JP2022518294A - 感染性因子を使用するListeriaの迅速検出のための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年1月29日出願の米国仮出願第62/798,248号の優先権を主張する。米国出願第13/773,339号、同第14/625,481号、同第15/263,619号、同第15/409,258号の開示は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
本発明は、感染性因子を使用する、微生物の検出のための組成物、方法、システムおよびキットに関する。
生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および臨床サンプル中の細菌、ウイルス、および他の微生物の検出のための速度および感度を改善することには、強い重要性がある。微生物病原体は、ヒトおよび飼いならされた動物において実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。また、微生物の検出は、ある種の微生物(例えば、Listeria spp.、Salmonella spp.、またはStaphylococcus spp.)で汚染された食品の摂取によって引き起こされる生命を脅かすもしくは致命的な病気の大流行を考慮すると、米国食品医薬品局(FDA)および疾病対策センター(CDC)、ならびに米国農務省(USDA)にとっての優先順位は高い。
本発明の実施形態は、微生物(例えば、Listeria spp.)の検出のための組成物、方法、システムおよびキットを含む。本発明は、種々の方法で具現化され得る。
試験サンプル(例えば、生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および環境サンプル)中の目的の微生物(例えば、Listeria spp.)の検出に関して驚くべき感度を示す、組成物、方法およびシステムが本明細書で開示される。検出は、最小限の富化時間(その間に、微生物が潜在的に増殖し得る)を伴って行われるアッセイにおいて、遺伝的に改変された感染性因子を使用して、以前に可能と考えられた時間枠より短い時間枠で達成され得る。また、試験サンプルとともにインキュベートするために、潜在的に高い感染多重度(MOI)、もしくは高濃度のプラーク形成単位(PFU)を使用することの成功は驚くべきである。このような高いファージ濃度(PFU/mL)は、細菌検出アッセイにおいて有害であると以前に主張された。なぜならそれらは、「非感染溶菌(lysis from without)」を引き起こすと主張されたからである。しかし、高濃度のファージは、少数の標的細胞の発見、結合および感染を容易にし得る。
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有するべきである。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むべきであり、複数の用語は、単数を含むべきである。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。公知の方法および技術は、他に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって、および本明細書を通して考察される様々な一般のおよびより特定の参考文献において記載されているように一般に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造元の仕様によって行われる。本明細書に記載されている実験室の手順および技術に関連して使用される命名法は当技術分野で周知のものであり、一般に使用される。
ない遺伝的物質を一緒にするために、通常は実験室で行われる場合、遺伝的な(すなわち、核酸)改変をいう。この用語は、本明細書において用語「改変された」と交換可能に使用される。
本発明の方法およびシステムの実施形態の各々は、サンプル中の微生物の迅速検出および定量を可能にし得る。例えば、本発明に従う方法は、優れた結果を有する、短縮した期間で行われ得る。
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、病原性微生物の検出において使用するための感染性因子を含み得る。ある種の実施形態において、本発明は、組換えインジケーターバクテリオファージを含み、ここで、バクテリオファージゲノムはインジケーターまたはレポーター遺伝子を含むように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、本発明は、バクテリオファージのゲノムに組み込まれるインジケーター遺伝子を有する組換えバクテリオファージを含む組成物を含み得る。
インジケーターバクテリオファージを作製する方法の実施形態は、遺伝的改変のための野生型バクテリオファージの選択から始める。いくつかのバクテリオファージは、標的細菌に高度に特異的である。このことは、高度に特異的な検出の機会を提供する。
プシドタンパク質の数に制限されないことを確実にする。
本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明は、微生物を検出するための感染性粒子を使用するための方法を包含し得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。
目的の微生物を検出するための方法を包含し、上記方法は、少なくとも1個のサンプル細菌を捕捉する工程;該少なくとも1個の細菌を、複数のインジケーターファージとともにインキュベートする工程;子孫ファージを生成し、可溶性インジケーター部分を発現するための、感染および複製の時間を与える工程;ならびに上記子孫ファージ、好ましくは上記インジケーターを検出する工程であって、ここで上記インジケーターの検出は、上記細菌が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で開示される方法を行うための構成要素を含むシステム(例えば、自動化システムもしくはキット)を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるシステムまたはキットにはインジケーターファージが含まれる。本明細書に記載される方法は、このようなインジケーターファージシステムまたはキットも利用し得る。本明細書で記載されるいくつかの実施形態は、上記方法を行うために必要とされる試薬および材料の最小限の量を考慮すると、自動化もしくはキットに特に適している。ある種の実施形態において、上記キットの構成要素の各々は、第1の部位から第2の部位へと送達可能である自己充足式ユニットを含み得る。
上記システムは、現在の技術もしくはその構成要素のうちのいずれかにおいて記載されるように、コンピューターシステムの形態で具現化され得る。コンピューターシステムの代表例としては、汎用コンピューター、プログラムされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラー、周辺集積回路素子、および本技術の方法を構成する工程を実装し得る他のデバイスもしくはデバイスの配置が挙げられる。
インジケーターファージListeria特異的LMA4.NANOLUC、LMA8.NANOLUC、および他のListeriaバクテリオファージを、先に記載されたとおりの手順を使用して、相同組換えを通じて作製した。LMA4およびLMA8に由来する組換えListeriaファージを示し、記載する図1~3を参照のこと。
EZ Reachポリウレタンスポンジサンプルを、Dey/Engleyブロスで予め濡らし、一晩培養物から希釈した<1 CFUのListeria monocytogenesまたは100 CFUチャレンジ細菌(Cronobacter sakazakii)を添加した。
ステンレス鋼表面を、培地中で示された数の細胞とともにインキュベートした。細胞を、その表面上で乾燥させ、室温において18~24時間維持し、その後、Letheen培地(World BioProducts)で予め濡らしたEZ Reachポリウレタンスポンジサンプルで拭った。Listeria monocytogenes 19115を、標的として使用し、Staphylococcus aureus 12600をチャレンジ株として使用した。
Claims (25)
- バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む組換えバクテリオファージであって、ここで前記組換えバクテリオファージは、Listeria sppに特異的に感染する、組換えバクテリオファージ。
- 前記組換えバクテリオファージは、LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1、およびLP-ES3Aバクテリオファージのうちの1種から構築される、請求項1に記載の組換えバクテリオファージ。
- 前記インジケーター遺伝子がコドン最適化され、内因性シグナルを生成する可溶性タンパク質生成物または基質との反応の際にシグナルを生成する可溶性酵素をコードする、請求項1に記載の組換えバクテリオファージ。
- 前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に非翻訳領域をさらに含み、該非翻訳領域が、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む、請求項1に記載の組換えバクテリオファージ。
- 請求項1に記載の少なくとも1種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物。
- 前記少なくとも1種の組換えバクテリオファージは、LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1、およびLP-ES3Aのうちの1種から構築される、請求項5に記載のカクテル組成物。
- LMA8、LP-ES1、およびLP-ES3Aのうちの2種から構築される少なくとも2種の組換えバクテリオファージを含む、請求項5に記載のカクテル組成物。
- 組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法であって、
標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、
インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド/ベクターを調製する工程、
該相同組換えプラスミド/ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、
形質転換された該標的病原性細菌に、選択された該野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、該プラスミド/ベクターと該バクテリオファージのゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および
組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程
を含む、方法。 - 相同組換えプラスミド/ベクターを調製する工程は、
選択された前記バクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然のヌクレオチド配列を決定すること;
前記ゲノムを注釈し、選択された前記バクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を識別すること;
前記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計することであって、前記配列がコドン最適化インジケーター遺伝子を含むこと;および
相同組換えのために設計された前記配列をプラスミド/ベクターに組み込むこと
を含む、請求項8に記載の方法。 - 配列を設計することが、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を、前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に挿入することをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記相同組換えプラスミドが、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に含む、請求項8に記載の方法。
- 前記野生型バクテリオファージは、Listeria特異的バクテリオファージであり、前記標的病原性細菌は、Listeria monocytogenesまたは他のListeria spp.である、請求項8に記載の方法。
- 組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程が、前記インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを含む、請求項8に記載の方法。
- サンプル中でListeria spp.を検出するための方法であって、前記方法は:
前記サンプルを、請求項1に記載の少なくとも1種のListeria特異的バクテリオファージを含むカクテル組成物とともにインキュベートする工程;および
前記組換えバクテリオファージによって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで前記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、Listeria spp.が前記サンプルに存在することを示す工程、
を含む方法。 - 前記少なくとも1種の組換えバクテリオファージは、LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1、およびLP-ES3Aのうちの1種から構築される、請求項14に記載の方法。
- LMA8、LP-ES1、およびLP-ES3Aのうちの少なくとも2種から構築される少なくとも2種の組換えバクテリオファージを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記サンプルが、食品サンプル、環境サンプル、水サンプルまたは商業サンプルである、請求項14に記載の方法。
- 食品安全産業のための標準サイズのサンプル中の10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個程度の少なさの細菌を検出する、請求項14に記載の方法。
- 前記食品サンプルは、食肉、魚肉、野菜、卵、酪農製品、ドライフード製品、または乳児用調製粉乳を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記サンプルは、24時間未満、23時間未満、22時間未満、21時間未満、20時間未満、19時間未満、18時間未満、17時間未満、16時間未満、15時間未満、14時間未満、13時間未満、12時間未満、11時間未満、10時間未満、9時間未満、8時間未満、7時間未満、6時間未満、5時間未満、4時間未満、3時間未満、または2時間未満の富化期間の間、成長を有利にする条件において最初にインキュベートされる、請求項14に記載の方法。
- 結果までの合計時間は、28時間未満、27時間未満、26時間未満、25時間未満、24時間未満、23時間未満、22時間未満、21時間未満、20時間未満、19時間未満、18時間未満、17時間未満、16時間未満、15時間未満、14時間未満、13時間未満、12時間未満、11時間未満、10時間未満、9時間未満、8時間未満、7時間未満、6時間未満、5時間未満、4時間未満、3時間未満、または2時間未満である、請求項14に記載の方法。
- 前記インジケーターを検出する工程によって生成されるシグナル対バックグラウンドの比が、少なくとも2.0または少なくとも2.5または少なくとも3.0である、請求項14に記載の方法。
- Listeria特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む、Listeria spp.を検出するためのキット。
- 前記組換えバクテリオファージによって発現される可溶性タンパク質生成物を検出するための、インジケーターと反応させるための基質をさらに含む、請求項23に記載のキット。
- Listeria特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む、Listeria spp.を検出するためのシステム。
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