复合物可以发光和/或可以通过添加底物的颜色变化而是可检测的。各种合适的酶可商购获得的，例如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作指示蛋白。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是可检测的酶。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是可检测的酶。在一些实施方案中，
Figure BDA0003620488110000321
是可检测的酶。在一些实施方案中，HiBiT-LgBiT复合物是可检测的酶。在一些实施方案中，是可检测的酶。产生可检测信号的其他工程改造的萤光素酶或其他酶也可以与本文详细描述的实施方案一起使用。
在一些实施方案中，指示基因编码能够发射内在信号的蛋白质的亚基，例如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或其他)。指示蛋白的亚基(标记亚基)可以与蛋白质的第二亚基(检测亚基)重构以形成指示复合物。指示复合物可以发光和/或可以通过颜色变化是可检测的。在一些实施方案中，指示复合物是与底物相互作用以产生信号的功能性酶(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，标记亚基是萤光素酶基因的亚基。在一些实施方案中，萤光素酶基因是Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、Gaussia萤光素酶、Lucia萤光素酶或工程改造的萤光素酶例如
Figure BDA0003620488110000322
Rluc8.6-535或Orange Nano-lantern中的一种。
检测指示物可以包括检测光的发射。在一些实施方案中，可使用光度计来检测指示物(例如，萤光素酶)与底物的反应。RLU的检测可以通过光度计来实现，或者也可以使用其他机器或设备。例如，分光光度计、CCD相机或CMOS相机可以检测颜色变化和其他光发射。绝对RLU对于检测很重要，但信号背景比也需要很高(例如，>2.0、>2.5或>3.0)，以便可靠地检测单个细胞或少量细胞。
在一些实施方案中，指示噬菌体经基因工程改造以包含酶(例如萤光素酶)的基因的亚基。因此，酶(例如萤光素酶)仅在噬菌体特异性识别和感染的细菌的感染以及随后用检测亚基重构在子代噬菌体上表达的标记亚基时产生。在某些情况下，指示部分在病毒生命周期的晚期表达。在一些实施方案中，指示物是融合蛋白。在其他实施方案中，如本文所述，指示物是可溶性蛋白质(例如，可溶性萤光素酶)并且不与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。
因此，在使用指示噬菌体的一些实施方案中，本公开内容包括用于检测目标微生物的方法，其包括以下步骤：捕获至少一种样品细菌；将至少一种细菌与多个指示噬菌体孵育；为感染和复制留出时间以产生子代噬菌体并表达指示部分；用检测亚基重构指示部分，从而形成指示复合物；以及检测子代噬菌体，或优选地指示复合物，其中指示复合物的检测证明样品中存在细菌。
例如，在一些实施方案中，可以通过结合到板的表面，或通过细菌过滤器(例如，0.45μm孔径旋转过滤器或板过滤器)过滤样品来捕获测试样品细菌。在一个实施方案中，将感染因子(例如，指示噬菌体)以最小体积直接添加到在过滤器上的捕获样品中。在一个实施方案中，捕获在过滤器或板表面上的微生物随后被洗涤一次或多次以去除过量的未结合的感染因子。在一个实施方案中，可以添加培养基(例如，Luria-Bertani肉汤，在本文中也称为LB、缓冲蛋白胨水，在本文中也称为BPW，或胰蛋白酶大豆肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤，在本文中也称为TSB)用于进一步的孵育时间，以允许细菌细胞和噬菌体的复制以及编码指示部分的基因的高水平表达。然而，测试测定的一些实施方案的一个令人惊讶的方面是与指示噬菌体的孵育步骤只需要足够长的时间以用于单个噬菌体生命周期。以前认为使用噬菌体的扩增能力需要更多时间，以使噬菌能复制几个周期。根据本公开的一些实施方案，指示噬菌体的单个复制周期可以足以促进灵敏和快速的检测。
在一些实施方案中，可以将包含细菌的测试样品的等分试样施加到离心柱上，并且在用重组噬菌体感染和任选洗涤以去除任何过量的噬菌体之后，检测到的可溶性指示物的量将与由受感染的细菌产生的噬菌体的量成比例。
在一些实施方案中，在与包含检测亚基的检测试剂孵育之前裂解子代噬菌体。在一些实施方案中，检测试剂还包括底物。例如，在利用Nano-Glo HiBiT裂解检测系统技术的检测系统中，必须裂解表达HiBiT的子代噬菌体，以使互补多肽LgBiT接近HiBiT。当HiBiT遇到LgBiT时，它们重构以形成功能性萤光素酶。
然后可以测量和量化在细菌裂解时释放到周围液体中的可溶性指示物。在一个实施方案中，将溶液旋转通过过滤器，并在添加指示酶的底物(例如，萤光素酶底物)之后将滤液收集在新容器中(例如，在光度计中)用于测定。可替代地，可以直接在过滤器上测量指示信号。
在各种实施方案中，纯化的亲本指示噬菌体不包含可检测指示物本身，因为亲本噬菌体可以在用于与测试样品孵育之前被纯化。晚期(III类)基因的表达发生在病毒生命周期的晚期。在本公开的一些实施方案中，可以纯化亲本噬菌体以排除任何存在的指示蛋白(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。因此，在许多实施方案中，不需要在检测步骤之前将亲本噬菌体与子代噬菌体分开。在一个实施方案中，微生物是细菌并且指示噬菌体是噬菌体。在一个实施方案中，指示蛋白是可溶性萤光素酶，其在宿主微生物裂解时释放。
因此，在一个替代实施方案中，指示底物(例如，萤光素酶底物)可以与保留在过滤器上或结合到板表面的样品部分孵育。因此，在一些实施方案中，固体支持物是96孔滤板(或常规96孔板)，并且可以通过将板直接放置在发光计中来检测底物反应。
例如，在一个实施方案中，本公开内容可以包括用于检测沙门氏菌属物种的方法，其包括以下步骤：用多个能够在感染时表达萤光素酶的亲本指示噬菌体感染在96孔滤板上捕获的细胞；洗去多余的噬菌体；添加LB肉汤并留出时间用于噬菌体复制和裂解特定的沙门氏菌属物种靶标(例如，30-120分钟)；和通过直接在96孔板中添加萤光素酶底物并测量萤光素酶活性来检测指示萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表明样品中存在沙门氏菌属物种。
在另一个实施方案中，本公开内容可包括用于检测沙门氏菌属物种的方法，其包括以下步骤：用多个能够在感染时表达指示基因的亲本指示噬菌体感染96孔板中的液体溶液或悬浮液中的细胞；留出时间用于噬菌体复制和裂解特定的沙门氏菌属物种靶标(例如，30-120分钟)；和通过直接在96孔板中添加萤光素酶底物并测量萤光素酶活性来检测指示萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表明样品中存在沙门氏菌属物种。在这样的实施方案中，不需要捕获步骤。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是可消耗的测试样品，例如蔬菜洗液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩的LB肉汤、胰蛋白酶/胰蛋白胨大豆肉汤、蛋白胨水或营养肉汤强化的蔬菜洗液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是细菌稀释在LB肉汤中。
在一些实施方案中，指示蛋白(例如，萤光素酶)与底物的反应可以持续30分钟或更长时间，并且在不同时间点的检测对于优化灵敏度是需要的。例如，在使用96孔滤板作为固体支持物和萤光素酶作为指示物的实施方案中，最初以及以10或15分钟的间隔获取光度计读数，直到反应完成。
令人惊讶的是，用于感染测试样品的高浓度噬菌体已经在非常短的时间内成功地实现了对非常低的数量的靶标微生物的检测。在一些实施方案中，噬菌体与测试样品的孵育只需要足够长的时间以用于单个噬菌体生命周期。在一些实施方案中，该孵育步骤的噬菌体浓度大于7x106、8x106、9x106、1.0x107、1.1x107、1.2x107、1.3x107、1.4x107、1.5x107、1.6x107、1.7x107、1.8x107、1.9x107、2.0x107、3.0x107、4.0x107、5.0x107、6.0x107、7.0x107、8.0x107、9.0x107或1.0x108PFU/mL。
如此高浓度的噬菌体的成功是令人惊讶的，因为大量的噬菌体先前与“自外溶菌作用”相关，这会杀死靶标细胞，从而阻止早期噬菌体测定产生有用的信号。本文所述的制备的噬菌体原液的清理可能有助于缓解这个问题(例如，通过氯化铯等密度密度梯度超速离心进行清理)，因为除了去除与噬菌体相关的任何污染性指示基因外，这种清理还可以去除菌蜕颗粒(已丢失DNA的颗粒)。菌蜕可以通过“自外溶菌作用”来裂解细菌细胞，过早地杀死细胞，从而阻止指示信号的产生。电子显微镜表明，粗噬菌体裂解物(即在氯化铯清理之前)可能有超过50％的菌蜕。这些菌蜕颗粒可能通过许多噬菌体颗粒刺穿细胞膜的作用导致微生物过早死亡。因此，菌蜕颗粒可能导致了以前的问题，其中据报道高PFU浓度是有害的。此外，非常干净的噬菌体制备允许在没有洗涤步骤的情况下进行测定，这使得测定可以在没有初始浓缩步骤的情况下进行。一些实施方案确实包括初始浓缩步骤，并且在一些实施方案中，该浓缩步骤允许更短的富集孵育时间。
测试方法的一些实施方案可以进一步包括验证性测定。本领域已知有多种测定法用于确认初始结果，通常在较晚的时间点。例如，可以对样品进行培养(例如，
Figure BDA0003620488110000361
测定法、PCR可用于确认微生物DNA的存在，或其他确认测定法可用于确认初始结果。
在某些实施方案中，除了用感染因子进行检测外，本公开内容的方法组合使用结合剂(例如，抗体)以从样品中纯化和/或浓缩目标微生物。例如，在某些实施方案中，本公开内容包括用于检测样品中的目标微生物的方法，其包括以下步骤：使用对目标微生物特异的捕获抗体从先前支持物上的样品中捕获微生物；将样品与包含指示基因的重组指示噬菌体孵育，其中所述指示基因编码指示蛋白的第一亚基，从而产生一定量的表达第一亚基的子代噬菌体；裂解一定量的子代噬菌体；在检测试剂的存在下孵育裂解的子代噬菌体，其中检测试剂包含指示蛋白的第二亚基，从而允许第一亚基和第二亚基重构而形成指示蛋白复合物；和检测指示蛋白复合物，其中指示蛋白复合物的阳性检测表明样品中存在特定目标细菌。在一些实施方案中，合成噬菌体被设计为优化用于病原体检测测定的所需性状。在一些实施方案中，生物信息学和先前的遗传修饰分析用于优化所需性状。例如，在一些实施方案中，可以优化编码噬菌体尾蛋白的基因以识别和结合特定种类的细菌。在其他实施方案中，可以优化编码噬菌体尾蛋白的基因以识别和结合整个细菌属或属内的特定物种组。通过这种方式，可以优化噬菌体以检测更宽或更窄的病原体组。在一些实施方案中，可以设计合成噬菌体以改善报告基因的表达。另外地和/或可替代地，在一些情况下，可以设计合成噬菌体以增加噬菌体的裂解量来改善检测。
在一些实施方案中，可以优化噬菌体的稳定性以改善保质期。例如，可以增加酶的溶解度以增加随后的噬菌体稳定性。另外地和/或可替代地，可以优化噬菌体热稳定性。热稳定噬菌体在储存期间更好地保持功能活性，从而增加保质期。因此，在一些实施方案中，可以优化热稳定性和/或pH耐受性。
本公开内容的系统和试剂盒
在一些实施方案中，本公开内容包括系统(例如，自动化系统或试剂盒)，其包含用于执行本文公开的方法的组分。在一些实施方案中，指示噬菌体包含在根据本公开内容的系统或试剂盒中。本文所述的方法也可利用此类指示噬菌体系统或试剂盒。考虑到执行所述方法所需的试剂和材料的最小量，本文描述的一些实施方案特别适用于自动化和/或试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒的每个组分可包括可从第一部位递送至第二部位的独立单元。
在一些实施方案中，本公开内容包括用于快速检测样品中目标微生物的系统或试剂盒。在某些实施方案中，系统或试剂盒可以包括用于将样品与对目标微生物特异的感染因子孵育的组分，其中感染因子包括指示基因和用于检测指示蛋白的组分。在本公开内容的系统和试剂盒两者的一些实施方案中，感染因子是感染目标细菌的重组噬菌体，并且重组噬菌体包含编码指示蛋白的肽或多肽亚基的指示基因。在一些实施方案中，插入噬菌体的晚期基因区域中的指示基因是指示部分，使得在感染宿主细菌后噬菌体复制期间指示基因的表达产生指示蛋白产物的亚基。因此，一些系统还包括检测试剂，其中检测试剂包含指示蛋白的多肽亚基，其中多肽亚基与肽亚基重构以形成指示蛋白复合物，以及用于与指示蛋白复合物反应以检测指示蛋白复合物的底物。此外，一些系统还包括用于捕获在固体支持物上的目标微生物的组分。
在其他实施方案中，本公开内容包括用于快速检测样品中的目标微生物的方法、系统或试剂盒，其包括对目标微生物特异的感染因子组分，其中感染因子包含指示部分，以及用于检测指示蛋白的组分。在某些实施方案中，重组噬菌体对特定细菌高度特异。
在某些实施方案中，系统和/或试剂盒还可包括用于洗涤捕获的微生物样品的组分。另外地或可替代地，系统和/或试剂盒还可包括用于确定指示部分的量的组分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。例如，在某些实施方案中，系统或试剂盒可以包括用于测量萤光素酶活性的光度计或其他装置。
在一些系统和/或试剂盒中，相同的组分可以用于多个步骤。在一些系统和/或试剂盒中，步骤是自动化的或由用户通过计算机输入控制和/或其中液体处理机器人执行至少一个步骤。
因此，在某些实施方案中，本公开内容可包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统或试剂盒，其包括：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组分，其中感染因子包含指示部分；用于从固体支持物上的样品中捕获微生物的组分；用于洗涤捕获的微生物样品以去除未结合的感染因子的组分；以及用于检测指示部分的组分。在一些实施方案中，相同的组分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤(例如，过滤器组分)。一些实施方案另外包括用于确定样品中目标微生物的量的组分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。这样的系统可以包括与上述用于快速检测微生物的方法类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌并且感染因子是噬菌体。在计算机化系统中，系统可以是完全自动化的、半自动化的或由用户通过计算机(或其某些组合)来指导的。
在一些实施方案中，系统可以包括用于将目标微生物与样品中的其他组分分离的组分。
在一个实施方案中，本公开内容包括包含用于检测目标微生物的组分的系统或试剂盒，其包括：用于将至少一种微生物与样品中的其他组分分离的组分；用于用多种亲本感染因子感染至少一种微生物的组分；用于裂解至少一种受感染的微生物以释放存在于微生物中的子代感染因子的组分；以及用于检测子代感染因子或以更高灵敏度检测由感染因子编码和表达的可溶性蛋白质的组分，其中检测到感染因子或感染因子的蛋白质产物或其亚基，表明样品中存在微生物。在一些实施方案中，系统或试剂盒可进一步包括用于重构感染因子的蛋白质产物的亚基以形成可检测的指示蛋白复合物的组分。感染因子可包括携带HiBiT指示基因的噬菌体。
在其他实施方案中，本公开内容可包括用于快速检测样品中的目标微生物的试剂盒，系统包括：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子孵育的组分，其中感染因子包含指示蛋白的亚基；用于从固体支持物上的样品中捕获微生物的组分；用于洗涤捕获的微生物样品以去除未结合的感染因子的组分；以及用于检测指示蛋白的组分(即检测试剂)。在一些实施方案中，检测试剂包含指示蛋白的多肽亚基，其中多肽亚基与肽亚基重构以形成指示蛋白复合物，和用于与指示蛋白复合物反应以检测指示蛋白复合物的底物。相同的组分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤。一些实施方案另外包括用于确定样品中目标微生物的量的组分，其中检测到的指示蛋白复合物的量对应于样品中微生物的量。这样的试剂盒可包括与上述用于快速检测微生物的方法类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌并且感染因子是噬菌体。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于捕获目标微生物的组分。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于将目标微生物与样品中的其他组分分离的组分。
本公开内容的这些系统和试剂盒包括各种组分。如本文所用，术语“组分”被广义地定义并且包括适合于执行所述方法的任何合适的装置或装置的集合。组分不需要以任何特定方式彼此整体连接或定位。本公开内容包括组分相对于彼此的任何合适的布置。例如，组分不必在同一个房间中。但是在一些实施方案中，这些组分在一个整体单元中彼此连接。在一些实施方案中，相同的组分可以执行多种功能。
计算机系统和计算机可读介质
如在本技术中描述的系统或其任何组分，可以以计算机系统的形式体现。计算机系统的典型示例包括通用计算机、编程的微处理器、微控制器、外围集成电路元件和能够实施构成本技术的方法的步骤的其他设备或设备布置。
计算机系统可以包括计算机、输入设备、显示单元和/或互联网。计算机还可以包括微处理器。微处理器可以连接到通信总线。计算机还可以包括存储器。存储器可以包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机系统还可以包括存储设备。存储设备可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器，例如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备还可以是用于将计算机程序或其他指令加载到计算机系统中的其他类似工具。计算机系统还可以包括通信单元。通信单元允许计算机通过I/O接口连接到其他数据库和互联网。通信单元允许向其他数据库传输数据以及从其他数据库接收数据。通信单元可以包括调制解调器、以太网卡或使计算机系统能够连接到诸如LAN、MAN、WAN和互联网的数据库和网络的任何类似设备。因此，计算机系统可以促进用户通过输入设备进行输入，通过I/O接口访问系统。
计算设备通常将包括为该计算设备的一般管理和操作提供可执行程序指令的操作系统，并且通常将包括计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)存储指令，当由服务器的处理器执行时，允许计算设备执行其预期功能。计算设备的操作系统和一般功能性的合适实现是已知的或可商购获得的，并且本领域普通技术人员容易实现，特别是根据本文的公开内容。
计算机系统执行存储在一个或多个存储元件中的一组指令，以便处理输入数据。存储元件还可以根据需要保存数据或其他信息。存储元件可以是信息源或存在于处理机器中的物理存储器元件的形式。
环境可以包括各种数据存储器和其他存储器以及如上所述的存储介质。这些可以驻留在各种位置，例如在一个或多个计算机本地(和/或驻留在其中)的存储介质上，或者在网络上远离任何或所有计算机的存储介质上。在一组特定的实施方案中，信息可以驻留在本领域技术人员熟悉的存储区域网络(“SAN”)中。类似地，用于执行归属于计算机、服务器或其他网络设备的功能的任何必要文件可以视情况而定在本地和/或远程存储。在系统包括计算设备的情况下，每个这样的设备可以包括可以通过总线电耦合的硬件元件，这些元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入设备(例如鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)以及至少一个输出设备(例如，显示设备、打印机或扬声器)。这样的系统还可以包括一个或多个存储设备，例如磁盘驱动器、光学存储设备和固态存储设备，例如随机存取存储器(“RAM”)或只读存储器(“ROM”)，以及作为可移动媒体设备、存储卡、闪存卡等。
这样的设备还可以包括计算机可读存储介质读取器、通信设备(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通信设备等)和如上所述的工作存储器。计算机可读存储介质读取器可以与计算机可读存储介质连接或被配置为接收计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质代表远程、本地、固定和/或可移动存储设备以及用于临时和/或更永久地包含、存储、传输和检索计算机可读信息的存储介质。系统和各种设备通常还将包括位于至少一个工作存储器设备内的多个软件应用程序、模块、服务器或其他元件，包括操作系统和应用程序，例如客户端应用程序或Web浏览器。应当理解，替代实施方案可以具有与上述实施方案不同的许多变化。例如，还可以使用定制的硬件和/或可以在硬件、软件(包括便携式软件，例如小程序)或两者中实现特定元件。此外，可以采用与诸如网络输入/输出设备之类的其他计算设备的连接。
用于包含代码或部分代码的非瞬态存储介质和计算机可读介质可以包括本领域已知或使用的任何适当介质，包括存储介质和通信介质，例如但不限于以任何方法或技术实现的用于存储和/或传输信息(例如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的易失性和非易失性、可移动和不可移动的介质，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储器技术、CD-ROM、数字多功能磁盘(DVD)或其他光学存储器、磁盒、磁带、磁盘存储器或其他磁性存储设备，或任何其他可用于存储所需信息且可由系统设备访问的介质。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将理解实现各种实施方案的其他方式和/或方法。
计算机可读介质可以包括但不限于能够为处理器提供计算机可读指令的电子、光学、磁性或其他存储设备。其他示例包括但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(“CAM”)、DDR、闪存例如NAND闪存或NOR闪存、ASIC、配置的处理器、光存储器、磁带或其他磁存储器，或者计算机处理器可以从中读取指令的任何其他介质。在一个实施方案中，计算设备可以包括单一类型的计算机可读介质，例如随机存取存储器(RAM)。在其他实施方案中，计算设备可以包括两种或更多种类型的计算机可读介质，例如随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和缓存。计算设备可以与一个或多个外部计算机可读介质通信，例如外部硬盘驱动器或外部DVD或蓝光驱动器。
如上面所讨论的，实施方案包括处理器，其被配置为执行计算机可执行程序指令和/或访问存储在存储器中的信息。指令可以包括由编译器和/或解释器从以任何合适的计算机编程语言编写的代码生成的处理器专用指令，包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(Adobe Systems，Mountian View，Calif.)。在一个实施方案中，计算设备包括单个处理器。在其他实施方案中，设备包括两个或更多个处理器。这样的处理器可以包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。这样的处理器还可以包括可编程电子设备例如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑设备(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、电子可编程只读存储器(EPROM或EEPROM)或其他类似的设备。
计算设备包括网络接口。在一些实施方案中，网络接口被配置用于通过有线或无线通信链路进行通信。例如，网络接口可以允许通过以太网、IEEE 802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外线等在网络上进行通信。作为另一个示例，网络接口可以允许通过例如CDMA、GSM、UMTS或其他蜂窝通信网络在网络上进行通信。在一些实施方案中，网络接口可以允许与另一设备的点对点连接，例如通过通用串行总线(USB)、1394FireWire、串行或并行连接或类似接口。合适的计算设备的一些实施方案可以包括用于在一个或多个网络上进行通信的两个或更多个网络接口。在一些实施方案中，计算设备可以包括除了网络接口之外或代替网络接口的数据存储器。
合适的计算设备的一些实施方案可以包括多个外部或内部设备或与之通信，例如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、音频扬声器、一个或多个麦克风或者任何其他输入或输出设备。例如，计算设备可以与各种用户界面设备和显示器进行通信。显示器可以使用任何合适的技术，包括但不限于LCD、LED、CRT等。
由计算机系统执行的指令集可以包括指示处理机器执行特定任务(例如构成本技术的方法的步骤)的各种命令。指令集可以是软件程序的形式。此外，如在本技术中，软件可以是单独程序的集合、具有较大程序的程序模块或程序模块的一部分的形式。软件还可以包括以面向对象编程形式的模块化编程。处理机器对输入数据的处理可以响应于用户命令、先前处理的结果或另一处理机器作出的请求。
虽然已经参考某些实施方案公开了本公开内容，但是在不背离如所附权利要求中定义的本公开内容的范围和精神的情况下，对所描述的实施方案的许多修改、变更和改变是可能的。因此，本公开内容旨在不限于所描述的实施方案，而是其具有由所附权利要求的语言及其等价物限定的全部范围。
实施例
以下实施例描述了方法，以下实施例中描述的结果证明检测到少量细胞，甚至是单个细菌，在缩短的时间内得到结果。
实施例1.沙门氏菌中的可溶性TSP12.Hibit表达
将可溶性HiBiT TSP12构建体克隆到pUC57.Amp质粒中，产生TSP12.HR.HiBiT。将质粒转化到邦戈里沙门氏菌ATCC 43975中，并在LB羧苄青霉素选择性琼脂上选择转化体。选择分离良好的菌落并接种到选择性肉汤中并培养2小时。孵育后，根据制造商的说明，使用HiBiT Lytic测定试剂盒对5μL培养物进行测定以确定HiBiT表达。检测到的信号范围为11,000-100,000RLU/5uL培养物(表1)。质粒包含在邦戈里沙门氏菌43975中可溶性HiBiT表达的所有必需元件(启动子/RBS和编码序列)。
表1.邦戈里沙门氏菌转化体的HiBiT信号。
Figure BDA0003620488110000441
然后用野生型TSP12以0.1的感染复数(MOI)感染具有最高HiBit信号的邦戈里沙门氏菌转化体。噬菌体裂解物经过澄清、过滤和缓冲交换。进行噬菌体和具有宿主细胞的噬菌体的系列稀释。然后使用TU50测定法分析系列稀释并确定PFU滴度(表2)。
表2.可溶性TSP12.HiBit同源重组筛选
Figure BDA0003620488110000442
Figure BDA0003620488110000451
实施例2.沙门氏菌属中的TSP12.MCP-PS-HiBit表达
将TSP12主要衣壳蛋白(MCP)HiBiT融合构建体克隆到pUC57.Amp质粒中。使用GeneWiz执行克隆和序列验证。将质粒重构并冻干。然后将重构、冻干的质粒转化到邦戈里沙门氏菌ATCC 43975中。在LB羧苄青霉素选择性琼脂上培养和选择转化体。选择分离的菌落并接种到选择性肉汤中，并在37℃下孵育2小时。孵育后，根据制造商的说明，使用HiBiTLytic测定试剂盒测定5uL培养物以确定HiBiT表达。来自转化体的检测到的HiBiT信号为约800RLU/5uL培养物(表3)。该质粒不包含在邦戈里沙门氏菌ATCC 43975中有效MCP-HiBiT表达的所有必需元件。为了使HiBit融合蛋白充分表达，必须将质粒与TSP12噬菌体重组。
表3.邦戈里沙门氏菌转化体的HiBiT信号。
Figure BDA0003620488110000452
Figure BDA0003620488110000461
然后用野生型TSP12以0.1的感染复数(MOI)感染具有最高HiBit信号的邦戈里沙门氏菌转化体。噬菌体裂解物经过澄清、过滤和缓冲交换。进行噬菌体和具有宿主细胞的噬菌体的系列稀释。然后使用TU50测定法分析系列稀释并确定PFU滴度(表4)。以背景信号(无细胞对照)的20-80倍检测到重组噬菌体。该信号是剂量依赖性的并且随着噬菌体数量的增加而增加。
表4.TSP12.MCP-PS-HiBit同源重组筛选
Figure BDA0003620488110000462
实施例3.同源重组构建体
同源重组产物在图4中描述。亲本噬菌体表示用于重组的野生型输入噬菌体。融合蛋白识别用于HiBiT的融合伴侣的目标蛋白(POI)。HR供体质粒提供了转化到HR宿主中的质粒的名称。载体主干提供了用于克隆HR区域的载体的名称(GENEWIZ提供的载体)。GENEWIZ克隆ID是GENEWIZ用于跟踪克隆并报告QC数据的唯一标识符。切割位点指示哪个蛋白酶切割位点用于连接HiBiT和融合伴侣。HR宿主/菌株表示重组和分离感染中使用的物种和菌株。噬菌体批次表示噬菌体是否被完全分离，它将被储存(NA)或进行大规模制备(噬菌体批次#)。不完整表示a)重组体不稳定或b)无法被完全分离或c)未尝试重组。
实施例4.HiBiT测定法优化
将样品添加到微量滴定测定孔中。根据HiBiT裂解试剂盒制造商的说明，每个含有样品的微量滴定测定孔都接受了表5中列出的组分。在光度计上读数之前，通过章动器将反应混合10分钟。我们转化的HR宿主和HR感染裂解物的初步实验显示，单独的培养基中就有相对较高的(～500RLU)的背景信号。
表5.HiBiT测定法组分
Figure BDA0003620488110000471
随后的实验确定升高的背景可归因于含有样品的培养基。在使用S-M缓冲液、水或S-M缓冲液中的噬菌体的测定法中未检测到升高的背景水平。为了识别高背景的来源，将几种培养基在无菌d-水中连续稀释2倍，每种100uL进行上述测定并报告在表6中。
表6.培养基背景信号(RLU)
Figure BDA0003620488110000472
此外，将几种培养基组分以推荐浓度的两倍(2X)溶解在无菌水中，连续稀释2倍并进行如上所述的HiBiT测定法(表7)。
表7. 2X培养基背景信号(RLU)
Figure BDA0003620488110000481
结果表明，所有测试的培养基都具有高背景，并且BHI和胰蛋白胨(Sigma)都具有非常高的背景(2000-6000RLU)。即使将培养基/组分稀释8倍，信号也会出现饱和。进行了一项实验，以辨别在不存在HiBiT的情况下，与BHI联合的Lytic试剂盒测定法的哪个组分是导致非常高RLU的原因。表8显示LgBiT组分与BHI相互作用，在furimazine底物的存在下产生高RLU背景。这里还要注意的是单独缓冲液中LgBiT和furimazine的真实背景，其也高达110-180RLU。
表8.培养基组分背景信号(RLU)
Figure BDA0003620488110000482
为了降低与仅LgBiT、培养基和底物相关的高背景，将LgBiT的浓度降低5-10倍(表9)。
表9显示了当LgBiT降低到0.05μL/反应时，与制造商推荐的0.5μL/反应相比，背景信号下降约6倍。对于所有后续的HiBiT测定法，LgBiT组分减少到至少0.1μL/反应，以减轻与培养基相关的背景RLU。
表9.LgBiT和培养基背景信号
Figure BDA0003620488110000491
实施例5.重组噬菌体生成
通过标准感染含有同源重组供体质粒的宿主细菌产生表达可溶性HiBiT或与结构蛋白融合的HiBiT标签的重组噬菌体。通过电穿孔将同源重组(HR)质粒转化到优选的宿主细菌中。通过在抗生素选择性板上生长来选择含有质粒的转化体。宿主在选择压力下生长至早中对数期，并在培养物中测量HiBiT活性。
然后将存活选择并显示HiBiT活性的细菌细胞用作HR感染的宿主。在含有抗生素的培养基中将对数细胞稀释至大约1.0E+07个细胞/mL。以约0.05-1.0的MOI加入天然/野生型噬菌体，并将感染在优选温度下振荡孵育3-5小时。孵育后，通过以5000xg离心5分钟使任何剩余的细菌宿主细胞和细胞碎片沉淀。收集裂解物并通过0.45微米过滤器进行过滤以消除任何剩余的宿主细胞。
然后制备噬菌体裂解物用于终点稀释和噬斑测定法以确定估计的重组/噬斑滴度。将噬菌体裂解物进行缓冲液交换，以通过用另外4个体积的洗涤缓冲液使裂解物通过100,000道尔顿分子量截断旋转过滤器来去除所有未掺入的/宿主衍生的HiBiT。将得到的噬菌体悬浮在0.5mL缓冲液/培养基中，并在培养基中进行8次10倍稀释。
然后，通过使用TU50测定法(转导单位50％)滴定HiBiT重组体的HR裂解物来测定噬菌体滴度。没有显示高于背景的HiBiT活性的孔(仅噬菌体和培养基)被评分为阴性，具有3X背景RLU的孔被评分为阳性。TU50滴度的计算基于Reed-Muench方法。通过噬斑测定法滴定相同的系列稀释。将TU50滴度与噬斑测定法滴度进行比较以确定重组/总噬菌体滴度比。
如果重组体/总噬菌体滴度比小于1/30，则执行有限稀释富集直到该比率等于或高于1/30。通过稀释裂解物以在5mL培养基中包含1-10个转导单位来执行有限稀释富集。然后将天然宿主细菌以低MOI添加到稀释的噬菌体中，并分布在96孔培养板的孔中。将噬菌体感染于25-37℃孵育3-16小时。对每个孔的10％进行HiBiT测定法，并对顶部阳性孔进行上述噬菌体滴度测定法。执行连续的有限稀释富集，直到重组/总噬菌体滴度比小于1/30。
一旦达到有利的重组/总滴度比，就执行重组噬菌体的噬斑分离。分离单个噬斑并针对HiBiT活性进行筛选。阳性噬斑至少传代3次以达到纯度。通过大规模感染产生完全分离的重组体，并通过铯或蔗糖梯度离心进行纯化。
实施例6.TSP1.sHiBiT(具有可溶性未融合HiBiT单体的TSP1)的噬菌体浓度优化
将鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 19585)在TSB中于37℃培养16-18小时。将细胞稀释至10、20、50、100、1000、10000和100,000CFU/mL。吸取100μL稀释的细胞，在白色96孔板中产生1、2、5、10、100、1000和10000CFU/孔。将10μL的TSP1.sHiBit噬菌体以1.2x104至108PFU/mL添加到每个孔中(表10)。
表10.HiBiT噬菌体测定法板布局
噬菌体/mL 10<sup>4</sup>P/mL 10<sup>5</sup>P/mL 10<sup>6</sup>P/mL 10<sup>7</sup>P/mL 10<sup>8</sup>P/mL
A 0 0 0 0 0
B 1 1 1 1 1
C 2 2 2 2 2
D 5 5 5 5 5
E 10 10 10 10 10
F 100 100 100 100 100
G 1000 1000 1000 1000 1000
H 10000 10000 10000 10000 10000
将板于37℃孵育2小时或3小时。将50μL预混液(50μL测定缓冲液(NanoGlo HiBiT缓冲液)、1μL NanoGlo HiBit底物和0.1μL LgBiT蛋白)添加到每个孔中，在章动器上于室温进行孵育，并在GloMax/Navigator中读取1秒。2小时孵育的信号/背景值显示在图5中。3小时孵育的信号/背景值显示在图6中。3小时的孵育时间具有改善的信号/背景比。
实施例7.TSP12.sHiBiT、表达可溶性HiBiT肽的TSP12的噬菌体浓度优化
将邦戈里沙门氏菌(ATCC 43975)在TSB中于37℃培养16-18小时。将细胞稀释至10、20、50、100、1000、10000和100,000CFU/ml。吸取100μL稀释的细胞，在白色96孔板中产生1、2、5、10、100、1000和10000CFU/孔。将10μL的TSP12.sHiBit噬菌体以1.2x104至108PFU/mL添加到每个孔中(表10)。将板于37℃孵育2小时或4小时。将50μL预混液(50μL测定缓冲液(NanoGlo HiBiT缓冲液)、1μL NanoGlo HiBit底物和0.1μL LgBiT蛋白)添加到每个孔中，在章动器上于室温进行孵育，并在GloMax/Navigator中读取1秒。4小时孵育的信号/背景值显示在图7中。3小时孵育的信号/背景值显示在图8中。4小时的孵育时间具有改善的信号/背景比。
实施例8.TSP12.HiBiT-PS-Soc的噬菌体浓度优化
将邦戈里沙门氏菌(ATCC 43975)在TSB中于37℃培养16-18小时。将细胞稀释至10、20、50、100、1000、10000和100,000CFU/ml。吸取100μL稀释的细胞，在白色96孔板中产生1、2、5、10、100、1000和10000CFU/孔。将10μL的TSP12.HiBit-PS-Soc噬菌体以1.2x104至108PFU/mL添加到每个孔中(表10)。将板于37℃孵育2小时。将50μL预混液(50μL测定缓冲液(NanoGlo HiBiT缓冲液)、1μL NanoGlo HiBit底物和0.1μL LgBiT蛋白)添加到每个孔中，在章动器上于室温进行孵育，并在GloMax/Navigator中读取1秒。2小时孵育的信号/背景值显示在图9中。
实施例9.TSP12.HiBiT-PS-Soc的检测水平
将邦戈里沙门氏菌(ATCC 43975)在TSB中于37℃培养16-18小时。将细胞稀释至10、20、50、100、1000、10000和100,000CFU/ml。吸取100μL稀释的细胞，在白色96孔板中产生1、2、5、10、100、1000和10000CFU/孔。将10μL的TSP12-HTS或TSP12-HPS噬菌体以1.2x107PFU/mL添加到每个孔中(表10)。将板于37℃孵育2小时。将50μL预混液(50μL测定缓冲液(NanoGlo HiBiT缓冲液)、1μL NanoGlo HiBit底物和0.1μL LgBiT蛋白)添加到每个孔中，在章动器上于室温孵育10分钟，然后在GloMax/Navigator中读取1秒。信号/背景值显示在图10中。

Claims (22)

1.一种重组指示噬菌体，其包含插入噬菌体基因组中的指示基因，其中所述指示基因编码指示蛋白的肽或多肽亚基。
2.权利要求1所述的重组噬菌体，其还包含蛋白酶切割位点。
3.权利要求1所述的重组噬菌体，其中肽或多肽亚基是第一亚基并且与指示蛋白的第二多肽亚基互补。
4.权利要求1所述的重组噬菌体，其中指示蛋白是萤光素酶。
5.权利要求1所述的重组噬菌体，其还包括位于经密码子优化的指示基因的上游的非翻译区，其中所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
6.一种混合组合物，其包含至少两种不同类型的重组噬菌体，其中至少一种重组噬菌体包含根据权利要求1所述的指示基因。
7.一种制备重组指示噬菌体的方法，其包括：
选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；
制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；
将同源重组质粒/载体转化到靶病原菌中；
用所选野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而使质粒/载体与噬菌体基因组之间发生同源重组；和
分离重组噬菌体的特定克隆。
8.权利要求7所述的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括：
确定所选噬菌体的基因组的晚期区域中的天然核苷酸序列；
注释所述基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；
设计用于在主要衣壳蛋白基因的下游进行同源重组的序列，其中所述序列包含经密码子优化的指示基因；和
将设计用于同源重组的序列掺入质粒/载体中。
9.权利要求8所述的方法，其中设计序列进一步包括在经密码子优化的指示基因的上游插入非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
10.权利要求9所述的方法，其中同源重组质粒包含位于经密码子优化的指示基因的上游的非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
11.权利要求9所述的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离证明所述指示基因的表达的克隆的有限稀释测定。
12.一种用于检测样品中特定目标细菌的方法，其包括：
将样品与包含指示基因的重组指示噬菌体孵育，其中所述指示基因编码指示蛋白的第一亚基，从而产生一定量的表达第一亚基的子代噬菌体；
裂解一定量的子代噬菌体；
在检测试剂的存在下孵育裂解的子代噬菌体，其中检测试剂包含指示蛋白的第二亚基，从而允许第一亚基和第二亚基重构而形成指示蛋白复合物；和
检测指示蛋白复合物，其中指示蛋白复合物的阳性检测表明样品中存在特定目标细菌。
13.权利要求12所述的方法，其中所述样品是食品样品、环境样品、水样品或商业样品。
14.权利要求12所述的方法，其中所述方法检测到在食品安全行业标准尺寸样品中少至10、9、8、7、6、5、4、3、2个或单个细菌。
15.权利要求13所述的方法，其中所述食品样品包括肉、鱼、蔬菜、蛋、乳制品、干燥食品或婴儿配方奶粉。
16.权利要求12所述的方法，其中所述样品首先在有利于生长的条件下孵育少于24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时的富集期。
17.权利要求12所述的方法，其中获得结果的总时间少于26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。
18.权利要求12所述的方法，其中通过检测指示物产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。
19.一种用于检测包含重组指示噬菌体的特定目标细菌的试剂盒，其包括编码指示蛋白的第一肽或多肽亚基的指示基因。
20.权利要求19所述的试剂盒，其进一步包括检测试剂，其中所述检测试剂包括
指示蛋白的第二多肽亚基，其中所述第二多肽亚基与所述第一肽或多肽亚基重构而形成指示蛋白复合物，和
用于与指示蛋白复合物反应以检测指示蛋白复合物的底物。
21.权利要求19所述的试剂盒，其还包括裂解缓冲液。
22.一种用于检测包含重组指示噬菌体的特定目标细菌的系统，其包括编码指示蛋白的肽或多肽亚基的指示基因。
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