BR112021013769A2 - Métodos e sistemas para a detecção rápida de listeria usando agentes infecciosos. - Google Patents
Métodos e sistemas para a detecção rápida de listeria usando agentes infecciosos. Download PDFInfo
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Abstract
métodos e sistemas para a detecção rápida de listeria usando agentes infeccioso. são aqui divulgados métodos e sistemas para a detecção rápida de micro-organismos tais como listeria spp. em uma amostra. um bacteriófago geneticamente modificado é também divulgado o qual compreende um gene indicador na região tardia do gene. a especificidade do bacteriófago, tal como bacteriófago específico para listeria, permite a detecção de um micro-organismo específico, tal como listeria spp. e um sinal indicador pode ser amplificado para otimizar a sensibilidade do ensaio.
Description
[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido provisório norte-americano nº US 62/798.248, depositado em 29 de janeiro de 2019. As divulgações dos pedidos norte-americanos nº 13/773.339, 14/625.481, 15/263.619, 15/409.258 são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[0002] Esta invenção se refere a composições, métodos, sistemas, e kits para a detecção de micro-organismos usando agentes infecciosos.
[0003] Há um grande interesse em melhorar a velocidade e a sensibilidade para a detecção de bactérias, vírus e outros micro-organismos em amostras biológicas, alimentares, de água e clínicas. Patógenos microbianos podem causar morbidade substancial entre humanos e animais domésticos, bem como imensa perda econômica. Ainda, a detecção dos micro-organismos é uma alta prioridade para a Administração de Alimentos e Fármacos (em inglês, Food and Drug Administration - FDA) e Centros de controle de doenças (em inglês, Centers for Disease Control - CDC), bem como o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (em inglês, United States Department of Agriculture - USDA), devido a surtos de doenças ameaçadoras ou fatais causadas pela ingestão de alimentos contaminados com certos micro- organismos, por exemplo, Listeria spp., Salmonella spp. ou Staphylococcus spp.
[0004] Em particular, Listeria spp. são conhecidas por causar a infecção potencialmente grave, listeriose. Listeria spp., tal como L. monocytogenes, são tipicamente transmitidas através da ingestão de produtos alimentícios contaminados. L. monocytogenes é uma bactéria gram-positiva comumente associada à contaminação de produtos alimentícios, incluindo, mas não se limitando a, leite, frutos do mar, aves e carne. Doenças de origem alimentar, tal como a listeriose, podem ser evitadas pela detecção de alimentos contaminados antes da disponibilidade para o consumidor.
[0005] Os testes microbiológicos tradicionais para a detecção de bactérias baseiam-se em culturas de enriquecimento não-seletivo e seletivo seguido de plaqueamento em meios seletivos e testes adicionais para confirmar colônias suspeitas. Os referidos procedimentos podem requerer até sete dias. Por exemplo, testes tradicionais para a detecção de Listeria spp. em produtos alimentícios são complexos e demorados, requerendo períodos de enriquecimento de 24 - 48 horas seguidos por testes adicionais longos com um tempo total para a detecção variando de 5 - 7 dias. Uma variedade de métodos rápidos foram investigados e introduzidos na prática para reduzir a necessidade de tempo. No entanto, esses métodos têm desvantagens. Por exemplo, os testes de reação em cadeia de polimerase (PCR), que também incluem uma etapa de amplificação e, portanto, são capazes de alta sensibilidade e seletividade; são economicamente limitados a um pequeno tamanho de amostra. Com suspensões bacterianas diluídas, a maioria das pequenas subamostras estará livre de células e, portanto, a purificação e / ou etapas de enriquecimento prolongadas são ainda necessárias.
[0006] O tempo requerido para o enriquecimento biológico tradicional é ditado pela taxa de crescimento da população bacteriana alvo de uma amostra, pelo efeito de uma matriz de amostra e pela sensibilidade necessária. Devido ao tempo requerido para o cultivo, esses métodos podem levar até oito dias, dependendo do organismo a ser identificado e da origem da amostra. Este lapso de tempo geralmente é inadequado, uma vez que o alimento contaminado, água ou outro produto pode já ter chegado ao gado ou aos humanos. Além disso, o aumento de bactérias resistentes a antibióticos e considerações de biodefesa tornam a identificação rápida de patógenos bacterianos em água, alimentos e amostras clínicas prioridades críticas em todo o mundo.
[0007] Sendo assim, há uma necessidade de uma detecção e identificação mais rápida, simples e sensível de micro-organismos, tais como bactérias e outros micro- organismos potencialmente patogênicos.
[0008] Modalidades da invenção compreendem composições, métodos, sistemas, e kits para a detecção de micro-organismos tais como Listeria spp. A invenção pode ser incorporada de várias maneiras.
[0009] Em alguns aspectos, a invenção compreende um bacteriófago recombinante compreendendo um gene indicador inserido em uma região tardia do gene de um genoma de bacteriófago. Em algumas modalidades o bacteriófago recombinante é um genoma de bacteriófago geneticamente modificado específico para Listeria. Em certas modalidades o bacteriófago recombinante compreende um genoma de bacteriófago geneticamente modificado derivado a partir de um bacteriófago que reconhece especificamente Listeria spp. Em algumas modalidades, o bacteriófago usado para preparar o bacteriófago recombinante infecta especificamente uma ou mais Listeria spp. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir Listeria spp. na presença de outros tipos de bactérias. Em algumas modalidades o bacteriófago recombinante reconhece especificamente Listeria monocytogenes.
[0010] Em algumas modalidades do bacteriófago indicador recombinante, o gene indicador pode ser com códon otimizado e pode codificar um produto de proteína solúvel que gera um sinal intrínseco ou uma enzima solúvel que gera sinal após reação com substrato. Algum bacteriófago recombinante ainda compreende uma região não traduzida a montante de um gene indicador com códon otimizado, em que a região não traduzida inclui um promotor de gene tardio do bacteriófago e um local de entrada ribossomal. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase. O gene luciferase pode ser um gene de ocorrência natural, tal como luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, ou luciferase de Renilla, ou pode ser um gene geneticamente modificado tal como NANOLUC®.
[0011] São também aqui divulgados métodos para a preparação de um bacteriófago indicador recombinante. Algumas modalidades incluem selecionar um bacteriófago de tipo selvagem que infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um plasmídeo de recombinação homóloga / vetor compreendendo um gene indicador; transformar o plasmídeo de recombinação homóloga / vetor em bactérias patogênicas alvo; infectar as bactérias patogênicas transformadas alvo com o bacteriófago de tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é um bacteriófago específico para Listeria.
[0012] Em algumas modalidades, preparar um plasmídeo de recombinação homóloga / vetor inclui determinar a sequência de nucleotídeos natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para a recombinação homóloga a jusante da principal gene da proteína do capsídeo, em que a sequência compreende um gene indicador com códon otimizado; e incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga dentro de um plasmídeo / vetor. A etapa de projetar uma sequência pode incluir inserir um constructo genético compreendendo uma região não traduzida, incluindo um promotor de gene tardio do fago e local de entrada ribossomal, a jusante do gene indicador com códon otimizado. Em algumas modalidades, o promotor de gene tardio do fago é um promotor exógeno, diferente de qualquer promotor endógeno no genoma do fago. Então, em alguns métodos, o plasmídeo de recombinação homóloga compreende uma região não traduzida incluindo um promotor de gene tardio do bacteriófago e um local de entrada ribossomal a jusante do gene indicador com códon otimizado.
[0013] Algumas modalidades da invenção são composições que incluem um bacteriófago indicador recombinante tal como aqui descrito. Por exemplo, as composições podem incluir um ou mais agentes infecciosos de tipo selvagem ou geneticamente modificados (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender um coquetel de pelo menos um bacteriófago recombinante para uso na detecção de micro- organismos tais como Listeria spp.
[0014] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de um micro-organismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta o micro- organismo de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região tardia do gene do bacteriófago de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto solúvel de proteína indicadora, e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que o micro-organismo de interesse está presente na amostra.
[0015] Em algumas modalidades dos métodos para a preparação do bacteriófago indicador recombinante, o bacteriófago de tipo selvagem é um bacteriófago específico para Listeria spp. e a bactéria patogênica alvo é Listeria spp. Em algumas modalidades, isolar um clone particular do bacteriófago recombinante compreende um ensaio de diluição limitante para isolar um clone que demonstra a expressão do gene indicador.
[0016] Outros aspectos da invenção incluem métodos para a detecção de bactérias, tais como Listeria spp. em uma amostra, incluindo as etapas de incubar a amostra com um bacteriófago recombinante derivado a partir de bacteriófago específico para Listeria e detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo bacteriófago recombinante, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que Listeria spp. está presente na amostra. Em algumas modalidades, a invenção inclui métodos para a detecção de Listeria spp. usando um bacteriófago recombinante derivado a partir de um bacteriófago que direciona para Listeria spp. A amostra pode ser uma amostra alimentar ou de água. Em algumas modalidades, as amostras incluem amostras ambientais (por exemplo, esponjas e swabs de superfícies ou equipamentos para monitoramento bacteriano em fábricas e outras instalações de processamento).
[0017] Em algumas modalidades dos métodos para a detecção de bactérias, a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 24 horas ou menos, 23 horas ou menos, 22 horas ou menos, 21 horas ou menos, 20 horas ou menos, 19 horas ou menos, 18 horas ou menos, 17 horas ou menos, 16 horas ou menos, 15 horas ou menos, 14 horas ou menos, 13 horas ou menos, 12 horas ou menos, 11 horas ou menos, 10 horas ou menos, ou 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos. Em algumas modalidades, a amostra não é enriquecida antes da detecção. Em algumas modalidades, o tempo total para resultados é de menos do que 26 horas, 25 horas, 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas ou 2 horas. Em algumas modalidades, a proporção de sinal para o fundo gerado pela detecção do indicador é de pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5 ou pelo menos 3.0. Em algumas modalidades, o método detecta tão pouco quanto 1, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 das bactérias específicas em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.
[0018] Modalidades adicionais incluem sistemas e kits para a detecção de Listeria spp., em que os sistemas ou kits incluem um bacteriófago recombinante derivado a partir de bacteriófago específico para Listeria. Algumas modalidades ainda incluem um substrato para reagir com um indicador para detectar o produto de proteína solúvel expresso pelo bacteriófago recombinante. Estes sistemas ou kits podem incluir características descritas para o bacteriófago, composições, e métodos da invenção. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende mídia legível por computador não transitória para uso com os métodos ou sistemas de acordo com a invenção.
[0019] A presente invenção pode ser melhor compreendida referindo-se às seguintes figuras não limitativas.
[0020] A Figura 1 mostra um constructo de fago indicador de acordo com uma modalidade da invenção ilustrando a inserção de um constructo genético compreendendo um gene luciferase, um promotor de gene tardio do bacteriófago, e um sítio de ligação ribossomal (RBS) inserido na região tardia (classe III) de um bacteriófago. O promotor descrito está em adição a e separado do promotor do gene endógeno tardio a jusante dos genes tardios endógenos, tal como o gene para a principal proteína do capsídeo (MCP).
[0021] A Figura 2 mostra o genoma do bacteriófago LMA4, um miovírus (relacionado ao fago de Listeria LMTA-94) que foi obtido a partir do esgoto. Um gene homólogo hipotético à protease prohead putativa da proteína p85 está a montante da cps, o gene do principal capsídeo dentro da região tardia do gene, consistindo de genes estruturais, os quais codificam para proteínas do vírion. Após a cps, está um terminador da transcrição, seguido por um homólogo da proteína da bainha da cauda LMTA-94 (tsh). Como essas proteínas de vírion são expressas em um nível muito alto, qualquer gene inserido nesta região pode ter níveis de expressão semelhantes, desde que promotores de genes tardios e / ou outros elementos de controle semelhantes sejam usados.
[0022] A Figura 3 mostra dois projetos de constructos de plasmídeos de recombinação homóloga que carregam o gene da luciferase usado para construir os fagos recombinantes com aproximadamente várias centenas de pares de base da sequência correspondente do fago a montante e a jusante do local de inserção para promover a recombinação homóloga. A luciferase NANOLUC® está inserida dentro da estrutura de plasmídeo do vetor de troca gram-positivo pCE104 com uma região não traduzida a montante contendo um promotor dedicado de gene tardio do fago e local de entrada ribossomal. pCE104.HR.A511.NanoLuc.v2 foi usado para construir recombinantes para os A511, LMA4 e LMA8 de
Pecentumvírus. O pCE104.HR.LP-ES1.NanoLuc foi usado para construir o LP-ES1 de Homburvírus. Cada constructo consistiu de 500 bp de sequência homóloga que consiste em um fragmento do gene da principal proteína do capsídeo (cps) seguido por um promotor de gene tardio, o qual foi adicionado em adição ao promotor endógeno de gene tardio a jusante da principal proteína do capsídeo no genoma do fago, o gene luciferase, e aproximadamente 258 bp de sequência correspondente a jusante para a recombinação homóloga para pCE104.HR.A511.NanoLuc.v2 e 500 bp de jusante para pCE104.HR.LP-ES1.NanoLuc. Todos os recombinantes usaram um promotor de gene tardio P100virus em vez do promotor de gene tardio T4.
[0023] A Figura 4 mostra um ensaio de placa de filtro para a detecção de bactérias de interesse usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção em que as bactérias e fago recombinante são incubados em placas de filtro e após a geração do bacteriófago da progênie a proteína indicadora é detectada diretamente sem remoção do meio de incubação.
[0024] As Figuras 5A e 5B dados de modalidades de um ensaio de detecção de Listeria usando bacteriófago recombinante específico para Listeria para detectar Listeria em esponjas enriquecidas, usando 10 mL de meio adicionado (5A) ou 90 mL de meio adicionado (5B).
[0025] A Figura 6 mostra dados de modalidades de um ensaio de detecção de Listeria usando bacteriófago recombinante específico para Listeria para detectar Listeria em amostras de esponja de esfregaço de superfície ambiental.
[0026] São aqui divulgadas composições, métodos e sistemas que demonstram sensibilidade surpreendente para a detecção de um micro-organismo de interesse, tal como Listeria spp., em amostras teste (por exemplo, amostras biológicas, alimentares, de água e de meio ambiente). A detecção pode ser alcançada em um período de tempo mais curto do que se pensava ser possível usando agentes infecciosos geneticamente modificados em ensaios realizados com tempos mínimos de enriquecimento durante os quais os micro- organismos poderia potencialmente multiplicar. Também surpreendente é o sucesso do uso de uma potencialmente alta multiplicidade de infecção (MOI), ou altas concentrações de unidades formadoras de colônia (UFC), para incubação com uma amostra teste. Essas altas concentrações de fago (UFC / mL) foram anteriormente consideradas prejudiciais em ensaios de detecção de bactérias, pois foram consideradas como causadoras da "lise de fora". No entanto, uma alta concentração de fago pode facilitar a localização, ligação e infecção de um baixo número de células-alvo.
[0027] As composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender agentes infecciosos para uso na detecção de micro-organismos tais como Listeria spp. Em certas modalidades, a invenção pode compreender uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador inserido em uma região tardia do gene do bacteriófago. Em certas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de uma bactéria hospedeira resulta na produção de um produto solúvel de proteína indicadora. Em certas modalidades, o gene indicador pode ser inserido em uma região de gene tardio (isto é, classe III) do bacteriófago. O bacteriófago pode ser derivado a partir de bacteriófago específico para Listeria spp., ou outro bacteriófago de tipo selvagem ou projetado. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é construído a partir de pelo menos um de bacteriófagos LMA4, LMA8, A511, P70, LP-ES1, e LP- ES3A.
[0028] Em algumas modalidades, as composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender um coquetel de pelo menos um bacteriófago recombinante para uso na detecção de micro-organismos tais como Listeria spp.
[0029] Em alguns aspectos, a invenção compreende um método para a detecção de um micro-organismo de interesse. O método pode usar um agente infeccioso para a detecção do micro-organismo de interesse tal como uma Listeria spp. Por exemplo, em certas modalidades, o micro-organismo de interesse é Listeria spp. e o agente infeccioso é um bacteriófago que infecta especificamente uma Listeria spp. Então, em certas modalidades, o método pode compreender a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra ao incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta a bactéria de interesse. Em certas modalidades, o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador. O gene indicador pode, em certas modalidades, estar inserido em uma região tardia do gene do bacteriófago de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de bactérias hospedeiras resulta na produção de um produto de proteína indicadora. O método pode compreender detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra. Em algumas modalidades, a proteína indicadora é solúvel.
[0030] Em certas modalidades, a invenção pode compreender um sistema. O sistema pode conter pelo menos alguma das composições da invenção. Ainda, o sistema pode compreender pelo menos alguns dos componentes para realizar o método. Em certas modalidades, o sistema é formulado como um kit. Então, em certas modalidades, a invenção pode compreender um sistema para a detecção rápida de um micro- organismo de interesse tal como Listeria spp. em uma amostra, compreendendo: Um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específico para o micro-organismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; e um componente para a detecção da porção indicadora. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende software para uso com os métodos ou sistemas.
[0031] Então, algumas modalidades da presente invenção resolver uma necessidade usando métodos baseados em bacteriófago para amplificar um sinal detectável indicando a presença de bactérias. Em certas modalidades tão pouco quanto 10 bactérias são detectadas. Os princípios aqui aplicados podem ser aplicados à detecção de uma variedade de micro-organismos. Por causa dos inúmeros sítios de ligação de um agente infeccioso na superfície de um micro-organismo, a capacidade de produzir progênie durante a infecção, e o potencial de expressão de alto nível de uma porção indicadora codificada, o agente infeccioso ou uma porção indicadora podem ser mais facilmente detectáveis do que o próprio micro- organismo. Neste sentido, modalidades da presente invenção podem alcançar uma tremenda amplificação de sinal até mesmo de uma única célula infectada.
[0032] Aspectos da presente invenção utilizar a alta especificidade dos agentes de ligação que podem se ligar a determinados micro-organismos, tais como o componente de ligação de agentes infecciosos, como um meio de detectar e / ou quantificar o micro-organismo específico em uma amostra. Em algumas modalidades, a presente invenção utiliza a alta especificidade de agentes infecciosos tal como bacteriófago.
[0033] Em algumas modalidades, a detecção é alcançada através de uma porção indicadora associada ao agente de ligação específico para o micro-organismo de interesse. Por exemplo, um agente infeccioso pode compreender uma porção indicadora, tal como um gene que codifica para um indicador solúvel. Em algumas modalidades o indicador pode ser codificado pelo agente infeccioso, tal como um bacteriófago, e o bacteriófago é designado um fago indicador.
[0034] Algumas modalidades da invenção aqui divulgadas e descritas utilizam a descoberta de que um único micro-organismo é capaz de se ligar a agentes de reconhecimento específicos, tais como fago. Após a infecção e replicação do fago, o fago da progênie pode ser detectado por meio de uma porção indicadora expressa durante a replicação do fago. Este princípio permite a amplificação do indicador de sinal a partir de uma ou poucas células com base no reconhecimento específico dos receptores de superfície do micro-organismo. Por exemplo, ao expor tão pouco quanto 10 células de bactérias para uma pluralidade de fagos, depois disso, permitindo a amplificação do fago e a expressão de alto nível de um produto indicador de gene codificado durante a replicação, o sinal indicador é amplificado de tal modo que as bactérias são detectáveis.
[0035] Modalidades dos métodos e sistemas da invenção podem ser aplicados à detecção e quantificação de uma variedade de micro-organismos (por exemplo, bactérias) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, mas não se limitando a detecção de patógenos de amostras alimentares, de água e comerciais. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade de detecção e especificidade rapidamente. Em algumas modalidades a detecção é possível dentro de um único ciclo de replicação do bacteriófago, o que é inesperado. Definições
[0036] A menos que definido de outra forma aqui, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção têm os significados comumente compreendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que de outra forma requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas usadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e proteína e química do ácido nucleico e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas e métodos conhecidos são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são discutidas ao longo do presente relatório descritivo sem indicação em contrário. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme comumente realizado na arte ou tal como aqui descrito. As nomenclaturas usadas em conexão com os procedimentos de laboratório e técnicas aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica.
[0037] Os termos a seguir, a menos que indicado de outra forma, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:
[0038] Tal como aqui utilizado, os termos “um”, “uma”, e “o / a” pode se referir a um ou mais a menos que especificamente observado de outra forma.
[0039] O uso do termo "ou" é usado para significar "e / ou" a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas às alternativas e "e / ou". Tal como aqui utilizado “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[0040] Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é usado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente ao dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre as amostras.
[0041] O termo "suporte sólido" ou "suporte" significa uma estrutura que fornece um substrato e / ou superfície sobre a qual as biomoléculas podem ser ligadas. Por exemplo, um suporte sólido pode ser um poço de ensaio (isto é, tal como uma placa de micro titulação ou uma placa de múltiplos poços), ou o suporte sólido pode ser uma localização num filtro, um arranjo, ou um suporte móvel, tal como um grânulo ou uma membrana (por exemplo, uma placa de filtro, partículas de látex, partículas paramagnéticas, ou faixa de fluxo lateral).
[0042] O termo "agente de ligação" se refere a uma molécula que pode se ligar especificamente e seletivamente a uma segunda (isto é, diferente) molécula de interesse. A interação pode ser não covalente, por exemplo, como resultado de ligações de hidrogênio, interações de van der Waals, ou eletrostáticas ou hidrofóbicas, ou pode ser covalente. O termo "agente de ligação solúvel" se refere a um agente de ligação que não está associado (isto é, ligado covalentemente ou não covalentemente) a um suporte sólido.
[0043] Tal como aqui utilizado, um "analito" se refere a uma molécula, composto ou célula que está sendo medida. O analito de interesse pode, em certas modalidades, interagir com um agente de ligação. Tal como aqui descrito, o termo “analito” pode se referir a uma proteína ou peptídeo de interesse. Um analito pode ser um agonista, um antagonista ou um modulador. Ou, um analito pode não ter um efeito biológico. Os analitos podem incluir pequenas moléculas, açúcares, oligossacarídeos, lipídeos, peptídeos, peptidomiméticos, compostos orgânicos e similares.
[0044] O termo “porção detectável ”ou“ biomolécula detectável ”ou“ repórter” ou “indicador” ou “porção indicadora” se refere a uma molécula que pode ser medida em um ensaio quantitativo. Por exemplo, uma porção indicadora pode compreender uma enzima que pode ser usada para converter um substrato em um produto que pode ser medido. Uma porção indicadora pode ser uma enzima que catalisa uma reação que gera emissões bioluminescentes (por exemplo, luciferase). Ou uma porção indicadora pode ser um radioisótopo passível de quantificação. Ou uma porção indicadora pode ser um fluoróforo. Ou, outras moléculas detectáveis podem ser usadas.
[0045] Tal como aqui utilizado, “bacteriófago” ou “fago” incluem um ou mais de uma pluralidade de vírus bacterianos. Nesta divulgação, os termos “bacteriófago” e “fago” incluem vírus tais como micobacteriófagos (tais como para TB e paraTB), micófago (tal como para fungos), fago de micoplasma e qualquer outro termo que se refere a um vírus que pode invadir bactérias vivas, fungos, micoplasmas, protozoários, leveduras e outros organismos vivos microscópicos e os utiliza para se replicar. Aqui, “microscópico” significa que a maior dimensão é um milímetro ou menos. Bacteriófagos são vírus que evoluíram na natureza para usar bactérias como meio de se replicarem. Um fago faz isso ao se ligar a uma bactéria e injetar seu DNA (ou RNA) naquela bactéria, induzindo-a a se replicar centenas ou até milhares de vezes. Isso é conhecido como amplificação do fago.
[0046] Tal como aqui utilizado, “região tardia do gene” se refere a uma região de um genoma viral que é transcrita no final do ciclo de vida viral. A região tardia do gene tipicamente inclui os genes mais abundantemente expressos (por exemplo, proteínas estruturais montadas na partícula do bacteriófago). Genes tardios são sinônimos de genes de classe III e incluem genes com funções de estrutura e montagem. Por exemplo, os genes tardios (sinônimos de classe III) são transcritos no fago T7, por exemplo, a partir de 8 minutos após a infecção até a lise, a classe I (por exemplo, RNA polimerase) é precoce a partir de 4 - 8 minutos, e a classe II a partir de 6 - 15 minutos, então há sobreposição no tempo de II e III. Um promotor tardio é aquele que está naturalmente localizado e ativo na referida região tardia do gene.
[0047] Tal como aqui utilizado, “cultivo para enriquecimento" se refere ao cultivo tradicional, tal como incubação em meios favoráveis à propagação de micro- organismos, e não deve ser confundido com outros usos possíveis da palavra "enriquecimento ", tal como enriquecimento por remoção do componente líquido de uma amostra para concentrar o micro-organismo nele contido, ou outras formas de enriquecimento que não incluam a facilitação tradicional da propagação do micro-organismo. O cultivo para enriquecimento por períodos de tempo pode ser empregado em algumas modalidades de métodos aqui descritos.
[0048] Tal como aqui utilizado “recombinante” se refere a modificações genéticas (isto é, ácido nucléico) normalmente realizadas em um laboratório para reunir material genético que de outra forma não seria encontrado. Este termo é aqui usado alternadamente com o termo “modificado”.
[0049] Tal como aqui utilizado “RLU” se refere a unidades de luz relativas medidas por um luminômetro (por exemplo, GLOMAX® 96) ou instrumento semelhante que detecta luz. Por exemplo, a detecção da reação entre luciferase e substrato apropriado (por exemplo, NANOLUC® com NANO-GLO®) é frequentemente reportada em RLU detectados.
[0050] Tal como aqui utilizado “tempo para resultados” se refere à quantidade total de tempo desde o início da incubação da amostra até o resultado gerado. O tempo para resultados não inclui nenhum tempo de teste de confirmação. A coleta de dados pode ser feita a qualquer momento após a geração de um resultado. Amostras
[0051] Cada uma das modalidades dos métodos e sistemas da invenção podem permitir a detecção rápida e quantificação de micróbios em uma amostra. Por exemplo, métodos de acordo com a presente invenção podem ser realizados em um período de tempo reduzido com resultados superiores.
[0052] Células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, células bacterianas que são patógenos alimentares ou da água.
[0053] As amostras podem ser líquidas, sólidas ou semissólidas. As amostras podem ser swabs de superfícies sólidas. As amostras podem incluir materiais ambientais, tais como amostras de água, ou os filtros de amostras de ar ou amostras de aerossóis de coletores de ciclone. As amostras podem ser de vegetais, carnes, peixes, aves, manteiga de amendoim, alimentos processados, fórmula infantil em pó, leite em pó, chás, amidos, ovos, leite, queijo, ou outros laticínios.
[0054] Em algumas modalidades, as amostras podem ser utilizadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação, concentração ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas, incluindo, mas não se limitando a, leite e sucos, podem ser analisadas diretamente. As amostras podem ser diluídas ou suspensas em solução, o que pode incluir, mas não está limitado a, uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriana. Uma amostra sólida ou semissólida pode ser suspensa em um líquido por trituração, misturando ou macerando o sólido no líquido. Uma amostra deve ser mantida dentro de uma faixa de pH que promova a adesão do bacteriófago à célula bacteriana hospedeira. Uma amostra também deve conter as concentrações adequadas de cátions divalentes e monovalentes, incluindo, mas não se limitando a Na+, Mg2+, e Ca2+. Preferencialmente, uma amostra é mantida a uma temperatura que mantém a viabilidade de quaisquer células patogênicas contidas dentro da amostra.
[0055] Em algumas modalidades do ensaio de detecção, a amostra é mantida a uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula patogênica presente na amostra. Por exemplo, durante as etapas em que os bacteriófagos se fixam às células bacterianas, é preferível manter uma amostra a uma temperatura que facilite a fixação do bacteriófago. Durante as etapas em que os bacteriófagos estão se replicando dentro de uma célula bacteriana infectada ou lisando essa célula infectada, é preferível manter uma amostra a uma temperatura que promova a replicação do bacteriófago e lise do hospedeiro. Essas temperaturas são de pelo menos cerca de 25 graus Celsius (ºC), mais preferencialmente não superiores a cerca de 35 graus C, mais preferencialmente cerca de 30 graus C.
[0056] Os ensaios podem incluir várias amostras controle apropriadas. Por exemplo, amostras controle que não contêm bacteriófagos ou amostras controle contendo bacteriófagos sem bactérias podem ser testadas como controles para os níveis de sinal de fundo.
Bacteriófago indicador
[0057] Tal como aqui descrito em maiores detalhes, as composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender agentes infecciosos para uso na detecção de micro-organismos patogênicos. Em certas modalidades, a invenção compreende um bacteriófago indicador recombinante, em que o genoma do bacteriófago é modificado geneticamente para incluir um gene indicador ou repórter. Em algumas modalidades, a invenção pode incluir uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador incorporado dentro do genoma do bacteriófago.
[0058] Um bacteriófago indicador recombinante pode incluir um gene repórter ou indicador. Em certas modalidades do agente infeccioso, o gene indicador não codifica para uma proteína de fusão. Por exemplo, em certas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de uma bactéria hospedeira resulta em um produto solúvel de proteína indicadora. Em certas modalidades, o gene indicador pode ser inserido em uma região tardia do gene de o bacteriófago. Genes tardios são geralmente expressos em níveis mais elevados do que outros genes de fago, uma vez que codificam para proteínas estruturais. A região tardia do gene pode ser uma região de gene de classe III e pode incluir um gene para uma principal proteína do capsídeo.
[0059] Algumas modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga a jusante do principal gene da proteína do capsídeo. Outras modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga a jusante do principal gene da proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, a sequência compreende um gene repórter com códon otimizado precedido por uma região não traduzida. A região não traduzida pode incluir um promotor de gene tardio do fago e local de entrada ribossomal.
[0060] Em algumas modalidades, um bacteriófago indicador é derivado a partir de fago específico para Listeria. Em algumas modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem ou coquetel de bacteriófagos de tipo selvagem é capaz de infectar pelo menos uma Listeria spp. alvo. Espécies de Listeria são onipresentes no meio ambiente e muitas vezes são encontradas na água, esgoto e solo. Em algumas modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem ou coquetel de bacteriófagos de tipo selvagem é capaz de infectar um ou mais, dois ou mais, ou três ou mais Listeria spp. alvos. Em certos casos, as espécies-alvo de Listeria são selecionadas a partir de L. monocytogenes, L. ivanovii e L. grayi.
[0061] Em algumas modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é da ordem Caudovirales de fagos. Caudovirales são uma ordem de bacteriófagos de cauda com genomas de DNA de fita dupla (dsDNA). Cada vírion da ordem Caudovirales tem uma cabeça icosaédrica que contém o genoma viral e uma cauda flexível. A ordem Caudovirales compreende cinco famílias de bacteriófago: Myoviridae (caudas contráteis longas), Siphoviridae (caudas longas não contráteis), Podoviridae (caudas curtas não contráteis), Ackermannviridae, e Herelleviridae. O termo miovírus pode ser usado para descrever qualquer bacteriófago com uma cabeça icosaédrica e uma cauda longa contrátil, que engloba bacteriófagos dentro de ambas as famílias Myoviridae e Herelleviridae.
Em algumas modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é um membro da família Myoviridae tais como, fago B054 de Listeria, fago LipZ5 de Listeria, fago PSU-VKH-LP041 de Listeria, e fago WIL-2 de Listeria.
Em outras modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é um membro da família Herelleviridae.
O gênero Pecentumvirus, sob a família Herelleviridae inclui bacteriófagos tais como fago LMSP-25 de Listeria, fago LMTA- 148 de Listeria, fago LMTA-34 de Listeria, fago LP-048 de Listeria, fago LP-064 de Listeria, fago LP-083-2 de Listeria, fago LP-125 de Listeria, vírus P100 de Listeria, fago List- 36 de Listeria, fago WIL-1 de Listeria, fago vB_LmoM_AG20 de Listeria, e vírus A511 de Listeria.
LMA4 e LMA8 também estão provavelmente no gênero pecentumvirus, sob a família Herelleviridae.
Em outras modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é LMA4 ou LMA8. Em alguns casos, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é LP-ES3A, o qual é derivado a partir de A511 mas foi adaptado para ser capaz de infectar sorotipo 3A de Listeria monocytogenes.
Ainda em outras modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é um membro da família Ackermannviridae.
Ainda em outras modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é um membro da família Siphoviridae, a qual inclui os fagos A006, A118, A500, B025, LP-026, LP-030-2, LP-030- 3, LP-037, LP-101, LP-110, LP-114, P35, P40, P70, PSA, vB_LmoS_188 e vB_Lmos_293 de Listeria.
Em outras modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é LP-ES1. LP-ES1 também é provável no gênero Homburgvirus, sob a família Siphoviridae.
[0062] Em algumas modalidades, um bacteriófago indicador é derivado a partir de fago específico para Listeria. Um bacteriófago indicador pode ser construído a partir de um Pecentumvírus, Tequatravírus, ViI, Kuttervírus, Homburgvírus, LMTA-94, LMA4, LMA8, P70, LP-ES1, LP-ES3A ou outro bacteriófago apresentando um genoma com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de homologia com o fago LMTA-94 de Listeria, P70, T7, tipo T7, T4, tipo T4, bacteriófago específico para Listeria spp., bacteriófagos ViI ou tipo ViI (Kuttervírus, conforme GenBank / NCBI). Em outras modalidades, o bacteriófago selecionado de tipo selvagem é LP-ES1, LP-ES3A, LMA4 ou LMA8. Em algumas modalidades, o fago indicador é derivado a partir de um bacteriófago que é altamente específico para um determinado microrganismo patogênico. As modificações genéticas podem evitar exclusões de genes do tipo selvagem e, portanto, o fago modificado pode permanecer mais semelhante ao agente infeccioso de tipo selvagem do que muitos fago comercialmente disponíveis. O bacteriófago de origem ambiental pode ser mais específico para bactérias encontradas no meio ambiente e, como tal, geneticamente distintas do fago disponível comercialmente.
[0063] Em outro aspecto da invenção, uma composição de coquetel compreende pelo menos um tipo de bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, a composição de coquetel compreende pelo menos um tipo de bacteriófago recombinante construído a partir de LMA4, LMA8, A511, P70, LP-ES1 e LP-ES3A. Em outras modalidades, a composição de coquetel compreende pelo menos um tipo de bacteriófago recombinante construído a partir de LMA8, LP-ES1 e LP-ES3A.
[0064] Além disso, os genes de fago considerados não essenciais podem apresentar função não reconhecida. Por exemplo, um gene aparentemente não essencial pode apresentar uma função importante na elevação do tamanho da explosão, tais como corte sutil, encaixe ou funções de corte na montagem. Portanto, deletar genes para inserir um indicador pode ser prejudicial. A maioria dos fagos pode empacotar DNA alguns por cento maiores do que seu genoma natural. Com esta consideração, um indicador de gene menor pode ser uma escolha mais apropriada para modificar um bacteriófago, especialmente aquele com um genoma menor. As proteínas OpLuc e NANOLUC® são apenas cerca de 20 kDa (aproximadamente 500 - 600 bp para codificar), enquanto FLuc é de cerca de 62 kDa (aproximadamente 1700 bp para codificar). Além disso, o gene repórter não deve ser expresso endogenamente pela bactéria (isto é, não faz parte do genoma bacteriano), deve gerar um sinal alto para a proporção do fundo, e deve ser prontamente detectável em tempo hábil. Em algumas modalidades, o gene indicador é uma luciferase. Em outras modalidades, o gene indicador é uma subunidade ativa de uma luciferase. NANOLUC® de Promega é uma luciferase de Oplophorus gracilirostris (camarão do fundo do mar) modificada. Em algumas modalidades, NANOLUC® combinado com NANO-GLO® de Promega, um substrato de imidazopirazinona (furimazina), pode fornecer um sinal robusto com fundo baixo.
[0065] Em algumas modalidades de fago indicador, o gene indicador pode ser inserido em uma região não traduzida para evitar a interrupção de genes funcionais, deixando os genes de fago de tipo selvagem intactos, o que pode levar a uma maior aptidão ao infectar cepas de bactérias não laboratoriais. Além disso, a inclusão de códons de parada em todos os três quadros de leitura pode ajudar a aumentar a expressão, reduzindo a leitura, também conhecida como expressão com vazamento. Essa estratégia também pode eliminar a possibilidade de uma proteína de fusão ser feita em níveis baixos, o que se manifestaria como sinal de fundo (por exemplo, luciferase) que não pode ser separado do fago.
[0066] Um gene indicador pode expressar uma variedade de biomoléculas. O gene indicador é um gene que expressa um produto detectável ou uma enzima que produz um produto detectável. Por exemplo, em uma modalidade o gene indicador codifica uma enzima luciferase. Vários tipos de luciferase podem ser usados. Em modalidades alternativas, e tal como aqui descrito em maiores detalhes, a luciferase é uma de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, luciferase de Renilla, ou uma luciferase projetada. Em algumas modalidades, o gene luciferase é derivado a partir de Oplophorus. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase geneticamente modificado, tal como NANOLUC®.
[0067] Então, em algumas modalidades, a presente invenção compreende um bacteriófago geneticamente modificado compreendendo um gene indicador não bacteriófago na região de gene tardia (classe III). Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo está sob o controle de um promotor tardio. Usando um promotor de gene tardio viral garante que o gene repórter (por exemplo, luciferase) não é apenas expresso em níveis elevados, como as proteínas do capsídeo viral, mas também não se desliga como genes bacterianos endógenos ou mesmo genes virais iniciais.
[0068] Em algumas modalidades, o promotor tardio é um promotor de Pecentumvírus, Tequatravírus, Homburgvírus, ou Kuttervírus, ou outro promotor de fago similar àquele encontrado no fago de tipo selvagem selecionado, isto é, sem modificação genética. A região tardia do gene pode ser uma região de gene de classe III, e o bacteriófago pode ser derivado a partir de fago LMTA-94, P70, A511, LP-ES1, LP- ES3A, LMA4, LMA8 de Listeria, Pecentumvírus, Tequatravírus, Homburgvírus, Kuttervírus, T7, T4, tipo T4, ViI, bacteriófago específico para Listeria spp., ou outro bacteriófago de tipo selvagem apresentando genoma com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 % de homologia para LMTA-94, LMA4, LMA8, Pecentumvírus, Tequatravírus, Homburgvírus, Kuttervírus, T7, T4, ViI, ou bacteriófago específico para Listeria. O promotor de gene tardio Pecentumvirus é distinto do promotor T4 ou Tequatravírus, pois consiste não apenas na região -10, mas também em uma região -35. Esta região -35 difere da região -35 padrão encontrada na maioria dos promotores bacterianos.
[0069] Modificações genéticas em agentes infecciosos podem incluir inserções, deleções ou substituições de um pequeno fragmento de ácido nucleico, uma parte substancial de um gene ou um gene inteiro. Em algumas modalidades, ácidos nucléicos inseridos ou substituídos compreendem sequências não nativas. Um gene indicador não nativo pode ser inserido dentro de um genoma de bacteriófago de tal modo que está sob o controle de um promotor de bacteriófago. Então, em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não faz parte de uma proteína de fusão. Isto é, em algumas modalidades, uma modificação genética pode ser configurada de tal modo que o produto de proteína indicadora não compreende polipeptídeos do bacteriófago de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o produto de proteína indicadora é solúvel. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de uma bactéria de interesse compreendendo a etapa de incubar uma amostra de teste com o referido bacteriófago recombinante.
[0070] Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador no bacteriófago da progênie após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína solúvel, livre. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não é contíguo com um gene que codifica para uma proteína fago estrutural e, portanto, não produz uma proteína de fusão. Diferente de sistemas que empregam uma fusão de uma porção de detecção à proteína do capsídeo (isto é, uma proteína de fusão), algumas modalidades da presente invenção expressam um indicador solúvel ou repórter (por exemplo, luciferase solúvel). Em algumas modalidades, o indicador ou repórter é idealmente livre de estrutura do bacteriófago. Isto é, o indicador ou repórter não está ligado à estrutura do fago. Assim, o gene para o indicador ou repórter não está fundido com outros genes no genoma do fago recombinante. Isso pode aumentar muito a sensibilidade do ensaio (até uma única bactéria) e simplificar o ensaio, permitindo que o ensaio seja concluído em duas horas ou menos para algumas modalidades, ao contrário das várias horas devido a etapas de purificação adicionais requeridas com os constructos que produzem proteínas de fusão detectáveis. Ainda, as proteínas de fusão podem ser menos ativas do que proteínas solúveis devido, por exemplo, a restrições de enovelamento de proteínas que podem alterar a conformação do sítio ativo da enzima ou o acesso ao substrato. Se a concentração for 1.000 células bacterianas / mL de amostra, por exemplo, menos do que quatro horas de infecção podem ser suficientes para a detecção da bactéria alvo.
[0071] Além disso, proteínas de fusão por definição limitam o número de porções ligadas às subunidades de uma proteína no bacteriófago. Por exemplo, usando um sistema disponível comercialmente projetado para servir como uma plataforma para uma proteína de fusão resultaria em cerca de 415 cópias da porção de fusão, correspondendo a cerca de 415 cópias do gene 10B da proteína do capsídeo em cada partícula do bacteriófago T7. Sem essa restrição, pode-se esperar que as bactérias infectadas expressem muito mais cópias da porção de detecção (por exemplo, luciferase) do que pode caber no bacteriófago. Além disso, proteínas de fusão grandes, tais como uma fusão capsídeo - luciferase, pode inibir a montagem da partícula do bacteriófago, produzindo assim menos progênie de bacteriófago. Assim, um produto indicador de gene solúvel e sem fusão pode ser preferível.
[0072] Em algumas modalidades, o fago indicador codifica para um repórter, tal como uma enzima detectável. O produto do gene indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectado por uma mudança de cor. Várias enzimas apropriadas estão disponíveis comercialmente, tais como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano (HRP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem servir como porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades,
luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis também podem ser porções indicadoras apropriadas.
[0073] Em algumas modalidades, o uso de uma porção de detecção solúvel elimina a necessidade de remover fago parental contaminante do lisado das células de amostra infectadas. Com um sistema de proteína de fusão, qualquer bacteriófago usado para infectar células de amostra teria a porção de detecção ligada, e seria indistinguível do bacteriófago filho que também contém a porção de detecção. Como a detecção de amostras de bactérias depende da detecção de uma porção de detecção recém-criada (sintetizada de novo), usar constructos de fusão requer etapas adicionais para separar porções antigas (parentais) de porções recém-criadas (bacteriófago filho). Isso pode ser alcançado ao lavar as células infectadas várias vezes, antes da conclusão do ciclo de vida do bacteriófago, inativando o excesso de fago parental após a infecção por meios físicos ou químicos e / ou modificando quimicamente o bacteriófago parental com uma porção de ligação (tal como biotina), que podem então ser ligados e separados (tal como por grânulos de Sepharose revestidos com estreptavidina). No entanto, mesmo com todas essas tentativas de remoção, o fago parental pode permanecer quando uma alta concentração de fago parental é usada para assegurar a infecção de um pequeno número de células da amostra, criando um sinal de fundo que pode obscurecer a detecção de sinal do fago da progênie celular.
[0074] Por outro lado, com a porção de detecção solúvel expressa em algumas modalidades da presente invenção, a purificação do fago parental a partir do lisado final é desnecessária, uma vez que o fago parental não tem nenhuma porção de detecção ligada. Então, qualquer porção de detecção presente após a infecção deve ter sido criada de novo, indicando a presença de uma bactéria ou bactéria infectada. Para aproveitar esse benefício, a produção e preparação do fago parental pode incluir a purificação do fago de qualquer porção de detecção livre produzida durante a produção do bacteriófago parental em cultura bacteriana. Técnicas padrão de purificação do bacteriófago podem ser empregadas para purificar algumas modalidades de fago de acordo com a presente invenção, tais como centrifugação do gradiente de densidade de sacarose, centrifugação do gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio, HPLC, cromatografia de exclusão de tamanho, e diálise ou tecnologias derivadas (tais como concentradores da marca Amicon – Millipore, Inc.). A ultracentrifugação isopícnica de cloreto de césio pode ser empregada como parte da preparação do fago recombinante da invenção, para separar as partículas de fago parental da proteína luciferase contaminante produzida na propagação do fago no hospedeiro bacteriano. Desse modo, o bacteriófago parental recombinante da invenção está substancialmente livre de qualquer luciferase gerada durante a produção na bactéria. A remoção da luciferase residual presente no estoque de fago pode reduzir substancialmente o sinal de fundo observado quando o bacteriófago recombinante é incubado com uma amostra teste.
[0075] Em algumas modalidades de bacteriófago modificado, o promotor tardio (promotor de classe III, por exemplo, de Pecentumvirus, Homburgvirus, T7, T4, ViI, ou LMA4 / 8) tem alta afinidade pela RNA polimerase do mesmo bacteriófago que transcreve genes para proteínas estruturais montadas na partícula do bacteriófago. Essas proteínas são as proteínas mais abundantes do fago, pois cada partícula do bacteriófago compreende dezenas ou centenas de cópias dessas moléculas. O uso de um promotor viral tardio pode garantir um nível ótimo de expressão da porção de detecção de luciferase. O uso de um promotor viral tardio derivado a partir de, específico para, ou ativo sob o bacteriófago de tipo selvagem original, o fago indicador é derivado a partir de (por exemplo, um Pecentumvirus, Homburgvirus, T4, T7, ViI, ou promotor tardio LMA4 / 8 com um sistema a base de Pecentumvirus, T4, T7, ViI ou LMA) pode ainda garantir a expressão ideal da porção de detecção. O uso de um promotor bacteriano padrão (não viral / não bacteriófago) pode, em alguns casos, ser prejudicial à expressão, uma vez que esses promotores são frequentemente regulados negativamente durante a infecção do bacteriófago (para que o bacteriófago priorize os recursos bacterianos para a produção da proteína do fago). Assim, em algumas modalidades, o fago é preferencialmente projetado para codificar e expressar em alto nível uma porção indicadora solúvel (livre), usando uma colocação no genoma que não limita a expressão ao número de subunidades de um componente estrutural do fago.
[0076] Composições da invenção pode compreender um ou mais agentes infecciosos de tipo selvagem ou geneticamente modificado (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes fagos indicadores que podem codificar e expressar as mesmas proteínas indicadoras ou diferentes. Em algumas modalidades, o coquetel de bacteriófago compreende pelo menos dois tipos diferentes de bacteriófago recombinantes. Métodos de preparação do bacteriófago indicador
[0077] Modalidades dos métodos para a preparação do bacteriófago indicador começam com a seleção de um bacteriófago de tipo selvagem para modificação genética. Alguns bacteriófago são altamente específicos para uma bactéria alvo. Isso apresenta uma oportunidade para detecção altamente específica.
[0078] Então, os métodos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos agentes de ligação, associada aos agentes infecciosos que reconhecem e se ligam a um determinado micro-organismo de interesse como um meio de amplificar um sinal e assim detectar baixos níveis de um micro-organismo (por exemplo, um único micro-organismo) presente em uma amostra. Por exemplo, os agentes infecciosos (por exemplo, bacteriófago) reconhecem especificamente os receptores de superfície de micro-organismos específicos e, assim, infectam especificamente esses micro-organismos. Como tal, esses agentes infecciosos podem ser agentes de ligação apropriados para o direcionamento um micro-organismo de interesse.
[0079] Algumas modalidades da invenção utilizam a especificidade de ligação e capacidade de expressão genética de alto nível do bacteriófago recombinante para um direcionamento rápido e sensível para infectar e facilitar a detecção de uma bactéria de interesse. Em algumas modalidades, um bacteriófago específico para Listeria é modificado geneticamente para incluir um gene repórter. Em algumas modalidades, a região tardia do gene de um bacteriófago é modificada geneticamente para incluir um gene repórter. Em algumas modalidades, um gene repórter está posicionado a jusante do gene do capsídeo principal. Em outras modalidades, um gene repórter está posicionado a jusante do gene do capsídeo principal. Em algumas modalidades, o constructo genético inserido ainda compreende seu próprio promotor exógeno dedicado para direcionar a expressão do gene indicador. O promotor exógeno está em adição a qualquer promotor endógeno no genoma do fago. Como o bacteriófago produz transcritos de mRNA policistrônicos, apenas um único promotor é necessário a jusante do primeiro gene / cístron no transcrito. Construções recombinantes convencionais usam apenas o promotor do bacteriófago endógeno para direcionar os genes inseridos. Por outro lado, a adição de um promotor adicional a jusante do gene repórter e sítio de ligação ribossomal pode aumentar a expressão do gene, agindo como um local de iniciação secundária para a transcrição. Os complicados e compactos genomas de vírus costumam ter genes sobrepostos em quadros diferentes, às vezes em duas direções diferentes.
[0080] Algumas modalidades dos métodos para a preparação de um bacteriófago indicador recombinante incluem selecionar um bacteriófago de tipo selvagem que infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo tal como Listeria spp.; preparar um plasmídeo de recombinação homóloga / vetor que compreende um gene indicador; transformar o plasmídeo de recombinação homóloga / vetor em bactérias patogênicas alvo; infectar as bactérias patogênicas transformadas alvo com o bacteriófago de tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante.
[0081] Vários métodos de projeto e preparação de um plasmídeo de recombinação homóloga são conhecidos. Vários métodos de transformação de bactérias com um plasmídeo são conhecidos, incluindo choque térmico, conjugação bacteriana mediada por F. pilus, eletroporação e outros métodos. Vários métodos para isolar um clone particular seguindo a recombinação homóloga também são conhecidos. Algumas modalidades de método aqui descritas utilizam estratégias específicas.
[0082] Então, algumas modalidades dos métodos para a preparação do bacteriófago indicador incluem as etapas de selecionar um bacteriófago de tipo selvagem que infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; determinar a sequência natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para a recombinação homóloga adjacente ao gene da principal proteína do capsídeo, em que a sequência compreende um gene repórter com códon otimizado; incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga dentro de um plasmídeo / vetor; transformar o plasmídeo / vetor em bactérias patogênicas alvo; selecionar para as bactérias transformadas; infectar as bactérias transformadas com o bacteriófago de tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo e o genoma do bacteriófago; determinar o título do lisado recombinante bacteriófago resultante; e realizar um ensaio de diluição limitante para enriquecer e isolar o bacteriófago recombinante. Algumas modalidades compreendem ainda repetir as etapas de diluição limitante e titulação, após o primeiro ensaio de diluição limitante, conforme necessário até que o bacteriófago recombinante represente uma fração detectável da mistura. Por exemplo, em algumas modalidades as etapas de diluição limitante e titulação podem ser repetidas até que pelo menos 1 / 30 do bacteriófago na mistura sejam recombinantes antes de isolar um clone particular do bacteriófago recombinante. Uma proporção de 1:30 recombinante:tipo selvagem é esperada, em algumas modalidades, para produzir uma média de 3.2 unidades de transdução (TU) por 96 placas (por exemplo, em uma placa de 96 poços). A proporção inicial de fago recombinante para tipo selvagem pode ser determinado pela realização de ensaios de diluição limitantes baseados em TCID50 (dose 50 % infecciosa de cultura de tecidos) conforme previamente descrito no pedido norte-americano nº US 15/409.258. Pela distribuição de Poisson, um proporção de 1:30 gera uma chance de 96 % de observação de pelo menos um TU em algum lugar nos 96 poços.
[0083] A Figura 1 mostra uma representação esquemática da estrutura genômica de um bacteriófago indicador recombinante da invenção. Para a modalidade mostrada na Figura 1, a porção de detecção é codificada por um gene luciferase 100 inserido dentro de uma região de fene tardia (classe III) 110, a qual é expressa no final do ciclo de vida viral. Genes tardios são geralmente expressos em níveis mais elevados do que outros genes do fago, uma vez que eles codificam para proteínas estruturais. Assim, na modalidade do fago recombinante mostrada na Figura 1, o gene indicador (isto é, luciferase) está inserido na região tardia do gene, logo após o gene para a principal proteína do capsídeo (cps) 120, e é um constructo compreendendo o gene luciferase 100. Em algumas modalidades, o constructo mostrado na Figura 1 pode incluir códons de parada em todos os 3 quadros de leitura para garantir que a luciferase não seja incorporada ao produto do gene cps através da criação de uma proteína de fusão. Também como mostrado na Figura 1, o constructo pode compreender um promotor tardio adicional dedicado 130 para direcionar a transcrição e a expressão do gene da luciferase. O constructo também compreende um sítio de ligação ao ribossomo (RBS) 140. Este constructo garante que a luciferase solúvel seja produzida de tal modo que a expressão não se limite ao número de proteína de capsídeos inerente ao sistema de exibição do fago.
[0084] Tal como aqui observado, em certas modalidades, pode ser preferível utilizar agentes infecciosos que foram isolados do ambiente para a produção dos agentes infecciosos da invenção. Neste sentido, agentes infecciosos que são específicos para micro-organismos derivados naturalmente podem ser gerados.
[0085] Por exemplo, Figura 2 mostra o genoma do bacteriófago LMA4, um bacteriófago de tipo selvagem que infecta especificamente Listeria spp. Tal como discutido nos exemplos, a principal proteína do capsídeo (cps) 240 e vários outros genes estruturais estão dentro da região tardia do gene 210, consistindo em genes estruturais, que codificam para proteínas do vírion. Os genes que codificam para o tRNA 220 representam a sequência genômica adjacente a, porém fora da região tardia do gene. Um gene hipotético homólogo à protease prohead putativa do fago LMTA-94 de Listeria 230 está a montante da cps 240, consistindo em genes estruturais, que codificam para proteínas do vírion. Outros genes tardios mostrados são homólogos à principal proteína do capsídeo (cps) putativa do fago LMTA-94 da Listeria 240, seguido por um terminador transcricional 250, e um homólogo à proteína da bainha da cauda (tsh) do fago LMTA-94 da Listeria 260. Uma vez que essas proteínas de vírion são expressas em um nível muito alto, qualquer gene inserido nesta região pode ter níveis de expressão semelhantes, desde que o promotor do gene tardios e / ou outros elementos de controle semelhantes sejam usados.
[0086] Existem inúmeros métodos e produtos comerciais conhecidos para a preparação de plasmídeos. Por exemplo, PCR, mutagênese dirigida ao local, digestão de restrição, ligação, clonagem e outras técnicas podem ser utilizadas em combinação para preparar plasmídeos. Plasmídeos sintéticos também pode ser pedidos comercialmente (por exemplo, GeneWiz). Cosmídeos também podem ser empregados, ou o sistema CRISPR / CAS9 pode ser usado para editar seletivamente um genoma de bacteriófago. Algumas modalidades dos métodos de preparação de um bacteriófago indicador recombinante incluem projetar um plasmídeo que pode se recombinar prontamente com o bacteriófago de tipo selvagem genoma para gerar genomas recombinantes. Ao projetar um plasmídeo, algumas modalidades incluem a adição de um gene repórter com códon otimizado, tal como um gene luciferase. Algumas modalidades ainda incluem a adição de elementos a montante da região não traduzida. Por exemplo, ao projetar um plasmídeo para recombinar com o genoma do bacteriófago específico para Listeria, uma região não traduzida a montante pode ser adicionada entre a sequência que codifica para a gp23 C terminal / principal proteína do capsídeo e o códon de partida do gene repórter NANOLUC®. A região não traduzida pode incluir um promotor, tal como um promotor T4, Tequatravírus, Homburgvírus, T7, tipo T7, Pecentumvírus, bacteriófago específico para Listeria, ViI ou Kuttervírus. A região não traduzida pode também incluir uma Sítio de Entrada Ribossômica / Ligação (RBS), também conhecida como “sequência Shine-Dalgarno” com sistemas bacterianos. Tanto ou ambos estes elementos, ou outros elementos não traduzidos, pode ser embutidas dentro de uma região não traduzida curta a montante feita de sequências aleatórias compreendendo cerca do mesmo conteúdo de GC que o resto do genoma do fago. A região aleatória não deve incluir uma sequência ATG, uma vez que atuará como um códon de partida.
[0087] As composições da invenção podem compreender vários agentes infecciosos e / ou indicadores de genes. Por exemplo, a Figura 3 mostra um constructo de plasmídeo de recombinação homóloga usado na fabricação do fago indicador específico para Listeria spp. Os constructos foram feitos e usados na recombinação com fago LMA4 de Listeria spp., fago LMA8 de Listeria spp., fago LP-ES3A de Listeria spp., fago LP-ES1 de Listeria spp. ou outros fagos específicos para Listeria para gerar o bacteriófago recombinante da invenção. O constructo na Figura 3 mostra um esquema geral para o plasmídeo de recombinação usado para a inserção da recombinação homóloga da luciferase NANOLUC® em ambos os fagos LMA4 e LMA8 de Pecentumvirus Listeria spp., cada um com 500 bp de sequência homóloga a montante e a jusante: plasmídeo de recombinação homóloga pCE104.HR.ListeriaPhage.NANOLUC.v2. Pecentumvirus.NANOLUC.v2 e o plasmídeo de recombinação usado para a inserção na recombinação homóloga da luciferase NANOLUC® em fago LP-ES1 de Homburgvirus Listeria spp., pCE104.HR.LP-ES1.NanoLuc.
[0088] Em certas modalidades um plasmídeo é projetado pCE104.HR.Pecentumvirus.NanoLuc.v2. A detecção / porção indicadora é codificada pelo repórter gene NANOLUC®
300. A inserção, representado pela série de retângulos, está no vetor de troca gram-positivo, pCE104 310. A região de recombinação homóloga a montante consiste em 500bp do fragmento da principal proteína do capsídeo C-terminal 320. Uma sequência de promotor tardio consenso Pecentumvirus & Sítio de Entrada Ribossômica / Ligação Shine-Dalgarno dentro da região 5’ não traduzida 330. O gene repórter NANOLUC® com códon otimizado 300 segue imediatamente depois. O terminador transcricional endógeno vem a seguir, junto com a região não traduzida (UTR) e fragmento hipotético N terminal da proteína que consiste na recombinação homóloga a jusante 340 estão no final da região de recombinação homóloga.
[0089] O fragmento da principal proteína do capsídeo é uma parte de um gene estrutural que codifica uma proteína do vírion. Como essas proteínas de vírion são expressas em um nível muito alto, qualquer gene inserido nesta região pode ter níveis de expressão semelhantes, desde que o promotor do gene tardios e / ou outros elementos de controle semelhantes sejam usados.
[0090] Em algumas modalidades, fago indicador de acordo com a invenção compreendem bacteriófago específico para Listeria geneticamente modificado para compreender um gene repórter tal como um gene luciferase. Por exemplo, um fago indicador pode ser bacteriófago específico para Listeria spp. em que o genoma compreende a sequência do gene NANOLUC®. Um genoma de bacteriófago NanoLuc específico para Listeria recombinante pode ainda compreender um promotor consenso Pecentumvirus, T4, T7, bacteriófago específico para Listeria, ViI, LMA4, ou LMA8 ou outro promotor tardio. Em modalidades adicionais, o promotor é um promotor exógeno. A inserção de um promotor exógeno para direcionar a expressão de um gene indicador é vantajosa uma vez que a expressão não está limitada pela expressão das proteínas de fago (por exemplo, a principal proteína do capsídeo).
[0091] Então, na modalidade do fago recombinante gerado como um resultado da recombinação, o gene indicador (isto é, NANOLUC®) está inserido dentro da região tardia do gene, logo a jusante do gene que codifica para a principal proteína do capsídeo, e então cria genomas de bacteriófago recombinante compreendendo o gene NANOLUC®. O constructo pode adicionalmente compreender o promotor consenso do fago LMTA-94 de Listeria, T4, T7, bacteriófago específico para Listeria, ViI ou outro promotor tardio ou outro promotor adequado para direcionar a transcrição e expressão do gene da luciferase. O constructo pode também compreender uma região não traduzida compósita sintetizado a partir de vários UTRs. Este constructo garante que a luciferase solúvel seja produzida de tal modo que a expressão não se limita ao número de proteína dos capsídeos inerente ao sistema de exibição de fago.
[0092] O fago recombinante gerado pela recombinação homóloga de um plasmídeo projetado para a recombinação com o genoma de fago de tipo selvagem pode ser isolado de uma mistura compreendendo uma porcentagem muito pequena (por exemplo, 0.005%) do total de genomas de fago. Após o isolamento, a produção em grande escala pode ser realizada para obter estoques de fago indicador recombinante de alto título apropriados para uso no ensaio de detecção de Listeria spp.. Além disso, a centrifugação do gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio pode ser usada para separar as partículas de fago da proteína luciferase contaminante para reduzir o fundo. Métodos de uso de agentes infecciosos para a detecção de Listeria spp.
[0093] Tal como aqui observado, em certas modalidades, a invenção pode compreender métodos de uso de partículas infecciosas para a detecção de micro-organismos. Os métodos da invenção podem ser incorporados de várias maneiras.
[0094] Em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com bacteriófago que infecta a bactéria de interesse, em que o bacteriófago compreende um gene indicador de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria de interesse resulta na produção de um produto solúvel de proteína indicadora; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra. Em alguns casos, a invenção compreende um método para a detecção de Listeria spp. em uma amostra compreendendo: incubar a amostra com uma composição de coquetel compreendendo pelo menos um bacteriófago recombinante específico para Listeria; e detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo bacteriófago recombinante, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que Listeria spp. está presente na amostra.
[0095] Em algumas modalidades, pelo menos um tipo de bacteriófago recombinante é construído a partir de LMA4, LMA8, A511, P70, LP-ES1, e LP-ES3A. Em outras modalidades, pelo menos um tipo de bacteriófago recombinante é construído a partir de LMA8, LP-ES1, e LP-ES3A.
[0096] Em certas modalidades, o ensaio pode ser realizado para utilizar um conceito geral que pode ser modificado para acomodar diferentes tipos ou tamanhos de amostra e formatos de ensaio. Modalidades que empregam o bacteriófago recombinante da invenção (isto é, bacteriófago indicador) podem permitir a detecção rápida de cepas de bactérias específicas tais como Listeria spp., com tempos totais de ensaio abaixo de 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0,
4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0,
10.5, 11.0, 11.5, 12, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0,
15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0,
21.0, 21.5 22.0, 22.5, 23.0, 23.5, 24.0, 24.5 25.0, 25.5, ou
26.0 horas, dependendo do tipo de amostra, tamanho da amostra e formato do ensaio. Por exemplo, o tempo necessário pode ser um pouco mais curto ou mais longo dependendo da cepa do bacteriófago e da cepa da bactéria a ser detectada no ensaio, tipo e tamanho da amostra a ser testada, condições necessárias para a viabilidade do alvo, complexidade do ambiente físico / químico, e a concentração de contaminantes bacterianos "endógenos" não-alvo.
[0097] O bacteriófago (por exemplo, fago T7, T4,P70 P100, A511, LP-ES3A, LP-ES1, LMA4 ou LMA8) pode ser projetado para expressar uma luciferase solúvel durante a replicação do fago. A expressão da luciferase é direcionada por um promotor de capsídeo viral (por exemplo, o bacteriófago Pecentumvirus ou promotor tardio T4), produzindo alta expressão. O fago parental é preparado de tal modo que está livre de luciferase, de modo que a luciferase detectada no ensaio deve vir da replicação do fago da progênie durante a infecção das células bacterianas. Assim, geralmente não há necessidade de separar o fago parental do fago da progênie.
[0098] A Figura 4 mostra um ensaio de placa de filtro para a detecção de Listeria usando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção. Resumidamente, as amostras 416 que incluem uma bactéria de interesse 418 podem ser adicionadas aos poços 402 de uma placa de filtro de múltiplos poços 404 e girada 406 para concentrar as amostras pela remoção de líquido da amostra. Fagos geneticamente modificados 420 são adicionados aos poços e incubados com meios adicionais adicionados por tempo suficiente para adsorção 408 seguido pela infecção da bactéria alvo e avanço do ciclo de vida do fago 410 (por exemplo, ~ 240 minutos). Por fim, o substrato de luciferase é adicionado e reage com qualquer luciferase presente 424. A emissão resultante é medida em um luminômetro 414 o qual detecta a atividade de luciferase 426.
[0099] Em algumas modalidades, o enriquecimento de bactérias na amostra não é necessário antes do teste. Em alguns casos, uma amostra pode ser enriquecida antes do teste por incubação em condições que estimulem o crescimento. Em tais modalidades, o período de enriquecimento pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 horas ou mais longo, dependendo do tipo e tamanho da amostra.
[0100] Em algumas modalidades, o bacteriófago indicador compreende uma porção indicadora detectável, e a infecção de uma única célula patogênica (por exemplo, bactéria) pode ser detectada por um sinal amplificado gerado por meio da porção indicadora. Então o método pode compreender detectar um porção indicadora produzida durante a replicação do fago, em que a detecção do indicador indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.
[0101] Em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção da bactéria de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta a bactéria de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região tardia do gene de o bacteriófago de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de bactérias hospedeiras resulta na produção de um produto solúvel de proteína indicadora; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra. Em algumas modalidades, a quantidade de porção indicadora detectada corresponde à quantidade de bactéria de interesse presente na amostra.
[0102] Tal como aqui descrito em maiores detalhes, os métodos e sistemas da invenção podem utilizar uma faixa de concentrações de bacteriófago indicador parental para infectar bactérias presentes na amostra. Em algumas modalidades o bacteriófago indicador é adicionado à amostra em uma concentrações suficiente para rapidamente encontra, se ligar e infectar bactérias alvo as quais estão presentes em números muito baixos na amostra, tais como dez células. Em algumas modalidades, a concentração do fago pode ser suficiente para encontrar, se ligar, e infectar as bactérias alvo em menos do que uma hora. Em outras modalidades, estes eventos podem ocorrer em menos do que duas horas, ou menos do que três horas, ou menos do que quatro horas, após a adição de fago indicador à amostra. Por exemplo, em certas modalidades, a concentração do bacteriófago para a etapa de incubação é maior do que 1 x 105 UFC / mL, maior do que 1 x 106 UFC / mL, ou maior do que 1 x 107 UFC / mL.
[0103] Em certas modalidades, o agente infeccioso recombinante pode ser purificado de modo a estar livre de qualquer proteína indicadora residual que pode ser gerada após a produção do estoque de agente infeccioso. Então, em certas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser purificado usando centrifugação do gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio antes da incubação com a amostra. Quando o agente infeccioso é um bacteriófago, esta purificação pode ter o benefício adicional de remover o bacteriófago que não apresenta DNA (isto é, fago vazio ou “fantasmas”).
[0104] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o micro-organismo pode ser detectado sem qualquer isolamento ou purificação do micro-organismos a partir de uma amostra. Por exemplo, em certas modalidades, uma amostra contendo um ou poucos micro-organismos de interesse podem ser aplicado diretamente a um recipiente de ensaio tal como uma coluna spin, um poço de micro titulação ou um filtro e o ensaio é conduzido nesse recipiente de ensaio. Várias modalidades dos referidos ensaios são aqui descritos.
[0105] Alíquotas de uma amostra teste podem ser distribuídas diretamente em poços de uma placa de múltiplos poços, fago indicador pode ser adicionado, e depois de um período de tempo suficiente para a infecção, um tampão de lise pode ser adicionado, bem como um substrato para a porção indicadora (por exemplo, substrato luciferase para uma luciferase indicadora) e analisado para a detecção do sinal indicador. Algumas modalidades do método podem ser realizadas em placas de filtro. Algumas modalidades do método podem ser realizadas com ou sem a concentração da amostra antes da infecção com fago indicador.
[0106] Por exemplo, em muitas modalidades, placas de múltiplos poços são usadas para conduzir os ensaios. A escolha das placas (ou qualquer outro recipiente no qual a detecção pode ser realizada) pode afetar a etapa de detecção. Por exemplo, algumas placas podem incluir um fundo colorido ou branco, o que pode afetar a detecção de emissões de luz. De um modo geral, as placas brancas têm maior sensibilidade, mas também produzem um sinal de fundo mais alto. Outras cores de placas podem gerar sinal de fundo inferior, mas também têm uma sensibilidade ligeiramente inferior. Além disso, uma razão para o sinal de fundo é o vazamento de luz de um poço para outro poço adjacente. Existem algumas placas que têm poços brancos, mas o resto da placa é preto. Isso permite um sinal alto dentro do poço, mas evita vazamento de luz poço- a-poço e, portanto, pode diminuir o fundo. Assim, a escolha da placa ou outro vaso para o ensaio pode influenciar a sensibilidade e o sinal de fundo para o ensaio.
[0107] Métodos da invenção pode compreender várias outras etapas para aumentar a sensibilidade. Por exemplo, tal como aqui discutido em mais detalhes, o método pode compreender uma etapa de lavagem da bactéria capturada e infectada, após a adição do bacteriófago porém antes da incubação, para remover o excesso de bacteriófago parental e / ou luciferase ou outra proteína repórter contaminante da preparação do bacteriófago.
[0108] Em algumas modalidades, a detecção do micro- organismo de interesse pode ser completada sem a necessidade de cultivo da amostra como uma forma de aumentar a população dos micro-organismos. Por exemplo, em certas modalidades o tempo total requerido para a detecção é de menos do que 28.0 horas, 27.0 horas, 26.0 horas, 25.0 horas, 24.0 horas, 23.0 horas, 22.0 horas, 21.0 horas, 20.0 horas, 19.0 horas, 18.0 horas, 17.0 horas, 16.0 horas, 15.0 horas, 14.0 horas, 13.0 horas, 12.0 horas, 11.0 horas, 10.0 horas, 9.0 horas, 8.0 horas, 7.0 horas, 6.0 horas, 5.0 horas, 4.0 horas, 3.0 horas,
2.5 horas, 2.0 horas, 1.5 horas, ou menos do que 1.0 hora. Minimizar o tempo de resultado é crítico em testes de alimentos e ambientais para patógenos.
[0109] Em contraste com os ensaios conhecidos na técnica, o método da invenção pode detectar micro-organismos individuais. Então, em certas modalidades, o método pode detectar tão pouco quanto 10 células do micro-organismo presente em uma amostra. Por exemplo, em certas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para Listeria spp. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir Listeria spp. na presença de outros tipos de bactérias. Em certas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser usado para detectar uma única bactéria do tipo específico na amostra. Em certas modalidades, o bacteriófago recombinante detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 das bactérias específicas na amostra.
[0110] Então, aspectos da presente invenção fornecem métodos para a detecção de micro-organismos em uma amostra teste por meio de uma porção indicadora. Em algumas modalidades, nas quais o micro-organismo de interesse é uma bactéria, a porção indicadora pode estar associada com um agente infeccioso tal como um bacteriófago indicador. A porção indicadora pode reagir com um substrato para emitir um sinal detectável ou pode emitir um sinal intrínseco (por exemplo, proteína fluorescente). Em algumas modalidades, a sensibilidade da detecção pode revelar a presença de tão pouco quanto 50, 40, 30, 20, 10, 5, ou 2 células do micro- organismo de interesse em uma amostra teste. Em algumas modalidades, até mesmo uma única célula do micro-organismo de interesse pode produzir um sinal detectável. Em algumas modalidades, o bacteriófago é um bacteriófago Pecentumvírus, Tequatravírus, Homburgvírus, ou Kuttervírus. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é derivado a partir de bacteriófago específico para Listeria. Em certas modalidades, um bacteriófago recombinante específico para Listeria é altamente específico para Listeria spp.
[0111] Em algumas modalidades, a porção indicadora codificada pelo agente infeccioso pode ser detectável durante ou após a replicação do agente infeccioso. Muitos tipos diferentes de biomoléculas detectáveis adequadas para uso como porções indicadoras são conhecidas na arte, e muitos estão disponíveis comercialmente. Em algumas modalidades o fago indicador compreende uma enzima, a qual serve como a porção indicadora. Em algumas modalidades, o genoma do fago indicador é modificado para codificar uma proteína solúvel. Em algumas modalidades, o fago indicador codifica uma enzima detectável. O indicador pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor em um substrato adicionado. Várias enzimas apropriadas estão disponíveis comercialmente, tais como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano (HRP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem servir como a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis também podem ser porções indicadoras apropriadas.
[0112] Então, em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante dos métodos, sistemas ou kits é preparada a partir de bacteriófago específico para Listeria de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o gene indicador codifica para a proteína que emite um sinal intrínseco, tal como uma proteína fluorescente (por exemplo, proteína verde fluorescente ou outras). O indicador pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Em algumas modalidades, o gene indicador codifica para uma enzima (por exemplo, luciferase) que interage com um substrato para gerar um sinal. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase. Em algumas modalidades, o gene luciferase é um de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Renilla, luciferase de Gaussia externa, luciferase de Lucia, ou uma luciferase projetada tal como NANOLUC®, Rluc8.6-535, ou nano-lanterna laranja.
[0113] Detectar o indicador pode incluir detectar emissões de luz. Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser usado para detectar a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com um substrato. A detecção de RLU pode ser alcançada com um luminômetro, ou outras máquinas ou dispositivos também podem ser usados. Por exemplo, um espectrofotômetro, câmera CCD, ou câmera CMOS pode detectar mudanças de cor e outras emissões de luz. O RLU absoluto é importante para a detecção, porém a proporção de sinal para o fundo também precisa estar alta (por exemplo, > 2.0, >
2.5, ou > 3.0) para que células únicas ou um baixo número de células sejam detectadas de forma confiável.
[0114] Em algumas modalidades, o fago indicador é geneticamente projetado para conter o gene para uma enzima, tal como uma luciferase, que só é produzida após a infecção de bactérias que o fago especificamente reconhece e infecta. Em algumas modalidades, a porção indicadora é expressa tardiamente no ciclo de vida viral. Em algumas modalidades,
tal como aqui descrito, o indicador é uma proteína solúvel (por exemplo, luciferase solúvel) e não está fundido com uma proteína estrutural do fago que limita seu número de cópia.
[0115] Então em algumas modalidades que utilizam fago indicador, a invenção compreende um método para a detecção de um micro-organismo de interesse compreendendo as etapas de capturar pelo menos uma bactéria da amostra; incubar a pelo menos um bactéria com uma pluralidade de fago indicador; permitir tempo para a infecção e replicação para gerar fago da progênie e expressar porção indicadora solúvel; e detectar o fago da progênie, ou preferencialmente o indicador, em que a detecção do indicador demonstra que a bactéria está presente na amostra.
[0116] Por exemplo, em algumas modalidades as bactérias da amostra teste podem ser capturadas ligando-se à superfície de uma placa, ou por filtração da amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, filtro spin de tamanho de poro de 0.45 μm ou filtro de placa). Em uma modalidade, o agente infeccioso (por exemplo, fago indicador) é adicionado em um volume mínimo à amostra capturada diretamente no filtro. Em uma modalidade, o micro- organismo capturado na superfície do filtro ou da placa é subsequentemente lavado uma ou mais vezes para remover o excesso de agente infeccioso não ligado. Em uma modalidade, um meio (por exemplo, caldo Luria-Bertani (LB), água peptonada tamponada (BPW) ou caldo de soja tríptico ou caldo de soja triptona (TSB), infusão de cérebro e coração (BHI), caldo tamponado de enriquecimento de Listeria (BLEB), caldo da Universidade de Vermont (UVM), ou caldo Fraser) pode ser adicionado para mais tempo de incubação, para permitir a replicação de células bacterianas e fago e a expressão em alto nível do gene que codifica para a porção indicadora. No entanto, um aspecto surpreendente de algumas modalidades de ensaios de teste é que a etapa de incubação com fago indicador só precisa ser longa o suficiente para um único ciclo de vida de fago. O poder de amplificação do uso do bacteriófago era pensado anteriormente para exigir mais tempo, de tal modo que o fago iria se replicar por vários ciclos. Um único ciclo de replicação de fago indicador pode ser suficiente para facilitar a detecção e detecção rápida de acordo com algumas modalidades da presente invenção.
[0117] Em algumas modalidades, alíquotas de uma amostra teste compreendendo bactérias podem ser aplicadas a uma coluna spin e após a infecção com um bacteriófago recombinante e uma lavagem opcional para remover qualquer excesso de bacteriófago, a quantidade de indicador solúvel detectada será proporcional à quantidade de bacteriófago que são produzidos por bactérias infectadas.
[0118] O indicador solúvel (por exemplo, luciferase) liberado no líquido circundante após a lise da bactéria pode então ser medido e quantificado. Em uma modalidade, a solução é centrifugada através do filtro, e o filtrado coletado para ensaio em um novo recipiente (por exemplo, em um luminômetro) após a adição de substrato para a enzima indicadora (por exemplo, substrato luciferase). Alternativamente, o sinal indicador pode ser medido diretamente no filtro.
[0119] Em várias modalidades, o fago indicador parental purificado não compreende o indicador detectável por si só, porque o fago parental pode ser purificado antes de ser usado para incubação com uma amostra teste. A expressão dos genes tardios (Classe III) ocorrem no final do ciclo de vida viral. Em algumas modalidades da presente invenção, o fago parental pode ser purificado para excluir qualquer proteína indicadora existente (por exemplo, luciferase). Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto solúvel de proteína indicadora. Então, em muitas modalidades, não é necessário separar os pais da progênie fago antes da etapa de detecção. Em uma modalidade, o micro-organismo é uma bactéria e o fago indicador é um bacteriófago. Em uma modalidade, a porção indicadora é a luciferase solúvel, que é liberada após a lise do micro-organismo hospedeiro.
[0120] Assim, em uma modalidade alternativa, o substrato indicador (por exemplo, substrato luciferase) pode ser incubado com a porção de uma amostra que permanece em um filtro ou ligada a uma superfície de placa. Assim, em algumas modalidades o suporte sólido é uma placa de filtro de 96 poços (ou placas regulares de 96 poços), e a reação do substrato pode ser detectada colocando a placa diretamente no luminômetro.
[0121] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de Listeria spp. compreendendo as etapas de: infectar células capturadas em uma placa de filtro de 96 poços com uma pluralidade de fago indicador parental capaz de expressar luciferase após infecção; lavar o excesso de fago; adicionar caldo BHI e permitir tempo para o fago replicar e lisar o alvo Listeria spp. específico (por exemplo, 60 - 240 minutos); e detectar a luciferase indicador pela adição de substrato de luciferase e medir a atividade da luciferase diretamente nas placas de 96 poços, em que a detecção de atividade da luciferase indica que a Listeria spp. está presente na amostra.
[0122] Em outra modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de Listeria spp. compreendendo as etapas de: infectar células em solução ou suspensão líquida em placas de 96 poços com uma pluralidade de fago indicador parental capaz de expressar luciferase após a infecção; permitir tempo para que o fago replique e lise o alvo de Listeria spp. específico (por exemplo, 60 - 240 minutos); e detectar a luciferase indicadora pela adição de substrato de luciferase e medir a atividade da luciferase diretamente nas placas de 96 poços, em que a detecção da atividade da luciferase indica que a Listeria spp. está presente na amostra. Na referida modalidade, nenhuma etapa de captura é necessária. Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser uma amostra de teste consumível, tal como uma lavagem vegetal. Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser uma lavagem vegetal fortificada com caldo Luria-Bertani (LB) concentrado, água peptonada tamponada (BPW) ou caldo de soja tríptico ou caldo de soja triptona (TSB), infusão de cérebro e coração (BHI), caldo tamponado de enriquecimento de Listeria (BLEB), caldo da Universidade de Vermont (UVM), ou caldo Fraser. Em algumas modalidades, a solução líquida ou suspensão podem ser bactérias diluídas em caldo BHI.
[0123] Em algumas modalidades, a lise das bactérias pode ocorrer antes, durante ou após a etapa de detecção. Os experimentos sugerem que as células infectadas não lisadas podem ser detectáveis após a adição de substrato de luciferase em algumas modalidades. Presumivelmente, a luciferase pode sair das células e / ou o substrato da luciferase pode entrar nas células sem lise celular completa. Então, para as modalidades que utilizam um sistema de filtro spin, onde apenas a luciferase liberada no lisado (e não a luciferase ainda dentro da bactéria intacta) é analisada no luminômetro, a lise é necessária para a detecção. No entanto, para as modalidades que utilizam, placas de filtro ou placas de 96 poços com a amostra em solução ou suspensão, nos quais a placa original cheia de células intactas e lisadas é analisada diretamente no luminômetro, não sendo necessária a lise para a detecção.
[0124] Em algumas modalidades, a reação da porção indicadora (por exemplo, luciferase) com o substrato pode continuar por 60 minutos ou mais, e a detecção em vários pontos no tempo pode ser desejável para otimizar a sensibilidade. Por exemplo, na modalidades que utiliza placas de filtro de 96 poços como suporte sólido e luciferase como indicador, leituras do luminômetro podem ser feitas inicialmente e em intervalos de 10 ou 15 minutos até que a reação seja completada.
[0125] Surpreendentemente, altas concentrações de fago utilizadas para infectar o teste conseguiram detectar com sucesso números muito baixos de um micro-organismo alvo em um período de tempo muito curto. A incubação do fago com uma amostra teste em algumas modalidades só precisa ser longa o suficiente para um único ciclo de vida de fago. Em algumas modalidades, a concentração do bacteriófago para esta etapa de incubação é maior do que 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1.0 x 107, 1.1 x 107, 1.2 x 107, 1.3 x 107, 1.4 x 107, 1.5 x
107, 1.6 x 107, 1.7 x 107, 1.8 x 107, 1.9 x 107, 2.0 x 107,
3.0 x 107, 4.0 x 107, 5.0 x 107, 6.0 x 107, 7.0 x 107, 8.0 x 107, 9.0 x 107, ou 1.0 x 108 UFC / mL.
[0126] O sucesso com as referidas altas concentrações de fago é surpreendente porque o grande número de fago foi anteriormente associado com “lise de fora”, que matou as células-alvo e assim impediu a geração de sinal útil nos ensaios de fago anteriores. É possível que a limpeza de estoques de fago preparados aqui divulgada ajude a amenizar esse problema (por exemplo, limpeza por ultracentrifugação por gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio), pois além de remover qualquer luciferase contaminante associada ao fago, esta limpeza também pode remover partículas fantasmas (partículas que perderam o DNA). As partículas fantasmas podem lisar células bacterianas por meio da “lise de fora”, matando as células prematuramente e assim evitando a geração de sinal indicador. A microscopia eletrônica demonstra que um lisado de fago bruto (isto é, antes da limpeza com cloreto de césio) pode ter mais de 50 % de fantasmas. Essas partículas fantasmas podem contribuir para a morte prematura do micro-organismo pela ação de várias partículas de fago perfurando a membrana celular. Assim, as partículas fantasmas podem ter contribuído para problemas anteriores, nos quais altas concentrações de UFC foram relatadas como prejudiciais. Além disso, uma preparação de fago muito limpa permite que o ensaio seja realizado sem etapas de lavagem, o que torna o ensaio possível para realização sem uma etapa de concentração inicial. Algumas modalidades incluem uma etapa de concentração inicial, e em algumas modalidades esta etapa de concentração permite um tempo de incubação de enriquecimento mais curto.
[0127] Algumas modalidades de métodos teste podem ainda incluir ensaios de confirmação. Uma variedade de ensaios são conhecidos na técnica para confirmar um resultado inicial, geralmente em um momento posterior. Por exemplo, as amostras podem ser cultivadas (por exemplo, plaqueamento cromogênico seletivo), e a PCR pode ser utilizada para confirmar a presença do DNA microbiano, ou outros ensaios confirmatórios podem ser usados para confirmar o resultado inicial.
[0128] Em certas modalidades, os métodos da presente invenção combinam o uso de um agente de ligação (por exemplo, anticorpo) para purificar e / ou concentrar um micro- organismo de interesse tais como Listeria spp. na amostra em adição à detecção com um agente infeccioso. Por exemplo, em certas modalidades, a presente invenção compreende um método para a detecção deum micro-organismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: capturar o micro- organismo a partir da amostra em um suporte anterior usando um anticorpo de captura específico para o micro-organismo de interesse tal como Listeria spp.; incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta Listeria spp. em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região tardia do gene de o bacteriófago de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto solúvel de proteína indicadora; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que Listeria spp. está presente na amostra.
[0129] Em algumas modalidades fagos sintéticos são projetados para otimizar características desejáveis para uso em ensaios de detecção de patógenos. Em algumas modalidades bioinformática e análises prévias de modificações genéticas são empregadas para otimizar características desejáveis. Por exemplo, em algumas modalidades, os genes que codificam para proteínas da cauda do fago podem ser otimizados para reconhecer e se ligar a determinadas espécies de bactérias. Em outras modalidades os genes que codificam para um produto proteínas da cauda do fago podem ser otimizados para reconhecer e se ligar a um gênero inteiro de bactérias, ou um grupo particular de espécies dentro de um gênero. Neste sentido, o fago pode ser otimizado para detectar grupos mais amplos ou estreitos de patógenos. Em algumas modalidades, o fago sintético pode ser projetado para melhorar a expressão do gene repórter. Adicionalmente e / ou alternativamente, em alguns casos, o fago sintético pode ser projetado para aumentar o tamanho de explosão do fago para melhorar detecção.
[0130] Em algumas modalidades, a estabilidade do fago pode ser otimizada para melhorar a vida útil. Por exemplo, a solubilidade enzimática pode ser aumentada a fim de aumentar a estabilidade do fago subsequente. Adicionalmente e / ou alternativamente, a termo estabilidade do fago pode ser otimizada. O fago termostável preserva melhor a atividade funcional durante o armazenamento, aumentando assim a vida útil. Assim, em algumas modalidades, a termo estabilidade e / ou tolerância ao pH pode ser otimizada.
[0131] Em algumas modalidades o fago geneticamente modificado ou o fago sinteticamente derivado compreende um indicador detectável. Em algumas modalidades, o indicador é uma luciferase. Em algumas modalidades o genoma do fago compreende um gene indicador (por exemplo, um gene luciferase ou outro gene que codifica para um indicador detectável). Sistemas e Kits da invenção
[0132] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas (por exemplo, sistemas automatizados ou kits) compreendendo componentes para realizar os métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, os fagos indicadores estão compreendidos em sistemas ou kits de acordo com a invenção. Os métodos aqui divulgados também podem utilizar o referido sistemas de fago indicador ou kits. Algumas modalidades aqui divulgadas são particularmente adequadas para automação e / ou kits, dada a quantidade mínima de reagentes e materiais necessários para realizar o métodos. Em certas modalidades, cada um dos componentes de um kit pode compreender uma unidade independente que pode ser entregue de um primeiro local para um segundo local.
[0133] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas ou kits para a detecção rápida de um micro-organismo de interesse em uma amostra. Os sistemas ou kits podem em certas modalidades compreender um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específico para o micro- organismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades de ambos os sistemas e os kits da invenção, o agente infeccioso é um bacteriófago recombinante que infecta a bactéria de interesse, e o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região tardia do gene do bacteriófago como a porção indicadora de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto solúvel de proteína indicadora. Alguns sistemas ainda compreendem um componente para a captura do micro- organismo de interesse em um suporte sólido.
[0134] Em outras modalidades, a invenção compreende um método, sistema, ou kit para a detecção rápida de um micro-organismo de interesse em uma amostra, compreendendo um componente de agente infeccioso que é específico para o micro-organismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora, e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o bacteriófago é um sinteticamente, ViI, Kuttervírus, Homburgvírus, Pecentumvírus, ou bacteriófago específico para Listeria spp.. em uma modalidade, o bacteriófago recombinante é derivado a partir de bacteriófago específico para Listeria spp.. Em certas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para uma bactéria particular. Por exemplo, em certas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para Listeria spp. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir Listeria spp. na presença de outros tipos de bactérias. Em certas modalidades, um sistema ou kit detecta tão pouco quanto 1, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 bactérias específicas na amostra.
[0135] Em certas modalidades, os sistemas e / ou kits podem ainda compreender um componente para lavar a amostra de micro-organismo capturado. Adicionalmente ou alternativamente, os sistemas e / ou kits podem ainda compreender um componente para determinar a quantidade de porção indicadora, em que a quantidade de porção indicadora detectada corresponde à quantidade de micro-organismo na amostra. Por exemplo, em certas modalidades, o sistema ou kit pode compreender um luminômetro ou outro dispositivo para medir a atividade da enzima luciferase.
[0136] Em alguns sistemas e / ou kits, o mesmo componente pode ser usado para várias etapas. Em alguns sistemas e / ou kits, as etapas são automatizadas ou controladas pelo usuário via computador e / ou em que um robô de manipulação de líquidos realiza pelo menos uma etapa.
[0137] Então, em certas modalidades, a invenção pode compreender um sistema ou kit para a detecção rápida de um micro-organismo de interesse em uma amostra, compreendendo: um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específico para o micro-organismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; um componente para capturar o micro-organismo a partir da amostra em um suporte sólido; um componente para lavar a amostra de micro-organismo capturado para remover agente infeccioso não ligado; e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o mesmo componente pode ser usado para as etapas de captura e / ou incubação e / ou lavagem (por exemplo, um componente de filtro). Algumas modalidades adicionalmente compreendem um componente para determinar a quantidade de micro-organismo de interesse na amostra, em que a quantidade de porção indicadora detecta corresponde à a quantidade de micro-
organismo na amostra. Os referidos sistemas podem incluir várias modalidades e submodalidades análogas àquelas descritas acima para os métodos de detecção rápida de micro- organismos. Em uma modalidade, o micro-organismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago. Em um sistema computadorizado, o sistema pode ser totalmente automatizado, semiautomatizado, ou dirigido pelo usuário por meio de um computador (ou alguma combinação dos mesmos).
[0138] Em algumas modalidades, o sistema pode compreender um componente para isolar o micro-organismo de interesse do outro componente na amostra.
[0139] Em uma modalidade, a invenção compreende um sistema ou kit compreendendo componentes para a detecção de um micro-organismo de interesse compreendendo: um componente para isolar pelo menos um micro-organismo de outros componentes na amostra; um componente para infectar pelo menos um micro-organismo com uma pluralidade de um agente infeccioso parental; um componente para lisar pelo menos um micro-organismo infectado para liberar os agentes infecciosos da progênie presente no micro-organismo; e um componente para a detecção dos agentes infecciosos da progênie, ou com maior sensibilidade, uma proteína solúvel codificada e expressa pelo agente infeccioso, em que detecção do agente infeccioso ou um produto de proteína solúvel do agente infeccioso indica que o micro-organismo está presente na amostra. O agente infeccioso pode compreender bacteriófago NANOLUC® específico para Listeria que carrega o gene indicador NANOLUC®.
[0140] Os sistemas ou kits pode compreender uma variedade de componentes para detecção de agentes infecciosos da progênie. Por exemplo, em uma modalidade, o agente infeccioso da progênie (por exemplo, bacteriófago) pode compreender uma porção indicadora. Em uma modalidade, a porção indicadora no agente infeccioso da progênie (por exemplo, bacteriófago) pode ser uma porção detectável que é expressa durante a replicação, tal como uma proteína solúvel de luciferase.
[0141] Em outras modalidades, a invenção pode compreender um kit para a detecção rápida de um micro- organismo de interesse em uma amostra, o sistema compreendendo: um componente para incubar a amostra com um agente infeccioso específico para o micro-organismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; um componente para capturar o micro-organismo de uma amostra em um suporte sólido; um componente para lavar a amostra de micro-organismo capturada para remover o agente infeccioso não ligado; e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o mesmo componente pode ser usado para as etapas de captura e / ou incubação e / ou lavagem. Algumas modalidades adicionalmente compreendem um componente para determinar a quantidade de micro-organismo de interesse na amostra, em que a quantidade de porção indicadora detectada corresponde à quantidade de microrganismo na amostra. Os referidos kits podem incluir diversas modalidades e submodalidades análogas às descritas acima para métodos de detecção rápida de micro-organismos. Em uma modalidade, o micro-organismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago.
[0142] Em algumas modalidades, um kit pode compreender um componente para isolar o micro-organismo de interesse dos outros componentes na amostra.
[0143] Estes sistemas e kits da invenção incluem vários componentes. Tal como aqui utilizado, o termo “componente” é amplamente definido e inclui qualquer aparelho adequado ou coleções de aparelhos adequados para a execução do método recitado. Os componentes não precisam estar integralmente conectados ou situados em relação uns aos outros de qualquer maneira particular. A invenção inclui quaisquer arranjos adequados dos componentes em relação uns aos outros. Por exemplo, os componentes não precisam estar na mesma sala. Mas, em algumas modalidades, os componentes são conectados uns aos outros em uma unidade integral. Em algumas modalidades, os mesmos componentes podem executar várias funções. Sistemas de computador e mídia legível por computador
[0144] O sistema, conforme descrito na presente técnica ou qualquer um de seus componentes, pode ser incorporado na forma de um sistema de computador. Exemplos típicos de um sistema de computador incluem um computador de uso geral, um microprocessador programado, um microcontrolador, um elemento de circuito integrado periférico e outros dispositivos ou arranjos de dispositivos que são capazes de implementar as etapas que constituem o método da presente técnica.
[0145] Um sistema de computador pode compreender um computador, um dispositivo de entrada, uma unidade de exibição e / ou a Internet. O computador pode ainda compreender um microprocessador. O microprocessador pode estar conectado a um barramento de comunicação. O computador pode também incluir uma memória. A memória pode incluir memória de acesso aleatório (RAM) e memória apenas de leitura (ROM). O sistema de computador pode ainda compreender um dispositivo de armazenamento. O dispositivo de armazenamento pode ser uma unidade de disco rígido ou uma unidade de armazenamento removível, tal como uma unidade de disquete, unidade de disco óptico, etc. O dispositivo de armazenamento também pode ser outro meio semelhante para carregar programas de computador ou outras instruções no sistema de computador. O sistema de computador também pode incluir uma unidade de comunicação. A unidade de comunicação permite que o computador se conecte a outras base de dados e à Internet através de uma interface I / O. A unidade de comunicação permite a transferência e recepção de dados de outras bases de dados. A unidade de comunicação pode incluir um modem, um cartão Ethernet ou qualquer dispositivo semelhante que permita ao sistema informático ligar-se a bases de dados e redes como LAN, MAN, WAN e Internet. O sistema de computador, portanto, pode facilitar as entradas de um usuário através de um dispositivo de entrada, acessível ao sistema através da interface I / O.
[0146] Um dispositivo de computação tipicamente incluirá um sistema operacional que fornece instruções de programa executáveis para a administração geral e operação desse dispositivo de computação, e normalmente incluirá um meio de armazenamento legível por computador (por exemplo, um disco rígido, memória de acesso aleatório, leitura apenas de memória, etc.) que armazena instruções que, quando executadas por um processador do servidor, permitem que o dispositivo de computação execute suas funções pretendidas. Implementações adequadas para o sistema operacional e funcionalidade geral do dispositivo de computação são conhecidas ou estão disponíveis comercialmente, e são prontamente implementadas por pessoas com habilidades comuns à técnica, particularmente à luz desta divulgação.
[0147] O sistema de computador executa um conjunto de instruções que são armazenadas em um ou mais elementos de armazenamento, a fim de processar os dados de entrada. Os elementos de armazenamento também podem conter dados ou outras informações, tal como desejado. O elemento de armazenamento pode estar na forma de uma fonte de informação ou de um elemento de memória física presente na máquina de processamento.
[0148] O ambiente pode incluir uma variedade de armazenamentos de dados e outras memórias e mídias de armazenamento tal como discutido acima. Eles podem residir em uma variedade de locais, tais como em um meio de armazenamento local para (e / ou residentes em) um ou mais computadores ou remotos a partir de qualquer um ou de todos os computadores da rede. Em um determinado conjunto de modalidades, as informações podem residir em uma rede de área de armazenamento ("SAN") familiar para aqueles versados na técnica. Da mesma forma, quaisquer arquivos necessários para o desempenho das funções atribuídas aos computadores, servidores ou outros dispositivos de rede podem ser armazenados localmente e / ou remotamente, conforme o caso. Onde um sistema inclui dispositivos de computação, cada um desses dispositivos pode incluir elementos de hardware que podem ser eletricamente acoplados por meio de um barramento, os elementos incluindo, por exemplo, pelo menos uma unidade de processamento central (CPU), pelo menos um dispositivo de entrada (por exemplo, um mouse, teclado, controlador, touch screen ou teclado), e pelo menos um dispositivo de saída (por exemplo, um dispositivo de exibição, impressora, ou alto-falante). Esse sistema também pode incluir um ou mais dispositivos de armazenamento, tais como unidades de disco, dispositivos de armazenamento óptico, e dispositivos de armazenamento de estado sólido, tais como memória de acesso aleatório ("RAM") ou memória somente leitura ("ROM"), também como dispositivos de mídia removíveis, cartões de memória, cartões flash, etc..
[0149] Os referidos dispositivos também podem incluir um leitor de mídia de armazenamento legível por computador, um dispositivo de comunicação (por exemplo, um modem, uma placa de rede (sem fio ou com fio), um dispositivo de comunicação infravermelho, etc.), e memória de trabalho tal como descrito acima. O leitor de mídia de armazenamento legível por computador pode ser conectado com, ou configurado para receber, um meio de armazenamento legível por computador, representando dispositivos de armazenamento remoto, local, fixo e / ou removível, bem como mídia de armazenamento para conter temporariamente e / ou mais permanentemente, o armazenamento, transmissão e recuperação de informações legíveis por computador. O sistema e vários dispositivos também incluirão, normalmente, uma série de aplicativos de software, módulos, serviços ou outros elementos localizados dentro de pelo menos um dispositivo de memória de trabalho, incluindo um sistema operacional e programas de aplicativos, tais como um aplicativo do cliente ou navegador da Web. Deve ser apreciado que as modalidades alternativas podem apresentar numerosas variações das descritas acima. Por exemplo, um hardware personalizado também pode ser usado e / ou elementos específicos podem ser implementados em hardware, software (incluindo software portátil, tais como applets), ou ambos. Além disso, a conexão a outros dispositivos de computação, tais como dispositivos de entrada / saída de rede, pode ser empregada.
[0150] Mídia de armazenamento não transiente e mídia legível por computador para conter código, ou partes de código, pode incluir qualquer mídia apropriada conhecida ou usada na técnica, incluindo mídia de armazenamento e mídia de comunicação, tais como, mas não limitada a mídia volátil e não volátil, removível e não removível implementada em qualquer método ou tecnologia de armazenamento e / ou transmissão de informações, tais como instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programa ou outros dados, incluindo RAM, ROM, EEPROM, memória flash ou outra tecnologia de memória, CD-ROM, disco versátil digital (DVD) ou outro armazenamento óptico, cassetes magnéticas, fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnético, ou qualquer outro meio que possa ser utilizado para armazenar a informação desejada e acessível pelo dispositivo do sistema. Com base na divulgação e nos ensinamentos aqui fornecidos, uma pessoa versada na técnica apreciará outras maneiras e / ou métodos para implementar as várias modalidades.
[0151] Um meio legível por computador pode compreender, mas não está limitado a, um dispositivo de armazenamento eletrônico, óptico, magnético ou outro capaz de fornecer um processador com instruções legíveis por computador. Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a, um disquete, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memória, ROM, RAM, SRAM, DRAM, memória endereçável por conteúdo ("CAM"), DDR, memória flash tal como NAND flash ou NOR flash, um ASIC, um processador configurado, armazenamento óptico, fita magnética ou outro armazenamento magnético, ou qualquer outro meio a partir do qual um processador de computador possa ler instruções. Em uma modalidade, o dispositivo de computação pode compreender um único tipo de meio legível por computador, tal como memória de acesso aleatório (RAM). Em outras modalidades, o dispositivo de computação pode compreender dois ou mais tipos de meio legível por computador, tais como memória de acesso aleatório (RAM), unidade de disco e cache. O dispositivo de computação pode estar em comunicação com um ou mais meios externos legíveis por computador, tal como uma unidade de disco rígido externa ou uma unidade externa de DVD ou Blu- Ray.
[0152] Conforme discutido acima, a modalidade compreende um processador que está configurado para executar instruções de programas executáveis por computador e / ou para acessar informações armazenadas na memória. As instruções podem compreender o processador específico para instruções geradas por um compilador e / ou um interpretador de código escrito em qualquer linguagem de programação de computador adequada incluindo, por exemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, JavaScript, e ActionScript (Adobe Sistemas, Mountain View, Califórnia). Em uma modalidade, o dispositivo de computação compreende um único processador. Em outras modalidades, o dispositivo compreende dois ou mais processadores. Tais processadores podem compreender um microprocessador, um processador de sinal digital (DSP), uma aplicação específica para circuito integrado (ASIC), matrizes de portas programáveis em campo (FPGAs), máquinas de estado. Tais processadores podem compreender ainda dispositivos eletrônicos programáveis, tais como PLCs, controladores de interrupção programáveis (PICs), dispositivos lógicos programáveis (PLDs), memórias somente leitura programáveis (PROMs), memórias somente leitura eletronicamente programáveis (EPROMs ou EEPROMs), ou outros semelhantes dispositivos.
[0153] O dispositivo de computação compreende uma interface de rede. Em algumas modalidades, a interface de rede é configurada para se comunicar por meio de links de comunicação com fio ou sem fio. Por exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação em redes via Ethernet, IEEE
802.11 (Wi-Fi), 802.16 (Wi-Max), Bluetooth, infravermelho, etc. Como outro exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação em redes como CDMA, GSM, UMTS, ou outras redes de comunicação celular. Em algumas modalidades, a interface de rede pode permitir conexões ponto a ponto com outro dispositivo, tais como via Universal Serial Bus (USB), FireWire 1394, conexões seriais ou paralelas, ou interfaces semelhantes. Alguns tipos de dispositivos de computação adequados podem compreender duas ou mais interfaces de rede para comunicação em uma ou mais redes. Em algumas modalidades, o dispositivo de computação pode incluir um armazenamento de dados, além de ou no lugar de uma interface de rede.
[0154] Algumas formas de dispositivos de computação adequadas podem compreender ou estar em comunicação com uma série de dispositivos externos ou internos, tais como um mouse, um CD-ROM, DVD, um teclado, um monitor, alto-falantes de áudio, um ou mais microfones, ou quaisquer outros dispositivos de entrada ou saída. Por exemplo, o dispositivo de computação pode estar em comunicação com vários dispositivos de interface de usuário e um monitor. O monitor pode usar qualquer tecnologia adequada, incluindo, mas não se limitando a, LCD, LED, CRT, e similares.
[0155] O conjunto de instruções para execução pelo sistema informático pode incluir vários comandos que instruem a máquina de processamento a realizar tarefas específicas, tais como as etapas que constituem o método da presente técnica. O conjunto de instruções pode estar na forma de um programa de software. Além disso, o software pode estar na forma de uma coleção de programas separados, um módulo de programa com um programa maior ou uma parte de um módulo de programa, tal como na presente técnica. O software também pode incluir programação modular na forma de programação orientada a objetos. O processamento de dados de entrada pela máquina de processamento pode ser em resposta a comandos do usuário, resultados de processamento anterior ou uma solicitação feita por outra máquina de processamento.
[0156] Embora a presente invenção tenha sido divulgada com referências a certas modalidades, numerosas modificações, alterações e mudanças nas modalidades descritas são possíveis sem se afastar do escopo e do âmbito da presente invenção, conforme definido nas reivindicações anexas. Nesse sentido, pretende-se que a presente invenção não seja limitada às formas descritas, mas que tenha o escopo completo definido pela linguagem das seguintes reivindicações, e seus equivalentes.
[0157] Resultados mostrados nos exemplos a seguir demonstram a detecção de um baixo número de células, tão pouco quanto 1 bactéria Listeria, em um tempo reduzido para resultados. Exemplo 1. Criação e isolamento de fago indicador a partir de bacteriófago específico para Listeria
[0158] Fago indicador específico para Listeria LMA4.NANOLUC, LMA8.NANOLUC, e outros bacteriófagos de Listeria foram criados através da recombinação homóloga usando procedimentos conforme previamente descritos. Vide as Figuras 1 - 3 as quais mostram e descrevem fagos de Listeria recombinantes derivados a partir de LMA4 e LMA8.
[0159] As sequências genômicas desses fagos foram obtidas por meio do sequenciamento do genoma completo usando o sistema Illumina MiSeq com montagem de sequência de novo. Com base em genomas previamente conhecidos e anotados de fago relacionado, as regiões tardia dos genes e genes da principal proteína do capsídeo foram localizados nos novos genomas do fago. Os plasmídeos foram projetados e sintetizados para inserir NANOLUC® junto com o promotor de gene tardio apropriado e sítio de ligação ribossomal, flanqueado por aproximadamente 200 - 500 bp de sequência de fago correspondente para promover a recombinação homóloga.
[0160] Bactérias alvo foram transformadas com os plasmídeos de recombinação homóloga sob seleção apropriada de antibióticos e infectados com seus respectivos fagos de tipo selvagem para permitir a recombinação homóloga com o plasmídeo. Após a recombinação homóloga para gerar os genomas de bacteriófago recombinante, séries etapas de titulação e enriquecimento foram usadas para isolar bacteriófagos recombinantes específicos que expressam NANOLUC® tal como previamente descrito.
[0161] Por fim, a produção em larga escala foi realizada para obter estoques de alto título apropriados para uso em ensaios de detecção de Listeria spp.. A centrifugação por gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio pode ser usada para separar as partículas de fago da proteína luciferase contaminante para reduzir o fundo. Em outras modalidades, a centrifugação de gradiente de densidade isopícnica de sacarose pode ser usada para separar as partículas de fago da proteína luciferase contaminante para reduzir o fundo. Exemplo 2. Amostra de esponja inoculada - Ensaio de esponja para Listeria
[0162] Amostradores de esponja de poliuretano EZ Reach foram pré-umedecidos com caldo Dey / Engley e inoculado com < 1 UFC de Listeria monocytogenes, o qual foi diluído a partir de uma cultura durante a noite ou com 100 UFC de bactérias desafio (Cronobacter sakazakii).
[0163] O cabo da esponja foi quebrado e a esponja foi colocada no meio em um saco. Adicionou-se meio tampão de enriquecimento de Listeria (BLEB) (Remel) (10 ou 90 mL) para cobrir o máximo possível da esponja. A esponja foi então massageada suavemente para liberação das bactérias no meio e enriquecimento seguido a 35 °C por 16 - 18 horas ou 24 horas. Após o enriquecimento, as esponjas foram massageadas / espremidas suavemente para remover o líquido e, em seguida, foram retiradas do meio no saco. O saco foi então massageado suavemente para misturar o conteúdo. Alíquotas de 150 µL foram transferidas para uma placa de 96 poços. A esponja foi então colocada no meio para enriquecimento adicional a 35 °C, se necessário.
[0164] Amostras de esponja foram testadas com coquetel de fago de Listeria após infecção de 1 hora e 4 horas. Resumidamente, reagente de fago (10 µL) foi adicionado às amostras e incubadas a 30 °C por 1 hora ou 4 horas. Por fim, 65 µL do reagente Luciferase Master Mix foram adicionados a cada poço e suavemente misturados por pipetagem para cima e para baixo. As amostras foram lidas (isto é, luminescência detectada) em um aparelho luminômetro (GloMax96) 3 minutos após a adição do substrato. As esponjas / swabs foram recolocados no saco / tubo e o enriquecimento continuou a 35 °C durante um total de 24 horas. Opcionalmente, as alíquotas podem ser retiradas e enriquecidas e testadas novamente.
[0165] Os resultados são mostrados nas Figuras 5A e 5B. Uma proporção de sinal para o fundo (S / B) maior do que 3 foi considerada positiva. O nível de fundo foi determinado como sendo 100 RLU com base nas caracterizações anteriores de fago. Esses experimentos indicam que o Ensaio de Fago de Listeria pode detectar uma inoculação de 1 UFC de L. monocytogenes ATCC 19115 após 16 - 18 horas de enriquecimento e 1 hora de infecção. A Figura 5A (10 mL de meio) mostra que as amostras de esponja 1 e 4 foram negativas para a detecção de Listeria (isto é, S / B < 3.0). As amostras de esponja 2, 3, 5 e o controle de 10 UFC foram todas positivas para todos os tempos de enriquecimento e infecção. A Figura 5B (90 mL de meio) mostra que a esponja 1 foi negativa para a detecção de Listeria enquanto todas as outras amostras tiveram detecção positiva. Esses dados indicam que as esponjas com 10 mL de meio adicionado geraram um melhor sinal com S / B relativo maior do que as amostras com 90 mL de meio adicionado.
[0166] Assim, a experiência demonstra que é possível detectar 1 inoculação de UFC de uma cultura durante a noite com todas as condições testadas (isto é, enriquecimento de 16 - 18 horas - infecção de 1 hora, enriquecimento de 16 - 18 horas - infecção de 4 horas, enriquecimento de 24 horas - infecção de 1 hora, e enriquecimento de 24 horas – infecção de 4 horas). Exemplo 3. Amostra de superfície ambiental - Ensaio de esponja para Listeria
[0167] As superfícies de aço inoxidável foram inoculadas com o número indicado de células no meio. As células foram deixadas secar na superfície e mantidas em temperatura ambiente por 18 - 24 horas antes de serem esfregadas com EZ Reach. Amostradores de esponja de poliuretano foram pré-umedecidos com meio Letheen (World BioProducts). Listeria monocytogenes 19115 foi usada como alvo e Staphylococcus aureus 12600 foi usado como a cepa desafio.
[0168] O cabo da esponja foi quebrado e a esponja colocada de volta no meio no saco. Adicionou-se meio tampão de enriquecimento de Listeria (BLEB) (Remel) (20 mL) para cobrir o máximo possível da esponja. A esponja foi então massageada suavemente para liberação das bactérias no meio e enriquecimento seguido a35 °C por 20 horas. Após o enriquecimento, as esponjas foram massageadas / espremidas suavemente para remover o líquido e, em seguida, foram retiradas do meio no saco. O saco foi então massageado suavemente para misturar o conteúdo. Alíquotas de 150 µL foram transferidas para uma placa de 96 poços. A esponja foi então colocada no meio para enriquecimento adicional a 35 °C, se necessário.
[0169] Amostras de esponja foram testadas com coquetel de fago de Listeria após infecção de 1 hora e 4 horas. Resumidamente, reagente de fago (10 µL) foi adicionado às amostras e incubadas a 30 °C por 4 horas. Por fim, 65 µL do reagente Luciferase Master Mix foram adicionados a cada poço e suavemente misturados por pipetagem para cima e para baixo. As amostras foram lidas (isto é, luminescência detectada) em um instrumento GloMax96 3 minutos após a adição do substrato.
[0170] Reagente de fago (10 µL) foi adicionado às amostras e incubadas a 30 °C por 4 horas. Por fim, 65 µL do reagente Luciferase Master Mix foram adicionados a cada poço e suavemente misturados por pipetagem para cima e para baixo. As amostras foram lidas (isto é, luminescência detectada) em um instrumento GloMax96 3 minutos (180 segundos) após a adição do substrato.
[0171] A Figura 6 mostra o RLU gerado a partir dos swabs de superfície de aço inoxidável. As amostras que geraram RLU > 300 foram consideradas positivas. Estes dados mostram que o Ensaio de Fago de Listeria pode detectar uma inoculação de superfície de 100 UFC de L. monocytogenes com um enriquecimento de 20 horas e 4 horas de infecção na presença de uma bactéria não Listeria presente em um nível de UFC 10 vezes maior do que a bactéria Listeria alvo. A amostra 2 e o controle negativo foram negativos para a detecção de L. monocytogenes.
Todas as outras amostras, incluindo o controle positivo, foram positivas.
Em comparação com os experimentos com esponja inoculada, os swabs de aço inoxidável exigiram um período de enriquecimento mais longo e um nível mais alto de UFC para detecção positiva.
Isso pode ser atribuído a várias variáveis, incluindo aumento do dano às células inoculadas na superfície em comparação com as de uma cultura noturna.
As células inoculadas na superfície normalmente apresentam perda significativa de viabilidade.
Além disso, a recuperação de células de esponjas de superfície pode ser altamente variável.
Claims (25)
1. Bacteriófago recombinante CARACTERIZADO por compreender um gene indicador inserido em uma região tardia do gene do genoma do bacteriófago, em que o bacteriófago recombinante infecta especificamente Listeria spp.
2. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o bacteriófago recombinante ser construído a partir de um de bacteriófago LMA4, LMA8, A511, P70, LP-ES1 e LP-ES3A.
3. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o gene indicador ser com códon otimizado e codificar um produto de proteína solúvel que gera um sinal intrínseco ou uma enzima solúvel que gera sinal após a reação com um substrato.
4. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreender ainda uma região não traduzida a montante do gene indicador com códon otimizado, em que a região não traduzida inclui um promotor de gene tardio do bacteriófago e um local de entrada ribossomal.
5. Composição de coquetel CARACTERIZADA por compreender pelo menos um bacteriófago recombinante conforme definido na reivindicação 1.
6. Composição de coquetel, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA por pelo menos um bacteriófago recombinante ser construído a partir de um de LMA4, LMA8, A511, P70, LP-ES1 e LP-ES3A.
7. Composição de coquetel, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA por compreender pelo menos dois bacteriófagos recombinantes construídos a partir de dois de LMA8, LP-ES1 e LP-ES3A.
8. Método de preparação de um bacteriófago indicador recombinante CARACTERIZADO por compreender: selecionar um bacteriófago de tipo selvagem que infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um plasmídeo de recombinação homóloga / vetor compreendendo um gene indicador; transformar o plasmídeo de recombinação homóloga / vetor em bactérias patogênicas alvo; infectar as bactérias patogênicas transformadas alvo com o bacteriófago de tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO por preparar um plasmídeo de recombinação homóloga / vetor compreende: determinar a sequência de nucleotídeos natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para a recombinação homóloga a jusante da principal gene da proteína do capsídeo, em que a sequência compreende um gene indicador com códon otimizado; e incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga dentro de um plasmídeo / vetor.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO por projetar uma sequência ainda compreendendo inserir uma região não traduzida incluindo um promotor de gene tardio do fago e local de entrada ribossomal a jusante do gene indicador com códon otimizado.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO por o plasmídeo de recombinação homóloga compreender uma região não traduzida incluindo um promotor de gene tardio do bacteriófago e um local de entrada ribossomal a jusante do gene indicador com códon otimizado.
12. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO por o bacteriófago de tipo selvagem ser um bacteriófago específico para Listeria e a bactéria patogênica alvo ser Listeria monocytogenes ou outra Listeria spp.
13. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO por isolar um clone particular do bacteriófago recombinante compreendendo um ensaio de diluição limitante para isolar um clone que demonstra a expressão do gene indicador.
14. Método para a detecção de Listeria spp. em uma amostra CARACTERIZADO por compreender: incubar a amostra com uma composição de coquetel compreendendo pelo menos um bacteriófago recombinante específico para Listeria conforme definido na reivindicação 1; e detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo bacteriófago recombinante, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que Listeria spp. está presente na amostra.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por pelo menos um bacteriófago recombinante ser construído a partir de um de LMA4, LMA8, A511, P70, LP- ES1 e LP-ES3A.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por compreender pelo menos dois bacteriófagos recombinantes construídos a partir de pelo menos dois de LMA8, LP-ES1 e LP-ES3A.
17. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por a amostra ser uma amostra alimentar, de meio ambiente, de água ou comercial.
18. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por o método detectar tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO por a amostra alimentar compreender carne, peixe, vegetais, ovos, laticínios, produtos alimentícios desidratados ou fórmula infantil em pó.
20. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por a amostra ser primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de menos do que 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, ou 2 horas.
21. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por o tempo total para resultados ser de menos do que 28 horas, 27 horas, 26 horas, 25 horas, 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, ou 2 horas.
22. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por a proporção de sinal para o fundo gerado pela detecção do indicador ser de pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5 ou pelo menos 3.0.
23. Kit para a detecção de Listeria spp. CARACTERIZADO por compreender um bacteriófago recombinante derivado a partir de um bacteriófago específico para Listeria.
24. Kit, de acordo com a reivindicação 23 CARACTERIZADO por compreender ainda um substrato para reagir com um indicador para detectar o produto de proteína solúvel expresso pelo bacteriófago recombinante.
25. Sistema para a detecção de Listeria spp. caracterizado por compreender bacteriófagos recombinantes derivados a partir de um bacteriófago específico para Listeria.
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