BR112020011688A2 - métodos e sistemas para a rápida detecção de salmonella usando agentes infecciosos - Google Patents

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Dwight Lyman Anderson
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Abstract

São aqui descritos métodos e sistemas para a rápida detecção de microrganismos em uma amostra. Um bacteriófago geneticamente modificado é também descrito o qual compreende um gene indicador na região tardia do gene. A especificidade do bacteriófago, tal como bacteriófago específico para Salmonella, permite a detecção de um microrganismo específico, tal como Salmonella spp. e um sinal indicador pode ser amplificado para otimizar a sensibilidade do ensaio.

Description

MÉTODOS E SISTEMAS PARA A RÁPIDA DETECÇÃO DE SALMONELLA USANDO AGENTES INFECCIOSOS REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[1] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido provisório nos Estados Unidos nos. 62/616.956, depositado em 12 de janeiro de 2018; 62/628.616, depositado em 09 de fevereiro de 2018; e 62/661.739, depositado em 24 de abril de 2019. As divulgações dos pedidos nos Estados Unidos nos. 13/773.339, 14/625.481, 15/263.619, 15/409.258 e os pedidos provisórios nos Estados Unidos nos. 62/616.956, 62/628.616 e 62/661.739 são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[2] Esta invenção se refere a composições, métodos, sistemas e kits para a detecção de microrganismos usando agentes infecciosos.
ANTECEDENTES
[3] Existe um forte interesse em melhorar a velocidade e a sensibilidade para a detecção de bactérias, vírus e outros microrganismos em amostras biológicas, de alimentos, de água e clínicas. Patógenos microbianos podem causar morbidade substancial dentre humanos e animais domésticos, bem como imensa perda econômica. Ainda, a detecção de microrganismos é uma alta prioridade para a Administração de Alimentos e Fármacos (sigla em inglês, FDA), o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (sigla em inglês, USDA), e Centros de Controle de Doenças (sigla em inglês, CDC) devido aos surtos de doenças com risco de vida ou fatais causadas pela ingestão de alimentos contaminados com determinados microrganismos, por exemplo,
Salmonella spp.
[4] Os testes microbiológicos tradicionais para a detecção de bactérias dependem de culturas de enriquecimento não seletivo e seletivo, seguidas pelo plaqueamento em meios seletivos e testes adicionais para confirmar as colônias suspeitas. Os referidos procedimentos podem requerer vários dias. Uma variedade de métodos rápidos tem sido investigada e introduzida na prática para reduzir o tempo requerido. No entanto, estes métodos apresentam inconvenientes. Por exemplo, as técnicas envolvendo imuno ensaios diretos ou sondas genéticas geralmente requerem uma etapa de enriquecimento durante a noite para obter a sensibilidade adequada. Os testes de reação em cadeia da polimerase (PCR) também incluem uma etapa de amplificação e, portanto, são capazes tanto de sensibilidade e seletividade muito altas; no entanto, o tamanho da amostra que pode ser economicamente submetida aos testes de PCR é limitado. Com suspensões bacterianas diluídas, a maioria das sub-amostras pequenas estarão livres de células e, portanto, etapas longas de purificação e / ou enriquecimento ainda são necessárias.
[5] O tempo requerido para o enriquecimento biológico tradicional é ditado pela taxa de crescimento da população bacteriana alvo da amostra, pelo efeito da matriz da amostra e pela sensibilidade requerida. Na prática, os métodos com a mais alta sensibilidade empregam uma incubação durante a noite e demoram cerca de 24 horas no total. Devido ao tempo requerido para o cultivo, estes métodos podem demorar até três dias, dependendo do organismo a ser identificado e a fonte da amostra. Este tempo lag é, em geral, inadequado, uma vez que alimentos, água ou outro produto contaminado já podem ter penetrado nos rebanhos ou nos humanos. Além disso, o aumento de bactérias resistentes a antibióticos e as considerações de biodefesa tornam a rápida identificação de patógenos bacterianos em amostras de água, alimentos e clínicas prioridades críticas em todo o mundo.
[6] Sendo assim, existe uma necessidade de detecção e identificação mais rápida, simples e sensível de microrganismos, tais como bactérias e outros microrganismos potencialmente patogênicos.
SUMÁRIO
[7] As modalidades da invenção compreendem composições, métodos, sistemas e kits para a detecção dos microrganismos de interesse, tais como Salmonella spp. A invenção pode ser incorporada de diversas maneiras.
[8] Em alguns aspectos, a invenção compreende um bacteriófago recombinante compreendendo um gene indicador inserido em uma região de gene tardio de um genoma do bacteriófago. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é um genoma geneticamente modificado de bacteriófago específico para Salmonella. Em determinadas modalidades o bacteriófago recombinante um genoma geneticamente modificado de bacteriófago. Em algumas modalidades, o bacteriófago usado para preparar o bacteriófago recombinante infecta especificamente Salmonella spp. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode diferenciar Salmonella spp. na presença de outros tipos de bactérias.
[9] Em algumas modalidades do bacteriófago indicador recombinante, o gene indicador pode ser otimizado por códon e pode codificar um produto de proteína solúvel que gera um sinal intrínseco ou uma enzima solúvel que gera sinal após reagir com o substrato. Alguns bacteriófagos recombinantes ainda compreendem uma região não traduzida à montante de um gene indicador otimizado por códon, em que a região não traduzida inclui um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada do ribossomo. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase. O gene luciferase pode ser um gene de ocorrência natural, tal como luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia ou luciferase de Renilla, ou ele pode ser um gene geneticamente projetado, tal como NANOLUC®.
[10] São também aqui descritos métodos para o preparo de um bacteriófago indicador recombinante. Algumas modalidades incluem selecionar um bacteriófago do tipo selvagem o qual infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga compreendendo um gene indicador; transformar o plasmídeo / vetor de recombinação homóloga dentro de uma bactéria patogênica alvo; infectar a bactéria patogênica alvo transformada com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim, permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, o bacteriófago do tipo selvagem selecionado é um bacteriófago específico para Salmonella. Em algumas modalidades, o bacteriófago do tipo selvagem selecionado é um miovírus, tal como T4, tipo T4 ou tipo ViI. Em outras modalidades, o bacteriófago do tipo selvagem selecionado é um sifovírus, tal como vírus tipo T5. Em outras modalidades, o bacteriófago do tipo selvagem selecionado é TSP1 ou TSP11. TSP1 e TSP11 são fagos recém isolados e sequenciados, respectivamente, provavelmente miovírus relacionado ao fago T4 e sifovírus relacionado a ou dentro do gênero de vírus tipo T5. Ainda em outras modalidades, os bacteriófagos são os bacteriófago SEA1 e TSP1 específicos para Salmonella.
[11] Em algumas modalidades, preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga inclui determinar a sequência de nucleotídeos natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para recombinação homóloga à jusante do gene da proteína do capsídeo maior, em que a sequência compreende um gene indicador otimizado por códon; e incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga dentro de um plasmídeo / vetor. A etapa de projetar uma sequência pode incluir inserir um constructo genético compreendendo, uma região não traduzida, incluindo um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada do ribossomo, à montante do gene indicador otimizado por códon. Em algumas modalidades, o promotor do gene tardio do fago é um promotor exógeno, diferente de qualquer promotor endógeno no genoma do fago. Então, em alguns métodos, o plasmídeo de recombinação homóloga compreende uma região não traduzida incluindo um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada do ribossomo à montante do gene indicador otimizado por códon.
[12] Algumas modalidades da invenção são composições que incluem um bacteriófago indicador recombinante tal como aqui descrito. Por exemplo, as composições podem incluir um ou mais agentes infecciosos do tipo selvagem ou geneticamente modificados (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes fagos indicadores os quais podem codificar e expressar o mesmo ou diferentes proteínas indicadoras.
[13] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta o microrganismo de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em um região de gene tardio do bacteriófago de modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel, e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que o microrganismo de interesse está presente na amostra.
[14] Em algumas modalidades dos métodos para o preparo do bacteriófago indicador recombinante, o bacteriófago do tipo selvagem é um bacteriófago específico para Salmonella e a bactéria patogênica alvo é Salmonella spp. Em algumas modalidades, isolar um clone particular do bacteriófago recombinante compreende um ensaio de diluição limitante para isolar um clone que demonstra a expressão do gene indicador.
[15] Outros aspectos da invenção incluem métodos para a detecção de bactérias, tais como Salmonella spp. em uma amostra, incluindo as etapas de incubar a amostra com um bacteriófago recombinante derivado de bacteriófago específico para Salmonella e detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo bacteriófago recombinante, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que Salmonella spp. está presente na amostra. A amostra pode ser uma amostra de alimento, ambiente, água, comercial ou clínica.
[16] Em algumas modalidades dos métodos para a detecção de bactérias, a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 24 horas ou menos, 23 horas ou menos, 22 horas ou menos, 21 horas ou menos, 20 horas ou menos, 19 horas ou menos, 18 horas ou menos, 17 horas ou menos, 16 horas ou menos, 15 horas ou menos, 14 horas ou menos, 13 horas ou menos, 12 horas ou menos, 11 horas ou menos, 10 horas ou menos, ou 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos. Em algumas modalidades, a amostra não é enriquecida antes da detecção. Em algumas modalidades, o tempo total para os resultados é menor do que 26 horas, menor do que 25 horas, menor do que 24 horas, menor do que 23 horas, menor do que 22 horas, menor do que 21 horas, menor do que 20 horas, menor do que 19 horas, menor do que 18 horas, menor do que 17 horas, menor do que 16 horas, menor do que 15 horas, menor do que 14 horas, menor do que 13 horas, menor do que 12 horas, menor do que 11 horas, menor do que 10 horas, menor do que
9 horas, menor do que 8 horas, menor do que 7 horas, menor do que 6 horas, menor do que 5 horas, ou menor do que 4 horas. Em algumas modalidades, a proporção de sinal em relação ao fundo gerado pela detecção do indicador é de pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5. Em algumas modalidades, o método detecta tão pouco quanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 da bactéria específica em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.
[17] Modalidades adicionais incluem sistemas e kits para a detecção de Salmonella spp., em que os sistemas ou kits incluem um bacteriófago recombinante derivado de bacteriófago específico para Salmonella. Algumas modalidades ainda incluem um substrato para reagir com um indicador para detectar o produto de proteína solúvel expresso pelo bacteriófago recombinante. Esses sistemas ou kits podem incluir características descritas para o bacteriófago, composições e métodos da invenção. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende mídia legível por computador não transitória para uso com os métodos ou sistemas de acordo com a invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[18] A presente invenção pode ser mais bem entendida ao se referir às seguintes figuras não limitativas.
[19] A Figura 1 mostra um constructo de fago indicador de acordo com uma modalidade da invenção que ilustra a inserção de um constructo genético compreendendo um gene luciferase, um promotor do gene tardio tipo T4 e um sítio de ligação do ribossomo (RBS) inserido na região tardia (classe III) de um bacteriófago. O promotor mostrado está em adição a e separado do promotor do gene tardio endógeno à montante dos genes tardios endógenos, tal como o gene para a proteína do capsídeo maior (MCP).
[20] A Figura 2 mostra o genoma do bacteriófago SEA1, um miovírus (relacionado ao bacteriófago T4) e compartilha aproximadamente 95 % de homologia com miovírus do fago S16 de Salmonella. A chaperona 57A do gene para a formação da fibra longa da cauda está na periferia da região de gene tardio, consistindo de genes estruturais, os quais codificam para proteínas do vírion. A medida que essas proteínas do vírion são expressas em um nível muito alto, espera-se que quaisquer genes inseridos nesta região apresentem níveis de expressão similares, desde que o promotor do gene tardios e / ou outros elementos de controle similares são usados.
[21] A Figura 3 mostra três constructos de plasmídeos de recombinação homóloga que carregam genes luciferase por 3 diferentes fagos com aproximadamente 500 bp da sequência de fago correspondente à montante e à jusante do sítio de inserção para promover a recombinação homóloga. A luciferase NANOLUC® é inserida em uma estrutura de plasmídeo pUC57.AmpR com uma região não traduzida à montante contendo um promotor do gene tardio e sítio de entrada do ribossomo do fago dedicado. O plasmídeo de recombinação 300 dos fagos de Salmonella SEA1 foi construído para inserir NANOLUC® dentro da região de gene tardio, porém, em uma distância da proteína do capsídeo maior (MCP) devido a problemas de estabilidade. A TSP1 é um fago recém isolado, relacionado a ou parte do gênero de vírus tipo T4 na família dos miovírus. A TSP11 é um fago recém isolado, relacionado a ou parte do gênero de vírus tipo T5 na família dos sifovírus. Cada constructo consistiu de 500 bp de sequência de recombinação homóloga do região de gene tardio 310 do vírus do tipo selvagem, seguido pelo promotor do gene tardio do fago adequado e um sítio de ligação do ribossomo 320, seguido pelo gene luciferase 330, e, por fim, uma região de recombinação homóloga de 500 bp à jusante do vírus do tipo selvagem 340.
[22] A Figura 4 mostra o isolamento do fago recombinante a partir de modificações do bacteriófago SEA1 usando os constructos de plasmídeo tais como aqueles mostrados na Figura 3 usando séries de etapas de infecção e diluição sequencial para identificar o fago recombinante que expressa um gene indicador.
[23] A Figura 5 mostra o uso do fago indicador que codifica uma luciferase solúvel para detectar células bacterianas por meio da detecção da luciferase gerada a partir da replicação do fago da progênie durante a infecção das células bacterianas, de acordo com uma modalidade da invenção.
[24] A Figura 6 mostra um ensaio de placa filtrante para a detecção das bactérias de interesse usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção em que a bactéria e o fago recombinante são incubados em placas filtrantes e, após a geração dos bacteriófagos da progênie, a proteína indicadora é detectada diretamente sem a remoção do meio de incubação.
[25] A Figura 7 mostra um “ensaio sem concentração” para a detecção de uma bactéria de interesse usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção.
[26] A Figura 8 mostra um Ensaio com fago imuno híbrido (HIP) para a detecção de uma bactéria de interesse usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção em que os anticorpos para o microrganismo de interesse são usados para capturar o microrganismo na superfície do ensaio muito antes da incubação com um agente infeccioso recombinante apresentando um gene indicador.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[27] São aqui descritas composições, métodos e sistemas que demonstram a sensibilidade surpreendente para a detecção de um microrganismo de interesse, tal como Salmonella spp., em amostras teste (por exemplo, amostras biológicas, de alimentos, de água, de ambiente e clínicas). A detecção pode ser alcançada em um intervalo de tempo mais curto do que foi previamente imaginado possível usando agentes infecciosos geneticamente modificados em ensaios realizados sem o cultivo para enriquecimento ou, em algumas modalidades, com tempos de incubação mínimos durante os quais os microrganismos podem potencialmente se multiplicar. É também surpreendente o sucesso do uso de uma multiplicidade de infecção (MOI) potencialmente alta, ou altas concentrações de unidades formadoras de colônia (UFC), para incubação com uma amostra teste. As referidas altas concentrações de fago (UFC / mL) foram previamente pretendidas para serem prejudiciais em ensaios de detecção de bactéria, uma vez que elas foram pretendidas para causar “lise de fora”. No entanto, uma alta concentração de fago pode facilitar a descoberta, ligação e infecção de um baixo número de células alvo.
[28] As composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender agentes infecciosos para uso na detecção dos referidos microrganismos, incluindo Salmonella spp. Em determinadas modalidades, a invenção pode compreender uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador inserido em uma região de gene tardio do bacteriófago. Em determinadas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de uma bactéria hospedeira resulta na produção de um produto solúvel da proteína indicadora. Em determinadas modalidades, o gene indicador pode ser inserido em uma região do gene tardio (isto é, classe III) do bacteriófago. O bacteriófago pode ser derivado de podovírus tais como T7, tipo T7, miovírus tais como T4, tipo T4, ViI, tipo ViI (ou vírus ViI, por GenBank / NCBI), bacteriófago especifico para Salmonella, ou outro bacteriófago do tipo selvagem ou projetado fago.
[29] Em alguns aspectos, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse. O método pode utilizar um agente infeccioso para a detecção do microrganismo de interesse. Por exemplo, em determinadas modalidades, o microrganismo de interesse é uma bactéria, tal como Salmonella spp., e o agente infeccioso é um bacteriófago. Então, em determinadas modalidades, o método pode compreender a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra ao incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta a bactéria de interesse. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador. O gene indicador pode, em determinadas modalidades, ser inserido em uma região de gene tardio do bacteriófago de modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta na produção de um produto de proteína indicadora. O método pode compreender detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra. Em algumas modalidade, a proteína indicadora é solúvel.
[30] Em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema. O sistema pode conter pelo menos alguma das composições da invenção. Ainda, o sistema pode compreender pelo menos algum dos componentes para a realização do método. Em determinadas modalidades, o sistema é formulado como um kit. Então, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema para a rápida detecção de um microrganismo de interesse tal como Salmonella spp., em uma amostra, compreendendo: um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específica para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; e um componente para a detecção da porção indicadora. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende o software para uso com os métodos ou sistemas.
[31] Então, algumas modalidades da presente invenção resolvem uma necessidade pelo uso de métodos a base de bacteriófago para a amplificação de um sinal detectável que indica a presença de bactéria. Em determinadas modalidades, tão pouco quanto uma única bactéria é detectada. Os princípios aqui aplicados podem ser aplicados na detecção de uma variedade de microrganismos. Devido aos inúmeros sítios de ligação para um agente infeccioso na superfície de um microrganismo, a capacidade de produzir cem ou mais progênies do agente durante a infecção e o potencial para alto nível de expressão de uma porção indicadora codificada, o agente infeccioso ou uma porção indicadora pode ser mais prontamente detectável do que o microrganismo por si só. Neste sentido, as modalidades da presente invenção podem alcançar enormes amplificações do sinal de ate mesmo uma única célula infectada.
[32] Os aspectos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos agentes de ligação que podem se ligar aos microrganismos particulares, tal como o componente de ligação de agentes infecciosos, como meios de detectar e / ou quantificar o microrganismo específico em uma amostra. Em algumas modalidades, a presente invenção utiliza a alta especificidade de agentes infecciosos, tais como bacteriófagos.
[33] Em algumas modalidades, a detecção é alcançada através de uma porção indicadora associada com o agente de ligação específico para o microrganismo de interesse. Por exemplo, um agente infeccioso pode compreender uma porção indicadora, tal como um gene que codifica um indicador solúvel. Em algumas modalidades, o indicador pode ser codificado pelo agente infeccioso, tal como um bacteriófago, e o bacteriófago é projetado um fago indicador.
[34] Algumas modalidades da invenção aqui divulgada e descrita utilizam a descoberta de que um único microrganismo é capaz de se ligar a agentes de reconhecimento específicos, tais como fagos. Após a infecção e replicação do fago, o fago da progênie pode ser detectado por meio de uma porção indicadora expressa durante a replicação do fago. Este princípio permite a amplificação do sinal indicador de uma ou poucas células com base no reconhecimento específico dos receptores da superfície do microrganismo. Por exemplo, ao expor até mesmo uma única célula de uma bactéria a uma pluralidade de fagos, assim permitindo a amplificação do fago e alto nível de expressão de um produto do gene indicador codificado durante a replicação, o sinal indicador é amplificado de modo que a única bactéria seja detectável.
[35] As modalidades dos métodos e sistemas da invenção podem ser aplicadas à detecção e quantificação de uma variedade de microrganismos (por exemplo, bactérias) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, porém não limitada à detecção de patógenos a partir de amostras de alimentos, água, clínicas, ambiente e comerciais. Em algumas modalidades, as amostras clínicas podem ser analisadas para a presença de microrganismos. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade de detecção e especificidade rapidamente. Em algumas modalidades, a detecção é possível dentro de um único ciclo de replicação do bacteriófago, o que é inesperado. Definições
[36] Salvo definição aqui em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção devem apresentar os significados os quais são comumente entendidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Além disso, a menos que o contexto exija o contrário, os termos singulares devem incluir as pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Em geral, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química das proteínas e dos ácidos nucléicos e hibridização aqui descritas são aquelas conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Os métodos e técnicas conhecidos são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na arte e tal como descritos em diversas referências gerais e mais específicas, as quais são discutidas ao longo do presente relatório descritivo, salvo indicação em contrário. Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, tal como comumente realizado na técnica ou tal como aqui descrito. As nomenclaturas utilizadas em conexão com os procedimentos e técnicas laboratoriais aqui descritos são as mais conhecidas e comumente utilizadas na técnica.
[37] Os termos a seguir, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos por apresentar os seguintes significados:
[38] Tal como aqui utilizado, os termos “um”, “uma” e “o / a” pode ser referir a um ou mais, a menos de especificamente notado o contrário.
[39] O uso do termo “ou” é usado para significar “e / ou” a menos que seja explicitamente indicado para se referir apenas a alternativas ou as alternativas sejam mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição a qual se refere apenas a alternativas e “e /
ou”. Tal como aqui utilizado, “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[40] Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é usado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente ao dispositivo, sendo o método empregado para determinar o valor, ou a variação que existe dentre as amostras.
[41] O termo “suporte sólido” ou “suporte” significa uma estrutura que fornece um substrato e / ou superfície na qual as biomoléculas podem ser ligadas. Por exemplo, um suporte sólido pode ser um poço de ensaio (isto é, tal como uma placa de micro titulação ou placa de múltiplos poços), ou o suporte sólido pode ser um local em um filtro, um arranjo, ou um suporte móvel, tal como um grânulo ou uma membrana (por exemplo, uma placa filtrante, faixa de fluxo lateral, partículas de látex, ou partículas paramagnéticas).
[42] O termo “agente de ligação” se refere a uma molécula que pode especificamente e seletivamente se ligar a uma segunda (isto é, diferente) molécula de interesse. A interação pode ser não covalente, por exemplo, tal como o resultado da ligação de hidrogênio, interações van der Waals, ou interações eletrostáticas ou hidrofóbicas, ou pode ser covalente. O termo “agente de ligação solúvel” se refere a um agente de ligação o qual não está associado (isto é, covalentemente ou não covalentemente ligado) a um suporte sólido.
[43] Tal como aqui utilizado, um “analito” se refere a uma molécula, composto ou célula que está sendo medido. O analito de interesse pode, em determinadas modalidades,
interagir com um agente de ligação. Tal como aqui descrito, o termo “analito” pode se referir a uma proteína ou peptídeo de interesse. Um analito pode ser um agonista, um antagonista, ou um modulador. Ou, um analito pode não apresentar um efeito biológico. Os analitos podem incluir pequenas moléculas, açúcares, oligossacarídeos, lipídios, peptídeos, peptídeo miméticos, compostos orgânicos e similares.
[44] O termo “porção detectável” ou “biomolécula detectável” ou “repórter” ou “indicador” ou “porção indicadora” se refere a uma molécula a qual pode ser medida em um ensaio quantitativo. Por exemplo, uma porção indicadora pode compreender uma enzima a qual pode ser utilizada para converter um substrato em um produto que pode ser medido. Uma porção indicadora pode ser uma enzima que catalisa uma reação que gera emissões bioluminescentes (por exemplo, luciferase). Ou, uma porção indicadora pode ser um radioisótopo o qual pode ser quantificado. Ou, uma porção indicadora pode ser um fluoróforo. Ou, outras moléculas detectáveis podem ser utilizadas.
[45] Tal como aqui utilizado, “bacteriófago” ou “fago” inclui uma ou mais de uma pluralidade de vírus bacterianos. Nesta divulgação, os termos “bacteriófago” e “fago” incluem vírus tais como mico bacteriófagos (tais como TB e paraTB), micófagos (tais como fungos), fagos de micoplasma e quaisquer outros termos que se referem a um vírus que pode invadir bactérias vivas, fungos, micoplasmas, protozoários, leveduras e outros organismos vivos microscópicos e que os utiliza para se replicar. Aqui, “microscópico” significa que a maior dimensão é de um milímetro ou menos.
Bacteriófagos são vírus que evoluíram na natureza para utilizar bactérias como meio de se replicarem. Um fago faz isso ao ligar-se a uma bactéria e ao injetar seu DNA (ou RNA) nessa bactéria, induzindo-a a replicar o fago centenas ou até milhares de vezes. Isso é denominado amplificação de fago.
[46] Tal como aqui utilizado, “região de gene tardio” se refere a uma região de um genoma viral que é transcrita tardiamente no ciclo de vida viral. A região tardia do gene inclui tipicamente os genes mais abundantemente expressos (por exemplo, proteínas estruturais montadas na partícula do bacteriófago). Os genes tardios são sinônimos com genes da classe III e incluem genes com funções de estrutura e montagem. Por exemplo, os genes tardios (sinônimos com a classe III) são transcritos no fago T7, por exemplo, a partir de 8 minutos após a infecção até a lise, a classe I (por exemplo, RNA polimerase) é precoce de 4 - 8 minutos e a classe II a partir de 6 - 15 minutos, então, há uma sobreposição no tempo de II e III. Um promotor tardio é um o qual está naturalmente localizado e ativo na referida região tardia do gene.
[47] Tal como aqui utilizado, “cultivo para enriquecimento” se refere ao cultivo tradicional, tal como incubação em meio favorável para a propagação dos microrganismos, e não deve ser confundido com outros possíveis usos da palavra “enriquecimento”, tais como enriquecimento pela remoção do componente líquido de uma amostra para concentrar o microrganismo contido na mesma, ou outras formas de enriquecimento que não incluem a facilitação tradicional de propagação do microrganismo. O cultivo para o enriquecimento por períodos de tempo pode ser empregado em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, porém não é necessária e é para um intervalo de tempo muito mais curto do que o cultivo tradicional para o enriquecimento.
[48] Tal como aqui utilizado, “recombinante” se refere a modificações genéticas (isto é, ácido nucléico), tal como geralmente realizadas em laboratório para reunir material genético os qual não seria encontrado de outra forma. Este termo é aqui utilizado de forma intercambiável com o termo “modificado”.
[49] Tal como aqui utilizado, “RLU” se refere a unidades de luz relativa tal como medida por um luminômetro (por exemplo, GLOMAX® 96) ou instrumento similar que detecta luz. Por exemplo, a detecção da reação entre luciferase e o substrato adequado (por exemplo, NANOLUC® com NANO-GLO®) é frequentemente reportada em RLU detectado.
[50] Tal como aqui utilizado, “tempo para resultados” se refere à quantidade total de tempo a partir do começo da incubação da amostra para gerar resultados. O tempo para resultado não inclui qualquer tempo de teste confirmatório. A coleta de dados pode ser realizada em qualquer tempo após um resultado ter sido gerado. Amostras
[51] Cada uma das modalidades dos métodos e sistemas da invenção pode permitir a rápida detecção e quantificação de micróbios em uma amostra. Por exemplo, métodos de acordo com a presente invenção podem ser realizados em um período de tempo encurtado com resultados superiores.
[52] Os micróbios detectados pelos métodos e sistemas da presente invenção incluem patógenos os quais são de preocupação natural, comercial, médica ou veterinária. Os referidos patógenos incluem bactérias Gram-negativas ou bactérias Gram-positivas. Qualquer micróbio para o qual um agente infeccioso que é específico para o micróbio particular tenha sido identificado pode ser detectado pelos métodos da presente invenção. Um técnico no assunto irá apreciar que não há limites para a aplicação dos presentes métodos além da disponibilidade dos pares de agentes infecciosos / micróbios específicos necessários.
[53] As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas a, células bacterianas as quais são patógenos suportados em alimentos ou água. Em algumas modalidades, as células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem bactérias resistentes a antibióticos (por exemplo, Salmonella resistente a antibióticos).
[54] A amostra pode ser uma amostra de ambiente ou alimento ou água. Algumas modalidades podem incluir amostras médicas ou veterinárias. As amostras podem ser líquidas, sólidas ou semissólidas. As amostras podem ser swabs de superfícies sólidas. As amostras podem incluir materiais do meio ambiente, tais como as amostras de água ou os filtros de amostras de ar ou amostras de aerossol de coletores de ciclone. As amostras incluem, porém não estão limitadas a, alimentos de animais domésticos, comida para cães, vegetais, carne, peixe, aves, manteiga de amendoim, alimentos processados, fórmula infantil em pó, leite em pó, chás, amidos, ovos, leite, queijo ou outros produtos laticínios, alimentos processados ou não processados,
alimentos prontos para o consumo, alimentos secos ou pimentas. Amostras médicas ou veterinárias incluem, porém não estão limitadas a, amostras de sangue, escarro, fluido cérebro espinhal e fecal e diferentes tipos de swabs.
[55] Em algumas modalidades, as amostras podem ser usadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação, concentração, ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas, incluindo, porém não limitadas a, leite e sucos, podem ser testadas diretamente. As amostras podem ser diluídas ou suspendidas em solução, as quais podem incluir, porém não estão limitadas a, uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriana. Uma amostra que é sólida ou semissólida pode ser suspensa em um líquido por picagem, mistura ou maceração do sólido no líquido. A amostra deve ser mantida dentro de uma faixa de pH que promova a fixação do bacteriófago na célula bacteriana hospedeira. A amostra também deve conter as concentrações adequadas de cátions bivalentes e monovalentes, incluindo, porém não limitados a Na+, Mg2+ e Ca2+. Preferencialmente, a amostra é mantida em uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula patogênica contida dentro da amostra.
[56] Em algumas modalidades do ensaio de detecção, a amostra é mantida em uma temperatura a qual mantém a viabilidade de qualquer célula patogênica presente na amostra. Por exemplo, durante as etapas nas quais os bacteriófagos estão se ligando às células bacterianas, é preferível manter a amostra em uma temperatura que facilite a ligação do bacteriófago. Durante as etapas nas quais os bacteriófagos estão se replicando dentro de uma célula bacteriana infectada ou lisando a referida célula infectada, é preferível manter a amostra em uma temperatura que promove a replicação do bacteriófago e a lise do hospedeiro. As referidas temperaturas são de pelo menos cerca de 25 graus Celsius (°C), mais preferencialmente não mais do que cerca de 45 °C, mais preferencialmente cerca de 37 °C.
[57] Os ensaios podem incluir diversas amostras controle adequadas. Por exemplo, as amostras controle contendo nenhum bacteriófago ou as amostras controle contendo bacteriófagos sem bactérias podem ser avaliadas como controles para os níveis do sinal de fundo. Bacteriófago indicador
[58] Tal como aqui descrito em maiores detalhes, as composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender agentes infecciosos para uso na detecção de microrganismos patogênicos. Em determinadas modalidades, a invenção compreende um bacteriófago indicador recombinante, em que o genoma do bacteriófago é geneticamente modificado para incluir um gene indicador ou repórter. Em algumas modalidades, a invenção pode incluir uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador incorporado dentro do genoma do bacteriófago.
[59] Um bacteriófago indicador recombinante pode incluir um gene repórter ou indicador. Em determinadas modalidades do agente infeccioso, o gene indicador não codifica uma proteína de fusão. Por exemplo, em determinadas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de uma bactéria hospedeira resulta em um produto da proteína indicadora solúvel. Em determinadas modalidades, o gene indicador pode ser inserido na região tardia do gene do bacteriófago. Os genes tardios são, em geral, expressos em níveis mais altos do que outros genes de fago, uma vez que eles codificam para proteínas estruturais. A região tardia do gene pode ser uma região do gene de classe III e pode incluir um gene para uma proteína do capsídeo maior.
[60] Algumas modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga à jusante do gene da proteína do capsídeo maior. Outras modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga à montante do gene da proteína do capsídeo maior. Em algumas modalidades, a sequência compreende um gene repórter otimizado por códon precedido por uma região não traduzida. A região não traduzida pode incluir o promotor do gene tardio do fago e o sítio de entrada do ribossomo.
[61] Em algumas modalidades, um bacteriófago indicador é derivado do fago T7, T5, T4 ou outro fago similar. Um bacteriófago indicador pode também ser derivado de bacteriófago tipo T4, tipo T5, tipo T7, ViI, tipo ViI, bacteriófago específico para Salmonella ou outro bacteriófago que apresenta um genoma com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de homologia ao bacteriófago T7, tipo T7, T5, tipo T5, T4, tipo T4, bacteriófago específico para Salmonella, ViI, ou bacteriófagos tipo ViI (ou vírus tipo ViI, por GenBank / NCBI). Em algumas modalidades, o fago indicador é derivado de um bacteriófago que é altamente específico para um microrganismo patogênico particular. As modificações genéticas podem evitar deleções dos genes do tipo selvagem e, então, o fago modificado pode permanecer mais similar ao agente infeccioso do tipo selvagem do que muitos fagos comercialmente disponíveis. Os bacteriófagos derivados do meio ambiente podem ser mais específicos para bactérias as quais são encontradas no meio ambiente e como tal, geneticamente distintos do fago comercialmente disponível.
[62] Além disso, genes de fago considerados como não essenciais podem apresentar uma função não reconhecida. Por exemplo, um gene aparentemente não essencial pode apresentar uma função importante na elevação do tamanho da explosão, tal como funções de corte sutil, encaixe ou corte na montagem. Portanto, deletar genes para inserir um indicador pode ser prejudicial. A maioria dos fagos pode empacotar o DNA que é alguns por cento maiores do que seu genoma natural. Com esta consideração, um gene indicador menor pode ser uma escolha mais adequada para modificar um bacteriófago, especialmente um com um genoma menor. As proteínas OpLuc e NANOLUC® têm apenas cerca de 20 kDa (aproximadamente 500 - 600 bp para codificar), enquanto o FLuc tem cerca de 62 kDa (aproximadamente 1700 bp para codificar). Para comparação, o genoma de T7 tem cerca de 40 kbp, enquanto o genoma de T4 tem cerca de 170 kbp, e o genoma do bacteriófago SEA1 do fago de Salmonella tem cerca de 157 kbp. Além disso, o gene repórter não deve ser expresso endogenamente pela bactéria (isto é, não faz parte do genoma bacteriano), deve gerar um alto sinal em relação ao fundo, e deve ser prontamente detectável em tempo hábil.
O NANOLUC® da Promega é uma luciferase modificada de Oplophorus gracilirostris (camarão de águas profundas). Em algumas modalidades, o NANOLUC® combinado com o NANO-GLO® da Promega, um substrato de imidazopirazinona (furimazina), pode fornecer um sinal robusto com baixo fundo.
[63] Em algumas modalidades do fago indicador, o gene indicador pode estar inserido em uma região não traduzida para evitar a ruptura de genes funcionais, deixando os genes do fago do tipo selvagem intactos, os quais podem levar a um melhor ajuste quando da infecção de cepas de bactérias não laboratoriais. Adicionalmente, a inclusão de códons de parada nos três quadros de leitura pode ajudar a aumentar a expressão, reduzindo a leitura direta, também denominada como expressão vazada. Esta estratégia também pode eliminar a possibilidade de uma proteína de fusão ser feita em níveis baixos, o que iria se manifestar como um sinal de fundo (por exemplo, luciferase) o qual não pode ser separado do fago.
[64] Um gene indicador pode expressar uma variedade de biomoléculas. O gene indicador é um gene que expressa um produto detectável ou uma enzima que produz um produto detectável. Por exemplo, em uma modalidade, o gene indicador codifica uma enzima luciferase. Diversos tipos de luciferase podem ser usados. Em modalidades alternativas, e tal como aqui descrito em maiores detalhes, a luciferase é uma de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, luciferase de Renilla ou uma luciferase projetada. Em algumas modalidades, o gene da luciferase é derivado de Oplophorus. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase geneticamente modificado, tal como NANOLUC®.
[65] Então, em algumas modalidades, a presente invenção compreende um bacteriófago geneticamente modificado compreendendo um gene indicador não bacteriófago na região do gene tardio (classe III). Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo está sob o controle de um promotor tardio. Usar um promotor do gene tardio viral garante que o gene repórter (por exemplo, a luciferase) não seja apenas expressa em altos níveis, tais como proteínas do capsídeo viral, porém não se desliga, tal como genes bacterianos endógenos ou até mesmo genes virais precoces.
[66] Em algumas modalidades, o promotor tardio é um promotor tipo T4, T5, T7 ou ViI, ou outro promotor de fago similar àquele encontrado no fago do tipo selvagem selecionado, isto é, sem modificação genética. A região de gene tardio pode ser uma região de gene da classe III e o bacteriófago pode ser derivado de bacteriófago T7, T5, tipo T5, T4, tipo T4, ViI, tipo ViI, bacteriófago específico para Salmonella ou outro bacteriófago natural apresentando um genoma com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 % de homologia a bacteriófago T7, T5, tipo T5, T4, tipo T4, ViI, tipo ViI ou bacteriófago específico para Salmonella.
[67] As modificações genéticas nos agentes infecciosos podem incluir inserções, deleções ou substituições de um pequeno fragmento de ácido nucleico, uma parte substancial de um gene ou um gene inteiro. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos inseridos ou substituídos compreendem sequências não nativas. Um gene indicador não nativo pode ser inserido em um genoma do bacteriófago de tal modo que ele está sob o controle de um promotor de bacteriófago. Então, em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não faz parte de uma proteína de fusão. Isto é, em algumas modalidades, uma modificação genética pode estar configurada de tal modo que o produto da proteína indicadora não compreende polipeptídeos do bacteriófago do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o produto da proteína indicadora é solúvel. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de uma bactéria de interesse compreendendo a etapa de incubar uma amostra teste com o referido bacteriófago recombinante.
[68] Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador no bacteriófago da progênie após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína livre e solúvel. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não é contíguo com um gene que codifica uma proteína de fago estrutural e, assim, não produz uma proteína de fusão. Diferente dos sistemas que empregam a fusão de uma porção de detecção à proteína do capsídeo (isto é, uma proteína de fusão), algumas modalidades da presente invenção expressam um indicador solúvel ou repórter (por exemplo, luciferase solúvel). Em algumas modalidades, o indicador ou repórter está idealmente livre da estrutura do bacteriófago. Isto é, o indicador ou repórter não está ligado à estrutura do fago. Como tal, o gene para o indicador ou repórter não é fundido a outros genes no genoma do fago recombinante. Isto pode aumentar grandemente a sensibilidade do ensaio (para uma única bactéria), e simplificar o ensaio, permitindo que o ensaio seja completado em duas horas ou menos para algumas modalidades,
o oposto a diversas horas devido às etapas de purificação adicionais requeridas com constructos que produzem proteínas de fusão detectáveis. Além disso, proteínas de fusão podem ser menos ativas do que proteínas solúveis devido, por exemplo, a restrições de dobramento de proteínas que podem alterar a conformação do sítio ativo da enzima ou acesso ao substrato.
[69] Além disso, proteínas de fusão, por definição, limitam o número das porções ligadas às subunidades de uma proteína no bacteriófago. Por exemplo, pelo uso de um sistema comercialmente disponível projetado para atuar como uma plataforma para que uma proteína de fusão resulte em cerca de 415 cópias da porção de fusão, correspondendo a cerca de 415 cópias do gene 10B da proteína do capsídeo em cada partícula do bacteriófago T7. Sem essa restrição, espera-se que a bactéria infectada expresse muito mais cópias da porção de detecção (por exemplo, luciferase) que possa se ajustar ao bacteriófago. Adicionalmente, proteínas de fusão grandes, tais como uma fusão capsídeo - luciferase, podem inibir a montagem da partícula do bacteriófago, assim, produzindo menos progênies do bacteriófago. Então, um produto do gene indicador solúvel e não fundido pode ser preferível.
[70] Em algumas modalidades, o fago indicador codifica um repórter, tal como uma enzima detectável. O produto do gene indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Diversas enzimas adequadas estão comercialmente disponíveis, tais como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP) ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem atuar como a porção indicadora. Em algumas modalidades, luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis podem também ser porções indicadoras adequadas.
[71] Em algumas modalidades, o uso de uma porção de detecção solúvel elimina a necessidade de remover fago parental contaminante do lisado das células da amostra infectada. Com um sistema de proteína de fusão, qualquer bacteriófago usado para infectar células da amostra teria a porção de detecção ligada e seria indistinguível do bacteriófago filho que também contém a porção de detecção. Uma vez que a detecção da bactéria da amostra depende da detecção de uma porção de detecção recém-criada (novamente sintetizada), o uso de constructos de fusão requer etapas adicionais para separar porções antigas (parentais) de porções recém-criadas (bacteriófago filho). Isto pode ser alcançado pela lavagem das células infectadas por múltiplas vezes, antes do final do ciclo de vida do bacteriófago, inativando o excesso do fago parental após a infecção por meios físicos ou químicos, e / ou a modificação química do bacteriófago parental com uma porção de ligação (tais como biotina), as quais podem, então, estar ligadas e separadas (tais como pelos grânulos de sefarose revestidos com estreptavidina). No entanto, até mesmo com todas essas tentativas de remoção, o fago parental pode permanecer quando uma alta concentração de fago parental é usada para garantir a infecção de um baixo número de células da amostra, criando sinal de fundo que pode obscurecer a detecção do sinal do fago da progênie de células infectadas.
[72] Por outro lado, com a porção de detecção solúvel expressa em algumas modalidades da presente invenção, a purificação do fago parental a partir do lisado final é desnecessária, uma vez que o fago parental não apresenta qualquer porção de detecção ligada. Assim, qualquer porção de detecção presente após a infecção deve ter sido criada novamente, indicando a presença de uma bactéria ou bactérias infectadas. Para aproveitar este benefício, a produção e a preparação do fago parental pode incluir a purificação do fago a partir de qualquer porção de detecção livre produzida durante a produção do bacteriófago parental na cultura bacteriana. Técnicas de purificação padrão do bacteriófago podem ser empregadas para purificar algumas modalidades de fago de acordo com a presente invenção, tais como centrifugação por gradiente de densidade de sacarose, centrifugação por gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio, HPLC, cromatografia de exclusão de tamanho, e diálise ou tecnologias derivadas (tais como concentradores da marca Amicon - Millipore, Inc.). A ultracentrifugação isopícnica de cloreto de césio pode ser empregada como parte da preparação do fago recombinante da invenção, para separar as partículas de fago parental da proteína luciferase contaminante produzida na propagação do fago no hospedeiro bacteriano. Desta forma, o bacteriófago parental recombinante da invenção está substancialmente livre de qualquer luciferase gerada durante a produção na bactéria. A remoção da luciferase residual presente no estoque do fago pode reduzir substancialmente o sinal de fundo observado quando o bacteriófago recombinante é incubado com um teste de amostra.
[73] Em algumas modalidades do bacteriófago modificado, o promotor tardio (promotor da classe III, por exemplo, a partir de T7, T5, T4, ViI) apresenta alta afinidade pela RNA polimerase do mesmo bacteriófago que transcreve genes para proteínas estruturais montadas na partícula do bacteriófago. Estas proteínas são as proteínas mais abundantes produzidas pelo fago, uma vez que cada partícula de bacteriófago compreende dezenas ou centenas de cópias destas moléculas. O uso de um promotor viral tardio pode otimamente garantir alto nível de expressão da porção de detecção da luciferase. O uso de um promotor viral tardio derivado de, específico para ou ativo sob o bacteriófago do tipo selvagem original derivado do fago indicador (por exemplo, um promotor tardio T4, tipo T4, T5, tipo T5, T7, ViI TSP1, SEA1 ou TSP11) pode ainda garantir expressão ótima da porção de detecção. O uso de uma promotor da bactéria padrão (não viral / não bacteriófago) pode, em alguns casos, ser prejudicial à expressão, uma vez que estes promotores são, com frequência, regulados negativamente durante a infecção do bacteriófago (a fim de que o bacteriófago priorize as fontes bacterianas para a produção da proteína do fago). Então, em algumas modalidades, o fago e preferencialmente projetado para codificar e expressar, em altos níveis, uma porção indicadora solúvel (livre), usando um posicionamento no genoma que não limita a expressão ao número de subunidade de um componente estrutural do fago.
[74] As composições da invenção podem compreender um ou mais agentes infecciosos do tipo selvagem ou geneticamente modificados (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes indicadores de fago que podem codificar e expressar o mesmo ou diferentes proteínas indicadores. Em algumas modalidades, o coquetel de bacteriófago compreende pelo menos dois diferentes tipos de bacteriófagos recombinantes. Métodos de preparo do bacteriófago indicador
[75] As modalidades dos métodos para a produção do bacteriófago indicador começam com a seleção de um bacteriófago do tipo selvagem para a modificação genética. Alguns bacteriófagos são altamente específicos para uma bactéria alvo. Isto apresenta uma oportunidade para a detecção altamente específica.
[76] Então, os métodos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos agentes de ligação, associados com os agentes infecciosos, que reconhecem e se ligam a um microrganismo de interesse particular com um meio de amplificar um sinal e, assim, detectar baixos níveis de um microrganismo (por exemplo, um único microrganismo) presente em uma amostra. Por exemplo, agentes infecciosos (por exemplo, bacteriófago) reconhecem especificamente receptores de superfície de microrganismos particulares e, então, infectam especificamente esses microrganismos. Como tal, esses agentes infecciosos podem ser agentes de ligação adequados para direcionar um microrganismo de interesse.
[77] Algumas modalidades da invenção utilizam a especificidade da ligação e alto nível de capacidade de expressão genética do bacteriófago recombinante para o direcionamento rápido e sensível para infectar e facilitar a detecção de uma bactéria de interesse. Em algumas modalidades, o bacteriófago específico para Salmonella é geneticamente modificado para incluir um gene repórter. Em algumas modalidades, a região tardia do gene de um bacteriófago é geneticamente modificada para incluir um gene repórter. Em algumas modalidades, um gene repórter está posicionado à jusante do gene do capsídeo maior. Em outras modalidades, um gene repórter está posicionado à montante do gene do capsídeo maior. Em algumas modalidades, o constructo genético inserido ainda compreende seu próprio promotor exógeno dedicado para direcionar a expressão do gene indicador. O promotor exógeno está em adição a qualquer promotor endógeno no genoma do fago.
[78] Uma vez que o bacteriófago produz transcritos de mRNA policistrônico, apenas um único promotor é requerido à montante do primeiro gene / cístron no transcrito. Constructos recombinantes convencionais apenas utilizam o promotor endógeno do bacteriófago para direcionar os genes inseridos. Por outro lado, a adição de um promotor adicional à montante do gene repórter e sítio de ligação ao ribossomo pode aumentar a expressão gênica pela atuação como um sítio de iniciação secundária para a transcrição. Os genomas complicados e compactos dos vírus apresentam, com frequência, genes que se sobrepõem em diferentes quadros, algumas vezes em duas direções diferentes. A inserção de um promotor adicional pode, inadvertidamente, interferir com estes outros genes, e pode ser uma razão para não o fazer.
[79] Algumas modalidades dos métodos para o preparo de um bacteriófago indicador recombinante incluem selecionar um bacteriófago do tipo selvagem que infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo, tal como Salmonella spp.; preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga o qual compreende um gene indicador; transformar o plasmídeo / vetor de recombinação homóloga dentro de uma bactéria patogênica alvo; infectar a bactéria patogênica alvo transformada com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim, permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante.
[80] Diversos métodos para projetar e preparar um plasmídeo de recombinação homóloga são conhecidos. Diversos métodos para transformar a bactéria com um plasmídeo são conhecidos, incluindo choque térmico, conjugação bacteriana mediada por pilus F, eletroporação e outros métodos. Diversos métodos para o isolamento de um clone particular após a recombinação homóloga são também conhecidos. Alguns métodos das modalidades aqui descritas utilizam estratégias particulares.
[81] Então, algumas modalidades dos métodos para o preparo bacteriófago indicador inclui as etapas de selecionar um bacteriófago do tipo selvagem que infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; determinar a sequência natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para recombinação homóloga adjacente ao gene da proteína do capsídeo maior, em que a sequência compreende um gene repórter otimizado por códon; incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga dentro de um plasmídeo / vetor; transformar o plasmídeo / vetor dentro de uma bactéria patogênica alvo; selecionar a bactéria transformada; infectar a bactéria transformada com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo e o genoma do bacteriófago; determinar o título do lisado do bacteriófago recombinante resultante; e realizar um ensaio de diluição limitante para enriquecer e isolar o bacteriófago recombinante.
Algumas modalidades compreendem, ainda, repetir as etapas de diluição limitante e titulação, após o primeiro ensaio de diluição limitante, tal como necessário até que o bacteriófago recombinante represente uma fração detectável da mistura.
Por exemplo, em algumas modalidades, as etapas de diluição limitante e titulação podem ser repetidas até que pelo menos 1/30 do bacteriófago na mistura seja recombinante antes do isolamento de um clone particular do bacteriófago recombinante.
Uma proporção de 1:30 recombinante:tipo selvagem é esperada, em algumas modalidades, para produzir uma média de 3.2 unidades de transdução (TU) por 96 placas (por exemplo, em uma placa de 96 poços). A proporção inicial do fago recombinante para o fago do tipo selvagem pode ser determinada pela realização do ensaio de diluição limitante baseado no TCID50 (dose infecciosa de 50 % da cultura de tecido) tal como previamente descrito no pedido norte americano n° US 15/409.258. Pela distribuição de Poisson, uma proporção de
1:30 gera uma chance de 96 % de observação de pelo menos um TU em algum lugar dos 96 poços.
[82] A Figura 1 mostra uma representação esquemática da estrutura genômica de um bacteriófago indicador recombinante da invenção. Para a modalidade mostrada na Figura 1, a porção de detecção é codificada por um gene luciferase 100 inserido dentro região tardia do gene (classe III) 110, o qual é expresso tardiamente no ciclo de vida viral. Os genes tardios são, geralmente, expressos em níveis mais altos do que outros genes do fago, uma vez que eles codificam para proteínas estruturais. Então, na modalidade do fago recombinante mostrada na Figura 1, o gene indicador (isto é, luciferase) é inserido na região tardia do gene, logo após o gene para a proteína do capsídeo maior (MCP) 120, e é um constructo compreendendo o gene luciferase 100. Em algumas modalidades, o constructo mostrado na Figura 1 pode incluir códons de parada em todos os 3 quadros de leitura para garantir que a luciferase não seja incorporada dentro do produto do gene da MCP através da criação de uma proteína de fusão. Também, tal como mostrado na Figura 1, o constructo pode compreender um promotor tardio adicional 130 dedicado para direcionar a transcrição e expressão do gene luciferase. O constructo também compreende um sítio de ligação do ribossomo (RBS)
140. Este constructo garante que luciferase solúvel seja produzida de modo que a expressão não está limitada ao número de proteínas do capsídeo inerentes no sistema de apresentação do fago.
[83] Tal como aqui notado, em determinadas modalidades, pode ser preferido utilizar agentes infecciosos os quais foram isolados do meio ambiente para a produção dos agentes infecciosos da invenção. Neste sentido, os agentes infecciosos os quais são microrganismos derivados naturalmente específicos podem ser gerados.
[84] Por exemplo, a Figura 2 mostra o genoma do bacteriófago SEA1, um fago natural que apresenta cerca de 95 % de homologia de sequência com um bacteriófago S16 T4 relacionado ao miovírus. O genoma completo do bacteriófago SEA1 foi sequenciado usando o sistema ILLUMINA® MISEQ™ com o conjunto de sequência de novo. Tal como discutido nos Exemplos, a proteína do capsídeo maior 220 e diversos outros genes estruturais estão dentro da região de gene tardio 210, consistindo de genes estruturais, os quais codificam para proteínas do vírion. O gene 57A 230, que codifica para a chaperona para a formação da fibra longa da cauda fica no limite da região de gene tardio. Uma vez que estas proteínas do vírion são expressas em um nível muito alto, espera-se que quaisquer genes inseridos nesta região apresentem níveis de expressão similares, desde que os promotores do gene tardio e / ou outros elementos de controle similares sejam usados.
[85] Existem inúmeros métodos e produtos comerciais conhecidos para a preparação de plasmídeos. Por exemplo, PCR, mutagênese dirigida ao local, digestão de restrição, ligação, clonagem, e outras técnicas podem ser utilizadas em combinação para a preparação de plasmídeos. Os plasmídeos sintéticos também podem ser pedidos comercialmente (por exemplo, GeneWiz). Cosmídeos também podem ser empregados ou o sistema CRISPR / CAS9 pode ser usado para editar seletivamente um genoma do bacteriófago.
Algumas modalidades dos métodos de preparo de um bacteriófago indicador recombinante incluem projetar um plasmídeo que pode recombinar prontamente com o genoma do bacteriófago do tipo selvagem para gerar genomas recombinantes. Ao projetar um plasmídeo, algumas modalidades incluem a adição de um gene repórter otimizado por códon, tal como um gene luciferase. Algumas modalidades ainda incluem a adição de elementos dentro da região não traduzida à montante. Por exemplo, ao projetar um plasmídeo para recombinar com o genoma do bacteriófago específico para Salmonella, uma região não traduzida à montante pode ser adicionada entre a sequência que codifica o C terminal da proteína gp23 / proteína do capsídeo maior e o códon de início do gene repórter NANOLUC®. A região não traduzida pode incluir um promotor, tal como um promotor de bacteriófago T4, tipo T4, T7, tipo T7, bacteriófago específico para Salmonella ou para Staphylococcus, ViI, ou tipo ViI. A região não traduzida incluir uma entrada / sítio de ligação do ribossomo (RBS), também conhecida como uma “sequência Shine-Dalgarno” com sistemas bacterianos. Um ou ambos destes elementos, ou outros elementos não traduzidos, podem ser abrangidos dentro de uma curta região não traduzida à montante feita de sequências aleatórias compreendendo cerca do mesmo conteúdo GC como o resto do genoma do fago. A região aleatória não deve incluir uma sequência ATG, uma vez que esta atua como um códon de partida.
[86] As composições da invenção podem compreender diversos agentes infecciosos e / ou genes indicadores. Por exemplo, a Figura 3 mostra três constructos de plasmídeo de recombinação homóloga usados para produzir o fago indicador específico para Salmonella. Os constructos foram feitos e usados em recombinação com o fago de SEA1 de Salmonella para gerar o bacteriófago recombinante da invenção. Então, o constructo 300 superior na Figura 3 mostra um plasmídeo de recombinação apresentando o constructo NANOLUC® usado para a inserção da recombinação homóloga da luciferase NANOLUC® em SEA1: plasmídeo de recombinação homóloga pUC57.HR..SEA1.Pre.Late.NANOLUC®. Tentativas prévias de inserir o NANOLUC® adjacente à proteína do capsídeo maior falharam com o SEA1 devido a problemas de estabilidade. O constructo 350 do mesmo mostra um plasmídeo de recombinação apresentando o constructo NanoLuc® usado para a inserção da recombinação homóloga da luciferase NanoLuc® em TSP1, um miovírus relacionado a ou dentro do genoma do vírus tipo T4: plasmídeo de recombinação homóloga pUC57.HR.TSP1.NANOLUC®. O constructo 360 inferior mostra um plasmídeo de recombinação apresentando o constructo NANOLUC® usado para a inserção da recombinação homóloga da luciferase NANOLUC® em TSP1, um miovírus relacionado a ou dentro do genoma do vírus tipo T5: plasmídeo de recombinação homóloga pUC57.HR.TSP11.NANOLUC®.
[87] O fragmento da proteína do capsídeo maior é uma parte de um gene estrutural que codifica uma proteína do vírion. Uma vez que estas proteínas do vírion são expressas em um nível muito alto, espera-se que quaisquer genes inseridos nesta região apresentem níveis de expressão similares, desde que promotores do gene tardio e / ou outros elementos de controle similar sejam utilizados.
[88] Em algumas modalidades, o fago indicador de acordo com a invenção compreende um bacteriófago específico para Salmonella geneticamente projetado para compreender um gene repórter tal como um gene luciferase. Por exemplo, um fago indicador pode ser um bacteriófago específico para Salmonella em que o genoma compreende a sequência do gene NANOLUC®. Um genoma do bacteriófago NanoLuc específico para Salmonella recombinante pode ainda compreender um promotor consenso de bacteriófago T4, T5, T7, bacteriófago específico para Salmonella, ViI ou outro promotor tardio. Em modalidades adicionais, o promotor é um promotor exógeno. A inserção de um promotor exógeno para direcionar a expressão de um gene indicador é vantajosa uma vez que a expressão não está limitada pela expressão de outras proteínas do fago (por exemplo, a proteína do capsídeo maior).
[89] Então, na modalidade do fago recombinante gerada como um resultado da recombinação, o gene indicador (isto é, NANOLUC®) é inserido na região tardia do gene, logo à jusante do gene que codifica a proteína do capsídeo maior e, então, cria genomas do bacteriófago recombinante compreendendo o gene NANOLUC®. O constructo pode adicionalmente compreender o promotor consenso do bacteriófago T4, T7, específico para Salmonella, ViI ou outro promotor tardio ou outro promotor adequado para direcionar a transcrição e a expressão do gene da luciferase. O constructo pode também compreender uma região não traduzida composta sintetizada a partir de diversas UTRs. Esse constructo garante que a luciferase solúvel seja produzida de tal modo que a expressão não está limitada ao número de proteínas do capsídeo inerente no sistema de apresentação do fago.
[90] A Figura 4 mostra o isolamento do fago recombinante a partir da mistura do bacteriófago do tipo selvagem e recombinante que resulta da recombinação homóloga. Na primeira etapa 402, as bactérias Salmonella spp. transformadas com o plasmídeo de recombinação homóloga são infectadas com o bacteriófago SEA1 de Salmonella spp., resultando no fago da progênie com uma mistura de fago parental e recombinante com baixas proporções de fago do tipo selvagem para o fago recombinante 434. A mistura resultante de fago recombinante é diluída 404 na placa de 96 poços 406 para fornecer um média de 5 unidades de transdução recombinantes (TU) por placa (9.3 UFC / poço). A placa de 96 poços é avaliada para a atividade da luciferase para identificar poços 436 contendo fago recombinante quando comparado com os poços 440 contendo bacteriófago do tipo selvagem. As bactérias 438 são adicionadas 408; por exemplo, cada poço pode conter cerca de 50 µL de uma cultura túrbida de Salmonella. Isto permite ao fago se replicar e produzir a enzima luciferase 442. Após 5 horas de incubação a 37 °C mostrado em 410, os poços podem ser avaliados para a presença de luciferase 442. Quaisquer poços positivos foram provavelmente inoculados com um único fago recombinante e neste estágio, a mistura pode conter uma proporção de aproximadamente 10 fagos do tipo selvagem: 1 fago recombinante, um enriquecimento sobre a proporção original. Se necessário (isto é, se a proporção de fago recombinante:total é menor do que 1:30), a progênie a partir desta cultura enriquecida 412 pode ser submetida a ensaio(s) de diluição limitante(s) adicionais 414 para aumentar a proporção e determinar a concentração real das unidades transdutoras de fago recombinante. Por exemplo, se a proporção foi 1:384 recombinantes:UFC, cerca de 5 TU recombinantes junto com 1920 fagos contaminantes no total (5 x 384 = 1920) por placa de 96 poços 416 podem ser aliquotados 414 a partir do poço positivo prévio, levando a uma inoculação aproximada dos 20 fagos do tipo mais selvagem por poço (1920 UFC / 96 poços = 20 UFC / poço) de uma segunda placa do ensaio de diluição 420. Qualquer poço com luciferase positiva foi provavelmente inoculado com um único recombinante junto com 19 fagos do tipo selvagem. Estes poços podem ser analisados para a presença da luciferase 442.
[91] Após a adição de bactérias e incubação (por exemplo, por 5 horas a 37 °C) 418, a luciferase solúvel e o fago estão presentes em aproximadamente 20 total:1 recombinante 420. Essa proporção pode ser verificada por titulação TU50 para recombinantes e ensaio de placa para o UFC total. Por fim, um ensaio da placa pode ser realizado 422 para avaliar os recombinantes que expressam a luciferase 446. Um pequeno número de placas individuais (por exemplo, n = 48) pode ser individualmente escolhido e avaliado em uma terceira placa de múltiplos poços 426 para a atividade da luciferase 436. Em uma modalidade, esta abordagem deve garantir que sejam avaliadas placas suficientes, de modo que cerca de 3 recombinantes estejam na mistura de placas sendo avaliadas com base na proporção conhecida de recombinantes para o fago total. Uma placa pode ser removida de cada poço da placa de uma placa de 96 poços 424 e um ensaio da luciferase realizado 426 para determinar quais os poços contidos no fago que exibe atividade da luciferase 442. Os poços 428 que demonstram atividade da luciferase representam o fago recombinante puro 434, enquanto os poços sem atividade da luciferase 430 representam o fago do tipo selvagem puro 432.
[92] Placas individuais podem, então, ser suspendidas em tampão (por exemplo, 100 µL de TMS) ou meio, e uma alíquota (por exemplo, cerca de 5 µL) adicionada a um poço contendo uma cultura túrbida de Salmonella spp. e avaliada após a incubação (por exemplo, cerca de 45 minutos a 1 hora a 37 °C). Espera-se que os poços positivos contenham uma cultura pura do fago recombinante. Determinadas modalidades podem incluir rodadas adicionais de purificação da placa.
[93] Então, tal como ilustrado pela Figura 4, o fago recombinante gerado pela recombinação homóloga de um plasmídeo projetado para a recombinação com o genoma do fago do tipo selvagem pode ser isolado a partir de uma mistura compreendendo uma porcentagem muito pequena (por exemplo, 0.005 %) do genoma total dos fagos. Após o isolamento, a produção em larga escala pode ser realizada para obter estoques com alta titulação do fago indicador recombinante, adequados para uso no ensaio de detecção da Salmonella spp.. Além disso, a centrifugação de gradiente de densidade isopícnica do cloreto de césio pode ser usada para separar partículas de fago da proteína luciferase contaminante para reduzir o fundo. Métodos de uso de agentes infecciosos para a detecção de microrganismos
[94] Tal como aqui notado, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender métodos de uso de partículas infecciosas para a detecção de microrganismos, tais como Salmonella spp. Os métodos da invenção podem ser incorporados em uma variedade de maneiras.
[95] Em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com o bacteriófago que infecta a bactéria de interesse, em que o bacteriófago compreende um gene indicador de modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria de interesse resulta na produção de um produto de proteína indicadora solúvel; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.
[96] Em determinadas modalidades, o ensaio pode ser realizado para utilizar um conceito geral que pode ser modificado para acomodar diferentes tipos ou tamanhos de amostra e formatos de ensaio. As modalidades que empregam o bacteriófago recombinante da invenção (isto é, o bacteriófago indicador) podem permitir a rápida detecção de Salmonella spp., com tempos de ensaio total de 1.5, 2.0,
2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0,
8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12, 12.5, 13.0,
13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0,
18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 24.0, 25.0 ou
26.0 horas, dependendo do tipo da amostra, tamanho da amostra e formato do ensaio. Por exemplo, a quantidade de tempo requerida pode ser, de alguma forma, mais curta ou mais longa, dependendo da cepa do bacteriófago e da cepa das bactérias a serem detectadas no ensaio, tipo e tamanho da amostra a ser testada, condições requeridas para viabilidade do alvo, complexidade do ambiente físico / químico, e a concentração dos contaminantes bacterianos “endógenos” não alvo.
[97] A Figura 5 mostra uma estratégia de uso de fago indicador que produz luciferase solúvel de acordo com uma modalidade da invenção. Neste método, o fago (por exemplo, fago TSP1, TSP11, SEA1) pode ser projetado para expressar uma luciferase solúvel durante a replicação do fago. A expressão da luciferase é direcionada pelo promotor do capsídeo viral (por exemplo, o promotor tardio do bacteriófago T5 ou T4), produzindo alta expressão. O fago parental será livre de luciferase, logo, a luciferase detectada no ensaio deve vir da replicação do fago da progênie durante a infecção das células bacterianas. Então, não há, em geral, necessidade de separar o fago parental do fago da progênie.
[98] Nestes experimentos, pelo menos parte da amostra 500 compreendendo as bactérias 502 a serem quantificadas é posicionada em uma coluna filtrante spin e centrifugada para remover o caldo LB e uma multiplicidade adequada de fago 504 geneticamente projetado para expressar luciferase solúvel 503 são adicionadas. As células infectadas podem ser incubadas por tempo suficiente para a que replicação do fago da progênie e a lise celular ocorram (por exemplo, 30 - 120 minutos a 37 ºC). O fago parental 504 e fago da progênie 516 mais a luciferase livre 503 no lisado podem, então, ser coletadas, por exemplo, por centrifugação e o nível de luciferase no filtrado quantificado usando um luminômetro 518. Alternativamente, um método de alto rendimento pode ser empregado, em que as amostras bacterianas são aplicadas a uma placa filtrante de 96 poços e, após todas as manipulações listadas acima serem realizadas, podem ser diretamente avaliadas para a luciferase na placa filtrante de 96 poços original sem a etapa de centrifugação final.
[99] A Figura 6 mostra um ensaio de placa filtrante para a detecção das bactérias de interesse usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção. De forma breve, as amostras 616 que incluem uma bactéria de interesse 618 podem ser adicionadas aos poços 602 de uma placa filtrante de múltiplos poços 604 e viradas 606 para concentrar as amostras pela remoção de líquido da amostra. Os fagos geneticamente modificados 620 são adicionados aos poços e incubados com meio adicional adicionado por tempo suficiente para a adsorção 608 seguida pela infecção da bactéria alvo e avanço do ciclo de vida do fago 610 (por exemplo, aproximadamente 45 minutos). Por fim, o substrato luciferase é adicionado e reage com qualquer luciferase presente 624. A emissão resultante é medida em um luminômetro 614 o qual detecta a atividade da luciferase 626.
[100] o ensaio pode ser realizado sem a concentração da bactéria na ou próxima da superfície de captura. A Figura 7 ilustra um “ensaio sem concentração” para a detecção de uma bactéria de interesse usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção. As alíquotas do fago indicador 714 são distribuídas aos poços individuais 702 de uma placa de múltiplos poços 704 e, então, alíquotas da amostra teste contendo a bactéria 712 são adicionadas e incubadas 706 (por exemplo, 45 minutos a 37 °C) por um intervalo de tempo suficiente para que o fago se replique e gere indicadores solúveis 716 (por exemplo, luciferase). Os poços da placa 708 contendo o indicador solúvel e o fago podem, então, ser avaliados 710 para medir a atividade do indicador na placa 718 (por exemplo, ensaio da luciferase). Nesta modalidade, as amostras testes não são concentradas (por exemplo, por centrifugação), porém, são simplesmente incubadas diretamente com o fago indicador por um período de tempo e subsequentemente avaliadas para a atividade da luciferase.
[101] Em algumas modalidades, a amostra pode ser enriquecida antes do teste pela incubação em condições que encorajem o crescimento. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 horas ou maior, dependendo do tipo e tamanho da amostra.
[102] Em algumas modalidades, o bacteriófago indicador compreende uma porção indicadora detectável e a infecção de uma única célula patogênica (por exemplo, bactéria) pode ser detectada por um sinal amplificado gerado por meio da porção indicadora. Então, o método pode compreender detectar uma porção indicadora produzida durante a replicação do fago, em que a detecção do indicador indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.
[103] Em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta a bactéria de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em um região de gene tardio do bacteriófago de modo que expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta na produção de um produto de proteína indicadora solúvel; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra. Em algumas modalidades, a quantidade da porção indicadora detectada corresponde à quantidade da bactéria de interesse presente na amostra.
[104] Tal como aqui descrito em maiores detalhes, os métodos e sistemas da invenção podem utilizar faixas de concentração do bacteriófago indicador parental para infectar a bactéria presente na amostra. Em algumas modalidades, os bacteriófagos indicadores são adicionados à amostra em uma concentração suficiente para rapidamente encontrar, se ligar e infectar a bactéria alvo as quais estão presentes em números muito baixos na amostra, tais como uma única célula. Em algumas modalidades, a concentração do fago pode ser suficiente para encontrar, se ligar e infectar a bactéria alvo em menos do que uma hora. Em outras modalidades, este eventos podem ocorrer em menos do que duas horas, ou menos do que três horas, após a adição do fago indicador à amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, a concentração do bacteriófago para a etapa de incubação é maior do que 1 x 105 UFC / mL, maior do que 1 x 106 UFC / mL, ou maior do que 1 x 107 UFC / mL.
[105] Em determinadas modalidades, o agente infeccioso recombinante pode ser purificado de modo a estar livre de qualquer proteína indicadora residual que pode ser gerada na produção do estoque do agente infeccioso. Então, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser purificado usando centrifugação com gradiente de densidade isopícnica do cloreto de césio antes da incubação com a amostra. Quando o agente infeccioso é um bacteriófago, esta purificação pode apresentar o benefício adicional da remoção do bacteriófago que não apresenta DNA (isto é, fago vazio ou “fantasma”).
[106] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o microrganismo pode ser detectado sem qualquer isolamento ou purificação dos microrganismos a partir da amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma amostra contendo um ou alguns microrganismos de interesse pode ser aplicada diretamente em um recipiente de ensaio, tal como uma coluna spin, um poço de micro titulação ou um filtro e o ensaio é realizado neste recipiente de ensaio. Diversas modalidades dos referidos ensaios são aqui descritas.
[107] Alíquotas de uma amostra teste podem ser distribuídas diretamente nos poços de uma placa de múltiplos poços, o fago indicador pode ser adicionado e, após um intervalo de tempo suficiente para a infecção, um tampão de lise pode ser adicionado bem como um substrato para a porção indicadora (por exemplo, substrato luciferase para um indicador luciferase) e avaliado para a detecção do sinal indicador. Algumas modalidades do método podem ser realizadas em placas filtrantes. Algumas modalidades do método podem ser realizadas com ou sem a concentração da amostra antes da infecção com o fago indicador.
[108] Por exemplo, em muitas das modalidades, as placas de múltiplos poços são usadas para conduzir os ensaios. A escolha das placas (ou qualquer outro recipiente no qual a detecção pode ser realizada) pode afetar a etapa de detecção. Por exemplo, algumas placas podem incluir um fundo colorido ou branco, o qual pode afetar a detecção das emissões de luz. De forma geral, placas brancas apresentam sensibilidade mais alta, porém também produzem um sinal de fundo mais alto. Outras cores de placas podem gerar sinal de fundo mais baixo, porém, também apresentam uma sensibilidade levemente mais baixa. Adicionalmente, uma razão para o sinal de fundo é o vazamento de luz vinda de um poço para o outro, o poço adjacente. Existem algumas placas que apresentam poços brancos, porém o resto da placa é preta. Isto permite um sinal alto dentro do poço, porém evita o vazamento de luz de um poço para outro e, então, pode diminuir o fundo. Então, a escolha da placa ou outro frasco de ensaio pode influenciar na sensibilidade e sinal de fundo para o ensaio.
[109] Os métodos da invenção podem compreender diversas outras etapas para aumentar a sensibilidade. Por exemplo, tal como discutido aqui em maiores detalhes, o método pode compreender uma etapa para a lavagem da bactéria capturada e infectada, após a adição do bacteriófago, porém antes da incubação, para remover o excesso de bacteriófago parental e / ou luciferase ou outra proteína repórter contaminante da preparação do bacteriófago.
[110] Em algumas modalidades, a detecção do microrganismo de interesse pode ser completada sem a necessidade de cultivar a amostra como uma maneira de aumentar a população dos microrganismos. Por exemplo, em determinadas modalidades, o tempo total requerido para a detecção é menor do que 26.0 horas, 25.0 horas, 24.0 horas,
23.0 horas, 22.0 horas, 21.0 horas, 20.0 horas, 19.0 horas,
18.0 horas, 17.0 horas, 16.0 horas, 15.0 horas, 14.0 horas,
13.0 horas, 12.0 horas, 11.0 horas, 10.0 horas, 9.0 horas,
8.0 horas, 7.0 horas, 6.0 horas, 5.0 horas, 4.0 horas, 3.0 horas, 2.5 horas, 2.0 horas, 1.5 horas, 1.0 hora, 45 minutos ou menor do que 30 minutos. Minimizar o tempo para o resultado é crítico para testes para patógenos em alimentos e no meio ambiente.
[111] Em contraste com os ensaios conhecidos no estado da técnica, o método da invenção pode detectar microrganismos individuais. Então, em determinadas modalidades, o método pode detectar ≤ 10 células do microrganismo (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 microrganismos) presentes em uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para Salmonella spp. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode diferenciar a Salmonella spp. na presença de outros tipos de bactérias. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser usado para detectar uma única bactéria do tipo específico na amostra. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 da bactéria específica na amostra.
[112] Então, aspectos da presente invenção fornecem métodos para a detecção de microrganismos em uma amostra teste por meio de uma porção indicadora. Em algumas modalidades, quando o microrganismo de interesse é uma bactéria, a porção indicadora pode estar associada a um agente infeccioso tal como um bacteriófago indicador. A porção indicadora pode reagir com um substrato para emitir um sinal detectável ou pode emitir um sinal intrínseco (por exemplo, proteína fluorescente). Em algumas modalidades, a sensibilidade da detecção pode revelar a presença de tão pouco quanto 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 células do microrganismo de interesse na amostra teste. Em algumas modalidades, até mesmo uma única célula do microrganismo de interesse pode produzir um sinal detectável. Em algumas modalidades, o bacteriófago é um bacteriófago tipo T4 ou tipo ViI. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é derivado de um bacteriófago específico para Salmonella. Em determinadas modalidades, um bacteriófago recombinante específico para Salmonella é altamente específico para Salmonella spp.
[113] Em algumas modalidades, a porção indicadora codificada pelo agente infeccioso pode ser detectável durante ou após a replicação do agente infeccioso. Muitos diferentes tipos de biomoléculas detectáveis adequadas para uso como porções indicadoras são conhecidas no estado da técnica, e muitas estão comercialmente disponíveis. Em algumas modalidades, o fago indicador compreende uma enzima, a qual atua como a porção indicadora. Em algumas modalidades, o genoma do fago indicador é modificado para codificar uma proteína solúvel. Em algumas modalidades, o fago indicador codifica uma enzima detectável. O indicador pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Diversas enzimas adequadas estão comercialmente disponíveis, tais como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP) ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, estas enzimas podem atuar como a porção indicadora. Em algumas modalidades, luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis podem também ser porções indicadoras adequadas.
[114] Então, em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante dos métodos, sistemas ou kits é preparado a partir do bacteriófago do tipo selvagem específico para Salmonella. Em algumas modalidades, o gene indicador codifica uma proteína que emite um sinal intrínseco, tal como uma proteína fluorescente (por exemplo, proteína verde fluorescente ou outras). O indicador pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Em algumas modalidades, o gene indicador codifica uma enzima (por exemplo, luciferase) que interage com um substrato para gerar um sinal. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase. Em algumas modalidades, o gene luciferase é um de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Renilla, luciferase externa de Gaussia, luciferase de Lucia ou uma luciferase projetada, tal como NANOLUC®, Rluc8.6-535 ou nano lanterna laranja (em inglês, orange nano-lantern).
[115] A detecção do indicador pode incluir a detecção de emissões de luz. Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser usado para detectar a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com um substrato. A detecção de RLU pode ser alcançada com um luminômetro ou outras máquinas ou dispositivos podem, também, ser usados. Por exemplo, um espectrofotômetro, câmera CCD ou câmera CMOS pode detectar as mudanças de cor e outras emissões de luz. A RLU absoluta é importante para a detecção, porém, a proporção do sinal para o fundo também precisa ser alta (por exemplo, > 2.0, >
2.5 ou > 3.0) de modo que uma única célula ou baixos números de células sejam confiavelmente detectados.
[116] Em algumas modalidades, o fago indicador é geneticamente projetado para conter o gene para uma enzima, tal como uma luciferase, a qual é produzida apenas quando da infecção da bactéria que o fago especificamente reconhece e infecta. Em algumas modalidades, a porção indicadora é expressa tardiamente no ciclo de vida viral. Em algumas modalidades, tal como aqui descrito, o indicador é uma proteína solúvel (por exemplo, luciferase solúvel) e não está fundido com uma proteína estrutural do fago que limita seu número de cópias.
[117] Então em algumas modalidades que utilizam o fago indicador, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse compreendendo as etapas de capturar pelo menos uma bactéria da amostra; incubar a pelo menos uma bactéria com uma pluralidade de fagos indicadores; permitir tempo para a infecção e replicação para gerar fagos da progênie e expressar a porção indicadora solúvel; e detectar o fago da progênie, ou preferencialmente o indicador, em que a detecção do indicador demonstra que a bactéria está presente na amostra.
[118] Por exemplo, em algumas modalidades a bactéria da amostra teste pode ser capturada pela ligação à superfície de uma placa ou pela filtração da amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, filtro spin com 0.45 μm de tamanho de poro ou placa filtrante). Em uma modalidade, o agente infeccioso (por exemplo, fago indicador) é adicionado em um volume mínimo para a amostra capturada diretamente no filtro. Em uma modalidade, o microrganismo capturado no filtro ou superfície da placa é subsequentemente lavado uma ou mais vezes para remover o excesso de agente infeccioso não ligado. Em uma modalidade, um meio (por exemplo, caldo Luria-Bertani, também aqui denominado LB, ou Tr ou caldo de soja tríptica ou caldo de soja triptona, também aqui denominado TSB, ou água peptona tamponada, também aqui denominado BPW) pode ser adicionado para um maior tempo de incubação, para permitir a replicação das células bacterianas e fago e altos níveis de expressão do gene que codifica a porção indicadora. No entanto, um aspecto surpreendente de algumas modalidades dos ensaios do teste é que a etapa de incubação com o fago indicador precisa ser longa o suficiente para um único ciclo de vida do fago. Previamente, acreditava-se que o poder de amplificação ao utilizar o bacteriófago iria requere mais tempo, de modo que o fago iria replicar por diversos ciclos. Um único ciclo de replicação do fago indicador pode ser suficiente para facilitar a sensibilidade e rápida detecção de acordo com algumas modalidades da presente invenção.
[119] Em algumas modalidades, as alíquotas de uma amostra teste compreendendo bactérias podem ser aplicadas a uma coluna spin e, após a infecção com um bacteriófago recombinante e uma lavagem opcional para remover qualquer excesso de bacteriófago, a quantidade de indicador solúvel detectada será proporcional à quantidade de bacteriófago que é produzida pelas bactérias infectadas.
[120] Indicadores solúveis (por exemplo, luciferase) liberados no líquido circundante quando da lise das bactérias podem, então, ser medidos e quantificados. Em uma modalidade, a solução é virada através do filtro e o filtrado coletado para o ensaio em um novo receptáculo (por exemplo, em um luminômetro) após a adição de um substrato para a enzima indicadora (por exemplo, substrato luciferase). Alternativamente, o sinal indicador pode ser diretamente medido no filtro.
[121] Em diversas modalidades, o fago indicador parental purificado não compreende o indicador detectável por si só, uma vez que o fago parental pode ser purificado antes de este ser usado para a incubação com uma amostra teste. A expressão dos genes tardios (Classe III) ocorre tardiamente no ciclo de vida viral. Em algumas modalidades da presente invenção, o fago parental pode ser purificado para excluir qualquer proteína indicadora existente (por exemplo, luciferase). Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto da proteína indicadora solúvel. Então, em muitas modalidades, não é necessário separar o fago parental do fago da progênie antes da etapa de detecção. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o fago indicador é um bacteriófago. Em uma modalidade, a porção indicadora é luciferase solúvel, a qual é liberada quando da lise do microrganismo hospedeiro.
[122] Então, em uma modalidade alternativa, o substrato indicador (por exemplo, substrato luciferase) pode ser incubado com a porção da amostra que permanece em um filtro ou ligado à superfície da placa. De acordo, em algumas modalidades, o suporte sólido é uma placa filtrante de 96 poços (ou placa de 96 poços regular), e a reação do substrato pode ser detectada pelo posicionamento da placa diretamente no luminômetro.
[123] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de Salmonella spp. compreendendo as etapas de: infectar células capturadas em uma placa filtrante de 96 poços com uma pluralidade de indicadores do fago parental capazes de expressar a luciferase sob infecção; lavar o excesso de fago; adicionar o caldo TSB e permitir tempo para o fago replicar e lisar o alvo de Salmonella spp. específico (por exemplo, 30 - 120 minutos); detectar a luciferase indicadora pela adição do substrato luciferase e medir a atividade da luciferase diretamente na placa de 96 poços, em que a detecção da atividade da luciferase indica que a Salmonella spp. está presente na amostra.
[124] Em outra modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de Salmonella spp. compreendendo as etapas de: infectar as células em solução ou suspensão líquida em uma placa de 96 poços com uma pluralidade de fago indicador parental capaz de expressar a luciferase sob infecção; permitir tempo para o fago replicar e lisar o alvo de Salmonella spp. específico (por exemplo, 30 - 120 minutos); e detectar a luciferase indicadora pela adição do substrato luciferase e medir a atividade da luciferase diretamente na placa de 96 poços, em que a detecção da atividade da luciferase indica que a Salmonella spp. está presente na amostra. Na referida modalidade, nenhuma etapa de captura é necessária. Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser uma amostra teste consumível, tal como uma lavagem de vegetais. Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser uma lavagem de vegetais fortificada com caldo LB concentrado, caldo de soja tríptica ou caldo de triptona soja, água peptona tamponada ou caldo nutriente. Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser bactérias diluídas em caldo LB.
[125] Em algumas modalidades, a lise da bactéria pode ocorrer antes, durante ou depois da etapa de detecção. Os experimentos sugerem que as células não lisadas infectadas podem ser detectáveis pela adição de substrato luciferase em algumas modalidades. Presumivelmente, a luciferase pode sair das células e / ou o substrato luciferase pode entrar nas células sem a lise celular completa. Então, para as modalidades que utilizam o sistema filtrante spin, em que apenas a luciferase liberada no lisado (e não a luciferase ainda dentro da bactéria intacta) é analisada no luminômetro, a lise é requerida para a detecção. No entanto, para as modalidades que utilizam placa filtrantes ou placas de 96 poços com amostra em solução ou suspensão, nos quais a placa original cheia de células intactas e lisadas é diretamente testada no luminômetro, a lise não é necessária para a detecção.
[126] Em algumas modalidades, a reação da porção indicadora (por exemplo, luciferase) com o substrato pode continuar por 30 minutos ou mais, e a detecção em diversos pontos no tempo pode ser desejável para a otimização da sensibilidade. Por exemplo, nas modalidades que utilizam placas filtrantes de 96 poços como suporte sólido e luciferase como indicador, as leituras do luminômetro podem ser tomadas inicialmente e em intervalos de 10 ou 15 minutos até que a reação esteja completa.
[127] De forma surpreendente, altas concentrações de fago utilizadas para a infecção das amostras testes alcançaram, de forma bem sucedida, a detecção de números muito baixos de microrganismo alvo em um intervalo de tempo muito curto. A incubação do fago com uma amostra teste em algumas modalidades precisa apenas ser longa o suficiente para um único ciclo celular do fago. Em algumas modalidades, a concentração do bacteriófago para esta etapa de incubação é maior do que 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1.0 x 107, 1.1 x 107, 1.2 x 107, 1.3 x 107, 1.4 x 107, 1.5 x 107,
1.6 x 107, 1.7 x 107, 1.8 x 107, 1.9 x 107, 2.0 x 107, 3.0 x 107, 4.0 x 107, 5.0 x 107, 6.0 x 107, 7.0 x 107, 8.0 x 107,
9.0 x 107, ou 1.0 x 108 UFC / mL.
[128] O sucesso com as concentrações tão altas de fago é surpreendente porque o grande número de fago estava previamente associado à “lise de fora”, a qual matava as células alvo e, assim, impedia a geração de sinal útil a partir de ensaios anteriores de fago. É possível que a limpeza dos estoques de fago preparados aqui descritos ajude a aliviar esse problema (por exemplo, a limpeza por ultracentrifugação com gradiente de densidade isópica do cloreto de césio), uma vez que, além de remover qualquer luciferase contaminante associada ao fago, essa limpeza também pode remover partículas fantasmas (partículas que perderam o DNA). As partículas fantasmas podem lisar células bacterianas por meio da “lise de fora”, matando as células prematuramente e, assim, impedindo a geração de sinal indicador. A microscopia eletrônica demonstra que um lisado de fago bruto (isto é, antes da limpeza com cloreto de césio) pode apresentar mais de 50 % de fantasmas. Essas partículas fantasmas podem contribuir para a morte prematura do microrganismo através da ação de muitas partículas de fago perfurando a membrana celular. Assim, as partículas fantasmas podem ter contribuído para problemas anteriores, nos quais altas concentrações de UFC foram relatadas como prejudiciais. Além disso, uma preparação de fago muito limpa permite que o ensaio seja realizado sem etapas de lavagem, o que possibilita a realização do ensaio sem uma etapa inicial de concentração. Algumas diferenças incluem uma etapa de concentração inicial e, em algumas modalidades, essa etapa de concentração permite um tempo de incubação de enriquecimento mais curto.
[129] Algumas modalidades de métodos de teste podem ainda incluir ensaios confirmatórios. Uma variedade de ensaios é conhecida no estado da técnica para confirmar um resultado inicial, usualmente em um ponto mais tarde no tempo. Por exemplo, as amostras podem ser cultivadas (por exemplo, ensaios CHROMAGAR®, DYNABEADS® tal como descritos nos Exemplos), o PCR pode ser utilizado para confirmar a presença do DNA microbiano ou outro ensaio confirmatório pode ser usado para confirmar o resultado inicial.
[130] Em determinadas modalidades, os métodos da presente invenção combinam o uso de um agente de ligação (por exemplo, anticorpo) para purificar e / ou concentrar um microrganismo de interesse, tal como Salmonella spp., da amostra em adição à detecção com um agente infeccioso. Por exemplo, em determinadas modalidades, a presente invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: capturar o microrganismo, tal como Salmonella spp., da amostra em um suporte principal usando um anticorpo de captura específico para o microrganismo de interesse, tal como Salmonella spp.; incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta o microrganismo de interesse, tal como Salmonella spp., em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região de gene tardio do bacteriófago de modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que o microrganismo de interesse está presente na amostra.
[131] Por exemplo, a Figura 8 mostra um ensaio de fago imuno híbrido (HIP) para a detecção de uma bactéria de interesse usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção. A amostra é, primeiro, aplicada ao poço da placa de micro titulação revestido com anticorpos específicos para a bactéria 802. A placa é, então, centrifugada para facilitar a ligação da bactéria aos anticorpos de captura 804. Após tempo suficiente para permitir a captura da bactéria completa, uma solução contendo o fago - NANOLUC® específico para a bactéria é adicionada a cada amostra 806. A incubação com o fago resulta na ligação e fixação de um único ou múltiplos fagos à bactéria capturada 808. Por fim, a amostra é incubada para facilitar a replicação do fago e a expressão da luciferase, o que leva à lise celular e à liberação da luciferase solúvel 810.
[132] Em algumas modalidades, o fago indicador pode ser empregado para testar amostras iniciais de pacientes para a presença de patógenos particulares, tais como um gênero particular ou espécies de bactéria. Em algumas modalidades, o fago indicador pode ser usado para detectar um patógeno particular em uma amostra clínica. Neste sentido, o fago indicador pode ser usado como um diagnóstico acompanhante, de modo a avaliar a eficácia potencial para fagos terapêuticos específicos no contexto de uma determinada infecção do paciente ou outra condição médica patogênica. Em algumas modalidades, o fago indicador do diagnóstico acompanhante pode ser preparado por modificação genética de bacteriófagos de ocorrência natural tal como previamente descrito.
[133] Em algumas modalidades, o fago indicador preparado através de tecnologias de síntese pode ser usado para usos não clínicos. Por exemplo, o fago indicador pode ser usado como um diagnóstico de segurança alimentar para identificar a presença de uma bactéria particular no alimento. Em outras modalidades, o fago indicador do diagnóstico acompanhante pode ser preparado através de tecnologias de síntese. Por exemplo, um genoma do fago sintético pode ser projetado e construído para a transformação e propagação do fago correspondente em diversos tipos de bactérias. Em alguns casos, as técnicas de síntese biológica podem ser usadas para gerar um fago indicador usando o as bactérias alvo do fago indicador. Em outros casos, uma bactéria mais conveniente pode ser usada para gerar um fago indicador.
[134] Em algumas modalidades, os fagos sintéticos são projetados para otimizar tratos desejáveis para o uso nos ensaios de detecção de patógenos. Em algumas modalidades, bioinformática e análises prévias de modificações genéticas são empregadas para otimizar tratos desejáveis. Por exemplo, em algumas modalidades, os genes que codificam as proteínas da cauda do fago podem ser otimizados para reconhecer e ligar-se a espécies particulares da bactéria. Em outras modalidades, os genes que codificam as proteínas da cauda do fago podem ser otimizados reconhecer e ligar-se a um gênero inteiro de bactérias, ou um grupo particular de espécies dentro de um gênero. Neste sentido, o fago pode ser otimizado para detectar grupos mais amplos ou mais estreitos de patógenos. Em algumas modalidades, o fago sintético pode ser projetado para melhorar a expressão do gene repórter. Adicionalmente e / ou alternativamente, em alguns casos, o fago sintético pode ser projetado para aumentar o tamanho da explosão do fago para melhorar a detecção.
[135] Em algumas modalidades, a estabilidade do fago pode ser otimizada para melhorar o prazo de validade. Por exemplo, a solubilidade enzimática pode ser aumentada para aumentar a estabilidade subsequente do fago. Adicionalmente e / ou alternativamente, a termo estabilidade pode ser otimizada. O fago termoestável preserva melhor a atividade funcional durante o armazenamento, aumentando, assim, o prazo de validade. Assim, em algumas ocasiões, a termo estabilidade e / ou a tolerância ao pH podem ser otimizadas.
[136] Algumas espécies de bactérias constroem biofilmes para proteger a si mesmas contra ataques do sistema imune. Estes biofilmes podem dificultar o direcionamento eficaz das bactérias. Um número de enzimas (por exemplo, glicosídeo hidrolases PelAh e PslGh) foi identificado o qual é capaz de romper o biofilme bacteriano. Em algumas modalidades, o fago pode ser modificado para codificar tanto proteínas de vírion solúveis ou de fusão para permitir a incorporação de enzimas para romper os biofilmes.
[137] Em algumas modalidades, o fago geneticamente modificado ou o fago sinteticamente derivado compreende um indicador detectável. Em algumas modalidades, o indicador é uma luciferase. Em algumas modalidades, o genoma do fago compreende um gene indicador (por exemplo, um gene luciferase ou outro gene que codifica um indicador detectável).
[138] Em algumas modalidades, o fago indicador, se sinteticamente preparado ou não, pode ser usado para detectar patógenos em amostras de pacientes subsequentes ao início de algum tipo de tratamento. Em outras modalidades, o tratamento pode ser um antibiótico (por exemplo, um antibiótico tradicional tal como penicilina ou ciclosporina). Em outras modalidades, o tratamento pode ser outro tipo de fármaco ou terapia. Neste sentido, o fago indicador pode ser usado para monitorar o progresso ou eficácia de qualquer tipo de tratamento ou terapia. Em algumas modalidades, o fago indicador pode ser usado para detectar e monitorar o conteúdo patogênico das amostras dos pacientes tomadas horas ou dias após o início do tratamento. Sistemas e kits da invenção
[139] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas (por exemplo, sistemas automatizados ou kits) compreendendo componentes para a realização dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, o fago indicador está compreendido em sistemas ou kits de acordo com a invenção. Os métodos aqui descritos podem também utilizar o referido sistemas ou kits de fago indicador. Algumas modalidades aqui descritas são particularmente adequadas para a automação e / ou kits, dada a quantidade mínima de reagentes e materiais necessários para executar os métodos. Em determinadas modalidades, cada um dos componentes de um kit pode compreender um unidade autocontida que é distribuível a partir de um primeiro sítio para um segundo sítio.
[140] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas ou kits para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra. Os sistemas ou kits podem, em determinadas modalidades, compreender um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades de ambos os sistemas e os kits da invenção, o agente infeccioso é um bacteriófago recombinante que infecta a bactéria de interesse, e o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região de gene tardio do bacteriófago como a porção indicadora de modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel. Alguns sistemas ainda compreendem um componente para a captura do microrganismo de interesse em um suporte sólido.
[141] Em outras modalidades, a invenção compreende um método, sistema, ou kit para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, compreendendo um agente infeccioso componente o qual é específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora, e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o bacteriófago é um bacteriófago tipo T4, tipo T5, ViI, tipo ViI, ou bacteriófago específico para Salmonella. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante é derivado de bacteriófago específico para Salmonella. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para a bactéria particular. Por exemplo, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para Salmonella spp. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode diferenciar Salmonella spp. na presença de outros tipos de bactérias. Em determinadas modalidades, um sistema ou kit detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 bactérias específicas na amostra.
[142] Em determinadas modalidades, os sistemas e / ou kits podem ainda compreender um componente para a lavagem da amostra de microrganismo capturado. Adicionalmente ou alternativamente, os sistemas e / ou kits podem ainda compreender um componente para a determinação da quantidade da porção indicadora, em que a quantidade da porção indicadora detectada corresponde à quantidade de microrganismo na amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, o sistema ou kit pode compreender um luminômetro ou outro dispositivo para a medição da atividade da enzima luciferase.
[143] Em alguns sistemas e / ou kits, o mesmo componente pode ser usado para múltiplas etapas. Em alguns sistemas e / ou kits, as etapas são automatizadas ou controladas pelo usuário por meio de entradas de computador e / ou em que um robô de manuseio de líquidos realiza pelo menos uma etapa.
[144] Então, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema ou kit para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, compreendendo: um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; um componente para a captura do microrganismo a partir da amostra em um suporte sólido; um componente para lavar a amostra de microrganismo capturado para remover agente infeccioso não ligado; e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o mesmo componente pode ser usado para as etapas de captura e / ou incubação e / ou lavagem (por exemplo, um componente de filtro). Algumas modalidades adicionalmente compreendem um componente para determinar a quantidade do microrganismo de interesse na amostra, em que a quantidade de porção indicadora detectada corresponde à quantidade de microrganismo na amostra. Os referidos sistemas podem incluir diversas modalidades e submodalidades análogas àquelas descritas acima para os métodos para a rápida detecção de microrganismos. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago. Em um sistema computadorizado, o sistema pode ser completamente automatizado, semi-automatizado ou direcionado pelo usuário através de um computador (ou alguma combinação dos mesmos).
[145] Em algumas modalidades, o sistema pode compreender um componente para isolar o microrganismo de interesse a partir de outros componentes na amostra.
[146] Em uma modalidade, a invenção compreende um sistema ou kit compreendendo componentes para a detecção de um microrganismo de interesse compreendendo: um componente para o isolamento de pelo menos um microrganismo a partir de outros componentes na amostra; um componente para a infecção de pelo menos um microrganismo com uma pluralidade de um agente infeccioso parental; um componente para a lise de pelo menos um microrganismo infectado para liberar a progênie de agentes infecciosos presente no microrganismo; e um componente para a detecção da progênie de agentes infecciosos, ou com maior sensibilidade, uma proteína solúvel codificada e expressa pelo agente infeccioso, em que a detecção do agente infeccioso ou um produto de proteína solúvel do agente infeccioso indica que o microrganismo está presente na amostra. O agente infeccioso pode compreender bacteriófago específico para Salmonella NANOLUC™.
[147] Os sistemas ou kits podem compreender uma variedade de componentes para a detecção da progênie de agentes infecciosos. Por exemplo, em uma modalidade, o agente infeccioso da progênie (por exemplo, bacteriófago) pode compreender uma porção indicadora. Em uma modalidade, a porção indicadora do agente infeccioso da progênie (por exemplo, bacteriófago) pode ser uma porção detectável que é expressa durante a replicação, tal como uma proteína luciferase solúvel.
[148] Em outras modalidades, a invenção pode compreender um kit para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, o sistema compreendendo: um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; um componente para capturar o microrganismo da amostra em um suporte sólido; um componente para lavar a amostra de microrganismo capturado para remover agente infeccioso não ligado; e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o mesmo componente pode ser usado para as etapas de captura e / ou incubação e / ou lavagem. Algumas modalidades adicionalmente compreendem um componente para determinação da quantidade do microrganismo de interesse na amostra, em que a quantidade da porção indicadora detectada corresponde à quantidade de microrganismo na amostra. Os referidos kits podem incluir diversas modalidades e submodalidades análogas àquelas descritas acima para os métodos para a rápida detecção de microrganismos. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago.
[149] Em algumas modalidades, um kit pode compreender um componente para isolar o microrganismo de interesse a partir de outros componentes na amostra.
[150] Estes sistemas e kits da invenção incluem diversos componentes. Tal como aqui utilizado, o termo “componente” é amplamente definido e inclui qualquer aparelho ou coleção de aparelhos adequados para a realização do método recitado. Os componentes não precisam estar integralmente conectados ou situados um em relação ao outro de qualquer maneira específica. A invenção inclui quaisquer arranjos adequados dos componentes em relação um ao outro. Por exemplo, os componentes não precisam estar na mesma sala. Porém, em algumas modalidades, os componentes estão conectados entre si em uma unidade integral. Em algumas modalidades, Em algumas modalidades, os mesmos componentes podem realizar múltiplas funções. Sistemas de computador e mídia legível por computador
[151] O sistema, tal como descrito na presente técnica ou qualquer um dos seus componentes, pode ser incorporado na forma de um sistema de computador. Exemplos típicos de um sistema de computador incluem um computador de uso geral, um microprocessador programado, um micro controlador, um elemento de circuito integrado periférico, e outros dispositivos ou arranjos de dispositivos os quais são capazes de implementar as etapas que constituem o método da presente técnica.
[152] Um sistema de computador pode compreender um computador, um dispositivo de entrada, uma unidade de visualização e / ou a Internet. O computador pode ainda compreender um microprocessador. O microprocessador pode estar conectado a um barramento de comunicação. O computador também pode incluir uma memória. A memória pode incluir memória de acesso aleatório (RAM) e memória de somente leitura (ROM). O sistema de computador pode ainda compreender um dispositivo de armazenamento. O dispositivo de armazenamento pode ser uma unidade de disco rígido ou uma unidade de armazenamento removível tal como uma unidade de disquete, unidade de disco óptico, etc. O dispositivo de armazenamento também pode ser outro meio similar para carregar programas de computador ou outras instruções no sistema de computador. O sistema de computador também pode incluir uma unidade de comunicação. A unidade de comunicação permite que o computador se conecte a outros bancos de dados e à Internet através de uma interface de E/S. A unidade de comunicação permite a transferência para, assim como a recepção de dados de, outros bancos de dados. A unidade de comunicação pode incluir um modem, uma placa Ethernet, ou qualquer dispositivo similar que permita ao sistema de computador conectar-se a bancos de dados e redes tais como LAN, MAN, WAN e a Internet. O sistema de computador pode, assim, facilitar as entradas de um usuário através de um dispositivo de entrada, acessível ao sistema através da interface de E/S.
[153] Um dispositivo de computação normalmente irá incluir um sistema operacional o qual fornece instruções de programa executáveis para a administração geral e operação desse dispositivo de computação, e normalmente irá incluir uma mídia de armazenamento legível por computador (por exemplo, um disco rígido, memória de acesso aleatório, memória somente de leitura, etc.) armazenando instruções que, quando executadas por um processador do servidor, permitem que o dispositivo de computação execute suas funções pretendidas. As implementações adequadas para o sistema operacional e funcionalidades gerais do dispositivo de computação são conhecidas ou estão comercialmente disponíveis, e são prontamente implementadas por pessoas com habilidades comuns na técnica, particularmente à luz desta divulgação aqui.
[154] O sistema de computador executa um conjunto de instruções as quais são armazenadas em um ou mais elementos de armazenamento, a fim de processar os dados de entrada. Os elementos de armazenamento também podem armazenar dados ou outras informações, conforme desejado. O elemento de armazenamento pode estar na forma de uma fonte de informação ou de um elemento de memória física presente na máquina de processamento.
[155] O ambiente pode incluir uma variedade de armazenamento de dados e outras mídias de memória e de armazenamento, tal como discutido acima. Estes podem residir em uma variedade de locais, tais como em uma mídia de armazenamento local para (e / ou residente em) um ou mais dos computadores ou remoto a partir de qualquer um ou todos os computadores da rede. Em um conjunto particular de modalidades, as informações podem residir em uma rede de área de armazenamento (“RAS”) familiar para um técnico no assunto. De forma similar, quaisquer arquivos necessários para realizar as funções atribuídas aos computadores, servidores ou outros dispositivos de rede podem ser armazenados localmente e / ou remotamente, conforme o caso. Quando um sistema inclui dispositivos de computação, cada um desses dispositivos pode incluir elementos de hardware os quais podem ser acoplados eletricamente por meio de barramento, os elementos incluindo, por exemplo, pelo menos uma unidade central de processamento (CPU), pelo menos um dispositivo de entrada (por exemplo, um mouse, teclado, controlador, tela touch screen, ou teclado), e pelo menos um dispositivo de saída (por exemplo, um dispositivo de exibição, impressora ou alto-falante). Tal sistema também pode incluir um ou mais dispositivos de armazenamento, tais como unidades de disco, dispositivos de armazenamento óptico, e dispositivos de armazenamento de estado sólido, tais como memória de acesso aleatório (“RAM”) ou memória somente de leitura (“ROM”), bem como dispositivos de mídia removível, cartões de memória, cartões flash, etc..
[156] Os referidos dispositivos também podem incluir um leitor de mídia de armazenamento legível por computador, um dispositivo de comunicação (por exemplo, um modem, uma placa de rede (sem fio ou com fio), um dispositivo de comunicação infravermelha, etc.), e memória de trabalho tal como descrito acima. O leitor de mídia de armazenamento legível por computador pode estar conectado ou configurado para receber uma mídia de armazenamento legível por computador, representando dispositivos de armazenamento remotos, locais, fixos e / ou removíveis, bem como mídia de armazenamento para conter, armazenar, transmitir e recuperar informações legíveis por computador de forma temporária e / ou mais permanente. O sistema e diversos dispositivos também incluem normalmente uma série de aplicativos de software, módulos, serviços ou outros elementos localizados dentro de pelo menos um dispositivo de memória de trabalho, incluindo um sistema operacional e programas aplicativos, tais como um aplicativo do cliente ou navegador da Web. Deve ser apreciado que as modalidades alternativas podem apresentar inúmeras variações em relação às descritas acima. Por exemplo, o hardware personalizado também pode ser usado e / ou elementos particulares podem ser implementados em hardware, software (incluindo software portátil, tais como applets), ou ambos. Além disso, a conexão com outros dispositivos de computação, tal como dispositivos de entrada / saída de rede, pode ser empregada.
[157] Mídias de armazenamento não transientes e mídias legíveis por computador que contenham código, ou partes de código, podem incluir qualquer mídia adequada conhecida ou utilizada na técnica, incluindo mídia de armazenamento e mídia de comunicação, tais como, porém não limitadas a, mídia volátil e não volátil, removível e não removível implementada em qualquer método ou tecnologia para o armazenamento e / ou a transmissão de informações tais como instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programa, ou outros dados, incluindo RAM, ROM, EEPROM, memória flash ou outra tecnologia de memória, CD- ROM, disco versátil digital (DVD) ou outro armazenamento óptico, cassetes magnéticos, fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnético, ou qualquer outro meio que possa ser usado para armazenar as informações desejadas e que possa ser acessado por um dispositivo do sistema. Com base na divulgação e nos ensinamentos aqui fornecidos, uma pessoa de habilidade comum na técnica apreciará outras formas e / ou métodos para implementar as diversas modalidades.
[158] Uma mídia legível por computador pode compreender, porém não está limitada a, um dispositivo de armazenamento eletrônico, óptico, magnético ou outro dispositivo de armazenamento capaz de fornecer ao processador instruções legíveis por computador. Outros exemplos incluem, porém não estão limitados a, um disquete, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memória, ROM, RAM, SRAM, DRAM, memória endereçável por conteúdo (“CAM”), DDR, memória flash, tal como NAND flash ou NOR flash, um ASIC, um processador configurado, armazenamento óptico, fita magnética ou outro armazenamento magnético ou qualquer outra mídia a partir da qual um processador de computador possa ler as instruções. Em uma modalidade, o dispositivo de computação pode compreender um único tipo de mídia legível por computador, tal como memória de acesso aleatório (RAM). Em outras modalidades, o dispositivo de computação pode compreender dois ou mais tipos de mídias legíveis por computador, tais como memória de acesso aleatório (RAM), uma unidade de disco e cache. O dispositivo de computação pode estar em comunicação com uma ou mais mídias externas legíveis por computador, tais como uma unidade de disco rígido externa ou uma unidade de DVD ou Blu-Ray externa.
[159] Tal como discutido acima, a modalidade compreende um processador o qual está configurado para executar instruções de programas executáveis por computador e / ou para acessar informações armazenadas na memória. As instruções podem compreender instruções específicas para o processador geradas por um compilador e / ou um intérprete a partir do código escrito em qualquer linguagem de programação de computador adequada, incluindo, por exemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, JavaScript e ActionScript (Adobe Sistemas, Mountain View, Califórnia). Em uma modalidade, o dispositivo de computação compreende um único processador. Em outras modalidades, o dispositivo compreende dois ou mais processadores. Os referidos processadores podem compreender um microprocessador, um processador de sinal digital (DSP), um circuito integrado específico de aplicativos (ASIC), matrizes de portas programáveis em campo (FPGAs) e máquinas de estado. Os referidos processadores podem ainda compreender dispositivos eletrônicos programáveis, tais como PLCs, controladores de interrupção programáveis (PICs), dispositivos lógicos programáveis (PLDs), memórias somente de leitura programáveis (PROMs), memórias somente de leitura eletronicamente programáveis (EPROMs ou EEPROMs) ou outras similares dispositivos.
[160] O dispositivo de computação compreende uma interface de rede. Em algumas modalidades, a interface de rede é configurada para comunicação através de links de comunicação com ou sem fio. Por exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação através de redes via Ethernet, IEEE 802.11 (Wi-Fi), 802.16 (Wi-Max), Bluetooth, infravermelho, etc. Como outro exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação através de redes como CDMA,
GSM, UMTS ou outras redes de comunicação celular. Em algumas modalidades, a interface de rede pode permitir conexões ponto a ponto com outro dispositivo, tais como o Universal Serial Bus (USB), 1394 FireWire, conexões seriais ou paralelas ou interfaces semelhantes. Algumas categorias de dispositivos de computação adequados podem compreender duas ou mais interfaces de rede para comunicação através de uma ou mais redes. Em algumas modalidades, o dispositivo de computação pode incluir um armazenamento de dados em adição a ou no lugar de uma interface de rede.
[161] Algumas modalidades dos dispositivos de computação adequados podem compreender ou estar em comunicação com um número de dispositivos externos ou internos, tais como um mouse, um CD-ROM, DVD, um teclado, uma exibição, alto-falantes, um ou mais microfones ou qualquer outro dispositivo de entrada ou de saída. Por exemplo, o dispositivo de computação pode estar em comunicação com diversos dispositivos de interface de usuário e uma exibição. A exibição pode utilizar qualquer tecnologia adequada incluindo, porém não limitada a, LCD, LED, CRT, e similares.
[162] O conjunto de instruções para execução pelo sistema de computador pode incluir diversos comandos que instruem a máquina de processamento a realizar tarefas específicas, tais como as etapas que constituem o método da presente técnica. O conjunto de instruções pode estar na forma de um programa de software. Além disso, o software pode estar na forma de uma coleção de programas separados, um módulo de programa com um programa maior ou uma parte de um módulo de programa, tal como na presente técnica. O software também pode incluir programação modular na forma de programação orientada a objetos. O processamento dos dados de entrada pela máquina de processamento pode ser em resposta a comandos do usuário, resultados de processamento anterior ou a uma solicitação feita por outra máquina de processamento.
[163] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referências a determinadas modalidades, inúmeras modificações, alterações e mudanças nas modalidades descritas são possíveis sem se afastar do escopo e âmbito da presente invenção, conforme definido nas reivindicações anexas. Consequentemente, pretende-se que a presente invenção não se limite às modalidades descritas, porém, que tenha o escopo completo definido pela linguagem das reivindicações a seguir, e seus equivalentes.
EXEMPLOS
[164] Os resultados mostrados nos exemplos a seguir demonstram a detecção de um baixo número de células, até mesmo uma única bactéria, em um tempo encurtado para os resultados. Exemplo 1. Criação e isolamento do fago indicador a partir do bacteriófago específico para Salmonella
[165] O fago indicador SEA1.NANOLUC®TSP1.NANOLUC® do bacteriófago específico para Salmonella foi criado através da recombinação homóloga usando procedimentos tal como previamente descritos. Os fagos de Salmonella TSP1 e TSP11 foram isolados a partir de amostras de esgoto.
[166] As sequências genômicas destes fagos foram obtidas através do sequenciamento completo do genoma usando o sistema Illumina MiSeq com o conjunto de sequência de novo. Tal como os genomas de fagos relacionados previamente conhecidos e anotados, as regiões de gene tardio e os genes da proteína do capsídeo maior foram localizados nos novos genomas do fago. Os plasmídeos foram projetados e sintetizados para inserir o NANOLUC® junto com o promotor do gene tardio e sítio de ligação do ribossomo adequados, flanqueados por aproximadamente 500 bp de sequência de fago correspondente para promover a recombinação homóloga.
[167] As bactérias alvo foram transformadas com os plasmídeos de recombinação homóloga sob uma seleção de antibióticos adequados e infectadas com seus respectivos fagos do tipo selvagem para permitir a recombinação homóloga com o plasmídeo. Após a recombinação homóloga gerar os genomas dos bacteriófagos recombinantes, uma série de etapas de titulação e enriquecimento foi usada para isolar bacteriófagos recombinantes específicos que expressam NANOLUC® tal como previamente descrito.
[168] Por fim, a produção em larga escala foi realizada para obter estoques de alta titulação adequados para uso nos ensaios de detecção de Salmonella spp.. Centrifugação de gradiente de densidade isopícnica do cloreto de césio foi usada para separar partículas de fago a partir de proteína luciferase contaminante para reduzir fundo. Exemplo 2. Detecção bacteriana usando o fago indicador nanoluc® do bacteriófago específico para Salmonella após a incubação da amostra em meio
[169] A detecção de Salmonella spp. usando o fago indicador NANOLUC® do bacteriófago específico para Salmonella foi testada em experimentos usando a modalidade de formato de ensaio mostrada na Figura 7. Primeiro,
números de células que variam de 1 - 10000 foram tomados a partir de culturas e infectados com 105, 106 e 107 fagos / mL em volumes de amostra idênticos de LB por 2 horas. Após a adição do tampão de lise e o reagente NANO-GLO®, a reação foi lida usando um instrumento GLOMAX® 96. Estes experimentos demonstraram que o ensaio ótimo para qualquer patógeno alvo particular pode variar, com base em um tipo e tamanho de amostra, o microrganismo a ser detectado, e o bacteriófago específico usado para criar o fago indicador recombinante. Exemplo 3. Detecção de Salmonella em amostras de peru ou frango crus moídos
[170] A Salmonella pode ser detectada em amostras de alimentos ou amostras dos ambientes nos quais o alimento é processado, por exemplo, instalações de processamento de peru ou frango. 25 g de amostras de peru ou frango moído foram não inoculadas, inoculadas em um baixo nível (0.2 -
2.0 UFC / amostra) ou inoculadas em um alto nível (2 - 10 UFC / amostra). As amostras inoculadas foram armazenadas a 4 ºC por 48 - 72 horas antes da realização do ensaio. Cada amostra teste foi misturada com 75 mL de meio de caldo de soja triptona (TSB) pré-aquecido (41 ºC) por uma proporção de 1:3 amostra:volume. O STOMACHER®, um misturador peristáltico, ou equivalente, foi usado para homogeneizar a amostra no ajuste mais alto por 30 segundos. A amostra homogeneizada foi incubada a 41 °C por 5, 6 e 7 horas. Os sacos contendo as amostras foram gentilmente massageados para misturar os conteúdos totalmente. Após a incubação, 2 mL da amostra foram removidos e transferidos para um tubo de cultura. A amostra foi dividida em amostras de 150 µL e
1 mL. As amostras de 150 µL foram transferidas para uma placa de 96 poços. 10 µl de 1.2 X 107 P / mL de solução de coquetel de bacteriófago adequada foi adicionado a cada poço e incubado por 2 horas a 37 °C. 65 µL de NANO-GLO® Master Mix foi adicionado a cada amostra e as amostras foram lidas em um luminômetro GLOMAX 96®. As amostras de 1 mL foram centrifugadas no ajuste mais alto por 1 min. Os sobrenadantes foram removidos e descartados e o pélete foi ressuspendido em 200 µL de TSB pré-aquecido (41 ºC). 15 µl de 1.2 X 107 P / mL de solução de coquetel de bacteriófago para Salmonella spp. foi adicionado a cada amostra, gentilmente misturado, e incubado por 2 horas a 37 ºC. 65 µL de NANOGLO® Master Mix foi adicionado a cada amostra e, então, brevemente misturado por vórtice em tubos de micro centrifugação. As amostras foram, então, centrifugadas por 5 - 10 segundos para peletizar os resíduos. 215 µL da amostra foram transferidos para a placa de 96 poços sem perturbar o pélete de resíduo e as amostras foram lidas em um luminômetro GLOMAX 96®. Uma proporção sinal / fundo com RLU ≥ 750 indicou a detecção positiva de Salmonella spp. Uma proporção sinal / fundo com RLU < 750 indicou que a amostra era negativa para Salmonella spp.
[171] A detecção positiva de Salmonella spp. foi confirmada. As amostras foram enriquecidas por 20 - 24 horas a 37 °C. 1 mL da amostra foi, então, submetida a seleção dos grânulos IMS e plaqueada em uma placa de seleção cromogênica específica para Salmonella spp. Com 6 horas de enriquecimento, o ensaio detectou todos os positivos para ambas as amostras de 150 µL e 1 mL. 5 horas de enriquecimento foi suficiente para a detecção com amostras de 1 mL.
Tabela 1. Ensaio de Salmonella spp. em peru moído (150 µL de amostra) 5 horas de 6 horas de 150 µl de Amostra 7 horas de enriquecimento enriquecimento enriquecimento 5 hr 6 hr 7 hr Pico alvo 5 hr Sinal Resultado 6 hr Sinal Resultado 7 hr Resultado Amostra UFC Sinal - estimado RLU - em 5 hr RLU - em 6 hr RLU em 7 hr fundo fundo fundo 2 UNINOC 0.0 271 1.1 NEG 287 1.1 NEG 275 1.1 NEG 16 UNINOC 0.0 325 1.3 NEG 265 1.1 NEG 281 1.1 NEG 18 UNINOC 0.0 170 0.7 NEG 206 0.8 NEG 199 0.8 NEG 21 UNINOC 0.0 213 0.9 NEG 225 0.9 NEG 234 0.9 NEG 23 UNINOC 0.0 180 0.7 NEG 227 0.9 NEG 242 1.0 NEG 1 BAIXO 1.2 4495 18.0 POS 37901 151.6 POS 442600 1770.4 POS 3 BAIXO 1.2 259 1.0 NEG 271 1.1 NEG 315 1.3 NEG 5 BAIXO 1.2 1374 5.5 POS 30339 121.4 POS 494142 1976.6 POS 6 BAIXO 1.2 10083 40.3 POS 60839 243.4 POS 799280 3197.1 POS 7 BAIXO 1.2 18226 72.9 POS 170117 680.5 POS 1958573 7834.3 POS
8 BAIXO 1.2 11250 45.0 POS 121831 487.3 POS 1505752 6023.0 POS 10 BAIXO 1.2 1804 7.2 POS 17638 70.6 POS 193210 772.8 POS 11 BAIXO 1.2 314 1.3 NEG 277 1.1 NEG 225 0.9 NEG 12 BAIXO 1.2 6419 25.7 POS 52125 208.5 POS 412072 1648.3 POS 14 BAIXO 1.2 3614 14.5 POS 23002 92.0 POS 258488 1034.0 POS 15 BAIXO 1.2 289 1.2 NEG 284 1.1 NEG 317 1.3 NEG 17 BAIXO 1.2 249 1.0 NEG 230 0.9 NEG 192 0.8 NEG 19 BAIXO 1.2 215 0.9 NEG 3234 12.9 POS 29750 119.0 POS 20 BAIXO 1.2 2230 8.9 POS 19960 79.8 POS 267300 1069.2 POS 22 BAIXO 1.2 3970 15.9 POS 13770 55.1 POS 185500 742.0 POS 24 BAIXO 1.2 4069 16.3 POS 32942 131.8 POS 461179 1844.7 POS 25 BAIXO 1.2 251 1.0 NEG 218 0.9 NEG 227 0.9 NEG 26 BAIXO 1.2 4132 16.5 POS 34069 136.3 POS 344198 1376.8 POS 28 BAIXO 1.2 191 0.8 NEG 235 0.9 NEG 208 0.8 NEG 30 BAIXO 1.2 267 1.1 NEG 280 1.1 NEG 311 1.2 NEG 4 ALTO 6.1 46170 184.7 POS 322398 1289.6 POS 4328205 17312.8 POS 9 ALTO 6.1 30905 123.6 POS 361609 1446.4 POS 5480287 21921.1 POS
13 ALTO 6.1 40088 160.4 POS 441490 1766.0 POS 5738016 22952.1 POS 27 ALTO 6.1 2444 9.8 POS 31854 127.4 POS 348080 1392.3 POS 29 ALTO 6.1 10098 40.4 POS 65018 260.1 POS 809694 3238.8 POS
Tabela 2. Ensaio de Salmonella spp. em peru moído (1 mL de amostra) 1 mL de Amostra 5 horas de 6 horas de 7 horas de Concentrada enriquecimento enriquecimento enriquecimento 5 hr 6 hr 7 hr Nível 5 hr Resultado 6 hr Resultado 7 hr Resultado Amostra UFC Sinal - Sinal - Sinal - do pico RLU em 5 hr RLU em 6 hr RLU em 7 hr fundo fundo fundo 2 UNINOC 0.0 109 0.4 NEG 101 0.4 NEG 121 0.5 NEG 16 UNINOC 0.0 231 0.9 NEG 174 0.7 NEG 141 0.6 NEG 18 UNINOC 0.0 101 0.4 NEG 104 0.4 NEG 57 0.2 NEG 21 UNINOC 0.0 128 0.5 NEG 69 0.3 NEG 69 0.3 NEG 23 UNINOC 0.0 194 0.8 NEG 84 0.3 NEG 68 0.3 NEG 1 BAIXO 1.2 6313 25.3 POS 59524 238.1 POS 1148437 4593.7 POS 3 BAIXO 1.2 142 0.6 NEG 112 0.4 NEG 118 0.5 NEG 5 BAIXO 1.2 7822 31.3 POS 131381 525.5 POS 1337166 5348.7 POS
6 BAIXO 1.2 14092 56.4 POS 83108 332.4 POS 3513244 14053.0 POS 7 BAIXO 1.2 37321 149.3 POS 350051 1400.2 POS 3406812 13627.2 POS 8 BAIXO 1.2 15762 63.0 POS 168150 672.6 POS 1863963 7455.9 POS 10 BAIXO 1.2 6365 25.5 POS 55887 223.5 POS 594467 2377.9 POS 11 BAIXO 1.2 135 0.5 NEG 162 0.6 NEG 110 0.4 NEG 12 BAIXO 1.2 15946 63.8 POS 108686 434.7 POS 1553574 6214.3 POS 14 BAIXO 1.2 2824 11.3 POS 82837 331.3 POS 638513 2554.1 POS 15 BAIXO 1.2 134 0.5 NEG 177 0.7 NEG 140 0.6 NEG 17 BAIXO 1.2 121 0.5 NEG 94 0.4 NEG 71 0.3 NEG 19 BAIXO 1.2 1280 5.1 POS 7393 29.6 POS 97380 389.5 POS 20 BAIXO 1.2 8758 35.0 POS 95480 381.9 POS 1168000 4672.0 POS 22 BAIXO 1.2 9690 38.8 POS 58400 233.6 POS 702400 2809.6 POS 24 BAIXO 1.2 8903 35.6 POS 66413 265.7 POS 385008 1540.0 POS 25 BAIXO 1.2 120 0.5 NEG 79 0.3 NEG 76 0.3 NEG 26 BAIXO 1.2 3360 13.4 POS 81605 326.4 POS 1539384 6157.5 POS 28 BAIXO 1.2 122 0.5 NEG 149 0.6 NEG 106 0.4 NEG 30 BAIXO 1.2 164 0.7 NEG 65 0.3 NEG 134 0.5 NEG
4 ALTO 6.1 47888 191.6 POS 1345672 5382.7 POS 8551625 34206.5 POS 9 ALTO 6.1 150225 600.9 POS 1572399 6289.6 POS 24842200 99368.8 POS 13 ALTO 6.1 105337 421.3 POS 677351 2709.4 POS 16348527 65394.1 POS 27 ALTO 6.1 4282 17.1 POS 68369 273.5 POS 1178443 4713.8 POS 29 ALTO 6.1 5311 21.2 POS 197412 789.6 POS 4135790 16543.2 POS
Tabela 3. Ensaio de Salmonella spp. em peru moído 1 mL de Amostra 5 horas de 6 horas de 7 horas de Concentrada enriquecimento enriquecimento enriquecimento
5 hr 6 hr 7 hr Nível 5 hr Resultado 6 hr Resultado 7 hr Resultado Amostra UFC Sinal - Sinal - Sinal - do pico RLU em 5 hr RLU em 6 hr RLU em 7 hr fundo fundo fundo
2 UNINOC 0.0 109 0.4 NEG 101 0.4 NEG 121 0.5 NEG 16 UNINOC 0.0 231 0.9 NEG 174 0.7 NEG 141 0.6 NEG 18 UNINOC 0.0 101 0.4 NEG 104 0.4 NEG 57 0.2 NEG 21 UNINOC 0.0 128 0.5 NEG 69 0.3 NEG 69 0.3 NEG 23 UNINOC 0.0 194 0.8 NEG 84 0.3 NEG 68 0.3 NEG 1 BAIXO 1.2 6313 25.3 POS 59524 238.1 POS 1148437 4593.7 POS
3 BAIXO 1.2 142 0.6 NEG 112 0.4 NEG 118 0.5 NEG 5 BAIXO 1.2 7822 31.3 POS 131381 525.5 POS 1337166 5348.7 POS 6 BAIXO 1.2 14092 56.4 POS 83108 332.4 POS 3513244 14053.0 POS 7 BAIXO 1.2 37321 149.3 POS 350051 1400.2 POS 3406812 13627.2 POS 8 BAIXO 1.2 15762 63.0 POS 168150 672.6 POS 1863963 7455.9 POS 10 BAIXO 1.2 6365 25.5 POS 55887 223.5 POS 594467 2377.9 POS 11 BAIXO 1.2 135 0.5 NEG 162 0.6 NEG 110 0.4 NEG 12 BAIXO 1.2 15946 63.8 POS 108686 434.7 POS 1553574 6214.3 POS 14 BAIXO 1.2 2824 11.3 POS 82837 331.3 POS 638513 2554.1 POS 15 BAIXO 1.2 134 0.5 NEG 177 0.7 NEG 140 0.6 NEG 17 BAIXO 1.2 121 0.5 NEG 94 0.4 NEG 71 0.3 NEG 19 BAIXO 1.2 1280 5.1 POS 7393 29.6 POS 97380 389.5 POS 20 BAIXO 1.2 8758 35.0 POS 95480 381.9 POS 1168000 4672.0 POS 22 BAIXO 1.2 9690 38.8 POS 58400 233.6 POS 702400 2809.6 POS 24 BAIXO 1.2 8903 35.6 POS 66413 265.7 POS 385008 1540.0 POS 25 BAIXO 1.2 120 0.5 NEG 79 0.3 NEG 76 0.3 NEG 26 BAIXO 1.2 3360 13.4 POS 81605 326.4 POS 1539384 6157.5 POS
28 BAIXO 1.2 122 0.5 NEG 149 0.6 NEG 106 0.4 NEG 30 BAIXO 1.2 164 0.7 NEG 65 0.3 NEG 134 0.5 NEG 4 ALTO 6.1 47888 191.6 POS 1345672 5382.7 POS 8551625 34206.5 POS 9 ALTO 6.1 150225 600.9 POS 1572399 6289.6 POS 24842200 99368.8 POS 13 ALTO 6.1 105337 421.3 POS 677351 2709.4 POS 16348527 65394.1 POS 27 ALTO 6.1 4282 17.1 POS 68369 273.5 POS 1178443 4713.8 POS 29 ALTO 6.1 5311 21.2 POS 197412 789.6 POS 4135790 16543.2 POS
Exemplo 4. Detecção de Salmonella em amostras de comida para cães
[172] As amostras de comida para cães foram não inoculadas, inoculadas em um nível baixo (0.2 - 2.0 UFC / amostra) ou inoculadas em um nível alto (2 - 10 UFC / amostra). As amostras inoculadas foram armazenadas a 4 ºC por > 24 horas antes da realização do ensaio.
[173] 25 g de amostra de comida para cães foi misturada com 225 mL de caldo de lactose ou meio TSB pré-aquecido (41 °C) por uma proporção de 1:9 amostra:volume. A amostra foi incubada a 41 °C por 30 minutos para permitir que a amostra fique mais suave. O STOMACHER®, um misturador peristáltico, ou um equivalente, foi usado para homogeneizar a amostra no ajuste mais alto por 60 segundos. A amostra homogeneizada foi incubada a 41 °C sem agitação por 16 - 18 horas. O saco contendo a amostra foi gentilmente massageado / agitado para misturar os conteúdos totalmente. 1 mL da amostra foi removido e a cultura foi diluída 1:10 em TSB (100 µL de amostra:900 µL de TSB). 150 µL da amostra da diluição foi, então, transferida para uma placa preta de 96 poços. 10 µl de coquetel de bacteriófago da solução de bacteriófago específico para Salmonella foi adicionado a cada poço e incubado por 2 horas a 37 °C. O reagente NANOGLO® Master Mix foi preparado e 65 µL do reagente foi adicionado a cada poço e gentilmente misturado por pipetação para cima e para baixo. Após 3 minutos de incubação após a adição do substrato, as amostras foram lidas em um luminômetro GLOMAX 96®.
[174] A detecção positiva de Salmonella spp. foi confirmada. As amostras foram enriquecidas por 24 horas a
41 °C. 1 mL de cultura durante a noite foi removido e o procedimento DYNABEADS® anti-Salmonella spp. foi seguido de acordo com as instruções do fabricante. Após a seleção dos grânulos IMS, os grânulos foram ressuspendidos em 100 µL de PBS e plaqueados em uma placa de seleção cromogênica específica para Salmonella spp. As placas foram incubadas por 18 - 24 horas a 37 °C ± 1 °C. A presença de colônias de cor malva confirmou a presença de Salmonella spp.
[175] Tal como mostrado na Tabela 5, o ensaio de Salmonella spp. em comida para cães não apresentou falsos positivos ou falsos negativos. Tabela 5. Ensaio de Salmonella spp. em comida para cães Resultado Nível Sinal - Sinal - Ensaio de Amostra RLU do ensaio do pico Fundo Fundo confirmação com fago 7 uninoc 48 -202 0.2 NEG NEG 12 uninoc 54 -196 0.2 NEG NEG 17 uninoc 49 -201 0.2 NEG NEG 22 uninoc 52 -198 0.2 NEG NEG 27 uninoc 45 -205 0.2 NEG NEG 1 baixo 42370000 42369750 169480.0 POS POS 2 baixo 43170000 43169750 172680.0 POS POS 3 baixo 70180000 70179750 280720.0 POS POS 4 baixo 29350000 29349750 117400.0 POS POS 5 baixo 37 -213 0.1 NEG NEG 6 baixo 39 -211 0.2 NEG NEG 8 baixo 20890000 20889750 83560.0 POS POS 10 baixo 3224000 3223750 12896.0 POS POS 11 baixo 60 -190 0.2 NEG NEG
13 baixo 5532839 5532589 22131.4 POS POS 15 baixo 73101712 73101462 292406.8 POS POS 16 baixo 2082342 2082092 8329.4 POS POS 18 baixo 10373953 10373703 41495.8 POS POS 20 baixo 47052716 47052466 188210.9 POS POS 21 baixo 51 -199 0.2 NEG NEG 23 baixo 44243100 44242850 176972.4 POS POS 25 baixo 14358209 14357959 57432.8 POS POS 26 baixo 37 -213 0.1 NEG NEG 28 Baixo 45 -205 0.2 NEG NEG 30 Baixo 28358970 28358720 113435.9 POS POS 9 Alto 8596000 8595750 34384.0 POS POS 14 Alto 26649364 26649114 106597.5 POS POS 19 Alto 39769272 39769022 159077.1 POS POS 24 Alto 16702595 16702345 66810.4 POS POS 29 Alto 162177760 162177510 648711.0 POS POS Exemplo 5. Detecção de Salmonella em Fórmula Infantil em Pó
[176] As amostras foram inoculadas com Salmonella seca em PIF em diversos níveis de inoculação; não inoculadas, baixa inoculação (0.2 - 2 UFC / amostra) ou alta inoculação (2 - 10 UFC / amostra). As amostras inoculadas foram permitidas descansar em temperatura ambiente por 2 - 4 semanas antes da realização dos ensaios.
[177] 10 g, 100 g e 300 g de amostras de PIF teste foram preparadas. 10 g de amostra de PIF foi misturada com 90 mL de meio de água peptona tamponada (BPW) pré-aquecido (37 °C) por uma proporção de 1:9 amostra:volume; 100 g de PIF foi misturada com 300 mL de meio BPW pré-aquecido por uma proporção de 1:3 amostra:volume; e 300 g de PIF foi misturada com 900 mL de meio BPW pré-aquecido por uma proporção de 1:3 amostra:volume. O STOMACHER®, um misturador peristáltico, ou um equivalente, foi usado para homogeneizar a amostra no ajuste mais alto por 120 segundos. A amostra homogeneizada foi incubada a 37 °C sem agitação por 16 - 18 horas. O saco contendo a amostra foi gentilmente massageado / agitado para misturar os conteúdos totalmente. 1 mL da amostra foi removido e a cultura foi diluída 1:10 em BPW (100 µL de amostra:900 µL de BPW). 150 µL da amostra da diluição foi, então, transferida para uma placa preta de 96 poços. 10 µl de coquetel de bacteriófago da solução de bacteriófago específico para Salmonella foi adicionado a cada poço e incubado por 2 horas a 37 °C. O reagente NANOGLO® Master Mix foi preparado e 65 µL do reagente foi adicionado a cada poço e gentilmente misturado por pipetação para cima e para baixo. Após 3 minutos de incubação após a adição do substrato, as amostras foram lidas em um luminômetro GLOMAX 96®.
[178] A detecção positiva de Salmonella spp. foi confirmada. As amostras foram enriquecidas por 24 horas a 37 °C. 1 mL da cultura durante a noite foi removido e o procedimento DYNABEADS® anti-Salmonella foi seguido de acordo com as instruções do fabricante. Após a seleção dos grânulos IMS, os grânulos foram ressuspendidos em 100 µL de PBS e plaqueados em uma placa de seleção cromogênica específica para Salmonella. As placas foram incubadas por 18 - 24 horas a 37 °C ± 1 °C. A presença de colônias de cor malva confirmou a presença de Salmonella.
[179] Tal como mostrado na Tabela 6, o ensaio de
Salmonella em PIF não apresentou falsos positivos ou falsos negativos.
Tabela 6. Ensaio de Salmonella spp. em PIF (10 g) SEA1/TSP1 SEA1/TSP1 Resultado Nível SEA1/TSP1 Placa de Amostra Sinal - Sinal - do ensaio do pico RLU confirmação Fundo Fundo com fago 2 uninoc 92 -158 0.4 NEG NEG 11 uninoc 106 -144 0.4 NEG NEG 12 uninoc 112 -138 0.4 NEG NEG 21 uninoc 1371 1121 5.5 NEG* NEG 5 baixo 95 -155 0.4 NEG NEG 6 baixo 96 -154 0.4 NEG NEG 7 baixo 32420000 32419750 129680.0 POS POS 8 baixo 12750000 12749750 51000.0 POS POS 9 baixo 61 -189 0.2 NEG NEG 10 baixo 8658000 8657750 34632.0 POS POS 15 baixo 13355638 13355388 53422.6 POS POS 16 baixo 34743668 34743418 138974.7 POS POS 17 baixo 113 -137 0.5 NEG NEG 18 baixo 83 -167 0.3 NEG NEG 19 baixo 33121322 33121072 132485.3 POS POS 20 baixo 112 -138 0.4 NEG NEG 23 baixo 19638814 19638564 78555.3 POS POS 24 baixo 5189561 5189311 20758.2 POS POS 25 baixo 29838676 29838426 119354.7 POS POS 26 baixo 115 -135 0.5 NEG NEG 27 baixo 15562075 15561825 62248.3 POS POS 28 baixo 117 -133 0.5 NEG NEG 29 baixo 10624720 10624470 42498.9 POS POS
30 baixo 97 -153 0.4 NEG NEG 3 alto 17780000 17779750 71120.0 POS POS 4 alto 24500000 24499750 98000.0 POS POS 13 alto 22195220 22194970 88780.9 POS POS 14 alto 26651412 26651162 106605.6 POS POS 22 alto 26835974 26835724 107343.9 POS POS * Salpicos acidentais ao carregar a placa Exemplo 6. Detecção de Salmonella em amostras de leite
[180] As amostras foram inoculadas com Salmonella em diversos níveis de inoculação; não inoculadas, baixa inoculação (0.2 - 2 UFC / amostra) ou alta inoculação (2 - 10 UFC / amostra). As amostras inoculadas foram permitidas descansar a 4 °C por 48 - 72 horas antes da realização dos ensaios.
[181] 25 mL de amostra de leite foi misturada com 75 mL de meio pré-aquecido (41 °C) para uma proporção de 1:3 amostra:volume. O STOMACHER®, um misturador peristáltico, ou um equivalente, foi usado para homogeneizar a amostra no ajuste mais alto por 60 segundos. A amostra homogeneizada foi incubada a 41 °C sem agitação por 5, 6 ou 7 horas. O saco contendo a amostra foi gentilmente massageado / agitado para misturar os conteúdos totalmente. 1 mL de amostra foi removido e centrifugado no ajuste mais alto por 1 minuto. O sobrenadante foi removido e o pélete foi ressuspendido em 200 µL de meio pré-aquecido. 15 µl de coquetel de bacteriófago da solução de bacteriófago específico para Salmonella foi adicionado a cada poço e incubado por 2 horas a 37 °C. As amostras foram misturadas por vórtice e, então, centrifugado por 5 - 10 segundos para peletizar os resíduos. 150 µL da amostra foi transferida para uma placa de 96 poços. O reagente NANOGLO® Master Mix foi preparado e 65 µL do reagente foi adicionado a cada poço e gentilmente misturado por pipetação para cima e para baixo. Após 3 minutos de incubação após a adição do substrato, as amostras foram lidas em um luminômetro GLOMAX 96®.
[182] A detecção positiva de Salmonella foi confirmada. As amostras foram enriquecidas por 18 - 24 horas no total a 41 °C. 1 mL de cultura durante a noite foi removido e o procedimento DYNABEADS® anti-Salmonella foi seguido de acordo com as instruções do fabricante. Após a seleção dos grânulos IMS, os grânulos foram ressuspendidos em 100 µL de PBS e plaqueados em uma placa de seleção cromogênica específica para Salmonella spp. As placas foram incubadas por 18 - 24 horas a 37 °C ± 1 °C. A presença de colônias de cor malva confirmou a presença de Salmonella spp.
[183] A detecção positiva de Salmonella spp. foi indicada por RLU > 750 ou um sinal:fundo > 3.0. A detecção do fundo foi determinada como sendo 250 RLU. Tal como mostrado na Tabela 7, o ensaio da Salmonella spp. no leite não apresentou falsos positivos ou falsos negativos após 6 ou 7 horas de enriquecimento. Após 5 horas de enriquecimento, as amostras 12, 13, 15, 18 e 25 produziram falsos negativos.
Tabela 7. Ensaio da Salmonella enterica no leite 5 horas de 6 horas de 7 horas de Enriquecimento durante a 1 mL de amostra enriquecimento enriquecimento enriquecimento noite
5 hr 5 hr 5 hr 6 hr 6 hr 6 hr 7 hr 7 hr 7 hr Pico 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL O/N 1:10 O/N 1:10 Resultado Amostra alvo UFC Conc.
Conc.
Conc.
Conc.
Conc.
Conc.
Conc.
Conc.
Conc.
RLU S/B O/N 1:10 estimado RLU S/B RLU RLU S/B RLU RLU S/B RLU 4 0 0 233 0.9 NEG 253 1.0 NEG 222 0.9 NEG 5101 20.4 NEG 10 0 0 283 1.1 NEG 260 1.0 NEG 244 1.0 NEG 29772 119.1 NEG 14 0 0 221 0.9 NEG 234 0.9 NEG 248 1.0 NEG 18399 73.6 NEG 20 0 0 237 0.9 NEG 210 0.8 NEG 289 1.2 NEG 38495 154.0 NEG 24 0 0 261 1.0 NEG 250 1.0 NEG 227 0.9 NEG 16393 65.6 NEG 2 1 1.2 2549 10.2 POS 2262 9.0 POS 36127 144.5 POS 404572832 1618291.3 POS 3 1 1.2 263 1.1 NEG 236 0.9 NEG 282 1.1 NEG 6871 27.5 NEG 5 1 1.2 259 1.0 NEG 1337 5.3 POS 5941 23.8 POS 418737280 1674949.1 POS 7 1 1.2 272 1.1 NEG 250 1.0 NEG 283 1.1 NEG 35242 141.0 NEG 8 1 1.2 1625 6.5 POS 4945 19.8 POS 26059 104.2 POS 316705536 1266822.1 POS
12 1 1.2 262 1.0 NEG 1227 4.9 POS 8038 32.2 POS 186169600 744678.4 POS 13 1 1.2 223 0.9 NEG 2426 9.7 POS 8020 32.1 POS 54255396 217021.6 POS 15 1 1.2 716 2.9 NEG 2404 9.6 POS 16143 64.6 POS 171687376 686749.5 POS 17 1 1.2 243 1.0 NEG 240 1.0 NEG 295 1.2 NEG 15296 61.2 NEG 18 1 1.2 580 2.3 NEG 835 3.3 POS 3167 12.7 POS 293230144 1172920.6 POS 22 1 1.2 231 0.9 NEG 255 1.0 NEG 265 1.1 NEG 46475 185.9 NEG 23 1 1.2 908 3.6 POS 948 3.8 POS 2726 10.9 POS 197835408 791341.6 POS 25 1 1.2 665 2.7 NEG 1802 7.2 POS 6127 24.5 POS 24409542 97638.2 POS 27 1 1.2 1430 5.7 POS 3212 12.8 POS 20179 80.7 POS 213923536 855694.1 POS 28 1 1.2 250 1.0 NEG 264 1.1 NEG 269 1.1 NEG 14175 56.7 NEG 1 10 12.0 4875 19.5 POS 15338 61.4 POS 139098 556.4 POS 183362752 733451.0 POS 9 10 12.0 5873 23.5 POS 40402 161.6 POS 121607 486.4 POS 163668880 654675.5 POS 11 10 12.0 4231 16.9 POS 31486 125.9 POS 142213 568.9 POS 162112992 648452.0 POS 19 10 12.0 2890 11.6 POS 41600 166.4 POS 174570 698.3 POS 196416272 785665.1 POS 21 10 12.0 4090 16.4 POS 17459 69.8 POS 67095 268.4 POS 253096112 1012384.4 POS 29 10 12.0 2650 10.6 POS 8488 34.0 POS 38036 152.1 POS 253975184 1015900.7 POS 6 100 122 36212 144.8 POS 205489 822.0 POS 1430167 5720.7 POS 129592224 518368.9 POS
16 100 122 30119 120.5 POS 160379 641.5 POS 859694 3438.8 POS 247186032 988744.1 POS 26 100 122 33172 132.7 POS 165894 663.6 POS 706144 2824.6 POS 306003808 1224015.2 POS 30 100 122 78723 314.9 POS 306560 1226.2 POS 1690050 6760.2 POS 176066256 704265.0 POS

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES
1. Bacteriófago recombinante CARACTERIZADO pelo fato de compreender um gene indicador inserido em uma região de gene tardio do genoma do bacteriófago, em que o bacteriófago recombinante infecta especificamente Salmonella spp.
2. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago recombinante ser derivado de SEA1 ou TSP1 ou TSP11.
3. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o gene indicador ser otimizado por códon e codificar um produto de proteína solúvel que gera um sinal intrínseco ou uma enzima solúvel que gera sinal após a reação com um substrato.
4. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender uma região não traduzida à montante do gene indicador otimizado por códon, em que a região não traduzida inclui um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada do ribossomo.
5. Composição de coquetel CARACTERIZADO pelo fato de compreender pelo menos dois diferentes tipos de bacteriófagos recombinantes, em que pelo menos um dos bacteriófagos recombinantes compreende um gene indicador conforme definido na reivindicação 1.
6. Método de preparo de um bacteriófago indicador recombinante CARACTERIZADO pelo fato de compreender: selecionar um bacteriófago do tipo selvagem que infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga compreendendo um gene indicador; transformar o plasmídeo / vetor de recombinação homóloga dentro de uma bactéria patogênica alvo; infectar a bactéria patogênica alvo transformada com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim, permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga compreender: determinar a sequência de nucleotídeos natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para recombinação homóloga à jusante do gene da proteína do capsídeo maior, em que a sequência compreende um gene indicador otimizado por códon; e incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga dentro de um plasmídeo / vetor.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de projetar uma sequência ainda compreende inserir uma região não traduzida incluindo um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada do ribossomo à montante do gene indicador otimizado por códon.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de o plasmídeo de recombinação homóloga compreender uma região não traduzida incluindo um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada do ribossomo à montante do gene indicador otimizado por códon.
10. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago do tipo selvagem ser um bacteriófago específico para Salmonella e a bactéria patogênica alvo ser Salmonella spp.
11. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de isolar um clone particular do bacteriófago recombinante compreender um ensaio de diluição limitante para isolar um clone que demonstra a expressão do gene indicador.
12. Método para a detecção de Salmonella spp. em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender: incubar a amostra com um bacteriófago recombinante derivado de um bacteriófago específico para Salmonella compreendendo, um gene indicador inserido em uma região de gene tardio do genoma do bacteriófago; e detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo bacteriófago recombinante, em que detecção positiva do produto de proteína indicadora indicar que Salmonella spp. está presente na amostra.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser uma amostra de alimento, ambiente, água, amostra comercial ou clínica.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de o método detectar tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra de alimento compreender laticínios, carne, peixe, vegetais, ovos, alimentos processados ou não processados, alimentos prontos para o consumo, alimentos secos, pimentas, ou fórmula infantil em pó.
16. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser incubada com uma composição de coquetel compreendendo pelo menos dois diferentes tipos de bacteriófagos recombinantes, em que pelo menos um dos bacteriófagos recombinantes compreende um gene indicador conforme definido na reivindicação 12.
17. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser, primeiro, incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, ou 2 horas.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o tempo total para os resultados é menor do que 26 horas, 25 horas, 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, ou 2 horas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de a proporção de sinal em relação ao fundo gerado pela detecção do indicador ser de pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5.
20. Kit para a detecção de Salmonella spp. CARACTERIZADO pelo fato de compreender um bacteriófago recombinante derivado de bacteriófago específico para Salmonella.
21. Kit, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender um substrato para reagir com um indicador para detectar o produto de proteína solúvel expresso pelo bacteriófago recombinante.
22. Sistema para a detecção de Salmonella spp. CARACTERIZADO pelo fato de compreender um bacteriófago recombinante derivado de bacteriófago específico para Salmonella.
23. Método para a seleção de um tratamento para um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (i) obter uma amostra biológica do indivíduo; (ii) detectar um microrganismo específico ou categoria de microrganismos na amostra biológica usando um fago indicador; e (iii) selecionar um tratamento baseado na identidade de um microrganismo específico detectado na amostra biológica.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de o fago indicador ser um fago sinteticamente preparado.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de o fago indicador ser um fago de ocorrência natural geneticamente modificado.
26. Método para o monitoramento da eficácia de um tratamento para um indivíduo apresentando uma condição médica patogênica CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (i) obter uma amostra biológica do indivíduo; (ii) detectar um microrganismo específico ou categoria de microrganismos na amostra biológica usando um fago indicador; (iii) obter uma segunda amostra biológica do mesmo tipo que a primeira amostra biológica do indivíduo; (iv) detectar o microrganismo específico ou categoria de microrganismos na segunda amostra biológica usando o fago indicador; e (v) determinar uma diminuição, aumento ou manutenção do nível do microrganismo específico ou categoria de microrganismos no indivíduo com base nas quantidades detectadas na primeira e segunda amostras biológicas.
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