ES2705716T3 - Métodos y sistemas para la detección rápida de microorganismos utilizando un bacteriófago recombinante - Google Patents

Abstract

Un bacteriófago recombinante que incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y sistemas para la detección rápida de microorganismos utilizando un bacteriófago recombinante Campo de la invención

La invención se refiere a un bacteriófago recombinante y a los métodos y sistemas relacionados para la detección de microorganismos utilizando bacteriófagos.

Antecedentes

Existe un gran interés en mejorar la velocidad y sensibilidad en la detección de bacterias, virus y otros microorganismos en las muestras biológicas, de alimentos, agua y clínicas. Los patógenos microbianos pueden causar una importante morbilidad en los seres humanos y animales domésticos, además de grandes pérdidas económicas. Por otra parte, la detección de microorganismos tiene máxima prioridad para la Food and Drug Administration (FDA) y los Centros de Control de Enfermedades de EE. UU. (CDC), dados los brotes de enfermedades mortales o potencialmente mortales que provoca la ingestión de alimentos contaminados por ciertos microorganismos, como Escherichia coli o Salmonella spp.

Los análisis microbiológicos tradicionales para la detección de bacterias se basan en cultivos de enriquecimiento selectivos y no selectivos que se colocan en placas sobre medios selectivos para su posterior análisis que confirme la presencia de las colonias sospechosas. Estos procedimientos pueden prolongarse durante varios días. Se han investigado e introducido en la práctica diversos métodos rápidos para reducir el tiempo necesario. Sin embargo, estos métodos presentan inconvenientes. Por ejemplo, las técnicas que implican inmunoensayos directos o sondas génicas generalmente requieren un paso de enriquecimiento para obtener una sensibilidad adecuada. Las pruebas por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también incluyen un paso de amplificación y ofrecen por tanto una alta sensibilidad y selectividad; sin embargo, el tamaño de la muestra que se puede someter de forma económica a las pruebas PCR es limitado. Con las suspensiones bacterianas diluidas, la mayoría de las pequeñas submuestras estarán libres de células y, por tanto, también se requieren pasos de purificación y/o enriquecimiento.

El tiempo necesario para el enriquecimiento biológico tradicional viene dictado por la velocidad de crecimiento de la población bacteriana diana de la muestra, por el efecto de la matriz de la muestra y por la sensibilidad requerida. Por ejemplo, un sistema PCR de captura magnética para E. coli verotoxigénica puede requerir unas 5, 7 y 10 horas de cultivo para el enriquecimiento para detectar 1000, 100, y 1 unidad formadora de colonia por milímetro (CFU/mL), respectivamente, en un sistema modelo, y 15 horas de cultivo para el enriquecimiento para detectar 1 CFU por gramo (g) en carne picada. En la práctica, los métodos de sensibilidad más elevada precisan una incubación durante la noche y tardan unas 24 horas en total. Debido al tiempo necesario para el cultivo, estos métodos pueden tardar hasta tres días, dependiendo del organismo que se pretende identificar y del origen de la muestra. Por lo general este lapso de tiempo no resulta apropiado, dado que el agua o los alimentos (u otro producto) contaminados pueden haber llegado ya a los animales o seres humanos. Por otra parte, el aumento de las bacterias resistentes a antibióticos y las consideraciones de biodefensa hacen que la identificación rápida de patógenos bacterianos en el agua, los alimentos y las muestras clínicas se haya convertido en una prioridad crítica en todo el mundo.

Así pues, existe la necesidad de contar con métodos más rápidos, sencillos y sensibles para la detección e identificación de microorganismos como bacterias, virus y otros microorganismos potencialmente patógenos.

Loessner M J y col., Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, EE. UU., vol. 62, n.° 4, 1996, pág. 1133-1140 divulgan un bacteriófago recombinante que comprende una fusión génica de luciferasa A y luciferasa B; A511 ::luxAB.

Loessner M J y col., Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, EE. UU., vol. 63, n.° 8, 1997, pág. 2961-2965 divulgan el uso del bacteriófago recombinante A511::luxAB para el análisis de muestras medioambientales y de alimentos contaminados.

Steven Hagens y col., Bacteriophage, vol.1, n.° 3, 2011, pág. 143-151 divulgan el bacteriófago A511::celB, que incorpora el gen para glicosidasa termoestable de Pyrococcus furiosus en células de Listeria infectadas por fagos. Edgar R., Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 103, n.° 13, 2006, pág. 4831-4845 divulga la combinación de biotinilación in vivo de bacteriófagos de huésped específico modificados y la conjugación del fago con puntos cuánticos recubiertos de estreptavidina.

Lina Wu y col., Analytical Chemistry, vol.86, n.° 1, 2014, pág. 907-912 divulgan un bacteriófago etiquetado con tetracisteína (TC).

Resumen

Las realizaciones de la invención comprenden un bacteriófago recombinante, los métodos y sistemas para la detección de microorganismos. La invención se define en las reivindicaciones.

La invención comprende un bacteriófago recombinante que incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural.

En algunas realizaciones, la invención incluye un método para detectar un microorganismo de interés en una muestra que comprende los pasos de incubar la muestra con un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés, donde el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, donde el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural; y detectar el producto de proteína indicadora, donde la detección positiva del producto de proteína indicadora significa que el microorganismo de interés se encuentra presente en la muestra.

En otras realizaciones, la invención incluye un sistema para la detección rápida de un microorganismo de interés en una muestra, que comprende un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés, donde el bacteriófago recombinante incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago en calidad de fracción indicadora, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural; un componente para incubar la muestra con el bacteriófago recombinante específico para el microorganismo de interés; y un componente para detectar la fracción indicadora.

En otras realizaciones, la divulgación comprende medios legibles por ordenador no transitorios para su uso con métodos o sistemas de conformidad con la divulgación.

Breve descripción de las figuras

La presente invención se puede entender mejor por referencia a las siguientes figuras de carácter no limitativo. La Figura 1 muestra una estructura de fago indicador de conformidad con una realización de la invención que ilustra la inserción de una estructura genética que comprende el gen de luciferasa de luciérnaga y un promotor tardío T7 insertado en la región tardía (clase III) de un bacteriófago. También se ilustra una secuencia que contiene codones de terminación en los tres marcos de lectura para evitar la ultralectura y una región no traducida (UTR).

La Figura 2 muestra el genoma del bacteriófago JG04, un bacteriófago similar a T4 que ha sido aislado de una muestra de una planta de tratamiento de aguas residuales y que tiene una homología aproximada del 8% con el fago similar a T4, RB69. Las proteínas de la cápside gp23 y gp24 se encuentran en la región génica tardía, que contiene genes estructurales que codifican proteínas del virión. Dado que estas proteínas del virión se expresan a un nivel muy elevado, cabe esperar que todos los genes insertados en esta región tengan unos niveles de expresión similares, siempre que se utilicen promotores génicos tardíos y/u otros elementos de control similares.

La Figura 3 muestra tres estructuras de plásmido de recombinación homólogos que portan tres genes de luciferasa diferentes. Los genes de luciferasa de luciérnaga, luciferasa NANOLUC® y luciferasa de camarón Oplophorus se insertan en un segmento principal del plásmido pUC57.AmpR En cada estructura, un fragmento del gen de la proteína de la cápside gp23 va seguido de un promotor tardío de T4, el correspondiente gen de luciferasa y una región no traducida de gp23-24. La estructura del Oplophorus comprende además un fragmento del gen gp24 secuencia abajo de la región no traducida.

La Figura 4 ilustra el aislamiento del fago recombinante de modificaciones del bacteriófago JG04 utilizando estructuras de plásmido como las mostradas en la Figura 3, utilizando una serie de pasos secuenciales de infección y dilución a fin de identificar el fago recombinante que expresa un gen indicador.

La Figura 5 ilustra el uso del fago indicador que codifica una luciferasa soluble para detectar células bacterianas a través de la detección de luciferasa generada por la replicación del fago de la progenie durante la infección de las células bacterianas de conformidad con una realización de la invención.

La Figura 6 demuestra sensibilidad para la detección de bacterias diana utilizando el fago indicador con columnas de centrifugación de conformidad con una realización de la invención. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU) sobre la señal de fondo (BG) (es decir, sin células) (RLU/BG).

La Figura 7 demuestra la detección de bacterias diana en un rango de titulaciones utilizando el fago indicador con columnas de centrifugación de conformidad con una realización de la invención. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU) sobre la señal de fondo (BG) (es decir, sin células) (RLU/BG).

La Figura 8 demuestra sensibilidad para la detección de bacterias diana utilizando el fago indicador con placas de filtro de 96 pocillos de conformidad con una realización de la invención. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU) sobre la señal de fondo (BG) (es decir, sin células) (RLU/BG).

La Figura 9 demuestra la detección de bacterias diana en un rango de titulaciones utilizando el fago indicador con placas de filtro de 96 pocillos de conformidad con una realización de la invención. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU) sobre la señal de fondo (BG) (es decir, sin células) (RLU/^b G). La detección de la actividad de luciferasa puede continuar durante un periodo de tiempo prolongado. Aquí, la lectura 0 representa tiempo 0 (es decir, un control de partida); A después de 15 minutos (min); y □ después de 30 minutos.

La Figura 10 ilustra un ensayo de placa de filtro para detectar bacterias de interés utilizando un bacteriófago modificado de conformidad con una realización de la invención, donde las bacterias y el fago recombinante se incuban en placas de filtro y tras la generación del bacteriófago de la progenie se detecta la proteína indicadora directamente sin eliminación del medio de incubación.

La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de placa de filtro utilizando el fago JG04-NANOLUC® para detectar células de E. coli 0157:H7 en muestras con números de células conocidos. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU) sobre la señal de fondo (BG) (es decir, sin células) (RLU/BG).

La Figura 12 ilustra un «ensayo de no concentración» para detectar una bacteria de interés utilizando un bacteriófago modificado de conformidad con una realización de la invención.

La Figura 13 muestra los resultados de un «ensayo de no concentración» utilizando el fago JG04-OpLuc para detectar células de E. coli 0157:H7 en muestras con números de células conocidos en un rango de cifras bajas. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU) en comparación con la señal de fondo (X) (es decir, sin células).

La Figura 14 muestra los resultados de un «ensayo de no concentración» utilizando el fago JG04-OpLuc para detectar células de E. coli 0157:H7 en muestras con números de células conocidos en un rango de cifras bajas a altas. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU).

La Figura 15 muestra los resultados de un «ensayo de no concentración» utilizando el fago JG04-OpLuc para detectar células de E. coli 0157:H7 en muestras de lavado vegetal con números de células conocidos. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU).

La Figura 16 demuestra la captura específica y cuantitativa de E. coli 0157:H7 utilizando anticuerpos específicos de superficie purificados por afinidad de conformidad con una realización de la invención.

La Figura 17 ilustra un ensayo de inmunofago híbrido (HIP) para detectar una bacteria de interés utilizando un bacteriófago modificado de conformidad con una realización de la invención, donde los anticuerpos para el microorganismo de interés se utilizan para capturar el microorganismo sobre la superficie del pocillo de ensayo antes de la incubación con un agente infeccioso recombinante que tiene un gen indicador.

La Figura 18 muestra los resultados de un ensayo HIP utilizando el fago JG04-NANOLUC® para detectar células de E. coli 0157:H7 en muestras con números de células conocidos en una escala logarítmica. El número aproximado de células de E. coli 0157:H7 en cada ensayo está indicado en el eje X. La señal proporcionada por la luciferasa soluble producida tras la infección de las bacterias se muestra en el eje Y en forma de unidades luminosas relativas (RLU).

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se divulgan las composiciones, métodos y sistemas que demuestran una sensibilidad sorprendente para la detección de un microorganismo de interés en muestras de ensayo (por ejemplo, muestras biológicas, de alimentos, de agua y clínicas). La detección se puede conseguir en un periodo de tiempo menor de lo que se creía hasta la fecha, utilizando agentes infecciosos genéticamente modificados en ensayos realizados sin ningún cultivo para el enriquecimiento, o en algunas realizaciones con tiempos de incubación mínimos durante los cuales los microorganismos se podrían multiplicar potencialmente. También resultan sorprendentes las ventajas de utilizar una alta multiplicidad de infección (MOI) o concentraciones elevadas de unidades formadoras de placa (PFU) para la incubación con una muestra de ensayo. Estas concentraciones elevadas de fago (PFU/ml) anteriormente se suponía que eran perjudiciales para los ensayos de detección de microorganismos, dado que supuestamente causaban «lisis desde fuera».

Las composiciones, métodos, sistemas y kits de la divulgación pueden comprender agentes infecciosos para el uso en la detección de estos microorganismos. La invención comprende un bacteriófago recombinante que tiene un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural. En determinadas realizaciones, la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de una bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble. El gen indicador se inserta en una región génica tardía (por ejemplo, de clase III) del bacteriófago. El bacteriófago se puede derivar de T7, T4, JG04 u otro bacteriófago natural.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés. El método utiliza un agente infeccioso para la detección del microorganismo de interés; el microorganismo de interés es una bacteria y el agente infeccioso es un bacteriófago.

Por tanto, el método comprende la detección de un microorganismo de interés en una muestra, incubando la muestra con un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés. El bacteriófago recombinante comprende un gen indicador, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural. El gen indicador se inserta en una región génica tardía del bacteriófago, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble. El método comprende la detección del producto de proteína indicadora, donde la detección positiva del producto de proteína indicadora significa que el microorganismo de interés se encuentra presente en la muestra.

En determinadas realizaciones, la invención puede comprender un sistema. El sistema contiene el bacteriófago recombinante de la invención. Por otra parte, el sistema puede comprender al menos algunos de los componentes para la realización del método. En determinadas realizaciones de la divulgación, el sistema se formula en forma de kit. Por tanto, en determinadas realizaciones, la invención incluye un sistema para la detección rápida de un microorganismo de interés en una muestra, que comprende un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés, donde el bacteriófago recombinante incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago en calidad de fracción indicadora, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural; un componente para incubar la muestra con el bacteriófago recombinante específico para el microorganismo de interés; y un componente para detectar la fracción indicadora. En otras realizaciones, la realización comprende un software para su uso con los métodos o sistemas de la divulgación.

Por tanto, la presente invención resuelve una necesidad, utilizando métodos basados en bacteriófagos para la amplificación de una señal detectable que indica la presencia de bacterias. En determinadas realizaciones se detecta incluso una única bacteria. Los principios aplicados en el presente documento se pueden utilizar para la detección de diversos microorganismos. Dada la presencia de numerosos puntos de unión para un agente infeccioso en la superficie de un microorganismo, la capacidad de producir cien o más elementos de progenie del agente durante la infección, y el potencial de expresión de alto nivel de una fracción indicadora codificada, el agente infeccioso o la fracción indicadora puede resultar más fácilmente detectable que el propio microorganismo. De este modo, las realizaciones de la presente invención pueden conseguir una enorme amplificación de la señal a partir incluso de una única célula infectada.

Aspectos de la presente invención utilizan la alta especificidad de los agentes de unión que pueden unirse a microorganismos concretos, es decir el componente de unión del bacteriófago, como medio para detectar y/o cuantificar el microorganismo específico en una muestra. La presente invención utiliza la elevada especificidad del bacteriófago.

En algunas realizaciones de la divulgación, la detección se consigue a través de una fracción indicadora asociada con el agente de unión específico para el microorganismo de interés. Por ejemplo, un agente infeccioso puede comprender una fracción indicadora. En algunas realizaciones el indicador puede estar codificado por el agente infeccioso que es un bacteriófago y el bacteriófago se designa fago indicador tal y como se define en las reivindicaciones.

Algunas realizaciones de la divulgación divulgada y descrita en el presente documento utilizan el descubrimiento de que un único microorganismo es capaz de unirse a agentes de reconocimiento específicos, como un fago. Tras la infección y replicación del fago, el fago de la progenie puede detectarse a través de una fracción indicadora expresada durante la replicación del fago. El principio permite la amplificación de la señal indicadora de una o varias células en base al reconocimiento específico de receptores de superficie del microorganismo. Por ejemplo, al exponer una única célula de un microorganismo a una pluralidad de fagos, permitir posteriormente la amplificación del fago y la expresión de alto nivel de un producto de gen indicador codificado durante la replicación, la señal indicadora se amplifica de forma que un solo microorganismo resulta detectable.

Se pueden aplicar realizaciones de los métodos y sistemas de la divulgación a la detección y cuantificación de diversos microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras) en diversas circunstancias, incluyendo, entre otras, la detección de patógenos en muestras de alimentos, agua, clínicas y comerciales. Los métodos de la presente divulgación ofrecen una elevada sensibilidad de detección y especificidad de forma rápida y sin necesidad del enriquecimiento biológico tradicional (por ejemplo, cultivo para enriquecimiento), lo que representa un aspecto sorprendente dado que todos los métodos disponibles requieren el cultivo. En algunas realizaciones la detección resulta posible dentro de 1-2 ciclos de replicación del bacteriófago o el virus, lo que contradice la teoría tradicional, dado que no aprovecha la capacidad natural del fago para amplificarse y la señal de luciferasa.

Definiciones

Salvo que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden habitualmente los expertos en la técnica. Por otra parte, salvo que así lo exija el contexto, los términos en singular incluirán los plurales y viceversa. Por lo general, las nomenclaturas utilizadas en las técnicas y en relación con los cultivos de células y tejido, la biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de ácidos nucleicos y proteínas, e hibridación descritos en el presente son aquellas conocidas habitualmente en la técnica. Generalmente las técnicas y métodos conocidos se realizan siguiendo métodos tradicionales habituales en la técnica y se describen en diversas referencias generales y más específicas que se exponen a lo largo de la presente memoria técnica, salvo que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza habitualmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las nomenclaturas usadas en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio que se describen en este documento son las conocidas y utilizadas habitualmente en la técnica.

Salvo que se indique lo contrario, se entenderá que los siguientes términos tienen los significados siguientes:

A efectos del presente, los términos «un», «una», «el» y «la» se pueden referir a uno o más elementos, salvo que se indique específicamente lo contrario.

El uso del término «o» significa en el presente «y/o», salvo que se indique de forma explícita que se refiere únicamente a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y a «y/o». A efectos del presente, «otro» puede significar al menos un segundo o más.

En la presente solicitud, el término «aproximado» se utiliza para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que se va a emplear para determinar el valor, o la variación que existe entre muestras.

El término «soporte sólido» o «soporte» significa una estructura que proporciona un sustrato y/o superficie a la que se pueden unir biomoléculas. Por ejemplo, un soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo (por ejemplo, una placa de microtitulación o una placa multipocillo) o el soporte sólido puede ser una ubicación en un filtro, un alineamiento, o un soporte móvil como un gránulo o una membrana (por ejemplo, una placa de filtro o una banda de flujo lateral). El término «anticuerpo» incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos sintéticos y anticuerpos quiméricos, por ejemplo, generados mediante mutagénesis combinatoria y visualización de fagos. El término «anticuerpo» también incluye miméticos o peptidomiméticos de anticuerpos. Los peptidomiméticos son compuestos basados en (u obtenidos de) péptidos y proteínas. Los peptidomiméticos de la presente invención se pueden obtener normalmente por modificación estructural de una secuencia peptídica conocida utilizando aminoácidos no naturales, restricciones conformacionales, sustituciones isostéricas y similares. En algunas realizaciones se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos en lugar de anticuerpos. «Anticuerpos de superficie específica» a efectos del presente se unen a moléculas expuestas en la superficie exterior de un microorganismo específico.

A efectos del presente, el término «anticuerpos libres» se refiere a anticuerpos que están en solución y que se pueden desplazar libremente por un líquido, es decir que inicialmente no están unidos a un soporte sólido ni limitados de otro modo.

A efectos del presente, «purificado por afinidad» o «purificación por afinidad» se refiere a una serie de pasos utilizados para preparar y tratar anticuerpos para que estos exhiban una especificidad y sensibilidad óptimas, incluyendo una reactividad cruzada mínima con epítopos no deseados. Por ejemplo, la eliminación de lípidos y proteínas no deseados del antisuero se puede conseguir primero mediante pasos de precipitación con sales. Otra selección positiva (también denominada «purificación por afinidad») y/o selección negativa (también denominada «purificación inversa») se puede conseguir pasando los anticuerpos restantes por un soporte (por ejemplo, columnas de agarosa) que comprende antígenos de superficie diseñados para retener anticuerpos con afinidades concretas por el epítopo. En algunos ejemplos, cuando el antisuero de partida es policlonal, los anticuerpos purificados que permanecen tras estos pasos de selección son capaces de reconocer muchos epítopos diferentes sobre la superficie del microorganismo de interés, pero no reconocen los epítopos de superficie de otros microorganismos.

El término «agente de unión» se refiere a una molécula que se puede unir específica y selectivamente a una segunda (es decir, diferente) molécula de interés. La interacción puede ser no covalente, por ejemplo, como resultado de la formación de un enlace de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, o interacciones electrostáticas o hidrófobas, o puede ser covalente. El término «agente de unión soluble» se refiere a un agente de unión que no está asociado (es decir, unido covalente o no covalentemente) con un soporte sólido.

A efectos del presente, un «analito» se refiere a una molécula, compuesto o célula que se pretende medir. En determinadas realizaciones, el analito de interés puede interactuar con un agente de unión. A efectos del presente, el término «analito» se puede referir a una proteína o péptido de interés. Un analito puede ser un agonista, un antagonista o un modulador. O bien, un analito puede no tener un efecto biológico. Los analitos pueden incluir pequeñas moléculas, azúcares, oligosacáridos, lípidos, péptidos, peptidomimétidos, compuestos orgánicos y similares.

El término «fracción detectable» o «biomolécula detectable» o «indicador» o «fracción indicadora» se refiere a una molécula que se puede medir en un ensayo cuantitativo. Por ejemplo, una fracción indicadora puede comprender una enzima que se puede utilizar para convertir un sustrato en un producto que se puede medir. Una fracción indicadora puede ser una enzima que cataliza una reacción que genera emisiones bioluminiscentes (por ejemplo, luciferasa). O bien, una fracción indicadora puede ser un radioisótopo que se puede cuantificar. O bien, una fracción indicadora puede ser un fluoróforo. O bien, se pueden utilizar otras moléculas detectables.

A efectos del presente, «bacteriófago» o «fago» incluye uno o más de una pluralidad de virus bacterianos. En esta divulgación, los términos «bacteriófago» y «fago» incluyen virus como micobacteriófagos (por ejemplo, para TB y para TB), micófagos (por ejemplo, para hongos), fagos para micoplasma y cualquier otro término que se refiera a un virus que puede invadir bacterias vivas, hongos, micoplasma, protozoos, levaduras y otros organismos microscópicos vivos y los utilice para replicarse. En el presente documento, «microscópico» significa que la dimensión mayor es de un milímetro o menos. Los bacteriófagos son virus que han evolucionado en la naturaleza para utilizar las bacterias como medio para replicarse. Un fago lo consigue uniéndose a una bacteria e inyectando su ADN (o ARN) en esa bacteria y provocando que replique el fago cientos o incluso miles de veces. Esto se denomina amplificación del fago.

A efectos del presente, «región génica tardía» se refiere a una región de un genoma viral que se trascribe de forma tardía en el ciclo de vida viral. La región génica tardía incluye normalmente los genes que se expresan de forma más abundante (por ejemplo, proteínas estructurales ensambladas en la partícula del bacteriófago). Los genes tardíos son sinónimos de los genes de clase III e incluyen genes con funciones de ensamblaje y estructura. Por ejemplo, los genes tardíos (sinónimos de genes de clase III) se transcriben en T7, por ejemplo, desde ocho minutos después de la infección hasta la lisis; los de clase I (por ejemplo, ARN polimerasa) son tempranos (desde los 4-8 minutos); y los de clase II desde los 6-15 minutos, por lo que se produce un solapamiento en los tiempos de las clases II y III. Un promotor tardío es aquel naturalmente ubicado y activo en esta región génica tardía.

A efectos del presente, «cultivo para enriquecimiento» se refiere al cultivo tradicional, como la incubación en medios favorables para la propagación de microorganismos, y no se deberá confundir con otros usos posibles de la palabra «enriquecimiento», como el enriquecimiento por eliminación del líquido que compone una muestra para concentrar el microorganismo contenido en ella, u otras formas de enriquecimiento que no incluyen la facilitación tradicional de la propagación del microorganismo. El cultivo para enriquecimiento durante periodos de tiempo muy breves se puede emplear en algunas realizaciones de los métodos descritos en este documento, pero no es necesario y si se llega a utilizar requiere un periodo de tiempo mucho más breve que en el cultivo para enriquecimiento tradicional.

A efectos del presente, «recombinante» se refiere a modificaciones genéticas (es decir, ácido nucleico) realizadas habitualmente en un laboratorio para unir material genético que de otro modo no se encontraría. A efectos del presente, el término se utiliza de forma intercambiable con el término «modificado».

Muestras

Cada una de las realizaciones de los métodos y sistemas de la invención puede permitir la detección y cuantificación rápidas de microbios en una muestra. Por ejemplo, los métodos de conformidad con la presente invención se pueden realizar, más preferiblemente, en unas dos horas o menos.

Los microbios detectados por los métodos y sistemas de la presente divulgación incluyen patógenos de interés comercial, médico o veterinario. Estos patógenos de la divulgación incluyen bacterias gramnegativas, bacterias grampositivas, micoplasmas y virus. Cualquier microbio para el que se haya identificado un agente infeccioso específico para el microbio concreto puede ser detectado por los métodos de la presente divulgación. Los expertos en la técnica apreciarán que no existe un límite para la aplicación de los presentes métodos de la divulgación, salvo por la disponibilidad de los pares de microbios/agentes infecciosos específicos necesarios.

Las células bacterianas detectables a través de la presente invención incluyen, entre otras, células bacterianas que son patógenos presentes en los alimentos o el agua. Las células bacterianas detectables a través de la presente invención incluyen, entre otras, todas las especies de Salmonella, todas las cepas de Escherichia coli, incluyendo, entre otras E. coli 0157:H7, todas las especies de Listeria, incluyendo, entre otras, L. monocytogenes, y todas las especies de Campylobacter. Las células bacterianas detectables a través de la presente invención incluyen, entre otras, células bacterianas que son patógenos de importancia médica o veterinaria. Estos patógenos incluyen, entre otros, Bacillus spp., Bordetella pertussis, Camplyobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Clostridium perfringens, Enterobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, y Streptococcus spp.

La muestra puede ser una muestra medioambiental, de alimentos o de agua, así como muestras médicas o veterinarias. Las muestras pueden ser líquidas, sólidas o semisólidas. Las muestras pueden ser frotis de superficies sólidas. Las muestras pueden incluir materiales medioambientales, como muestras de agua, o los filtros de muestras de aire o muestras de aerosoles de colectores ciclónicos. Las muestras pueden ser de carne, aves, alimentos procesados, leche, queso u otros productos lácteos. Las muestras médicas o veterinarias incluyen, entre otras, sangre, esputo, líquido cefalorraquídeo, muestras fecales y diferentes tipos de frotis.

Las muestras se pueden utilizar directamente en los métodos de detección de la presente invención, sin preparación, concentración o dilución. Por ejemplo, las muestras líquidas incluyendo, entre otras, leche y zumos, se pueden someter a ensayo directamente. Las muestras se pueden diluir o suspender en solución, incluyendo, entre otras, una solución con tampón o un medio de cultivo bacteriano. Una muestra que es sólida o semisólida se puede suspender en un líquido, moliendo, mezclando o macerando el sólido en el líquido. Una muestra se debería mantener dentro de un intervalo de pH que favorezca la unión del bacteriófago a la célula bacteriana hospedadora. Una muestra debería contener asimismo las concentraciones apropiadas de cationes divalentes y monovalentes, incluyendo, entre otros Na+, Mg2+, y K+. Preferiblemente una muestra se debe mantener a una temperatura que conserve la viabilidad de cualesquiera células patógenas que contenga la muestra.

Preferiblemente durante todos los ensayos de detección, la muestra se debe mantener a una temperatura que conserve la viabilidad de cualesquiera células patógenas presentes en la muestra. Durante los pasos en los que los bacteriófagos se unen a células bacterianas, es preferible mantener la muestra a una temperatura que facilite la unión del bacteriófago. Durante los pasos en los que los bacteriófagos se replican dentro de una célula bacteriana infectada o proceden al lisado de una célula infectada, es preferible mantener la muestra a una temperatura que promueva la replicación del bacteriófago y la lisis de la hospedadora. Estas temperaturas son al menos de unos 25 grados Celsius (C), más preferiblemente no superiores a unos 45° C, más preferiblemente de unos 37° C. También es preferible que las muestras se sometan a un mezclado o agitado suave durante la unión del bacteriófago, la replicación y la lisis celular.

Los ensayos pueden incluir varias muestras de control apropiadas. Por ejemplo, se pueden someter a ensayo muestras de control que no contienen bacteriófagos o muestras que control que contienen bacteriófagos sin bacterias, en tanto que controles para los niveles de señal de fondo.

Agentes infecciosos indicadores

Tal y como se describe más detalladamente en el presente, las composiciones, métodos, sistemas y kits de la divulgación pueden comprender agentes infecciosos para su uso en la detección de estos microorganismos. La invención comprende un bacteriófago recombinante que tiene un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de una bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble. El gen indicador se inserta en una región génica tardía del bacteriófago. En un bacteriófago recombinante la región génica tardía puede ser una región génica de clase III.

En algunas realizaciones, el fago indicador se obtiene de T7, T4 u otro fago. También se puede obtener un bacteriófago indicador de fagos similares a T7, similares a T4, JG04, similares a JG04, o cualquier otro bacteriófago que tenga un genoma con una homología de al menos el 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 9190, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, o el 70% con los fagos T7, similares a T7, T4, similares a T4, JG04, o similares a JG04. En algunas realizaciones, el fago indicador se obtiene de un fago natural aislado del entorno, como el fago JG04, un fago similar a T4 aislado tal y como se describe en los Ejemplos. Las modificaciones genéticas pueden evitar deleciones de genes de tipo salvaje y por tanto pueden mantenerse más similares al agente infeccioso de tipo salvaje que muchos fagos disponibles en el mercado, como por ejemplo T7SELECT®415. Este bacteriófago obtenido naturalmente puede ser más específico para las bacterias que se encuentran en el entorno que el bacteriófago disponible en el mercado y, por tanto, genéticamente distinto del fago que se encuentra en el entorno.

Por otra parte, los genes de los fagos considerados no esenciales pueden tener una función no reconocida. Por ejemplo, un gen supuestamente no esencial puede tener una función importante elevando el número de fagos producidos por una célula infectada con sutiles funciones de corte, adecuación o adaptación en el ensamblaje. Por tanto, someter los genes a deleción para insertar un indicador puede ser negativo. La mayoría de los fagos pueden contener un ADN que es algo más grande que su genoma natural. Teniendo esto en cuenta, un gen indicador más pequeño puede resultar una opción más apropiada para modificar un bacteriófago, especialmente uno con un genoma más pequeño. Las proteínas OpLuc y NANOLUC® son proteínas de tan solo unos 20 kDa (aproximadamente 500-600 bp para codificar), mientras que FLuc es una proteína de unos 62 kDa (aproximadamente 1700 bp para codificar). Por el contrario, el genoma de T7 tiene unos 40 kbp, mientras que el genoma de T4 tiene unos 170 kbp.

En algunas realizaciones con fagos indicadores, el gen indicador puede ser insertado en una región no traducida para evitar la disrupción de genes funcionales, dejando intactos los genes del fago de tipo salvaje, lo que puede suponer una mayor adecuación cuando se infectan bacterias de cepas que no son de laboratorio. Por otra parte, los codones de terminación de los tres marcos de lectura pueden ayudar a aumentar la expresión reduciendo la ultralectura, también conocida como expresión permeable. Esta estrategia también puede eliminar la posibilidad de que se cree una proteína de fusión a bajos niveles, que se manifestaría como una señal de fondo (por ejemplo, luciferasa) que no se puede separar del fago.

Un gen indicador puede expresar diversas biomoléculas. En una realización de la divulgación, el gen indicador es un gen que expresa un producto detectable o una enzima que produce un producto detectable. El gen indicador de la invención codifica una enzima de luciferasa. Se pueden utilizar varios tipos de luciferasa. En realizaciones alternativas, tal y como se describe detalladamente en el presente documento, la luciferasa es una luciferasa de camarón Oplophorus, luciferasa de luciérnaga o luciferasa transformada por ingeniería.

Por tanto, la presente invención comprende un bacteriófago modificado que contiene un gen indicador no bacteriófago en la región génica tardía (clase III). En algunas realizaciones, el gen indicador no nativo se encuentra bajo control de un promotor tardío. El uso de un promotor del gen tardío viral asegura que el gen indicador (luciferasa) no solo se exprese a altos niveles, como las proteínas de la cápside viral, y además no se desactiva como los genes bacterianos endógenos o incluso genes virales tempranos.

En algunas realizaciones, el promotor tardío es un promotor de T4 o de un fago similar a T7, u otro promotor del fago similar al que se encuentra en el fago natural sin modificación genética. La región génica tardía puede ser una región génica de clase III, y el bacteriófago se puede obtener de un fago T7, T4, similar a T4, JG04 u otro bacteriófago natural que tenga un genoma con una homología mínima del 90% con un fago T7, T4 o similar a T4. En realizaciones preferibles, el gen indicador no codifica una proteína de fusión.

Las modificaciones genéticas de agentes infecciosos pueden incluir inserciones, deleciones o sustituciones de un pequeño fragmento de ácido nucleico, de una parte sustancial de un gen o de un gen completo. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos insertados o sustituidos comprenden secuencias no nativas. Se puede insertar un indicador no nativo en el genoma de un bacteriófago de forma que esté bajo el control de un promotor del bacteriófago. En algunas realizaciones, el gen indicador no nativo no forma parte de una proteína de fusión. Es decir, en algunas realizaciones, se puede configurar una modificación genética de forma que el producto de proteína indicadora no comprenda polipéptidos del bacteriófago natural. En algunas realizaciones, el producto de proteína indicadora es soluble. En algunas realizaciones, la invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés que incluye el paso de incubar una muestra de ensayo con este bacteriófago modificado. En algunas realizaciones, el gen indicador no nativo no se encuentra contiguo a un gen que codifica una proteína del fago estructural y, por tanto, no produce una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la expresión del gen indicador en el bacteriófago de la progenie tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína soluble.

A diferencia de los sistemas que emplean una fusión de una fracción de detección con la proteína de la cápside (es decir, una proteína de fusión), algunas realizaciones de la presente invención expresan una luciferasa soluble. Esto puede incrementar en gran medida la sensibilidad del ensayo (hasta una única bacteria) y simplifica el ensayo, permitiendo que este se complete en menos de una hora en algunas realizaciones, frente a las varias horas que requieren los pasos de purificación adicionales necesarios con estructuras que producen proteínas de fusión detectables. Por otra parte, las proteínas de fusión pueden ser menos activas que las proteínas solubles, debido, por ejemplo, a las limitaciones de plegado que pueden alterar la conformación del punto activo de la enzima o el acceso al sustrato.

Por otra parte, las proteínas de fusión por definición limitan el número de fracciones unidas a subunidades de una proteína del bacteriófago. Por ejemplo, el uso de un sistema disponible en el mercado diseñado para actuar como plataforma para una proteína de fusión produciría unas 415 copias de la fracción de fusión, correspondientes a las aproximadas 415 copias de la proteína 10B de la cápside del gen en cada partícula del bacteriófago T7. Sin esta limitación, cabe esperar que las bacterias infectadas expresen muchas más copias de la fracción de detección (por ejemplo, luciferasa) de las que se pueden encontrar en el bacteriófago. Por otra parte, las proteínas de fusión de gran tamaño, como la fusión de cápside-luciferasa, pueden inhibir el ensamblaje de la partícula del bacteriófago, produciendo así una menor progenie del bacteriófago. Por tanto, puede ser preferible un producto génico indicador sin fusión.

En algunas realizaciones de la divulgación, el fago indicador codifica una enzima detectable. El indicador puede emitir luz y/o ser detectable por un cambio de color. Hay diversas enzimas apropiadas disponibles en el mercado, tales como fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano (HRP) o luciferasa (Luc). En algunas realizaciones de la divulgación, estas enzimas pueden actuar como fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de luciérnaga es la fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de camarón Oplophorus es la fracción indicadora. En algunas realizaciones, NANOLUC® es la fracción indicadora. Otras luciferasas transformadas por ingeniería u otras enzimas que generan señales detectables también pueden resultar fracciones indicadoras apropiadas.

Por otra parte, el uso de una fracción de detección soluble elimina la necesidad de aislar el fago parental contaminante del lisado de las células infectadas de la muestra. Con un sistema de proteínas de fusión, cualquier bacteriófago utilizado para infectar células de la muestra tendría la fracción de detección unida y no se podría distinguir del «bacteriófago hijo» que también contiene la fracción de detección. Dado que la detección de bacterias de la muestra depende de la detección de la fracción de detección de nueva creación (sintetizada de novo), el uso de estructuras de fusión requiere pasos adicionales para separar las fracciones viejas (parentales) de las fracciones de nueva creación («bacteriófago hijo»). Esto se puede conseguir lavando las células infectadas múltiples veces, antes de la conclusión del ciclo de vida del bacteriófago, inactivando el exceso de fago parental tras la infección por medios físicos o químicos, y/o modificando químicamente el bacteriófago parental con una fracción de unión (como biotina), que puede entonces unirse y separarse (por ejemplo con gránulos de sefarosa recubierta de estreptavidina). Sin embargo, incluso con todos estos intentos de aislamiento, el fago parental típicamente se mantiene cuando se utiliza una alta multiplicidad de infección (MOI) para asegurar la infección de un bajo número de células de la muestra, creando una señal de fondo que puede obstaculizar la detección de la señal de fagos de la progenie de células infectadas.

Por el contrario, con la fracción de detección soluble expresada en algunas realizaciones de la presente invención, la purificación del fago parental desde el lisado final resulta innecesaria, dado que el fago parental no tendrá ninguna fracción de detección unida. Por tanto, toda fracción de detección presente tras la infección tiene que haberse creado de novo, indicando la presencia de una bacteria o bacterias infectadas. Para aprovechar esta ventaja, la producción y preparación del fago parental pueden incluir la purificación del fago de cualquier fracción de detección libre producida durante la producción del bacteriófago parental en cultivo bacteriano. Se pueden emplear técnicas de purificación de bacteriófagos estándar para purificar algunas realizaciones del fago de conformidad con la presente invención, tales como centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio, HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño, y diálisis o tecnologías derivadas (tales como concentradores de la marca Amicon - Millipore, Inc.). Los Ejemplos del presente documento describen la ultracentrifugación isopícnica con cloruro de cesio como parte de la preparación del fago recombinante de la invención para separar partículas del fago parental de la proteína de luciferasa contaminante producida tras la propagación del fago en el caldo bacteriano. De esta forma, el bacteriófago recombinante de la invención está sustancialmente libre de toda luciferasa generada durante la producción de las bacterias. La eliminación de la luciferasa residual presente en el caldo del fago puede reducir de forma sustancial la señal de fondo observada cuando el bacteriófago recombinante se incuba con una muestra de ensayo.

En algunas realizaciones del bacteriófago modificado, el promotor tardío (promotor de clase III, como T7 o T4) tiene una alta afinidad por la ARN polimerasa del mismo bacteriófago nativo (por ejemplo, T7 o T4, respectivamente) que transcribe genes para proteínas estructurales ensambladas en la partícula del bacteriófago. Estas proteínas son las proteínas más abundantes producidas por el fago, dado que cada partícula de bacteriófago comprende docenas de cientos de copias de estas moléculas. El uso de un promotor tardío viral puede garantizar un nivel elevado óptimo de expresión de la fracción de detección de la luciferasa. El uso de un promotor viral tardío obtenido de, específico para o activo bajo el bacteriófago de tipo salvaje original del que se obtiene el fago indicador (por ejemplo, el promotor tardío de ^t4 o T7 con un sistema basado en T4 o T7) puede garantizar además la expresión óptima de la fracción de detección. En algunos casos el uso de un promotor bacteriano (no viral y no bacteriófago) estándar puede ser perjudicial para la expresión, dado que estos promotores son a menudo regulados a la baja durante la infección del bacteriófago (para que el bacteriófago priorice los recursos bacterianos para la producción de proteína del fago). Por tanto, en algunas realizaciones, el fago es preferiblemente transformado por ingeniería para que codifique y exprese a alto nivel una fracción indicadora soluble (libre), lo que no limita la expresión del número de subunidades del componente estructural de un fago.

Las realizaciones que emplean un bacteriófago modificado de la invención pueden permitir la detección rápida de cepas bacterianas específicas, con unos tiempos de ensayo totales de tan solo 45 minutos a 1,5 horas. La cantidad de tiempo requerido puede ser algo inferior o superior en función de la cepa del bacteriófago y de la cepa de la bacteria que se pretende detectar en ensayo.

La Figura 1 ilustra una representación esquemática de la estructura genómica de un bacteriófago recombinante de la invención, el Fago Indicador T7SELECT®415-Luc. Para la realización ilustrada en la Figura 1, la fracción de detección es codificada por un gen de luciferasa de luciérnaga 100 insertado dentro de la región génica tardía (clase III) 110, que se expresa de forma tardía en el ciclo de vida viral. Los genes tardíos se expresan generalmente a niveles más elevados que otros genes de los fagos, dado que codifican proteínas estructurales. Por tanto, en la realización del fago recombinante ilustrada en la Figura 1, el gen indicador (es decir, luciferasa de luciérnaga) se inserta en la región génica tardía, justo después del gen 10B (proteína de la cápside principal), y es una estructura que comprende el gen de luciferasa de luciérnaga 100. La estructura ilustrada en la Figura 1 ha sido diseñada para incluir codones de terminación 120 en los tres marcos de lectura para garantizar que la luciferasa no se incorpore en el producto del gen 10B. Como también se ilustra en la Figura 1, la estructura puede comprender el promotor tardío de T7 de consenso 130 para impulsar la transcripción y expresión del gen de luciferasa. La estructura también puede comprender una región no traducida compuesta sintetizada a partir de varias UTR de T7 140. Esta estructura garantiza que se produzca luciferasa de luciérnaga soluble para que la expresión no se limite al número de proteínas de la cápside 25 inherente al sistema de visualización del fago.

Como se ha señalado en el presente documento, en determinadas realizaciones puede ser preferible utilizar agentes infecciosos que hayan sido aislados del entorno para la producción de los agentes infecciosos de la invención. De este modo, se pueden generar agentes infecciosos que son específicos para microorganismos obtenidos naturalmente.

Por ejemplo, la Figura 2 muestra el genoma del bacteriófago JG04, un fago natural que tiene una homología de secuencia aproximada del 98% con un bacteriófago similar a T4, RB69. El aislamiento del bacteriófago JG04 de una muestra de una planta de tratamiento de aguas residuales se describe particularmente en los Ejemplos del presente documento. Tal y como se debate en los Ejemplos, las proteínas de la cápside gp23 (220) y gp24 (230) se encuentran en la región génica tardía (210), que contiene genes estructurales que codifican proteínas del virión. Dado que estas proteínas del virión se expresan a un nivel muy elevado, cabe esperar que todos los genes insertados en esta región tengan unos niveles de expresión similares, siempre que se utilicen promotores génicos tardíos y/u otros elementos de control similares. La estructura del bacteriófago ilustrada en la Figura 2 tiene la secuencia que se expone en SEC ID NO: 3.

Las composiciones de la invención pueden comprender diversos agentes infecciosos y/o genes indicadores. Por ejemplo, la Figura 3 muestra tres estructuras de plásmido de recombinación homólogos que portan tres genes de luciferasa diferentes. Se produjeron y utilizaron tres estructuras en recombinación con JG04 para generar el bacteriófago recombinante de la invención. Por tanto, la estructura superior de la Figura 3 muestra un plásmido de recombinación que tiene una estructura de luciferasa de luciérnaga utilizada para la inserción de recombinación homóloga de la luciferasa de luciérnaga en JG04: plásmido de recombinación homóloga pUC57.HR.Fluc, correspondiente a la SEC. ID. NO. 5. La estructura media de la Figura 3 muestra un plásmido de recombinación utilizado para la inserción de recombinación homóloga de la luciferasa NANOLUC® en JG04: plásmido de recombinación homóloga pUC57.HR.NANOLUC®, correspondiente a la SEC. ID. NO. 6; y la estructura inferior de la Figura 3 muestra un plásmido de recombinación utilizado para la inserción de recombinación homóloga de la luciferasa de camarón Oplophorus en JG04: plásmido de recombinación homóloga pUC19.HR.OpLuc.KanR, correspondiente a la SEC. ID. NO. 7.

En algunas realizaciones, el fago indicador de conformidad con la invención comprende JG04 transformado por ingeniería para que incluya cualquiera de las tres estructuras mostradas en la Figura 3. Es decir, un fago indicador que comprende la secuencia de SEC ID NO. 3, contiene además la secuencia adicional insertada entre los nucleótidos 116,555 y 119,830 de SEC ID NO. 3 correspondientes a los nucleótidos 402 - 2973 de la SEC ID NO. 5 (o una porción de esta); o los nucleótidos 402 - 1922 de la SEC ID NO. 6 (o una porción de esta), también denominado Fago Indicador JG04- NANOLUC® en los ejemplos 6 y 11 del presente documento; o los nucleótidos 2241 - 4729 de la SEC ID NO. 7 (o una porción de esta), también denominado Fago Indicador JG04-OpLuc en los Ejemplos 7-9 del presente documento. Por ejemplo, una porción de esta puede comprender la porción de luciferasa solo (es decir, nucleótidos 943 - 2595 de la SEC ID NO. 5; o los nucleótidos 943 - 1542 de la SEC ID NO. 6; o los nucleótidos 2784 - 3296 de la SEC ID NO. 7). Una porción de esta puede comprender también el promotor tardío de T430 (es decir, los nucleótidos 908 - 936 de cualquiera de las SEC ID NO. 5 o NO. 6, o los nucleótidos 2749 - 2777 de la SEC ID NO. 7). En otras realizaciones, este fago indicador está incluido en sistemas o kits de conformidad con la invención. Los métodos descritos en el presente documento también pueden utilizar este fago indicador.

La Figura 4 ilustra el aislamiento del fago recombinante de las modificaciones del bacteriófago JG04 utilizando las estructuras de plásmido que se muestra en la Figura 3 y se describen en el Ejemplo 6.

En el primer paso 402, las bacterias transformadas con plásmido de recombinación homólogo son infectadas con bacteriófago, produciendo un fago de progenie con una mezcla de fago parental y recombinante de aproximadamente 20000 de tipo salvaje 432: 1 fago recombinante 434. La mezcla de fago recombinante resultante se diluye 404 en placas de 96 pocillos 406 para obtener una media de 3 unidades de transducción (TU) recombinantes por placa, lo que se corresponde con unas 625 unidades infecciosas (IU) mayoritariamente de fago de tipo salvaje por pocillo. La placa de 96 pocillos se somete a ensayo para detectar la actividad de luciferasa a fin de identificar los pocillos 436 que contienen fago recombinante en comparación con los pocillos 440 que contienen el bacteriófago de tipo salvaje. Las bacterias 438 se añaden 408; por ejemplo, cada pocillo puede contener unos 50 pL de E. coli turbio 0157:H7. Esto permite que el fago se replique y produzca la enzima de luciferasa 442. Tras dos horas de incubación a 37°C como se muestra en 410, los pocillos se pueden analizar para detectar la presencia de luciferasa 442. Es posible que todos los pocillos positivos hayan sido inoculados con un único fago recombinante, y en esta fase la mezcla puede contener un ratio de aproximadamente 600 fagos de tipo salvaje: 1 recombinante, un enriquecimiento superior al ratio 20000:1 original. En una realización, la luciferasa soluble y el fago estaban presentes a aproximadamente un ratio de 625 de tipo salvaje: 1 recombinante. La progenie de este cultivo enriquecido 412 se puede someter a uno o varios ensayos de dilución limitadores adicionales 414 para verificar el ratio y determinar la concentración real de unidades transductoras del fago recombinante. Por ejemplo, unas 3 TU recombinantes por placa de 96 pocillos 416 pueden ser repartidas en partes iguales 414 desde el primer caldo de purificación, produciendo una inoculación aproximada de unos 20 fagos mayoritariamente de tipo salvaje por pocillo de una segunda placa de ensayo de dilución 420. Es probable que todos los pocillos de luciferasa positivos hayan sido inoculados con un único recombinante junto con unos 20 fagos de tipo salvaje. Estos pocillos pueden ser analizados para detectar la presencia de luciferasa 442.

Tras la adición de la bacteria y la incubación (por ejemplo, 37°C durante 2 horas) 418, la luciferasa soluble y el fago se encuentran presentes a un ratio aproximado de 20 de tipo salvaje: 1 recombinante 420. Por último, se puede realizar un ensayo de placa 422 para detectar recombinantes que expresan luciferasa 446. Un pequeño número de placas individuales (por ejemplo, n=48) pueden ser seleccionadas y analizadas individualmente en una tercera placa multipocillo 426 para detectar la actividad de luciferasa 436. En una realización, este enfoque debería asegurar que unos 3 recombinantes se encuentren presentes en la mezcla de placas que se van a analizar. Se puede eliminar una placa de cada una de las placas de 96 pocillos 424 y realizar un ensayo de luciferasa 426 para determinar qué pocillo contiene el fago que exhibe la actividad de luciferasa 442. Los pocillos 428 que demuestran actividad de luciferasa representan el fago recombinante puro 434, mientras que los pocillos sin actividad de luciferasa 430 representan el fago de tipo salvaje puro 432.

Las placas individuales se pueden suspender entonces en solución tampón o medio (por ejemplo, 100 uL TMS) y se puede añadir una parte alícuota (por ejemplo, unos 5 ^j L) a un pocillo que contiene un cultivo de E. coli turbio 0157:H7, y someter a ensayo tras la incubación (por ejemplo, de unos 45 minutos a una hora a 37°C). Se espera que los pocillos positivos contengan un cultivo puro de fago recombinante. Sin embargo, en determinadas realizaciones puede ser preferible incluir una ronda adicional de purificación de la placa.

Por tanto, tal y como se ejemplifica en la Figura 4, el fago recombinante generado por recombinación homóloga del plásmido de recombinación apropiado con JG04 puede ser aislado de una mezcla que contiene un 0,005% de fago total. Tras el aislamiento, se puede realizar la producción a gran escala para obtener caldos con una titulación más elevada adecuados para su uso en ensayos de detección de E. coli 0157:H7. Por ejemplo, tal y como se describe detalladamente en los Ejemplos del presente documento, se puede utilizar una centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio para separar las partículas del fago de la proteína de luciferasa contaminante para reducir la señal de fondo.

De este modo, tal y como se describe más detalladamente en los Ejemplos más abajo, se puede generar el bacteriófago recombinante que tiene el gen de luciferasa de interés (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga, de camarón Oplophorus o transformada por ingeniería como NANOLUC®) insertado en un bacteriófago obtenido del entorno.

Métodos de uso de los agentes infecciosos para detectar microorganismos

Tal y como se señala en el presente documento, en determinadas realizaciones la divulgación puede comprender métodos de uso de partículas infecciosas para detectar microorganismos. Los métodos de la invención se pueden realizar de diversas maneras.

Por tanto, los métodos de la presente divulgación utilizan la alta especificidad de los agentes de unión que reconocen y se unen a un microorganismo de interés concreto como medio para amplificar una señal y así detectar bajos niveles de un microorganismo (por ejemplo, un único microorganismo) presente en una muestra. Por ejemplo, los agentes infecciosos (por ejemplo, bacteriófago) reconocen específicamente receptores de superficie de microorganismos concretos y de este modo infectan de forma específica estos microorganismos. Por tanto, estos agentes infecciosos pueden ser agentes de unión apropiados para un microorganismo de interés diana. Algunas realizaciones de la divulgación utilizan la especificidad de unión y la capacidad de expresión genética de alto nivel de los agentes infecciosos para dirigirse de forma rápida y sensible, infectar y facilitar la detección de un microorganismo de interés.

Por tanto, en una realización la invención puede comprender un método para detectar un microorganismo de interés en una muestra que consiste en los pasos siguientes: incubar la muestra con un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés, donde el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección del microorganismo de interés resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima de luciferasa, y donde el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural; y detectar el producto de proteína indicadora, donde la detección positiva del producto de proteína indicadora indica que el microorganismo de interés está presente en la muestra.

Se pueden utilizar diversos agentes infecciosos como parte de la divulgación. En realizaciones alternativas de la divulgación, se pueden utilizar bacteriófagos, fagos, micobacteriófagos (por ejemplo, para TB y paraTB), micófagos (por ejemplo, para hongos), fagos de micoplasma y cualesquiera otros virus que puedan invadir bacterias vivas, hongos, micoplasma, protozoos, levaduras y otros organismos microscópicos vivos para dirigirse a un microorganismo de interés. En algunas realizaciones, el microorganismo de interés es una bacteria y el agente infeccioso comprende un bacteriófago. Tal y como se debate en el presente, este bacteriófago puede replicarse dentro de la bacteria para generar cientos de bacterias de la progenie. La detección del gen indicador insertado en el bacteriófago se puede utilizar como medida de la bacteria en la muestra. Por ejemplo, entre los fagos ampliamente estudiados de E. coli se incluyen Tl, T2, T3, T4, T5, T7, y lambda; otros fagos de E. coli disponibles en la colección ATCC, por ejemplo, incluyen phiX174, S13, 0x6, MS2, phiVI, fd, PR772, y ZIK1. Alternativamente, el bacteriófago natural puede ser aislado de diversas fuentes ambientales. Se puede seleccionar una fuente para el aislamiento del fago en base a la ubicación en la que se espera encontrar un microorganismo de interés. Por tanto, en algunas realizaciones de la divulgación, el bacteriófago indicador comprende una fracción indicadora y la infección de una única célula de E. coli se puede detectar en una señal amplificada generada a través de la fracción indicadora. Así pues, el método puede comprender la detección de una fracción indicadora producida durante la replicación del fago, donde la detección del indicador indica que la bacteria de interés está presente en la muestra.

En una realización, la invención puede incluir un método para detectar una bacteria de interés en una muestra que comprende los pasos de: incubar la muestra con un bacteriófago recombinante que infecta la bacteria de interés, donde el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, donde el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural; y detectar el producto de proteína indicadora, donde la detección positiva del producto de proteína indicadora significa que la bacteria de interés se encuentra presente en la muestra. En una realización, tal y como se describe detalladamente en el presente, la cantidad de la fracción indicadora detectada se corresponde con la cantidad de la bacteria de interés presente en la muestra.

En una realización, la región génica tardía es una región génica de clase III. Tal y como se describe más detalladamente en el presente, la inserción del gen indicador en la región génica tardía de clase III puede garantizar que el gen indicador se exprese en altas cantidades tras la replicación en la bacteria.

Tal y como se ha descrito anteriormente para las composiciones de la invención, el bacteriófago se obtiene de un fago T7, T4, similar a T4, JG04 u otro bacteriófago natural que tenga un genoma con una homología mínima del 90% con un fago T7, T4, u otro fago similar a T4.

Asimismo, en otras realizaciones, el gen indicador no codifica una proteína de fusión. Por tanto, en determinadas realizaciones, la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de las bacterias hospedadoras resulta en un producto de proteína indicadora soluble.

Se pueden utilizar diversas fracciones indicadoras como parte de la divulgación. En algunas realizaciones, el gen indicador puede codificar una enzima de luciferasa. Por ejemplo, la luciferasa puede ser luciferasa de camarón Oplophorus, luciferasa de luciérnaga o una luciferasa transformada por ingeniería.

Tal y como se describe detalladamente en el presente, los métodos y sistemas de la invención pueden utilizar diversas multiplicidades de infección (MOI). En determinadas realizaciones, la MOI es superior que en los ensayos estándar. Esta MOI relativamente elevada puede permitir la infección de microorganismos que se encuentran presentes en cantidades muy bajas en la muestra. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la concentración del bacteriófago para el paso de incubación es superior a 1 x 107 PFU/mL.

En determinadas realizaciones, el agente infeccioso recombinante puede ser purificado para que quede libre de toda proteína indicadora residual que se pueda generar tras la producción del caldo del agente infeccioso. Por tanto, en determinadas realizaciones, y tal y como se describe más detalladamente en el presente documento, el bacteriófago recombinante puede ser purificado utilizando centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio antes de la incubación con la muestra. Cuando el agente infeccioso sea un bacteriófago, esta purificación puede ofrecer la ventaja añadida de eliminar el bacteriófago que no tiene ADN (es decir, el fago vacío).

Tal y como se describe más abajo, en determinadas realizaciones el método puede emplear un paso por el que el microorganismo de interés es concentrado o capturado de un volumen de muestra mayor. Por tanto, en determinadas realizaciones, el método puede comprender un paso para capturar el microorganismo de la muestra en un soporte sólido antes del paso de incubación.

En algunas realizaciones, el método puede incluir poner en contacto un microorganismo capturado sobre un soporte sólido (por ejemplo, un gránulo magnético o un sustrato de filtro) con una pluralidad del agente infeccioso específico (bacteriófago indicador) y permitir que el bacteriófago se una a la bacteria y la infecte. En otras realizaciones, la captura del microorganismo no es necesaria para la detección. Se pueden utilizar diversos soportes sólidos. En determinadas realizaciones, el soporte sólido puede comprender una placa multipocillo, un filtro, un gránulo, una banda de flujo lateral, un disco de filtrado o un papel de filtro, o películas finas diseñadas para el cultivo de células (por ejemplo, PetriFilm de 3M). Otros soportes sólidos también pueden ser apropiados.

El microorganismo de interés puede ser purificado de la muestra utilizando un agente de unión. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el paso de captura comprende también la unión del microorganismo a un anticuerpo de captura. El anticuerpo se puede utilizar conjuntamente con el soporte sólido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura facilita la unión del microorganismo al soporte sólido.

El método de la invención puede comprender diversos pasos para aumentar la sensibilidad. Por ejemplo, tal y como se debate más detalladamente en el presente documento, el método puede comprender un paso para lavar el microorganismo capturado e infectado, después de añadir el bacteriófago pero antes de la incubación, para eliminar el exceso de bacteriófago parental y/o luciferasa u otra proteína indicadora que contamine la preparación del bacteriófago.

A diferencia de los ensayos conocidos en la técnica, la detección del microorganismo de interés se puede completar sin la necesidad de cultivar la muestra como forma de aumentar la población de los microorganismos. Por tanto, en determinadas realizaciones, la detección del microorganismo de interés se completa en menos tiempo que el periodo de tiempo necesario para multiplicar el número de microorganismos por cuatro o por 10 utilizando el cultivo para enriquecimiento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones el tiempo total necesario para la detección es inferior a 6,0 horas, 5,0 horas, 4,0 horas, 3,0 horas, 2,5 horas, 2,0 horas, 1,5 horas, 1,0 horas, 45 minutos o menos de 30 minutos.

Asimismo, a diferencia de los ensayos conocidos en la técnica, el método de la invención puede detectar microorganismos individuales. Por tanto, en determinadas realizaciones, el método puede detectar menos de 10 células del microorganismo (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 microorganismos) presentes en una muestra.

Por tanto, los aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos para la detección de microorganismos en una muestra de ensayo a través de una fracción indicadora. En algunas realizaciones, cuando el microorganismo de interés es una bacteria, la fracción indicadora que puede estar asociada con un agente infeccioso es un bacteriófago indicador. La fracción indicadora de la divulgación puede reaccionar con un sustrato para emitir una señal detectable o puede emitir una señal intrínseca (por ejemplo, proteína fluorescente). En algunas realizaciones, la sensibilidad de detección puede revelar la presencia de tan solo 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 células del microorganismo de interés en una muestra de ensayo. En algunas realizaciones, incluso una única célula del microorganismo de interés puede producir una señal detectable.

En algunas realizaciones de la divulgación, la fracción indicadora asociada con el agente infeccioso puede ser detectable durante o después de la replicación del agente infeccioso. En la técnica se conocen muchos tipos diferentes de biomoléculas detectables adecuadas para su uso como fracciones indicadoras y muchas de ellas están disponibles en el mercado. En algunas realizaciones de la divulgación, el fago indicador comprende una enzima, que actúa como fracción indicadora. En algunas realizaciones, el genoma del fago indicador es modificado para que codifique una proteína soluble. En algunas realizaciones de la divulgación, el fago indicador codifica una enzima detectable. El indicador puede emitir luz y/o ser detectable por un cambio de color. Hay diversas enzimas apropiadas disponibles en el mercado, tales como fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano (HRP) o luciferasa (Luc). En algunas realizaciones de la divulgación, estas enzimas pueden actuar como fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de luciérnaga es la fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de camarón Oplophorus es la fracción indicadora. En algunas realizaciones, NANOLUC® es la fracción indicadora. Otras luciferasas transformadas por ingeniería u otras enzimas que generan señales detectables también pueden resultar fracciones indicadoras apropiadas.

La detección del indicador puede incluir la detección de emisiones de luz. En algunas realizaciones, puede utilizarse un luminómetro para detectar el indicador (por ejemplo, luciferasa). Sin embargo, también se pueden utilizar otras máquinas o dispositivos. Por ejemplo, un espectrofotómetro, cámara CCD o cámara CMOS puede detectar los cambios de color y otras emisiones de luz.

En algunas realizaciones, el fago indicador es transformado por ingeniería genética para que contenga el gen para una enzima, como luciferasa, que solo se produce tras la infección de la bacteria que el fago reconoce e infecta de forma específica. En algunas realizaciones, la fracción indicadora se expresa de forma tardía en el ciclo de vida viral. En algunas realizaciones, tal y como se describe en el presente documento, el indicador es una proteína soluble (luciferasa soluble) y no se fusiona con la proteína estructural de un fago que limita su número de copias.

En diversas realizaciones de los métodos de la invención, el microorganismo se puede detectar sin ninguna purificación de los microorganismos de una muestra. Por ejemplo, en determinadas realizaciones una muestra que contiene uno o unos cuantos microorganismos de interés se puede aplicar directamente a un recipiente de ensayo, como una columna de centrifugación, una placa de microtitulación o un filtro, y el ensayo se realiza en dicho recipiente de ensayo. En el presente documento se divulgan diversas realizaciones de estos ensayos.

Por ejemplo, se pueden aplicar partes alícuotas de una muestra de ensayo que contiene bacterias a una columna de centrifugación y, tras la infección con un bacteriófago recombinante y un lavado opcional para eliminar cualquier exceso de bacteriófago, la cantidad de indicador soluble detectada será proporcional a la cantidad de bacteriófago que producen las bacterias infectadas. El Ejemplo 4 describe este ensayo.

O bien, se pueden distribuir directamente partes alícuotas de una muestra de ensayo en los pocillos de una placa multipocillo, se puede añadir un fago indicador, y tras un periodo de tiempo suficiente para la infección, se puede añadir un tampón de lisis y un sustrato para la fracción indicadora (por ejemplo, sustrato de luciferasa para un indicador de luciferasa) y someterse a ensayo para la detección de la señal indicadora. Los Ejemplos 5-6 describen realizaciones del método realizado en placas de filtro. Los Ejemplos 7-9 del presente documento describen variaciones del ensayo denominado «ensayo de no concentración».

Por ejemplo, en muchas realizaciones se utilizan placas multipocillo para realizar los ensayos. La elección de las placas (o cualquier otro recipiente en el que se pueda realizar la detección) puede afectar al paso de detección. Por ejemplo, algunas placas pueden incluir un fondo de color o blanco, que puede afectar a la detección de emisiones de luz. En términos generales, las placas blancas tienen una mayor sensibilidad pero también producen una mayor señal de fondo. Otros colores de placas pueden generar menos señal de fondo, pero también ofrecen una sensibilidad algo menor. Por otra parte, una razón de la señal de fondo es la fuga de luz de un pocillo a otro pocillo adyacente. Hay algunas placas que tienen los pocillos blancos pero el resto de la placa es negro. Esto permite una elevada señal en el interior del pocillo, pero impide la fuga de luz entre pocillos y, por tanto, puede reducir la señal de fondo. Por tanto, la elección de la placa u otro recipiente de ensayo puede influir en la sensibilidad y la señal de fondo del ensayo.

Así pues, en algunas realizaciones de la divulgación que utilizan un fago indicador, la invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés que comprende los pasos de capturar al menos un microorganismo de la muestra, incubar ese microorganismo o microorganismos con una pluralidad de fagos indicadores; dejar tiempo para la infección y replicación a fin de que se generen fagos de progenie y se exprese una fracción indicadora soluble; y detectar el fago de progenie, o preferiblemente el indicador, donde la detección del indicador demuestra que el microorganismo está presente en la muestra.

Por ejemplo, en algunas realizaciones el microorganismo de la muestra de ensayo puede ser capturado por unión a la superficie de una placa o filtrando la muestra a través de un filtro bacteriológico (por ejemplo, un filtro de placa o filtro de centrifugación con un tamaño de poro de 0,45 |jm). En una realización, el agente infeccioso (fago indicador) se añade en un volumen mínimo a la muestra capturada directamente sobre el filtro. En una realización, el microorganismo capturado sobre el filtro o la superficie de la placa es posteriormente lavado una o más veces para eliminar el exceso de agente infeccioso no unido. En una realización, se añaden medios (por ejemplo, Luria-Bertani también denominado caldo LB en el presente documento) para aumentar el tiempo de incubación y permitir la replicación del fago y una expresión de alto nivel del gen que codifica la fracción indicadora. Sin embargo, un aspecto sorprendente de las realizaciones del ensayo es que el paso de incubación solo necesita prolongarse lo suficiente para un único ciclo de vida del fago. Antes se creía que la potencia de amplificación al utilizar un bacteriófago requería más tiempo, para que el fago se replicase durante varios ciclos. Una única replicación del fago indicador es suficiente para facilitar una detección sensible y rápida, de conformidad con algunas realizaciones de la presente invención.

El indicador soluble (luciferasa) se libera en el líquido que lo rodea tras la lisis de la bacteria, que posteriormente puede ser medida y cuantificada. En una realización, la solución es posteriormente centrifugada a través del filtro y se recoge el filtrado para someterlo a ensayo mediante la adición de un sustrato para la enzima indicadora (sustrato de luciferasa). Por tanto, el filtrado se puede retirar del soporte sólido de captura y analizarse en un nuevo receptáculo (por ejemplo, en un luminómetro) o la señal indicadora se puede medir directamente sobre el filtro. En diversas realizaciones, el fago indicador parental purificado no comprende el indicador detectable por sí mismo, porque el fago parental puede ser purificado antes de ser utilizado para la incubación con una muestra de ensayo. La expresión de genes tardíos (clase III) se produce más avanzado el ciclo de vida viral. En algunas realizaciones de la presente invención, el fago parental puede ser purificado para excluir cualquier proteína indicadora existente (luciferasa). En algunas realizaciones, la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago de la progenie tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble. Por tanto, en muchas realizaciones no es necesario separar el fago parental del fago de progenie en el paso de detección. En una realización, el microorganismo es una bacteria y el fago indicador es un bacteriófago. En una realización, la fracción indicadora es luciferasa soluble, que se libera tras la lisis del microorganismo hospedador. Por tanto, en una realización alternativa, el sustrato indicador puede ser incubado con la porción de la muestra que permanece unida a un filtro o unida a la superficie de una placa. Por consiguiente, en algunas realizaciones el soporte sólido es una placa de filtro de 96 pocillos (o una placa de 96 pocillos normal) y la reacción del sustrato se puede detectar colocando la placa directamente en el luminómetro.

Por ejemplo, en una realización la invención puede incluir un método para detectar E. coli O157:H7 que comprende los pasos de: infectar las células capturadas en una placa de filtro de 96 pocillos con una pluralidad de fagos indicadores parentales capaces de expresar luciferasa tras la infección; lavar el exceso de fago; añadir caldo LB y dejar tiempo para que el fago se replique y se produzca la lisis del E. coli específico (por ejemplo, 30-90 minutos); y detectar la luciferasa indicadora añadiendo sustrato de luciferasa y midiendo la actividad de la luciferasa directamente en la placa de 96 pocillos, donde la detección de actividad de luciferasa indica que el E. coli 0157:H7 está presente en la muestra.

En otra realización la invención puede incluir un método para detectar E. coli O157:H7 que comprende los pasos de: infectar las células en solución líquida o suspensión en una placa de 96 pocillos con una pluralidad de fagos indicadores parentales capaces de expresar luciferasa tras la infección; dejar tiempo para que el fago se replique y se produzca la lisis del E. coli específico (por ejemplo, 30-90 minutos); y detectar la luciferasa indicadora añadiendo sustrato de luciferasa y midiendo la actividad de la luciferasa directamente en la placa de 96 pocillos, donde la detección de actividad de luciferasa indica que el E. coli 0157:H7 está presente en la muestra. En esta realización no es necesario ningún paso de captura. En algunas realizaciones, la solución líquida o suspensión puede ser una muestra de ensayo consumible, como un lavado vegetal. En algunas realizaciones, la solución líquida o suspensión puede ser un lavado vegetal reforzado con caldo LB concentrado o caldo Nutrient Broth. En algunas realizaciones, la solución líquida o suspensión pueden ser bacterias diluidas en caldo LB.

En algunas realizaciones, la lisis del microorganismo se puede producir antes, durante o después del paso de detección. Los experimentos sugieren que las células no lisadas infectadas pueden resultar detectables tras la adición de sustrato de luciferasa en algunas realizaciones. Presumiblemente la luciferasa puede salir de las células y/o el sustrato de luciferasa puede entrar en las células sin una lisis celular completa. Por tanto, para las realizaciones que utilizan el sistema de filtro de centrifugación, en las que solo se analiza la luciferasa liberada en el lisado (y no la luciferasa que todavía se encuentra dentro de las bacterias intactas) en el luminómetro, la lisis resulta necesaria para la detección. Sin embargo, para las realizaciones que utilizan placas de filtro o placas de 96 pocillos con muestra en solución o suspensión, en las que la placa original llena de células intactas y sometidas a lisis se somete a ensayo directamente en el luminómetro, la lisis no resulta necesaria para la detección.

En algunas realizaciones, la reacción de la fracción indicadora (luciferasa) con sustrato puede continuar durante 30 minutos o más y la detección en diversos puntos temporales puede resultar recomendable para optimizar la sensibilidad. Por ejemplo, en realizaciones que utilizan placas de filtro de 96 pocillos como soporte sólido y luciferasa como indicador, las lecturas del luminómetro se pueden tomar inicialmente y a intervalos de 10 o 15 minutos hasta que la reacción se haya completado.

Sorprendentemente, las altas concentraciones de fago utilizadas para infectar muestras de ensayo (es decir, alta MOI) han conseguido detectar con éxito cantidades muy bajas del microorganismo diana en un plazo de tiempo muy corto. La incubación del fago con una muestra de ensayo en algunas realizaciones solo necesita prolongarse lo suficiente para un único ciclo de vida del fago. En algunas realizaciones, la concentración de bacteriófago para este paso de incubación es superior a 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1,0 x 107, 1,1 x 107, 1,2 x 107, 1,3 x 107, 1,4 x 107, 1,5 x 107, 1,6 x 107, 1,7 x 107, 1,8 x 107, 1,9 x 107, 2,0 x 107, 3,0 x 107, 4,0 x 107, 5,0 x 107, 6,0 x 107, 7,0 x 107, 8,0 x 107, 9,0 x 107,o 1,0 x 108 PFU/mL.

El éxito con estas concentraciones elevadas de fago resulta sorprendente porque las grandes cantidades de fago se asociaban anteriormente con una «lisis desde fuera», que mataba las células diana y por tanto impedía la generación de una señal útil de los ensayos con fagos realizados. Es posible que la limpieza del caldo de fago preparado que se describe en el presente documento ayude a mitigar este problema (por ejemplo, lavado por ultracentrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio), porque además de eliminar cualquier luciferasa contaminante asociada con el fago, esta limpieza también puede retirar las partículas fantasma (partículas que tienen ADN perdido). Las partículas fantasma pueden lisar las células bacterianas mediante «lisis desde fuera», matando las células de forma prematura y, por tanto, evitando la generación de la señal indicadora. La microscopía de electrones demuestra que un lisado de JG04 bruto (es decir, antes de la limpieza con cloruro de cesio) puede tener más de un 50% de fantasmas. Estas partículas fantasma pueden contribuir a la muerte prematura del microorganismo por la acción de múltiples partículas del fago que perforan la membrana celular. Por tanto, es posible que las partículas fantasma hayan contribuido a los problemas anteriores en los que se documentaba que unas concentraciones de PFU elevadas resultaban perjudiciales. Por otra parte, una preparación de fago muy limpia permite realizar el ensayo sin pasos de lavado, lo que hace posible el «ensayo de no concentración»

Ensayos en columna de centrifugación

La Figura 5 muestra una estrategia de uso del fago indicador que produce luciferasa soluble de conformidad con una realización de la invención. En este método, el fago (por ejemplo, el fago T7, T4 o JG04) puede ser transformado por ingeniería para expresar una luciferasa soluble durante la replicación del fago. La expresión de luciferasa es provocada por un promotor de la cápside viral (por ejemplo, el promotor tardío del bacteriófago T7 o T4), que produce una elevada expresión. El fago parental estará libre de luciferasa, por lo que la luciferasa detectada en el ensayo debe proceder de la replicación del fago de progenie durante la infección de las células bacterianas. Por tanto, generalmente no es necesario separar el fago parental del fago de la progenie.

En estos experimentos, al menos parte de la muestra 500 que comprende la bacteria E. coli 502 a cuantificar se coloca en el filtro de una columna de centrifugación y se centrifuga para eliminar el caldo LB, y se añade una multiplicidad apropiada del fago T7504 transformado por ingeniería genética para expresar -luciferasa soluble 503. Las células infectadas se pueden incubar durante un tiempo suficiente para que se produzca la replicación del fago de la progenie y la lisis celular (por ejemplo, 30-90 minutos a 37 °C). El fago parental 504 y el fago de la progenie 516 más la luciferasa libre 503 del lisado se pueden recopilar entonces, por ejemplo por centrifugación, y se puede cuantificar el nivel de luciferasa del filtrado utilizando un luminómetro 518. Alternativamente, se puede emplear un método de alto rendimiento en el que las muestras bacterianas se aplican a una placa de filtro de 96 pocillos y, una vez que se han realizado todas las manipulaciones anteriormente indicadas, se pueden someter directamente a ensayo para detectar la luciferasa en la placa de filtro de 96 pocillos original sin un paso de centrifugación final. Los datos de los ejemplos de experimentos de las realizaciones de la invención se muestran en las Figuras 6-9. Los resultados demuestran realizaciones alternativas de la invención utilizando el fago indicador para someter a ensayo las bacterias de la muestra mediante la detección de luciferasa soluble producida por la infección de las bacterias con el fago indicador. El nivel de detección del indicador calibrado como unidades de luz relativas (RLU) se traza en relación a las concentraciones de células determinadas por el ensayo overnight estándar de unidad formadora de colonias (CFU) que se expresan como «células por ensayo» demostrando así una sensibilidad similar. El aumento de la señal de luciferasa se corresponde con el aumento de las células de la muestra introducida, lo que demuestra una respuesta dependiente de la dosis.

Tal y como se muestra en la Figura 6, el método de la invención puede demostrar una alta sensibilidad para la detección de bacterias diana utilizando el fago indicador con filtros de una columna de centrifugación. En este ensayo, se puede recopilar una muestra de ensayo en un filtro de centrifugación mediante centrifugación e incubarse con el fago indicador que comprende un gen para luciferasa soluble (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1). Tras la incubación durante un tiempo suficiente para la infección (por ejemplo, 10 minutos a temperatura ambiente), el filtro se puede lavar y centrifugar para eliminar el exceso de fago aportado. Se pueden añadir medios (por ejemplo, caldo LB) e incubarse (por ejemplo, durante 30 minutos a 37 °C) para permitir la replicación del fago de la progenie y la lisis de las bacterias. Los filtros se pueden centrifugar de nuevo para eliminar el filtrado, que se puede transferir a una placa del luminómetro, y realizar un ensayo de luciferasa (por ejemplo, utilizando un luminómetro Promega® con inyección de Luciferase Assay Reagent, Promega, Inc.). El recuento de células se puede corregir en función del número de colonias del ensayo de CFU paralelo.

Tal y como se muestra en la Figura 6, se pueden detectar aproximadamente 1700 células bacterianas en la muestra original, y un posterior ensayo de diluciones en serie puede demostrar la detección hasta una media de 1,7 células, que se corresponde con una detección real de una o dos células. Esto muestra que la infección de tan solo una a tres células de E. coli puede proporcionar una señal detectable, a través de la actividad de luciferasa. Esto demuestra también importancia estadística para la presencia o ausencia de incluso una única célula sobre el fondo (valor p = 0,018).

La Figura 7 demuestra el enorme rango de detección del mismo método descrito para el ensayo de la Figura 5 utilizando diluciones en serie con un rango más amplio de números de células. Esto pone de manifiesto que la detección puede oscilar en un rango medio de 1,4 células a 14 millones de células.

Ensayos en placa de filtro

Como se ha señalado anteriormente, en determinadas realizaciones el ensayo se puede realizar directamente en el pocillo de una placa de ensayo de microtitulación. Por ejemplo, la Figura 8 demuestra el uso del fago indicador con una placa de filtro de 96 pocillos para la captura y detección. El método es el mismo que el que se ha descrito anteriormente para la Figura 5, salvo por el hecho de que el ensayo completo se realiza en una placa de filtro de 96 pocillos, incluyendo la reacción de luciferasa. Esta realización reduce las manipulaciones y los materiales en comparación con el método del filtro de centrifugación. La reducción de las manipulaciones y el uso de una placa de filtro de 96 pocillos son apropiados para una situación de ensayo de alto rendimiento y se pueden adaptar para el uso con un robot de manipulación de líquidos de conformidad con las realizaciones de la invención. La Figura 8 muestra que en esta realización se puede utilizar una placa de filtro de 96 pocillos para detectar células únicas de E. coli (una media de 0,5 células sometidas a ensayo, lo que confirma que aproximadamente la mitad de los pocillos recibieron células únicas), 5,4 y 54 células.

La Figura 9 demuestra que en determinadas realizaciones se puede alcanzar un rango muy importante de detección de concentraciones de células para el mismo ensayo utilizando el sistema de 96 pocillos, desde menos de 1 célula por ensayo de media (células únicas) hasta al menos 14 millones de células por ensayo. Múltiples lecturas en diferentes puntos temporales tras la adición del sustrato de luciferasa pueden demostrar variaciones de sensibilidad. La sensibilidad para detectar menos de 10 células se consiguió con una lectura a los 15 minutos y la sensibilidad hasta de células individuales se puede conseguir en una lectura a los 30 minutos. Por tanto, se puede ahorrar tiempo si no es necesario detectar decenas de células o menos. Cabe destacar que la señal aumenta en respuesta a un mayor número de células en la muestra aportada en ambos experimentos, lo que demuestra una vez más una respuesta dependiente de la dosis.

La Figura 10 ilustra un ensayo de placa de filtro para detectar bacterias de interés utilizando un bacteriófago modificado de conformidad con una realización de la invención. Un experimento real utilizando este ensayo se describe en el Ejemplo 6. En resumen, las muestras 1016 que incluyen una bacteria de interés 1018 se pueden añadir a pocillos 1002 de una placa de filtro multipocillo 1004 y centrifugarse 1006 para concentrar las muestras por eliminación del líquido de la muestra. El fago genéticamente modificado 1020 se añade a los pocillos y se incuba con medios adicionales añadidos durante un tiempo suficiente para la absorción 1008, seguida de la infección de bacterias diana y del avance del ciclo de vida del fago 1010 (por ejemplo, unos 45 minutos). Por último, se añade el sustrato de luciferasa y reacciona con cualquier luciferasa presente 1024. La emisión resultante se mide en un luminómetro 1014 que detecta la actividad de luciferasa 1026. La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de placa de filtro descrito en la Figura 10, utilizando el fago JG04-NANOLUC® para detectar células de E. coli 0157:H7 en muestras con un número de células conocido. La prueba t de Student demostró un valor p de 0,034 entre 0 células y 1 célula por ensayo, demostrando importancia estadística.

En determinadas realizaciones el ensayo se puede realizar sin concentrar la bacteria en la superficie de captura o cerca de esta. La Figura 12 ilustra un «ensayo de no concentración» para detectar una bacteria de interés utilizando un bacteriófago modificado de conformidad con una realización de la invención. Se distribuyen partes alícuotas del fago indicador 1214 en los pocillos individuales 1202 de una placa multipocillo 1204 y, a continuación, se añaden partes alícuotas de la muestra de ensayo que contiene las bacterias 1212 y se incuban 1206 (por ejemplo, 45 minutos a 37 °C) durante un periodo de tiempo suficiente para que el fago se replique y genere el indicador soluble 1216 (por ejemplo, luciferasa). Los pocillos de la placa 1208 que contienen indicador soluble y fago pueden someterse entonces a ensayo 1210 para medir la actividad del indicador en la placa 1218 (por ejemplo, ensayo de luciferasa). Los experimentos reales utilizando este método se describen en los Ejemplos 7-9. En esta realización las muestras de ensayo no se concentran (por ejemplo, por centrifugación) sino que simplemente se incuban directamente con el fago indicador durante un periodo de tiempo y posteriormente se someten a ensayo para detectar la actividad de luciferasa.

La Figura 13 muestra los resultados de un ensayo de tipo «ensayo de no concentración» como el ilustrado en la Figura 12, utilizando el fago JG04-OpLuc para detectar células de E. coli O157:H7 en muestras con números de células conocidos en el rango de un número bajo (es decir, muestras de células muy diluidas). Este experimento, tal y como se describe en el Ejemplo 7, demuestra que se pueden observar diferencias estadísticamente significativas entre la señal de 0 células y 1 célula por ensayo (valor p = 0,0024 por ensayo ANOVA), lo que pone de manifiesto la capacidad de detectar células únicas. Por tanto, el ensayo resulta sorprendentemente sensible. Las muestras con menos de una célula por pocillo parecen mostrar un número proporcional de pocillos por encima de la señal de fondo.

La Figura 14 muestra los resultados de un «ensayo de no concentración» utilizando el fago JG04-OpLuc para detectar células de E. coli O157:H7 en muestras con números de células conocidos en el rango de un número muy bajo a uno muy alto (es decir, muestras que contienen menos de una célula por ensayo hasta otras que contienen millones de células). Este experimento, tal y como se describe en el Ejemplo 8, demuestra que se pueden observar diferencias estadísticamente significativas entre la señal de 0 células y 1,1 célula por ensayo (valor p = 0,000702 por prueba t de Student), lo que pone de manifiesto la capacidad de detectar células únicas. Un mayor número de células bacterianas por ensayo muestra una mayor señal de manera dependiente de la dosis, hasta al menos 106 células bacterianas por ensayo, demostrando sorprendentemente un rango de detección muy amplio.

La Figura 15 muestra los resultados de un «ensayo de no concentración» utilizando el fago JG04-OpLuc para detectar células de E. coli 0157:H7 en muestras de lavado vegetal con números de células conocidos, tal y como se describe en el Ejemplo 9.

Para preparar el lavado vegetal, las hojas de vegetales (por ejemplo, espinacas o lechuga) se pueden pesar y añadir a una bolsa de plástico limpia. Se añadió un mililitro de LB (+/- 0,01 - 0,05% Tween20) por cada gramo (g) de vegetales. Las hojas y la solución se mezclaron manualmente durante unos minutos. A continuación se extrajo el líquido de la bolsa de plástico y se utilizó como «lavado vegetal». Utilizando este método, se averiguó que aproximadamente un millón de bacterias residen en una única hoja de espinaca (1-2 g).

El ensayo es cuantitativo en el sentido de que la señal detectada es proporcional a la cantidad de microorganismos de interés en la muestra. Por ejemplo, en el experimento ilustrado en la Figura 15, se añadieron números conocidos de células de E. coli 0157:H7 a muestras del lavado vegetal para simular la contaminación de los vegetales con bacterias patógenas. El experimento utilizando muestras de lavado vegetal pone de manifiesto claras diferencias entre la señal de 0 células y 3 células por ensayo, demostrando la capacidad para detectar números de células de un solo dígito en el lavado vegetal. El uso de más células bacterianas por ensayo demuestra un aumento de la señal de manera dependiente de la dosis. El lavado vegetal contiene aproximadamente 106 bacterias no diana/mL, lo que se corresponde con al menos 105 bacterias no diana por muestra en este ensayo (incluyendo las 0 células del control de E. coli 0157:H7). La capacidad para distinguir incluso 3 células bacterianas diana de 105 bacterias no diana es sorprendente y pone de manifiesto una vez más la especificidad del ensayo.

Captura del microorganismo antes de la exposición al agente infeccioso

En algunas realizaciones, la presente invención comprende métodos y sistemas que no requieren un paso para la captura de microorganismos. Otras realizaciones permiten el aislamiento físico de células bacterianas de una muestra. Los métodos descritos en el presente documento pueden servir como medio para facilitar la detección de bajos niveles de un microorganismo (por ejemplo, un único microorganismo) presente en una muestra. Un paso de captura se puede basar en un agente de unión específico, como un anticuerpo que reconoce el microorganismo de interés, o se puede basar en la selección de otras características del microorganismo, como el fraccionamiento por tamaño.

En algunas realizaciones, un microorganismo se captura en base a las características físicas distintas de la especificidad molecular (por ejemplo, el tamaño). En algunas realizaciones la presente invención utiliza el tamaño físico del microorganismo para capturarlo sobre un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido es un filtro. Por ejemplo, el filtrado de una muestra a través de un filtro bacteriológico (por ejemplo, un filtro de centrifugación con un tamaño de poro de 0,45 pm) permite pasar las sustancias más pequeñas y retener las bacterias intactas. Alternativamente se puede utilizar el filtro de una placa para capturar un microorganismo o varios otros dispositivos de filtrado (por ejemplo, una placa de filtro de 96 pocillos).

Por ejemplo, el método puede incluir el paso de recopilar el microorganismo sobre un soporte sólido, por ejemplo filtrando una muestra a través de un filtro bacteriológico. Tras la captura basada en el tamaño, se puede emplear cualquier agente de unión dirigido específicamente al microorganismo de interés. Por ejemplo, se puede incubar un agente infeccioso con el microorganismo capturado, para detectar e identificar específicamente el microorganismo de interés.

Se pueden emplear otros métodos para aislar los microorganismos en la muestra. En algunas realizaciones los pasos de detección se pueden realizar antes, durante o después de dichos pasos de captura.

En algunas realizaciones, se pueden utilizar agentes de unión con una alta especificidad para un microorganismo de interés como medio para facilitar la captura específica de bajos niveles de un microorganismo (por ejemplo, un único microorganismo) presente en una muestra. En algunas realizaciones, puede ser necesario concentrar eficazmente un gran volumen de una muestra líquida a analizar antes de someterla a ensayo.

Por ejemplo, una única bacteria, que puede tener un volumen aproximado de un micrómetro cúbico, se puede aislar de una muestra de un mililitro que tiene un volumen de 1012 micrómetros cúbicos. En estas realizaciones el paso de captura puede incluir poner en contacto la muestra con una pluralidad (un exceso) de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de captura purificados por afinidad.

Algunas realizaciones utilizan anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos de superficie purificados por afinidad y/o purificación inversa generados contra moléculas antigénicas encontradas en la superficie de un microorganismo de interés específico. Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden identificar específicamente un microorganismo para los fines de la captura o detección o ambos. Los anticuerpos que demuestran un reconocimiento específico de antígenos de superficie en una amplia variedad de bacterias u otros microorganismos se pueden obtener en el mercado de diversas fuentes, tales como Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (KPL) o Abcam.

En algunas realizaciones de la invención los anticuerpos específicos de superficie purificados por afinidad y/o purificación inversa que reconocen los antígenos de superficie microbianos de un microorganismo concreto (por ejemplo, E.coli O157:H7) no reconocen otros microorganismos similares (por ejemplo, E.coli B). En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos para, por ejemplo, E. coli B o E. coli 0157:H7 no reconocen células de Salmonella typhimurium o Staphylococcus epidermidis. Esto representa otro descubrimiento sorprendente, dado que muchas bacterias tienen, por ejemplo moléculas de lipopolisacárido de superficie (bacterias gramnegativas) o ácido lipoteicoico (bacterias grampositivas) que anteriormente se consideraban muy similares, especialmente entre especies estrechamente relacionadas.

Los métodos de captura basados en anticuerpos divulgados en el presente documento pueden ser adaptados a cualquier bacteria u otro microorganismo de interés (por ejemplo, microorganismos patógenos) para los que existen anticuerpos específicos de superficie disponibles que no presentan reacciones cruzadas con otros microorganismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un paso de captura de la invención puede utilizar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de captura que son específicos para el microorganismo, a fin de facilitar la captura del microorganismo. En algunas realizaciones, se pueden conjugar anticuerpos de captura con una fracción química que se une a otro agente de unión que se encuentra sobre un soporte sólido (por ejemplo, gránulos o la superficie de una placa). Por ejemplo, en algunas realizaciones el anticuerpo de captura puede ser biotinilado para facilitar la unión a estreptavidina unida a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende gránulos magnéticos. En otras realizaciones, un soporte sólido comprende la superficie de una placa o superficies de una placa multipocillo (por ejemplo, una placa ELISA). Por ejemplo, una placa LISA puede estar recubierta con un anticuerpo que reconoce específicamente el microorganismo de interés.

En determinadas realizaciones el microorganismo puede ser aislado de otros componentes de la muestra mediante la unión del microorganismo a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de captura libre que posteriormente se une a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de captura comprende un agente de unión (por ejemplo, biotina) que se une a un segundo agente (por ejemplo, estreptavidina) unido a un soporte sólido.

En algunas realizaciones, por ejemplo, si el anticuerpo de captura está etiquetado con biotina, el método puede consistir también en poner en contacto la muestra con una pluralidad de gránulos magnéticos recubiertos de estreptavidina para que se unan al complejo bacteria-anticuerpo, y en aislar el complejo gránulo-anticuerpo-bacteria con un imán para aislar las bacterias. También se pueden utilizar otros métodos de purificación del complejo biotinaanticuerpo-bacteria. Con estas realizaciones, una bacteria en una muestra de un milímetro se puede concentrar en aproximadamente un microlitro (unas 1000 veces), facilitando así los métodos de detección y/o cuantificación descritos en el presente.

Por tanto, en algunas realizaciones la invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés donde el paso de captura comprende aislar específicamente el microorganismo de otros componentes de la muestra.

Alternativamente, en algunas realizaciones el paso de captura se puede basar en otras características del microorganismo de interés, como el tamaño. En realizaciones que utilizan la captura basada en el tamaño, el soporte sólido puede ser el filtro de una columna de centrifugación. En algunas realizaciones el soporte sólido comprende una placa de filtro de 96 pocillos. Alternativamente, el soporte sólido para captura puede ser una ubicación en un alineamiento, o un soporte móvil, como un gránulo.

Por tanto, en algunas realizaciones un microorganismo diana puede ser capturado y aislado de un gran volumen antes de la detección utilizando los métodos anteriormente descritos. Por ejemplo, el microorganismo puede ser aislado específicamente utilizando atributos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de captura. En algunas realizaciones el anticuerpo de captura es biotinilado de forma que facilite la posterior unión de complejos célulaanticuerpo a gránulos magnéticos de estreptavidina. La biotina del anticuerpo se puede unir con fuerza a la estreptavidina en el gránulo magnético. Alternativamente, el anticuerpo de captura se puede conjugar con otra proteína u otra molécula, que facilita la captura en los gránulos u otro soporte sólido. Estas realizaciones pueden proporcionar una mayor sensibilidad, en particular cuando el volumen inicial de la muestra es grande. Por tanto, el método puede comprender los pasos de unir una pluralidad de agentes de unión que se pueden unir específicamente a un antígeno de superficie en el microorganismo de interés, que facilita de este modo la unión a un soporte sólido de captura.

Alternativamente se puede utilizar otra fracción química que se une al anticuerpo anti-bacteria para recubrir los gránulos magnéticos. Por ejemplo, se puede utilizar un gránulo recubierto con un anticuerpo secundario que reconoce o se une al anticuerpo anti-bacteria. Entonces se pueden aislar las bacterias unidas a los gránulos. En una realización, la eficiencia de captura se puede cuantificar colocando en una placa las bacterias unidas a los gránulos y la fracción del supernatante no unida, y haciendo un recuento de las colonias resultantes (CFU). En otras realizaciones, la señal generada por reacción con sustrato (es decir, reactivo del sustrato para la fracción indicadora) se mide para la detección.

En algunas realizaciones, la especificidad de los anticuerpos se demuestra utilizando la captura específica en un

soporte sólido. Un método de la invención puede comprender el paso de recuperar y concentrar un microorganismo

(por ejemplo, una bacteria) de una muestra, utilizando un sustrato con un agente de unión específico para el microorganismo. En una realización, el agente de unión es inmovilizado sobre un soporte sólido (por ejemplo, gránulos magnéticos) o está libre y posteriormente se inmoviliza sobre un soporte sólido. A continuación, se puede

retirar el microorganismo inmovilizado de la muestra (por ejemplo, por aspiración, decantación, fuerza magnética u

otras técnicas de aislamiento apropiadas) y detectarse a través de diversas técnicas.

La Figura 16 ilustra una realización de ejemplo de captura específica de E.coli O157:H7 pero no E. coli B o S. typhimurium en muestras, utilizando anticuerpos producidos contra E. coli O157:H7 intacta. Por tanto, en diversas realizaciones los gránulos magnéticos recubiertos con estreptavidina se pueden utilizar para aislar E. coliO157:H7 preincubada con anticuerpos policlonales biotinilados libres (KPL), purificados por afinidad y purificación inversa para minimizar la reactividad cruzada con otras especies microbianas. En determinadas realizaciones, la E. coli O157:H7

solo estará presente en la fracción capturada (es decir, fracción del gránulo) cuando se hayan utilizado anticuerpos específicos para E. coli O157:H7 y no se recuperará ninguna bacteria en la fracción supernatante (no unida). En determinadas realizaciones las células de E. coli B y S. typhimurium se encuentran solo en la fracción supernatante

cuando se utilizan anticuerpos específicos para E. coli O157:H7, lo que pone de manifiesto la destacada especificidad de estos anticuerpos. En ausencia de anticuerpo, los tres tipos de bacterias se encontraron en la

fracción supernatante.

Ensayo de inmunofago híbrido (HIP)

En determinadas realizaciones los métodos de la presente invención combinan el uso de un agente de unión (por ejemplo, anticuerpo) para purificar y/o concentrar un microorganismo de interés de la muestra, además de para la detección de un agente infeccioso. Por ejemplo, en determinadas realizaciones la presente invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés en una muestra que comprende los pasos siguientes: capturar el microorganismo de la muestra en un soporte previo utilizando un anticuerpo de captura específico para el microorganismo de interés; incubar la muestra con un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de

interés, donde el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de

la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble; y detectar el producto de proteína indicadora, donde la detección positiva del producto de proteína indicadora indica que el microorganismo de interés

se encuentra presente en la muestra.

Por ejemplo, la Figura 17 ilustra un ensayo de inmunofago híbrido (HIP) para detectar una bacteria de interés utilizando un bacteriófago modificado de conformidad con una realización de la invención. La muestra se aplica primero al pocillo de la placa de microtitulación recubierto de anticuerpos específicos de bacteria 1702. A continuación la placa se centrifuga para facilitar la unión de la bacteria a los anticuerpos de captura 1704. Cuando ha transcurrido un tiempo suficiente para la captura completa de la bacteria, se añade una solución que contiene NANOLUC®-fago específico de bacteria a cada muestra 1706. La incubación con el fago provoca la unión y el acoplamiento de uno o varios fagos a la bacteria capturada 1708. Por último, la muestra se incuba para facilitar la replicación del fago y la expresión de luciferasa, lo que provoca la lisis celular y la liberación de luciferasa soluble

1710.

La Figura 18 muestra los resultados de un ensayo HIP utilizando el fago JG04-NANOLUC® para detectar células de

E. coli O157:H7 en muestras con números de células conocidos, tal y como se describe en el Ejemplo 11, a escala logarítmica. El ensayo HIP fue capaz de detectar 100 y 1000 células de E. coli O157:H7 en medios LB con aproximadamente 2 x 106 PFU de fago JG04-NANOLUC®. La señal media con respecto a una muestra sin células oscilaba entre aproximadamente 50 veces más para la muestra de 100 células a más de 1000 veces más para la muestra de 1000 células.

En algunas realizaciones el paso de incubación de los métodos descritos en el presente documento comprende una concentración de bacteriófago final superior a 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 10 x 107, 1,1 x 107, 1,2 x 107 1,3 x

107, 1,4 x 107, 1,5 x 107, 1,6 x 107, 1,7 x 107, 1,8 x 107, 1,9 x 107, 2,0 x 107, 3,0 x 107, 4,0 x 107, 5,0 x 107, 107, 7,0 x 107, 8,0 x 107, 9,0 x 107, o 1,0 x 108 PFU/mL. Anteriormente se suponía que esta elevada concentr fago era perjudicial para este ensayo, por lo que produce resultados sorprendentes. En algunas realizaciones, los métodos de la invención requieren menos de 3 horas, menos de 2,5 horas, menos de 2 horas, menos de 1,5 horas o menos de 1 hora para la detección de un microorganismo de interés. En algunas realizaciones, los métodos pueden detectar incluso 100, 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 células del microorganismo de interés. Estos plazos de tiempo

son más cortos de lo que se considera posible anteriormente. En algunas realizaciones, se puede detectar incluso

una única célula del microorganismo. En realizaciones adicionales, la invención incluye sistemas (por ejemplo, sistemas informáticos, sistemas automáticos o kits) que comprenden componentes para realizar los métodos divulgados en el presente documento y/o que utilizan los agentes infecciosos modificados que se describen en el presente documento.

Sistemas y kits de la divulgación

En algunas realizaciones la divulgación incluye sistemas (por ejemplo, sistemas automáticos o kits) que comprenden componentes para realizar los métodos divulgados en el presente documento. Algunas realizaciones de la divulgación descrita en el presente documento resultan particularmente adecuadas para la automatización o los kits, dada la cantidad mínima de reactivos y materiales que se requieren para realizar los métodos. En determinadas realizaciones de la divulgación, cada uno de los componentes del kit puede comprender una unidad autónoma que se puede llevar de un primer sitio a un segundo sitio.

En algunas realizaciones de la divulgación, la invención comprende un sistema o kits para la detección rápida de un microorganismo de interés en una muestra. El sistema o los kits pueden en determinadas realizaciones de la divulgación comprender un componente para incubar la muestra con un agente infeccioso específico para el microorganismo de interés, donde el agente infeccioso comprende una fracción indicadora y un componente para detectar la fracción indicadora. En algunas realizaciones tanto de los sistemas como de los kits de la divulgación, el agente infeccioso es un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés y el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago en tanto que fracción indicadora, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de las bacterias hospedadoras resulta en un producto de proteína indicadora soluble. Algunos sistemas comprenden además un componente para capturar el microorganismo de interés sobre un soporte sólido.

En determinadas realizaciones de la divulgación, los sistemas y/o kits pueden comprender también un componente para lavar la muestra del microorganismo capturado. Adicional o alternativamente, los sistemas y/o kits pueden comprender también un componente para determinar la cantidad de la fracción indicadora, donde la cantidad de fracción indicadora detectada se corresponde con la cantidad de microorganismo en la muestra. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la divulgación, el sistema o kit puede comprender un luminómetro u otro dispositivo para medir la actividad de la enzima de luciferasa.

En algunos sistemas y/o kits, se puede utilizar el mismo componente para múltiples pasos. En algunos sistemas y/o kits, los pasos están automatizados o controlados por el usuario a través de los datos introducidos en un ordenador y/o donde un robot de manipulación de líquidos realiza al menos un paso.

Por tanto, en determinadas realizaciones, la invención puede incluir un sistema para la detección rápida de un microorganismo de interés en una muestra, donde el sistema comprende: un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés, donde el bacteriófago recombinante incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago en calidad de fracción indicadora, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural; un componente para incubar la muestra con el bacteriófago recombinante específico para el microorganismo de interés; un componente para capturar el microorganismo de la muestra sobre un soporte sólido; un componente para lavar la muestra del microorganismo capturado para eliminar el agente infeccioso no unido; y un componente para detectar la fracción indicadora. En algunas realizaciones, se puede utilizar el mismo componente para los pasos de captura y/o incubación y/o lavado. Algunas realizaciones comprenden adicionalmente un componente para determinar la cantidad del microorganismo de interés en la muestra, donde la cantidad de la fracción indicadora detectada se corresponde con la cantidad de microorganismo en la muestra. Estos sistemas pueden incluir diversas realizaciones y subrealizaciones análogas a las anteriormente descritas para los métodos de detección rápida de microorganismos. El microorganismo es una bacteria y el agente infeccioso es un bacteriófago. En un sistema informatizado, el sistema puede estar totalmente automatizado, semiautomatizado o dirigido por el usuario a través de un ordenador (o alguna combinación de estos).

En algunas realizaciones, el sistema puede comprender un componente para aislar el microorganismo de interés de otros componentes de la muestra.

En una realización, la divulgación incluye un sistema que comprende componentes para detectar un microorganismo de interés que comprende lo siguiente: un componente para aislar al menos un microorganismo de otros componentes en la muestra; un componente para infectar al menos un microorganismo con una pluralidad de un agente infeccioso parental; un componente para el lisado de al menos un microorganismo infectado para liberar agentes infecciosos de la progenie presentes en el microorganismo; y un componente para detectar los agentes infecciosos de la progenie, o un componente de los agentes infecciosos de la progenie, donde la detección del agente infeccioso o un componente del agente infeccioso indica que el microorganismo se encuentra presente en la muestra.

Los sistemas de la divulgación pueden comprender diversos componentes para la detección de los agentes infecciosos de la progenie. Por ejemplo, en una realización de la divulgación, el agente infeccioso de la progenie (por ejemplo, el bacteriófago) puede comprender una fracción indicadora. En una realización de la divulgación, la fracción indicadora del agente infeccioso de la progenie (por ejemplo, bacteriófago) puede ser una fracción detectable que se expresa durante la replicación, como una proteína de luciferasa soluble.

En otras realizaciones, la divulgación puede comprender un kit para la detección rápida de un microorganismo de interés en una muestra, donde el sistema comprende: un componente para incubar la muestra con un agente infeccioso específico para el microorganismo de interés, donde el agente infeccioso comprende una fracción indicadora; un componente para capturar el microorganismo de la muestra sobre un soporte sólido; un componente para lavar la muestra del microorganismo capturado con el fin de eliminar el agente infeccioso no unido; y un componente para detectar la fracción indicadora. En algunas realizaciones, se puede utilizar el mismo componente para los pasos de captura y/o incubación y/o lavado. Algunas realizaciones comprenden adicionalmente un componente para determinar la cantidad del microorganismo de interés en la muestra, donde la cantidad de la fracción indicadora detectada se corresponde con la cantidad de microorganismo en la muestra. Estos kits pueden incluir diversas realizaciones y subrealizaciones análogas a las anteriormente descritas para los métodos de detección rápida de microorganismos. En una realización de la divulgación, el microorganismo es una bacteria y el agente infeccioso es un bacteriófago.

En algunas realizaciones de la divulgación, el kit puede comprender un componente para aislar el microorganismo de interés de otros componentes de la muestra.

En una realización, la divulgación incluye un kit que comprende componentes para detectar un microorganismo de interés que comprende lo siguiente: un componente para aislar al menos un microorganismo de otros componentes en la muestra; un componente para infectar al menos un microorganismo con una pluralidad de un agente infeccioso parental; un componente para el lisado de al menos un microorganismo infectado para liberar agentes infecciosos de la progenie presentes en el microorganismo; y un componente para detectar los agentes infecciosos de la progenie, o un componente de los agentes infecciosos de la progenie, donde la detección del agente infeccioso o un componente del agente infeccioso indica que el microorganismo se encuentra presente en la muestra.

Los kits de la divulgación pueden comprender diversos componentes para la detección de los agentes infecciosos de la progenie. Por ejemplo, en una realización de la divulgación, el agente infeccioso de la progenie (por ejemplo, el bacteriófago) puede comprender una fracción indicadora. En una realización de la divulgación, la fracción indicadora del agente infeccioso de la progenie (por ejemplo, bacteriófago) puede ser una fracción detectable que se expresa durante la replicación, como una proteína de luciferasa soluble.

Estos sistemas y kits de la divulgación incluyen diversos componentes. A efectos del presente, el término «componente» tiene una definición amplia e incluye cualquier aparato o colección de aparatos adecuados para llevar a cabo el método expuesto. Los componentes no tienen que estar integralmente conectados o situados entre sí de ninguna forma específica. La invención incluye cualquier disposición adecuada de los componentes entre sí. Por ejemplo, los componentes no tienen que estar en la misma sala. Sin embargo, en determinadas realizaciones de la divulgación, los componentes están conectados entre sí en una unidad integral. En algunas realizaciones, los mismos componentes pueden realizar múltiples funciones.

Sistemas informáticos y medios legibles por ordenador

El sistema, descrito en la presente técnica o cualquiera de sus componentes, se pueden realizar en la forma de un sistema informático. Los ejemplos típicos de un sistema informático incluyen un ordenador de uso general, un microprocesador programado, un microcontrolador, un elemento de circuito integrado periférico, y otros dispositivos o disposiciones de dispositivos capaces de implementar los pasos que integran el método de la presente técnica. Un sistema informático puede comprender un ordenador, un dispositivo de entrada, una unidad de visualización y/o Internet. El ordenador puede comprender también un microprocesador. El microprocesador puede estar conectado a un bus de comunicación. El ordenador también puede incluir una memoria. La memoria puede incluir una memoria de acceso aleatorio (RAM) y una memoria de solo lectura (ROM). El sistema informático puede comprender también un dispositivo de almacenamiento. El dispositivo de almacenamiento puede ser una unidad de disco duro o una unidad de almacenamiento extraíble como un disquete, un disco óptico, etc.

El dispositivo de almacenamiento también puede ser otro medio similar para cargar programas informáticos u otras instrucciones en el sistema informático. El sistema informático también puede incluir una unidad de comunicación. La unidad de comunicación permite al ordenador conectarse con otras bases de datos e Internet a través de una interfaz E/S. La unidad de comunicación permite la transferencia y la recepción de datos hacia y desde otras bases de datos. La unidad de comunicación puede incluir un modem, una tarjeta Ethernet o cualquier dispositivo similar que permita al sistema informático conectarse a bases de datos y redes como LAN, MAN, WAN e internet. El sistema informático facilita por tanto la introducción de datos de un usuario a través de un dispositivo de entrada, accesible al sistema a través de la interfaz E/S.

Un dispositivo informático típicamente incluirá un sistema operativo que proporciona instrucciones de programa ejecutables para la administración general y el funcionamiento de ese dispositivo informático, y típicamente incluirá un medio de almacenamiento legible por ordenador (por ejemplo, un disco duro, una memoria de acceso aleatorio, una memoria de solo lectura, etc.) que almacena las instrucciones que, cuando son ejecutadas por un procesador del servidor, permiten que el dispositivo informático realice sus funciones previstas. Las implementaciones adecuadas para el sistema operativo y la funcionalidad general del dispositivo informático son conocidas o se encuentran disponibles en el mercado, y son fácilmente aplicables por aquellos versados en la técnica, particularmente a la luz de la divulgación del presente documento.

El sistema informático ejecuta una serie de instrucciones que se almacenan en uno o más elementos de almacenamiento para procesar los datos introducidos. Los elementos de almacenamiento también pueden contener datos u otra información deseada. El elemento de almacenamiento puede ser en forma de una fuente de información o un elemento de memoria física presente en la máquina de procesamiento.

En entorno puede incluir diversos almacenamientos de datos y otras memorias y medios de almacenamiento como se ha debatido anteriormente. Estos se pueden encontrar en diversas ubicaciones, tales como un medio de almacenamiento local para (y/o ubicados en) uno o más ordenadores o remoto para cualquiera de los ordenadores que integran la red. En un conjunto específico de realizaciones, la información puede residir en una red de área de almacenamiento («SAN») conocida por los expertos en la técnica. De forma similar, todos los archivos necesarios para realizar las funciones atribuidas a los ordenadores, servidores u otros dispositivos de red se pueden almacenar de forma local y/o remota, según corresponda. Cuando un sistema incluye dispositivos informáticos, cada uno de estos dispositivos puede incluir elementos de hardware eléctricamente conectados a través de un bus, donde los elementos incluyen, por ejemplo, al menos una unidad de procesamiento central (CPU), al menos un dispositivo de entrada (por ejemplo, un ratón, teclado, controlador o pantalla táctil) y al menos un dispositivo de salida (por ejemplo, un dispositivo de pantalla, una impresora o un altavoz). Este sistema también puede incluir uno o más dispositivos de almacenamiento, tales como unidades de disco, dispositivos de almacenamiento ópticos y dispositivos de almacenamiento de estado sólido tales como una memoria de acceso aleatorio («RAM») o memoria de solo lectura («ROM»), así como dispositivos de medios extraíbles, tarjetas de memoria, tarjetas flash, etc.

Estos dispositivos también pueden incluir un lector de medios de almacenamiento legibles por ordenador, un dispositivo de comunicaciones (por ejemplo, un modem, una tarjeta de red (por cable o inalámbrica), un dispositivo de comunicación por infrarrojos, etc.) y una memoria funcional como se ha descrito anteriormente. El lector de medios de almacenamiento legibles por ordenador se puede conectar con (o estar configurado para recibir) un medio de almacenamiento legible por ordenador, que represente a dispositivos de almacenamiento remotos, locales, fijos y/o extraíbles, así como medios de almacenamiento para contener, almacenar, transmitir y recuperar de forma temporal y/o más permanente la información legible por ordenador. El sistema y diversos dispositivos también incluirán típicamente un número de aplicaciones de software, módulos, servicios u otros elementos ubicados dentro de al menos un dispositivo de memoria funcional, incluyendo un sistema operativo y programas de aplicaciones, tales como una aplicación para clientes o un navegador web. Cabe señalar que otras realizaciones alternativas pueden presentar numerosas variaciones respecto de las anteriormente descritas. Por ejemplo, también se podría utilizar un hardware personalizado y/o se podrían implementar elementos concretos en el hardware, el software (incluyendo software portátil, como applets) o ambos. Por otra parte, se puede emplear una conexión a otros dispositivos informáticos, como dispositivos de entrada/salida de red.

Los medios de almacenamiento no temporal y medios legibles por ordenador para almacenar un código, o porciones de un código, pueden incluir cualquier medio apropiado conocido o utilizado en la técnica, incluyendo medios de almacenamiento y medios de comunicación, tales como, por ejemplo, medios permanentes y no permanentes, extraíbles y no extraíbles implementados en cualquier método o tecnología para el almacenamiento y/o la transmisión de información como instrucciones legibles por ordenador, estructuras de datos, módulos de programas u otros datos, incluyendo memorias RAM, ROM, EEPROM, flash u otra tecnología de memoria, CD-ROM, discos versátiles digitales (DVD) u otros elementos de almacenamiento ópticos, casetes magnéticos, cintas magnéticas, discos magnéticos u otros dispositivos de almacenamiento magnético, o cualquier otro medio que se pueda utilizar para almacenar la información deseada y al que se pueda acceder a través de un dispositivo del sistema. En base a la divulgación y la pedagogía del presente documento, una persona con los conocimientos ordinarios en la técnica apreciará otras formas y/o métodos de implementar las diversas realizaciones.

Un medio legible por ordenador puede comprender, entre otros, un dispositivo electrónico, óptico, magnético u otro dispositivo de almacenamiento capaz de proporcionar a un procesador instrucciones legibles por ordenador. Entre otros ejemplos se incluyen un disco flexible, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memoria, ROM, RAM, SRAM, DRAM, memoria de contenido direccionable («CAM»), DDR, memoria flash, tales como NAND flash o NOR flash, un ASIC, un procesador configurado, un dispositivo de almacenamiento óptico, una cinta magnética u otro elemento de almacenamiento magnético, o cualquier otro medio del que un procesador informático pueda leer instrucciones. En una realización, el dispositivo informático puede comprender un único tipo de medio legible por ordenador, como una memoria de acceso aleatorio (RAM). En otras realizaciones, el dispositivo informático puede comprender dos o más tipos de medios legibles por ordenador, como una memoria de acceso aleatorio (RAM), una unidad de disco y una caché. El dispositivo informático puede estar en comunicación con uno o más medios externos legibles por ordenador, como una unidad de disco duro externo o una unidad de DVD externo.

Como se ha debatido anteriormente, la realización comprende un procesador que está configurado para ejecutar instrucciones de programa ejecutables por ordenador y/o acceder a la información almacenada en memoria. Las instrucciones pueden comprender instrucciones específicas de procesador generadas por un compilador y/o un intérprete del código escrito en cualquier lenguaje de programación informático adecuado, incluyendo, por ejemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, JavaScript, y ActionScript (Adobe Systems, Mountain View, Calif ). En una realización, el dispositivo informático comprende un único procesador. En otras realizaciones el dispositivo comprende dos o más procesadores. Estos procesadores pueden comprender un microprocesador, un procesador de señal digital (DSP), un circuito integrado de aplicación específica (ASIC), una matriz de puertas programables (FPGA) y máquinas de estado. Estos procesadores pueden comprender también dispositivos electrónicos programables como PLC, controladores programables de interrupciones (PIC), dispositivos lógicos programables (PLD), memorias de solo lectura programables (PROM), memorias de solo lectura electrónicamente programables (EPROM o EEPROM) u otros dispositivos similares.

El dispositivo informático comprende una interfaz de red. En algunas realizaciones, la interfaz de red está configurada para comunicarse a través de enlaces de comunicación por cable o inalámbricos. Por ejemplo, la interfaz de red puede permitir la comunicación por redes vía Ethernet, IEEE 802.11 (Wi-Fi), 802.16 (Wi-Max), Bluetooth, infrarrojos, etc. En otro ejemplo, la interfaz de red puede permitir la comunicación en redes como CDMA, GSM, UMTS, u otras redes de comunicación celulares. En algunas realizaciones, la interfaz de red puede permitir conexiones punto a punto con otro dispositivo, por ejemplo a través del bus serie universal (USB), 1394 FireWire, conexiones en serie o paralelo, o interfaces similares. Algunas realizaciones de dispositivos informáticos adecuados pueden comprender dos o más interfaces de red para la comunicación en una o más redes. En algunas realizaciones, el dispositivo informático puede incluir un almacén de datos además de o en lugar de una interfaz de red.

Algunas realizaciones de dispositivos informáticos adecuados pueden comprender o estar en comunicación con una serie de dispositivos externos o internos como un ratón, un CD-ROM, un DVD, un teclado, una pantalla, unos altavoces, uno o más micrófonos, o cualquier otro dispositivo de entrada o salida. Por ejemplo, el dispositivo informático puede estar en comunicación con diversos dispositivos de interfaz del usuario y una pantalla. La pantalla puede utilizar cualquier tecnología adecuada, incluyendo, por ejemplo, LCD, LED, CRT y similares.

El conjunto de instrucciones que van a ser ejecutadas por el sistema informático puede incluir diversos comandos que ordenan a la máquina de procesamiento que realice tareas específicas como los pasos que constituyen el método de la presente técnica. El conjunto de instrucciones puede adquirir la forma de un programa de software. Por otra parte, el software puede adquirir la forma de una serie de programas separados, un módulo de programa con un programa más grande o una porción de un módulo de programa, como en la presente técnica. El software también puede incluir programación modular en forma de programación orientada a objetos. El procesamiento de los datos introducidos por la máquina de procesamiento se puede producir en respuesta a comandos del usuario, como resultado de un procesamiento anterior o a petición de otra máquina de procesamiento.

Está previsto que la presente invención no se limite a las realizaciones descritas, sino que su alcance completo se definirá por la redacción de las siguientes reivindicaciones y equivalentes de las mismas.

EJEMPLOS

Los resultados ilustrados en los siguientes ejemplos, salvo por el ejemplo 11, se obtuvieron sin cultivo para enriquecimiento o sin incubación de la muestra para conseguir la replicación de las células de la muestra. Por otra parte, en el «ensayo de no concentración» el fago indicador añadido directamente a una muestra, sin concentración de las células, podría infectar y detectar un bajo número de células, incluso una única bacteria. Todos los ejemplos que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones se ofrecen con fines exclusivamente comparativos.

EJEMPLO 1. Creación del fago indicador

El fago indicador se creó utilizando el sistema de visualización de fagos T7SELECT®415-1 de Millipore, Inc. En resumen, el ADN T7SELECT® purificado se compró y se sometió a digestión con enzimas de restricción de ADN EcoRl y Hindlll (New England Biolabs), y el ADN cortado fue posteriormente purificado. El gen para luciferasa de luciérnaga de tipo salvaje (de la luciérnaga oriental común, Photinus pyralis) se sintetizó con la región secuencia arriba de un bacteriófago T7 incluyendo el promotor tardío de T7 para garantizar unos niveles elevados de expresión del gen de luciferasa.

El gen de luciferasa sintetizado se designa como SEC ID NO. 1. Este gen se amplificó por PCR para que incluir puntos de reconocimiento de la enzima de restricción compatible para EcoRl y Hindlll a fin de garantizar que el nuevo gen se pudiera insertar en el genoma de T7SELECT®415-1, utilizando los cebadores siguientes:

TATCTGAATTCTAAGTAACTGATAATACGACTCACTATAGGGAGACCACA AC, designado SEC ID NO. 2, y AATGA AAGCTTTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG, designado SEC ID NO. 3.

Por otra parte, se añadieron codones de terminación en los tres marcos de lectura secuencia arriba del punto de inicio de la luciferasa, para terminar la producción de la principal proteína de la cápside del bacteriófago, el producto del gen 10B. El sistema de visualización del fago T7SELECT®415-1 está diseñado para crear un producto de fusión de la principal proteína de la cápside del gen 10B y cualquier proteína pequeña insertada secuencia debajo de la misma. La adición de codones de terminación garantiza que no se produce ningún producto de fusión y permite que el gen relativamente grande de luciferasa se exprese en forma soluble. El producto de la PCR se sometió a digestión con EcoR1 y Hindlll, se purificó y se ligó a T7SELECT®415-1. El producto de la ligación se insertó en células electrocompetentes MegaX DH10B (Invitrogen) utilizando un sistema de electroporación BioRad MicroPulser, y el cultivo se colocó en placas de E.coli para la formación de placas. Las placas se recogieron y el fago se propagó en E. coli DH10B y se purificó mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa para utilizarlo como fago indicador, T7SELECT®415-Luc.

La Figura 1 ilustra la estructura genómica de un fago indicador de ejemplo, T7SELECT®415-Luc. La fracción indicadora detectable es codificada por el gen de luciferasa de luciérnaga insertado dentro de la región génica de clase III, expresada de forma tardía en el ciclo de vida viral y a unos niveles superiores de otros genes del fago. La estructura contiene codones de terminación para garantizar que la luciferasa no se incorpore a un producto génico nativo, como el gen de la proteína de la cápside 10B y, por tanto, que no sea una proteína de fusión. Por tanto, esta construcción permite que el fago de la progenie exprese luciferasa de luciérnaga soluble como indicador a detectar.

EJEMPLO 2. Aislamiento y purificación del bacteriófago específico para E. coli O157:H7 del entorno.

Se obtuvieron muestras de la Planta de tratamiento de aguas residuales de Hyperion junto con muestras de agua de unos humedales cercanos que se encuentran en Ballona. Las muestras se mezclaron con caldo en polvo Nutrient Broth (Gibco, Inc.) a una proporción de 1x y se inocularon con E. coli 0157:H7 (ATCC 43888) de 3 mL de cultivo turbio. La muestra se incubó durante 3 horas a 37°C con agitación para el enriquecimiento del fago que infecta E. coli O157:H7, se sometió a lisis con 120 pL de cloroformo, se agitó durante 15 segundos y una muestra de 1 mL se centrifugó durante 2 minutos a 6800g. Los supernatantes se filtraron (filtro de 0,45 pm) y se colocaron en placas para la formación de placas sobre E. coli o 157:H7. Esta muestra se sometió a ensayos en placas a distintas diluciones para obtener placas bien aisladas. Las placas individuales se recogieron con puntas de pipetas desechables y se resuspendieron en 100 pL de tampón TMS (50mM Tris-HCl, pH 7.4, 10mM MgCh, y 100mM NaCl). Partes alícuotas de 5 pL de las placas resuspendidas se sometieron a una prueba de dilución única con recubrimiento de agar sobre cepas de E. coli 0157:H7, B, y DH10B, y sobre una cepa de Salmonella. El fago que solo eliminó 0157:H7 se amplificó en E. coli 0157:H7, los lisados se clarificaron por centrifugación y las partículas se colocaron en tampón de TMS utilizando columnas ZEBA® Buffer Exchange.

Se cultivaron ocho aislados de fagos estrechamente relacionados en E. coli 0157:H7, se purificaron y los genomas se aislaron y se sometieron a secuenciación. Los tres tipos genómicos mostraron una homología del 98% con el fago similar a T4 RB69. Los genes tardíos se delimitaron en función de esta homología y el fago JG04 se seleccionó para continuar el estudio. La Figura 2 muestra JG04 y el genoma de JG04 se designa SEC ID NO. 4.

EJEMPLO 3. Creación y purificación del fago indicador recombinante

En base al análisis de secuencias y la ubicación de la región génica tardía, se sintetizaron secuencias de recombinación homólogas con insertos para diversos genes indicadores, que contenían diferentes proteínas de luciferasa, tal y como se muestra en la Figura 3. Concretamente se utilizaron tres estructuras: Plásmido de recombinación homóloga de luciferasa de luciérnaga, pUC57.HR.Fluc, correspondiente a la SEC ID NO. 5; plásmido de recombinación homóloga de NANOLUC®, pUC57.HR.NANOLUC® correspondiente a la SEC ID NO. 6; plásmido de recombinación homóloga de luciferasa de camarón Oplophorus, pUC19.HR.OpLuc.KanR correspondiente a la SEC ID NO. 7.

Los genes de luciferasa se insertaron con un promotor del gen tardío T4 secuencia arriba para garantizar la expresión durante la fase tardía viral. En algunos casos también ser insertó un marcador de resistencia a la kanamicina para permitir la selección de células infectadas bajo el antibiótico kanamicina. Estas regiones se flanquearon con hasta 500 bp de secuencia correspondientes a las proteínas de la cápside gp23 y gp24. Estas secuencias sintetizadas fueron portadas por el plásmido resistente a ampicilina pUC57 o pUC19.

Los plásmidos que contenían las secuencias sintetizadas se transformaron en E. coli 0157:H7 competente en electroporación utilizando un electroporador BIORAD® Gene Pulser II, confiriendo resistencia a la ampicilina. Las colonias se analizaron para confirmar la transformación positiva, sometiéndolas a ensayo con el sustrato de luciferasa apropiado (D-luciferina para luciferasa de luciérnaga, coelenterazina para luciferasa de camarón Oplophorus, y coelenterazina o NANOGLO® para NANOLUC®). Los E. coli O157:H7 que contenían un plásmido con luc flanqueado por secuencias homólogas con el fago JG04 se cultivaron en caldo LB que contenía ampicilina; los cultivos bacterianos se cultivaron en caldo LB que contenía ampicilina a aproximadamente 107 células/mL. A continuación los cultivos se infectaron con fago a una MOI de 1 y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C con agitación para lisar las células. Los lisados contenían una mezcla de fago mayoritariamente de tipo salvaje con una minoría de fago recombinante creado por recombinación homóloga del genoma del fago de tipo salvaje con el plásmido de recombinación homóloga.

A fin de determinar el ratio de fago recombinante y fago de tipo salvaje, se utilizaron ensayos de dilución limitantes basados en TCID50 (dosis infecciosa del cultivo de tejido del 50%) para determinar tanto la concentración de unidades infecciosas (IU/mL), semejantes al número de partículas de virus o unidades formadoras de placa, como el número de unidades transductoras de luciferasa (TU/mL). En estos ensayos la muestra se diluyó en serie y cada dilución se distribuyó en partes alícuotas en los pocillos con bacterias E. coli O157:H7. Todos los pocillos que muestran actividad de luciferasa deben haber sido infectados al menos con un fago recombinante. Todos los pocillos que mostraron lisis celular habían sido infectados al menos por un fago. En base a la dilución más elevada en la ocurrió cada uno de estos casos, se recalcularon las concentraciones originales. Estas mezclas de fagos iniciales de células transformadas típicamente producían un ratio de 20000 IU de tipo salvaje por cada TU de fago recombinante. A continuación se emprendieron los pasos para aislar y amplificar el fago recombinante.

Como se ilustra en la Figura 4, se aisló el fago recombinante de una mezcla que contenía un 0,005% de fago total. Las mezclas de fago se diluyeron en placas de 96 pocillos para obtener una media de 3 TU recombinantes por placa, que dan aproximadamente 625 IU de fago mayoritariamente de tipo salvaje por pocillo. Cada pocillo contenía 50 pL de E. coli O157:H7 turbio. Tras dos horas de incubación a 37°C, se tomaron muestras de los pocillos y se analizaron para detectar la presencia de luciferasa. Todos los pocillos positivos habrían sido probablemente inoculados por un único fago recombinante, y unos 600 fagos de tipo salvaje, lo que supone un enriquecimiento respecto del ratio original de 20000:1. La progenie de este cultivo enriquecido se sometió a otro ensayo de dilución limitador para verificar el ratio y determinar la concentración real de unidades transductoras de fago recombinante. Una vez más, 3 TU de fago recombinante de este caldo se distribuyeron en partes alícuotas por placa de 96 pocillos, lo que supone una inoculación aproximada de unos 20 fagos mayoritariamente de tipo salvaje por pocillo. Es probable que todos los pocillos de luciferasa positivos hubieran sido inoculados con un único recombinante junto con unos 20 fagos de tipo salvaje. Estos pocillos se analizaron para detectar la actividad de luciferasa y todos los pocillos positivos se sometieron al ensayo de dilución limitador para determinar el ratio de TU:IU y posteriormente a un ensayo de placa para obtener placas bien aisladas.

En este punto, el ratio previsto de fago de tipo salvaje frente al fago recombinante era aproximadamente de 20:1. Se recogieron 48 placas individualmente y se analizaron para verificar la capacidad de transducción de luciferasa, asegurando que había unos 3 recombinantes en la mezcla de placas a analizar. Cada placa se suspendió en 100 pL de TMS y se añadieron 5 pL a un pocillo que contenía un cultivo de E. coli O157:H7 turbio; y los pocillos se sometieron a ensayo tras incubación durante 45 minutos a una hora a 37 °C.

Se esperaba que los pocillos positivos contuvieran un cultivo puro de fago recombinante, pero una ronda adicional de purificación de placa fue el procedimiento estándar. Se realizó una producción a gran escala para obtener caldos con una titulación más elevada adecuada para el uso en ensayos de detección de E. coli O157:H7. Se utilizó la centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio para separar las partículas del fago de la proteína de luciferasa contaminante, a fin de reducir la señal de fondo.

EJEMPLO 4. Detección de bacterias a través del fago indicador utilizando filtros de columnas de centrifugación

La Figura 5 ilustra el uso del fago indicador y los filtros de las columnas de centrifugación para la detección bacteriana de conformidad con una realización de la invención. En un experimento de ejemplo, se cultivó E. coli DH10B en caldo Luria-Bertani (LB) a 37°C con agitación. Los fagos T7SELECT® 415-Luc se diluyeron a 108 PFU/40 pL (2,5 X 109 PFU/mL). Las células se sometieron a recuento y se diluyeron a 3000, 300, 30 y 3 células/mL. Se realizó un ensayo CFU en paralelo con el siguiente ensayo de luciferasa para determinar el número real de células producidas por ensayo.

Para cada dilución celular, se añadieron 0,1 mL a los filtros por triplicado. Los filtros se centrifugaron a 600 g durante un minuto. A continuación, se añadieron 40 pL de cada dilución de fago a cada filtro y se centrifugaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los filtros se lavaron dos veces añadiendo 400 pL de PBST (0,05% Tween) y se centrifugaron a 600 g durante un minuto. A continuación se añadieron 50 pL de LB y se procedió a la incubación durante 30 minutos a 37°C. Los filtros se centrifugaron a 6800 g durante 2 minutos. A continuación, se transfirieron 30 uL del filtrado a una placa de luminómetro de 96 pocillos LUMITRAC® 200, y se realizó un ensayo de luciferasa en un luminómetro Promega con inyección de 100 pL de Luciferase Assay Reagent (Promega, Inc.). El recuento de células se corrigió en función del número de colonias del ensayo de CFU paralelo. Se obtuvo el ratio de señal/fondo dividiendo la señal de cada pocillo por la media de señal de los controles con cero células.

La Figura 6 muestra los resultados que demuestran una alta sensibilidad del ensayo para detectar incluso 1 a 3 células de E. coli cells, a través de la actividad de luciferasa.

La Figura 7 muestra los resultados que demuestran el enorme rango de detección del mismo método utilizando diluciones en serie de la muestra bacteriana de partida. Esto muestra la detección desde una media de 1,4 células a 14 millones de células.

EJEMPLO 5. Detección bacteriana por el fago indicador utilizando placas de filtro de 96 pocillos

Se cultivó E. coli DH10B en LB a 37°C con agitación. Los fagos T7SELECT®415-Luc se diluyeron hasta 4 x 107 PFU/20 pL en LB (2 X 109 PFU/mL). Las células se sometieron a recuento y se diluyeron hasta 500, 50 y 5 células/mL (se añadieron 0,1 mL a cada pocillo, dando unas 50, 5 y <1 células como se muestra en la Figura 5). Se realizó un ensayo CFU en paralelo con el siguiente ensayo de luciferasa para determinar el número real de células producidas por ensayo.

Para cada dilución celular, se añadieron 0,1 mL a múltiples pocillos en una placa de filtro de 96 pocillos: 9 pocillos para 0,5 células y 3 pocillos para 50 células, 5 células y el control de cero células. La placa de filtro de 96 pocillos se centrifugó a 1200 rpm (263 ref) durante 3 minutos. A continuación se añadieron 20 pL de la dilución del fago a cada filtro y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y posteriormente durante 30 minutos a 37 °C. El ensayo de luciferasa se realizó directamente en la placa de filtro original con una inyección de 100 pL de Luciferase Assay Reagent (Promega, Inc.) utilizando un luminómetro Promega, y las placas se leyeron inmediatamente después de la inyección y se volvieron a leer 15 y 30 minutos más tarde. El recuento de células se corrigió en función del número de colonias del ensayo de CFU paralelo. Se obtuvieron los ratios de señal/fondo dividiendo la señal de cada pocillo por la media de señal de los controles con cero células.

La Figura 8 muestra los resultados que demuestran el uso de la placa de filtro de 96 pocillos para la detección de células únicas de E. coli en cada pocillo (se sometieron a ensayo 0,5 células de media, de forma que aproximadamente la mitad de los pocillos recibieron células únicas), y 5,4 y 54 células por pocillo.

La Figura 9 muestra los resultados que demuestran un rango muy elevado de detección de células, utilizando el sistema de placa de filtro de 96 pocillos, desde menos de una célula por pocillo de media (células únicas) hasta al menos 14 millones de células por pocillo.

EJEMPLO 6. Ensayo de placa de filtro utilizando el fago indicador JG04-NANOLUC® y baja concentración celular

Las células de E. coli O157:H7 se cultivaron en LB a 37°C con agitación a 220 rpm. Los fagos indicadores JG04-NANOLUC® se prepararon a 106 PFU/20 pL. Las células se sometieron a recuento y se diluyeron a 7290, 2430, 810, 270, 90, 30, 10 y 0 células/mL. Se depositaron partes alícuotas de 100 pL de cada muestra en los pocillos de una placa de filtro PERKINELMER® Optiplate 96-well Grey Luminometer 0.45 pL en muestras idénticas.

Tal y como se ilustra en la Figura 10, las placas se cargaron en una centrifugadora de cuba basculante y se centrifugaron a 2400 rpm durante 3 minutos. Se añadieron 20 pL de dilución de fago JG04-NANOLUC® a cada pocillo, dando una concentración final de 5 x 107 PFU/mL. Las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 200 pL de PBST a cada pocillo, y las placas se centrifugaron durante 3 minutos a 2400 rpm para lavar el exceso de fago parental JG04-NANOLUC®.

A continuación, se añadieron 50 pL de LB a cada pocillo y las placas se incubaron durante 45 minutos en una incubadora a 37° C sin agitación. Se añadieron partes alícuotas de 10 pL de tampón Promega Renilla Luciferase Lysis Buffer a los pocillos; se transfirió el analito a los pocillos y se realizó el ensayo de luciferasa con 50 pL de inyección de reactivo Promega NANOGLO® Reagent. Las muestras con células se compararon con los controles de cero células.

Como se observa en la Figura 11, los resultados de la placa de filtro de NANOLUC® demuestran diferencias estadísticamente significativas entre la señal de 0 células y 1 célula/ensayo (valor p = 0,034 por prueba t de Student), lo que pone de manifiesto la capacidad de detectar células únicas. El uso de más células bacterianas por ensayo demuestra un aumento de la señal de manera dependiente de la dosis.

EJEMPLO 7. Ensayo de no concentración con bajas concentraciones de células

En la preparación de un experimento similar al ensayo ilustrado en el esquema de la Figura 12, las células de E. coli O157:H7 se cultivaron en LB a 37°C con agitado a 220 rpm. Se preparó el fago indicador JG04-OpLuc a 1,2 x 107 PFU/20 pL, y se distribuyeron partes alícuotas de 20 pL en los pocillos de una placa PERKINELMER® Optiplate 96-well Grey Luminometer. Las células se sometieron a recuento y se diluyeron a 10, 3,3, 1,1 y 0 células/mL. Se distribuyeron partes alícuotas de 100 pL de cada muestra en los pocillos en muestras idénticas (12x para 0,11 y 0,33 células/ensayo y 5x para 1 célula/ensayo), dando una concentración de fago final de 108 PFU/mL.

Las placas se incubaron durante 45 minutos en una incubadora a 37 °C sin agitado. Por último, se añadieron 10 pL de tampón PROMEGA® Renilla Luciferase Lysis Buffer a cada pocillo y se realizó el ensayo de luciferasa con 50 pL de inyección de reactivo PROMEGA® Renilla Luciferase Assay Reagent (coelenterazina). Las muestras se compararon con los controles de cero células.

Como se observa en la Figura 13, los resultados del «ensayo de no concentración» con las muestras de baja concentración de células demuestran diferencias estadísticamente significativas entre la señal de 0 células y 1 célula/ensayo (valor p = 0,0024 por ensayo ANOVA), lo que pone de manifiesto la capacidad de detectar células únicas. Por tanto, el ensayo resulta sorprendentemente sensible. Las muestras con menos de una célula por pocillo parecen mostrar un número proporcional de pocillos por encima de la señal de fondo.

EJEMPLO 8. Ensayo de no concentración con amplio rango de concentraciones de células

En un experimento similar con concentraciones de células superiores, las células de E. coli O157:H7 se cultivaron en LB a 37°C con agitado a 220 rpm. Se preparó el fago indicador JG04-OpLuc a 1,2 x 107 PFU/20 pL, y se distribuyeron partes alícuotas de 20 pL en los pocillos de una placa PERKINELMER® Optiplate 96-well Grey Luminometer. Las células se sometieron a recuento y se diluyeron a 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 33, 11, 3,7, 1,2 y 0 células/mL. Se distribuyeron partes alícuotas de 100 pL de cada muestra en pocillos en muestras idénticas, dando una concentración de fago final de 108 PFU/mL.

Las placas se incubaron durante 45 minutos en una incubadora a 37 °C sin agitado. Se añadieron 10 pL de tampón PROMEGA® Renilla Luciferase Lysis Buffer a cada pocillo y se realizó el ensayo de luciferasa con 50 pL de inyección de reactivo PROMEGA® Renilla Luciferase Assay Reagent (coelenterazina). Las muestras se compararon con los controles de cero células.

Como se observa en la Figura 14, el experimento para el ensayo de no concentración con un rango muy amplio de concentraciones de células muestra diferencias estadísticamente significativas entre la señal de 0 células y 1,1 célula/ensayo (valor p = 0,000702 por prueba t de Student), lo que pone de manifiesto la capacidad de detectar células únicas. Un mayor número de células bacterianas por ensayo muestra una mayor señal de manera dependiente de la dosis, hasta al menos 106 células bacterianas/mL, demostrando sorprendentemente un rango de detección muy amplio.

EJEMPLO 9. Ensayo de no concentración con muestras de lavado vegetal

Para preparar el lavado vegetal, las hojas de vegetales (por ejemplo, espinacas o lechuga) se pesaron y añadieron a una bolsa de plástico limpia. Se añadió un mililitro de LB (+/- 0,01 - 0,05% Tween20) por cada gramo (g) de vegetales. Las hojas y la solución se mezclaron manualmente durante unos minutos. A continuación se extrajo el líquido de la bolsa de plástico y se utilizó como «lavado vegetal». Utilizando este método, se averiguó que aproximadamente un millón de bacterias por CFU residen en una única hoja de espinaca (1-2 g).

Las células de E. coli O157:H7 se cultivaron en LB a 37°C con agitación a 220 rpm. Se preparó el fago indicador JG04-OpLuc a 1,2 x 107 PFU/20 |jL, y se distribuyeron partes alícuotas de 20 ^j L en los pocillos de una placa PERKINELMER® Optiplate 96-well Grey Luminometer. Las células se sometieron a recuento y se diluyeron en lavado vegetal a 120, 60, 30 y 0 células/mL. Se distribuyeron partes alícuotas de 100 ^j L de cada muestra en pocillos en muestras idénticas, dando una concentración de fago final de 108 PFU/mL.

Las placas se incubaron durante 45 minutos en una incubadora a 37 °C sin agitado. Se añadieron 10 ^j L de tampón PROMEGA® Renilla Luciferase Lysis Buffer a cada pocillo y se realizó el ensayo de luciferasa con 50 ^j L de inyección de reactivo PROMEGA® Renilla Luciferase Assay Reagent (coelenterazina). Las muestras se compararon con los controles de cero células.

Como se observa en la Figura 15, el experimento para el ensayo de no concentración utilizando muestras de lavado vegetal pone de manifiesto claras diferencias entre la señal de 0 células y 3 células por ensayo, demostrando la capacidad para detectar números de células de un solo dígito en el lavado vegetal. El uso de más células bacterianas por ensayo demuestra un aumento de la señal de manera dependiente de la dosis. El lavado vegetal contiene aproximadamente 106 bacterias no diana/mL, lo que se corresponde con unas 105 bacterias no diana en este ensayo (incluyendo las 0 células del control de E. coli 0157:H7). La capacidad para distinguir incluso 3 células bacterianas diana de 105 bacterias no diana es sorprendente y pone de manifiesto una vez más la especificidad del ensayo.

EJEMPLO 10. Captura específica y cuantitativa de E. coli 0157:H7 utilizando anticuerpos y gránulos

La Figura 16 ilustra un experimento de ejemplo que demuestra que los anticuerpos contra E.coli O157:H7 y los gránulos magnéticos recubiertos con estreptavidina capturaron E. coli O157:H7 específica y cuantitativamente en las muestras, pero no E. coli B ni Salmonella typhimurium en las muestras. A fin de demostrar la especificidad de captura de células bacterianas viables intactas de la solución, se compraron anticuerpos policlonales para epítopos de superficie de E. coli 0157:H7 a KPL (con purificación por afinidad e inversa para minimizar la reactividad cruzada). Los cultivos de especies de E. coli y S. typhimurium se cultivaron en caldo LB, se recogieron y lavaron con tampón de fosfato (1,1 mM KH²PO⁴, 5,6 mM Na²HPO⁴, 154 mM NaCl, pH 7.4). Las células lavadas se sometieron después a recuento y se diluyeron a una concentración entre 5-20 células por mL.

Se combinó una muestra que contenía E. coli O157:H7 con una solución que contenía BSA y anticuerpo conjugado con biotina. Aproximadamente 10 ng de anticuerpo anti-E. coli policlonal biotinilado (equivalente a unas 4 x 1010 moléculas de anticuerpo) fabricado por KPL se añadieron a cada una de las suspensiones de células. Un experimento de control, en el que no se añadió anticuerpo a la suspensión de las células, también se realizó en paralelo. La concentración de BSA fue aproximadamente del 1% y el conjugado de biotina-anticuerpo total fue de 10 ng. La mezcla fue sometida a rotación durante una hora.

Tras la incubación con anticuerpos, se añadieron 4 x 107 micropartículas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Invitrogen/Life Technologies) a la mezcla y se incubaron otros 30 minutos. Los complejos de célula-anticuerpogránulo se recogieron utilizando un soporte magnético y la fracción no unida (supernatante) se retiró. Los gránulos se lavaron suavemente con tampón de fosfato con Tween-20 (1,1 mM KH²PO⁴, 5,6 mM Na²HPO⁴ , 154 mM NaCl, pH 7,4, 0,05% Tween-20). Tanto los supernatantes como los complejos de célula-gránulo capturados se extendieron posteriormente en placas de agar con LB y las placas se incubaron hasta el día siguiente a 37° C para determinar las CFU. La captura de E. coliO157:H7 con anticuerpos anti-O157:H7, pero no E. coli B o Salmonella typhimurium, fue específica y cuantitativa.

EJEMPLO 11. Ensayo de inmunofago híbrido (HIP)

Tal y como se ilustra en el esquema de la Figura 17, el ensayo de inmunofago híbrido o «HIP» combina las ventajas de la captura de anticuerpo específico de bacteria con las ventajas de un bacteriófago modificado. La muestra se aplica primero al pocillo de la placa de microtitulación recubierto de anticuerpos específicos de bacteria (1702). A continuación la placa se centrifuga para facilitar la unión de la bacteria a los anticuerpos de captura (1704). Cuando ha transcurrido un tiempo suficiente para la captura completa de la bacteria, se añade una solución que contiene Luc-fago específico de bacteria a cada muestra (1706). La incubación con el fago provoca la unión y el acoplamiento de uno o varios fagos a la bacteria capturada (1708). Por último, la muestra se incuba para facilitar la replicación del fago y la expresión de luciferasa, lo que provoca la lisis celular y la liberación de luciferasa soluble (1710).

En un experimento de ensayo HIP, se recubrió una placa de ELISA de 96 pocillos blanca con 300 ng de anticuerpo monoclonal (en 100 ^j L de PBS) específico para la bacteria de interés a temperatura ambiente durante 2-3 horas. Los pocillos se lavaron con PBS (200 ^j L x 3 lavados), se bloquearon con 5% de BSA/PBS (300 ^j L) a temperatura ambiente durante 1-1,5 horas, y se lavaron de nuevo con 300 ^j L de PBS x 1. Se aplicaron las muestras de ensayo (100 ^j L) a los pocillos.

La placa ELISA se centrifugó a 700 x g durante 30 minutos y, a continuación, se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió fago JG04-NANOLUC® a las muestras (2 - 4 x 106 PFU en 10 pL de LB) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las muestras se lavaron con PBS (200 pL x 2 lavados). Se añadió medio LB a las muestras (100 pL) y se incubaron a 37°C durante 1,5 horas.

Se añadió sustrato NANOGLO® (50 pL) directamente a las muestras y se midió la luminiscencia en un luminómetro. Como se observa en la Figura 18, el ensayo HIP fue capaz de detectar 100 y 1000 células de E. coli O157:H7 en el medio LB con aproximadamente 2 x 10° PFU de fago JG04-NANOLUC®. La señal media con respecto a una muestra sin células se muestra en una escala logarítmica y oscilaba entre aproximadamente 50 veces más para la muestra de 100 células a más de 1000 veces más para la muestra de 1000 células.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un bacteriófago recombinante que incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural.

2. El bacteriófago recombinante de la reivindicación 1, donde el gen indicador se encuentra adyacente a un gen de la cápside importante y opcionalmente donde la transcripción del gen indicador está controlada por un promotor tardío del bacteriófago.

3. El bacteriófago recombinante de la reivindicación 1, donde el bacteriófago se obtiene de un fago T7, T4, similar a T4, JG04, similar a JG04 u otro bacteriófago natural que tenga un genoma con una homología mínima del 90% con un fago T7, JG04, similar a JG04, T4, u otro fago similar a T4.

4. El bacteriófago de la reivindicación 1, donde la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de una bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble y opcionalmente donde la luciferasa es luciferasa de camarón Oplophorus, luciferasa de luciérnaga, luciferasa Lucia o una luciferasa transformada por ingeniería.

5. Un método para detectar un microorganismo de interés en una muestra que comprende los pasos siguientes: incubar la muestra con un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés, donde el bacteriófago recombinante incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural; y

detectar el producto de proteína indicadora, donde la detección positiva del producto de proteína indicadora significa que el microorganismo de interés se encuentra presente en la muestra.

6. El método de la reivindicación 5, donde la cantidad de la fracción indicadora detectada se corresponde con la cantidad del microorganismo de interés presente en la muestra.

7. El método de la reivindicación 5, donde el gen indicador se encuentra adyacente a un gen de la cápside importante.

8. El método de la reivindicación 5, donde el bacteriófago se obtiene de un fago T7, T4, similar a T4, JG04 u otro bacteriófago natural que tenga un genoma con una homología mínima del 90% con un fago T7, T4, u otro fago similar a T4.

9. El método de la reivindicación 5 donde la concentración de bacteriófago en el paso de incubación para infectar la bacteria es superior a 1 x 107 unidades formadoras de placa por mililitro de volumen.

10. El método de la reivindicación 5 donde el bacteriófago recombinante es purificado utilizando centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio antes de la incubación con la muestra.

11. El método de la reivindicación 5 que comprende también un paso para capturar el microorganismo de la muestra sobre un soporte sólido antes de la incubación con el bacteriófago recombinante para infectar la bacteria.

12. El método de la reivindicación 11, donde el soporte sólido comprende una placa multipocillo o un filtro.

13. El método de la reivindicación 11, que comprende también un paso para lavar el microorganismo capturado e infectado, después de añadir el bacteriófago pero antes de la lisis celular, para eliminar el exceso de bacteriófago y/o la proteína indicadora contaminante, como la luciferasa.

14. El método de la reivindicación 5, donde el método puede detectar < 10 células del microorganismo en la muestra, y opcionalmente donde la detección del microorganismo de interés se completa en menos tiempo que el periodo de tiempo necesario para aumentar el número de microorganismos por cuatro o por 10 utilizando el cultivo para enriquecimiento, donde opcionalmente el tiempo total necesario para la detección es inferior a dos horas.

15. Un sistema para la detección rápida de un microorganismo de interés en una muestra, que consiste en lo siguiente:

un bacteriófago recombinante que infecta el microorganismo de interés, donde el bacteriófago recombinante incluye un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago en calidad de fracción indicadora, de forma que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria hospedadora resulta en un producto de proteína indicadora soluble, donde el gen indicador codifica una enzima luciferasa, el gen indicador no codifica una proteína de fusión y donde el producto de proteína indicadora no comprende polipéptidos del bacteriófago natural;

un componente para incubar la muestra con el bacteriófago recombinante; y

un componente para detectar la fracción indicadora.