BR112020018017A2

BR112020018017A2 - Métodos para a detecção de microrganismos utilizando proteína de detecção de microrganismo e outras aplicações de componentes de ligação celular

Info

Publication number: BR112020018017A2
Application number: BR112020018017-3A
Authority: BR
Inventors: Stephen Erickson; Jose S. Gil; Minh Mindy Bao Nguyen; Dwight L. Anderson; Wendy Hahn; John Paulson
Original assignee: Laboratory Corporation Of America Holdings
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2020-12-22
Also published as: CN112740041A; CA3093277A1; EP3762724A1; JP2021516964A; AU2019231316A1; WO2019173838A1; JP2024038515A; US20190276868A1

Abstract

são aqui divulgados métodos e sistemas para a rápida detecção de microrganismos utilizando um componente de ligação celular (cbc). a especificidade dos cbss para a ligação de microrganismos permite a detecção direcionada e altamente específica de um microrganismo de interesse.

Description

MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS UTILIZANDO PROTEÍNA DE DETECÇÃO DE MICRORGANISMO E OUTRAS APLICAÇÕES DE COMPONENTES DE LIGAÇÃO CELULAR REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica a prioridade dos pedidos provisórios norte-americanos nos. US 62/640.793, depositado em 9 de março de 2018 e US 62/798.980, depositado em 30 de janeiro de 2019. As divulgações dos pedidos norte- americanos nos. US 13/773.339, US 14/625.481, US 15/263.619, US 15/409.258 e pedidos provisórios norte-americanos nos. US 62/616.956, US 62/628.616, US 62/661.739, US 62/640.793, e US 62/798.980 são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A invenção se refere métodos, aparelhos, sistemas para a detecção de microrganismo de interesse utilizando proteínas recombinantes e / ou conjugadas.

ANTECEDENTES

[0003] Existe um forte interesse em melhorar a velocidade e sensibilidade para a detecção de bactérias, vírus e outros microrganismos em amostras biológicas, alimentares, de água e clínicas. Patógenos microbianos podem causar morbidade substancial entre humanos e animais domésticos, bem como imensa perda econômica. A detecção de microrganismos é uma alta prioridade para a Administração de Alimentos e Fármacos (em inglês, Food and Drug Administration - FDA) e os Centros de Controle de Doenças (em inglês Centers for Disease Control - CDC) devido a surtos de doenças fatais ou com risco de vida causados pela ingestão de alimentos contaminados com determinados microrganismos, por exemplo,

Staphylococcus spp., Escherichia coli ou Salmonella spp.

[0004] Os testes microbiológicos tradicionais para a detecção de bactérias dependem de culturas de enriquecimento não seletivas e seletivas, seguidos de plaqueamento em meios seletivos e testes adicionais para confirmar colônias suspeitas. Os referidos procedimentos podem exigir diversos dias. Uma variedade de métodos rápidos tem sido investigada e introduzida na prática para reduzir a exigência de tempo. Entretanto, até o momento, os métodos que reduzem a exigência de tempo apresentam inconvenientes. Por exemplo, as técnicas que envolvem ensaios imunológicos diretos ou sondas genéticas geralmente requerem uma etapa de enriquecimento durante a noite a fim de obter a sensibilidade adequada e, portanto, carecem da capacidade de fornecer resultados no mesmo dia. Os testes de reação em cadeia da polimerase (PCR) também incluem uma etapa de amplificação e, portanto, são capazes tanto de sensibilidade e seletividade muito altas; entretanto, um tamanho de amostra que pode ser submetido economicamente a testes de PCR é limitado. As suspensões bacterianas diluídas capazes de serem submetidas à PCR estarão livres de células e, portanto, etapas de purificação e / ou enriquecimento demorado ainda são necessárias.

[0005] O tempo necessário para o enriquecimento biológico tradicional é ditado pela taxa de crescimento da população bacteriana alvo de uma amostra, pelo efeito da matriz da amostra, e pela sensibilidade requerida. Na prática, a maioria dos métodos de alta sensibilidade emprega uma incubação durante a noite e leva cerca de 24 horas no total. Devido ao tempo requerido para o cultivo, estes métodos podem levar até três dias, dependendo do organismo a ser identificado e da fonte da amostra. Este tempo de atraso é geralmente inadequado, uma vez que os referidos atrasos permitem que alimentos ou água contaminados ou outros produtos façam seu caminho em direção a rebanhos ou humanos. Em adição, aumentos nas bactérias resistentes a antibióticos e considerações biodefensivas torna uma prioridade crítica a identificação rápida de patógenos bacterianos em amostras de água, alimentares e clínicas em todo o mundo.

[0006] Sendo assim, existe uma necessidade de detecção e identificação mais rápida, simples e sensível de microrganismos, tais como bactérias e outros microrganismos potencialmente patogênicos.

SUMÁRIO

[0007] Modalidades da invenção compreendem composições, métodos, aparelhos, sistemas e kits para a detecção de microrganismos. Em determinadas modalidades, um componente de ligação celular (CBC) é utilizado para detectar microrganismos de interesse. A invenção pode ser incorporada em uma variedade de formas.

[0008] Em um aspecto, a presente invenção compreende métodos para o teste de uma amostra para a presença de um microrganismo de interesse utilizando uma sonda de detecção de microrganismo (MDP). Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um método para a captura e detecção de tão pouco quanto um único microrganismo de interesse em uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, os métodos podem compreender as etapas de incubar a amostra com uma pluralidade de MDPs as quais se ligam ao microrganismo de interesse, em que a MDP compreende uma porção indicadora e um componente de ligação celular (CBC) sob condições de modo que o microrganismo se ligue à pluralidade de MDPs; separar as MDP não ligadas da MDP ligada à célula; e detectar a porção indicadora na MDP ligada à célula. Em modalidades adicionais, a detecção positiva da porção indicadora indica que o microrganismo de interesse está presente na amostra. Em algumas modalidades, a pluralidade de MDPs ligada ao único microrganismo é de pelo menos 1 x 106. Em modalidades adicionais, o CBC é específico para bactérias Gram-negativas ou bactérias Gram-positivas. A bactéria Gram-negativa pode ser uma Salmonella spp ou E. coli O157:H7. A bactéria Gram- positiva pode ser uma Listeria spp ou Staphylococcus spp.

[0009] Em outros aspectos adicionais e / ou alternativos, a presente invenção pode compreender métodos para a separação do excesso de MDP não ligada da MDP ligada à célula. Em algumas modalidades, a separação compreende capturar o microrganismo de interesse em um suporte sólido. Por exemplo, o suporte sólido pode compreender pelo menos um de uma placa de múltiplos poços, um filtro, um grânulo, uma faixa de fluxo lateral, uma faixa filtrante, disco de filtro, e papel de filtro. O método pode ainda compreender uma etapa para lavar o microrganismo capturado, a fim de remover o excesso de MDP não ligado. Em algumas modalidades, o microrganismo ligado à MDP está fixado em um suporte sólido para exame por microscopia de fluorescência.

[0010] Em outros aspectos adicionais e / ou alternativos, a presente invenção utiliza a alta especificidade das MDPs que podem ligar um microrganismo para detectar baixos níveis de um microrganismo. Em algumas modalidades, o método detecta tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar. Em outras modalidades, a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos. Em algumas modalidades, a amostra é não enriquecida antes da incubação com a pluralidade de MDPs.

[0011] Em outro aspecto, a invenção compreende uma sonda de detecção de microrganismo recombinante (MDP) compreendendo um componente de ligação celular (CBC) e uma porção indicadora. Em algumas modalidades, o CBC é específico para bactérias Gram-negativas ou bactérias Gram-positivas. O CBC pode ser isolado a partir de uma endolisina, ou uma espanina, ou uma fibra da cauda, ou uma proteína do espigão da cauda específica para o microrganismo de interesse. A espanina pode ser uma espanina de membrana externa (RZ1) ou uma variante truncada da mesma. Alguns CBCs isolados a partir de uma endolisina ainda compreendem domínio de ligação celular (CBD) ou uma variante truncada do mesmo.

[0012] Em algumas modalidades, a MDP é um produto de gene recombinante ou uma proteína conjugada. Em modalidades adicionais, a MDP recombinante compreende um domínio de ligação apresentando ≥ 95 % de homologia para o CBC de qualquer um dos seguintes bacteriófagos: fago de Salmonella SPN1S, fago de Salmonella 10, fago de Salmonella epsilon15, fago de Salmonella SEA1, fago de Salmonella Spn1s, fago de Salmonella P22, fago de Listeria LipZ5, fago de Listeria P40, fago de Listeria vB_LmoM_AG20, fago de Listeria P70, fago de Listeria A511, fago de Staphylococcus P4W, fago de

Staphylococcus K, fago de Staphylococcus Twort, fago de Staphylococcus SA97, ou fago de Escherichia coli O157:H7 CBA120.

[0013] Em determinadas modalidades das MDPs recombinantes, a porção indicadora pode gerar um sinal intrínseco. Em outras modalidades, a porção indicadora compreende uma enzima que gera sinal após reação com substrato. Ainda em outras modalidades, a porção indicadora compreende um cofator que gera sinal após reação com um ou mais componentes adicionais de produção de sinal. Por exemplo, a porção indicadora compreende pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, e uma enzima. A enzima pode compreender pelo menos uma de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase, e uma glicosidase. O gene da luciferase pode ser um gene de ocorrência natural, tal como luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, ou luciferase de Renilla, ou ele pode ser um gene geneticamente projetado.

[0014] São também aqui divulgados métodos para o preparo de uma MDP recombinante compreendendo gerar um CBC o qual é substancialmente idêntico a pelo menos um de um gene de endolisina, gene de espanina, ou gene da fibra da cauda de um bacteriófago de tipo selvagem ou grupo de bacteriófagos o qual infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um gene de fusão do CBC com uma porção indicadora, em que o produto da proteína de fusão é a MDP recombinante; transformar um vetor de expressão com o gene de fusão para sintetizar a MDP recombinante; e purificar a MDP recombinante.

[0015] Modalidades adicionais incluem sistemas e kits para a detecção de Listeria, Salmonella, Staphylococcus, ou E. coli O157:H7, compreendendo uma MDP recombinante. Algumas modalidades ainda incluem um substrato para reagir com uma porção indicadora da MDP. Estes sistemas ou kits podem incluir características descritas para o bacteriófago, composições e métodos da invenção. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende mídia legível por computador não transitória para uso com os métodos ou sistemas de acordo com a invenção.

[0016] Em outro aspecto, o método para a detecção de um ou mais microrganismos de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: colocar em contato a amostra com um suporte sólido de um aparelho, em que o suporte sólido captura o um ou mais microrganismos na amostra, se presente, em que o aparelho compreende: um primeiro compartimento compreendendo bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido dentro de um genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; colocar em contato o bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento com a amostra de modo que o bacteriófago recombinante infecte o um ou mais microrganismos na amostra, produzindo, assim, o produto do gene indicador, e detectar o produto do gene indicador.

[0017] Em algumas modalidades, o aparelho ainda compreende um segundo compartimento compreendendo um substrato, e em que detectar o produto do gene indicador é por colocar em contato o produto do gene indicador com um substrato. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um grânulo. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS),

ácido polilático (PLA) e cloreto de polivinila (PVC).

[0018] Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma ou mais moléculas de um componente de ligação celular (CBC), em que o CBC reconhece o um ou mais microrganismos de interesse na amostra. Em algumas modalidades, o CBC é específico para bactérias Gram- negativas. Em algumas modalidades, o CBC é específico para bactérias Gram-positivas. Em algumas modalidades, a bactéria Gram-negativa é uma Salmonella spp ou E. coli O157:H7. Em algumas modalidades, a bactéria Gram-positiva é uma Listeria spp ou Staphylococcus spp.

[0019] Em algumas modalidades, o CBC é isolado a partir de uma endolisina ou uma espanina ou uma proteína de ligação ao receptor (RBP) específica para o microrganismo de interesse. Em algumas modalidades, a espanina é uma espanina de membrana externa (RZ1) ou uma variante truncada da mesma. Em algumas modalidades, a RBP é uma proteína da fibra da cauda ou uma variante truncada da mesma.

[0020] Em algumas modalidades, o CBC é isolado a partir de uma endolisina.

[0021] Em algumas modalidades, o CBC isolado a partir de uma endolisina é um domínio de ligação celular (CBD) ou uma variante truncada do mesmo.

[0022] Em algumas modalidades, o aparelho ainda compreende um segundo compartimento contendo substrato, e em que o método ainda compreende adicionar o substrato a partir do segundo compartimento à amostra, simultaneamente com ou após a adição do bacteriófago recombinante.

[0023] Em algumas modalidades, o primeiro compartimento compreende uma vedação, e em que colocar em contato o bacteriófago recombinante com a amostra é por rompimento da vedação, em que o rompimento da vedação faz com que bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento esteja em contato com a amostra e infecte o um ou mais microrganismos na amostra, produzindo, assim, o produto do gene indicador.

[0024] Em algumas modalidades, o bacteriófago é liofilizado.

[0025] Em algumas modalidades, o aparelho compreende um terceiro compartimento contendo meio de crescimento.

[0026] Em algumas modalidades, o método compreendendo incubar o suporte sólido que tenha capturado o um ou mais microrganismos de interesse no meio de crescimento por um período de tempo antes da adição do bacteriófago recombinante.

[0027] Em algumas modalidades, o aparelho compreende uma trava de parada para a mistura em fases do meio, o bacteriófago recombinante, e o substrato com a amostra.

[0028] Em algumas modalidades, o suporte sólido é seco antes de colocar em contato a amostra. Em algumas modalidades, o suporte sólido é imerso em meio antes de colocar em contato a amostra.

[0029] Em algumas modalidades, o suporte sólido que tenha capturado o um ou mais organismos é incubado com o meio de crescimento no terceiro compartimento antes de entrar em contato com o bacteriófago recombinante.

[0030] Em algumas modalidades, a incubação é de 0 - 2 horas. Em algumas modalidades, o bacteriófago foi colocado em contato com a amostra por 0.5 - 3 horas antes de detectar o produto do gene indicador.

[0031] Em algumas modalidades, o produto do gene indicador compreende pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, e uma enzima. Em algumas modalidades, a enzima compreende pelo menos uma de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase, e uma glicosidase. Em algumas modalidades, a luciferase é uma luciferase geneticamente projetada. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra alimentar, ambiental, de água, comercial ou clínica.

[0032] Em algumas modalidades, o método detecta tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar. Em algumas modalidades, a amostra compreende carne ou vegetais. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra alimentar, de água, de laticínios, ambiental, comercial ou clínica.

[0033] Em algumas modalidades, a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

[0034] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um sistema para a detecção de microrganismo de interesse em uma amostra compreendendo: um aparelho, que compreende: um primeiro compartimento compreendendo bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido dentro de um genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; em que o suporte sólido compreende um componente de ligação celular, e um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal pode detectar o produto do gene indicador produzido a partir da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, o componente de detecção de sinal é um luminômetro portátil.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0035] A presente invenção pode ser melhor entendida por referência às figuras não limitativas a seguir.

[0036] A Figura 1 mostra uma modalidade de um método para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando MDPs.

[0037] A Figura 2 mostra a estrutura das endolisinas codificadas pelo bacteriófago específico para bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas.

[0038] A Figura 3 mostra os resultados da detecção de cultura de L. monocytogenes utilizando o aparelho autônomo com um swab como um suporte sólido. Os sinais correspondentes à presença das bactérias foram detectados por luminômetros Hygiena, GloMax e GloMax 20/20. A Tabela 1 mostra resultados da cultura na fase log e Tabela 2 mostra os resultados da cultura durante a noite.

[0039] As Figuras 4A e 4B são gráficos gerados a partir dos dados mostrados na Tabela 1. A Figura 4A mostra medidas de sinais detectados utilizando Hygiena. Os swabs foram inoculados com células em fase log no nível indicado de UFC. A amostra foi imediatamente infectada com coquetel de fago de Listeria por 4 horas. O substrato foi adicionado e as amostras foram lidas em luminômetro Hygiena. Um sinal de > 10 RLU é considerado positivo. Com este método, aproximadamente 25000 UFC são requeridas para gerar um resultado positivo.

[0040] A Figura 4B mostra as medidas de sinais detectados utilizando luminômetros GloMax 20/20 e GloMax (também conhecidos como GloMax 96). Os swabs foram inoculados com células em fase log no nível indicado de UFC. A amostra foi imediatamente infectada com coquetel de fago de Listeria por 4 horas. O substrato foi adicionado e as amostras foram lidas tanto em luminômetros GloMax 20/20 (1 mL de amostra) ou GloMax (150 µl de amostra). Uma relação sinal / fundo de > 3.0 é considerada positiva. Com este método, aproximadamente 5000 UFC são requeridas para gerar um resultado positivo.

[0041] A Figura 5 mostra os resultados da detecção de Salmonella em peru moído o qual tenha sido inoculado com Salmonella. A Tabela 3 mostra amostra controle não inoculada, e a Tabela 4 mostra amostra de peru inoculada. Os testes foram repetidos com tempos de incubação e infecção variados.

[0042] As Figura 6A e Figura 6B são gráficos gerados a partir de dados da Figura 5. A Figura 4A mostra que amostras de peru inoculadas com Salmonella foram detectadas como positivas em cada tempo de incubação e infecção testado. A amostra de peru foi cultivada por 24 horas a 41 ºC após inoculação antes do teste com os métodos divulgados no pedido. Para o sinal relativo: 0HR incubação, 2HR infecção > 1HR incubação, 0.5HR infecção > 0HR incubação, 0.5HR infecção. Em adição, a comparação do sinal RLU mostra que os luminômetros GloMax apresentam um sinal muito mais alto do que o luminômetro Hygiena.

[0043] A Figura 6B mostra que a detecção utilizando luminômetros GloMax 20/20 e GloMax produziram relações sinal / fundo similares para as mesmas amostras. Embora o GloMax 20/20 apresentou um sinal melhor (Fig 6A), o fundo foi significativamente mais alto do que aquele com o GloMax. Assim, ao determinar o sinal / fundo, os dois luminômetros atuam de forma similar.

[0044] A Figura 7 mostra dados de detecção de Salmonella em três amostras de peru (amostras 21, 24, e 26) as quais foram inoculadas com Salmonella antes dos ensaios utilizando o aparelho autônomo. As amostras foram infectadas por diferentes tempos de duração tal como indicado antes da detecção do sinal.

[0045] As Figuras 8A - 8C são gráficos gerados a partir de dados mostrados na Figura 7. A FIG. 8A - 8C mostra os resultados dos experimentos nos quais três amostras de peru moído inoculadas foram enriquecidas por 24 horas e amostras de swab foram tomadas e ensaiadas. A amostra 24 (FIG. 8B) e 26 (FIG. 8C) não mostraram sinal em luminômetro portátil Hygiena para amostras as quais apresentaram 30 min de infecção de fago, porém mostraram para amostra que apresentou 2 horas de infecção. Os luminômetros GloMax 20/20 e GloMax geraram sinais relativamente fracos.

[0046] As Figuras 9A e 9C são gráficos gerados a partir de dados mostrados na Figura 7. Os gráficos mostram que ambos GloMax 20/20 e GloMax foram capazes de detectar a Amostra 21 (Figura 9A) e 26 (Figura 9B) como positivas com 30 minutos de infecção (proporção sinal / fundo de > 3.0 é positiva), no entanto, a Amostra 24 (Figura 9C) requereu 2 horas de infecção para mostrar um resultado positivo. Os resultados dos luminômetros GloMax 20/20 e GloMax foram similares.

[0047] A Figura 10 mostra dados da detecção de amostras de esponjas ambientais L. monocytogenes de superfícies não inoculadas e enriquecidas por 24 horas.

[0048] A Figura 11 mostra a detecção de microrganismos em amostras de peru inoculadas com Salmonella utilizando o aparelho. Os sinais foram medidos utilizando três diferentes luminômetros: GloMax, 3M e Hygiena.

[0049] As Figuras 12A e 12B mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de microrganismos, apresentando um swab (Figura 12A) ou um grânulo revestido com moléculas de um componente de ligação celular (CBC) (Figura 12B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento contém fago, o segundo compartimento contém substrato, e o terceiro compartimento contém meio. O painel A em todas Figuras representa o suporte sólido é um swab.

[0050] Figuras 13A e 13B mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de microrganismos, apresentando a swab (Figura 13A) ou um grânulo revestido com moléculas de um componente de ligação celular (CBC) (Figura 13B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento contém fago, o segundo compartimento contém meio, e o terceiro compartimento contém substrato. Após a incubação com o fago e meio, a vedação que separa o segundo e terceiro compartimentos pode ser rompida.

[0051] As Figuras 14A e 14B mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de microrganismos, apresentando um swab (Figura 14A) ou um grânulo revestido com moléculas de um componente de ligação celular (CBC) (Figura 14B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento contém meio, o segundo compartimento contém fago, e o terceiro compartimento contém substrato.

[0052] As Figuras 15A e 15B mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de microrganismos, apresentando um swab (Figura 15A) ou um grânulo revestido com moléculas de um componente de ligação celular (CBC) (Figura 15B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento contém meio, o segundo compartimento contém fago, e o terceiro compartimento contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de trava de parada para a mistura em fases de reagentes.

[0053] As Figuras 16A e 16B mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de microrganismos, apresentando um swab (Figura 16A) ou um grânulo revestido com moléculas de um componente de ligação celular (CBC) (Figura 16B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separados por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento contém meio, o segundo compartimento contém fago, e o terceiro compartimento contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de trava de parada para a mistura em fases de reagentes.

[0054] A Figura 17 mostra um diagrama de fluxo de uma modalidade que utiliza um sistema de aparelho autônomo para a detecção de microrganismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

[0055] A menos se aqui definido de outra forma, termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção devem apresentar os significados os quais são comumente entendidos por um técnico no assunto. Além disso, a menos se requerido pelo contexto de outra forma, os termos no singular deverão incluir pluralidades e os termos no plural deverão incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química das proteínas e ácidos nucleicos e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Os métodos e técnicas conhecidos são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e tal como descrito em diversas referências gerais e mais específicas as quais são discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, tal como comumente realizado na técnica ou tal como aqui descrito. As nomenclaturas utilizadas em conexão com os procedimentos de laboratório e técnicas aqui descritas são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados na técnica.

[0056] Os termos a seguir, a menos se aqui indicado de outra forma, devem ser entendidos por apresentar os seguintes significados:

[0057] Tal como aqui utilizados, os termos “um”, “uma” e “o / a” podem se referir a um ou mais, a menos se especificamente observado o contrário.

[0058] O uso do termo “ou” é utilizado para significar “e / ou” a menos se explicitamente indicado para se referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação apoie uma definição que se refere apenas às alternativas e "e / ou". Tal como aqui utilizados, “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.

[0059] Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é utilizado para indicar que um valor inclui a variação inerente do erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre as amostras.

[0060] O termo “suporte sólido” ou “suporte” significa uma estrutura que fornece um substrato e / ou superfície na qual biomoléculas podem ser ligadas. Por exemplo, um suporte sólido pode ser um poço de ensaio (isto é, tal como uma placa de micro titulação ou placa de múltiplos poços), ou o suporte sólido pode ser uma localização em um filtro, uma matriz, ou um suporte móvel, tal como um grânulo ou uma membrana (por exemplo, uma placa filtrante ou faixa de fluxo lateral).

[0061] O termo “indicador” ou “porção indicadora” ou “porção detectável” ou “biomolécula detectável” ou “repórter” ou “etiqueta” se refere a uma molécula que fornece um sinal o qual pode ser medido em um ensaio qualitativo ou quantitativo. Por exemplo, uma porção indicadora pode compreender uma enzima a qual pode ser usada para converter um substrato a um produto que pode ser medido. Uma porção indicadora pode ser uma enzima que catalisa uma reação que gera emissões bioluminescentes (por exemplo, luciferase, HRP ou AP). Ou, uma porção indicadora pode ser um radioisótopo que pode ser quantificado. Ou, uma porção indicadora pode ser um fluoróforo. Ou, outras moléculas detectáveis podem ser utilizadas.

[0062] Tal como aqui utilizados, “bacteriófago” ou “fago” inclui um ou mais de uma pluralidade de vírus bacterianos. Nesta divulgação, os termos “bacteriófago” e “fago” incluem vírus tais como mico bacteriófago (tal como para TB e paraTB), micófago (tal como para fungos), fago de micoplasma e qualquer outro termo que se refere a um vírus que pode invadir bactérias vivas, fungos, micoplasma, protozoários, leveduras e outros organismos vivos microscópicos e usos dos mesmos para se replicar. Aqui, “microscópico” significa que a maior dimensão é um milímetro ou menos. Os bacteriófagos são vírus os quais evoluíram na natureza para utilizar bactérias como um meio de se replicarem.

[0063] Tal como aqui utilizados, “enriquecimento de cultura”, “cultivo para enriquecimento”, “cultivado para enriquecimento” ou “cultura para enriquecimento”, se refere ao cultivo tradicional, tal como incubação em meio favorável à propagação de microrganismos, e não deve ser confundido com outros usos possíveis da palavra “enriquecimento”, tal como enriquecimento por remoção do componente líquido de uma amostra para concentrar o microrganismo nela contido, ou outras formas de enriquecimento as quais não incluem a facilitação tradicional da propagação do microrganismo. O cultivo para enriquecimento por curtos períodos de tempo pode ser empregado em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, porém não é necessário e é por um período de tempo muito mais curto do que o cultivo tradicional para enriquecimento, se este for usado de alguma forma.

[0064] Tal como aqui utilizados “recombinante” se refere a modificações genéticas (isto é, ácido nucleico) tal como normalmente realizadas em um laboratório para reunir material genético que não seria encontrado de outra forma. Este termo é aqui utilizado de forma intercambiável com o termo “modificado”.

[0065] Tal como aqui utilizado, “RLU” se refere a unidades de luz relativa tal como medida por um luminômetro (por exemplo, GLOMAX® 96) ou instrumento similar que detecta a luz. Por exemplo, a detecção da reação entre luciferase e o substrato adequado (por exemplo, NANOLUC® com NANO-GLO®) é com frequência reportada em RLU detectadas. Visão geral

[0066] A presente invenção utiliza a alta especificidade de componentes de ligação celular (CBCs) os quais podem se ligar a um microrganismo particular com alta afinidade para detectar a presença de e / ou quantificar o microrganismo específico na amostra.

[0067] São aqui divulgadas composições, métodos, kits, e sistemas os quais demonstram sensibilidade e velocidade surpreendentes para a detecção de um microrganismo de interesse em amostras teste (por exemplo, amostras alimentares, de água, de laticínios, ambientais, comerciais, clínicas, ou outras amostras biológicas) utilizando ensaios realizados sem o cultivo para enriquecimento, ou em algumas modalidades com tempos de incubação mínimos durante os quais o microrganismo poderia potencialmente se multiplicar. As modalidades aqui divulgadas incluem uma sonda de detecção de microrganismo (MDP) que compreende pelo menos um componente de ligação celular (CBC) e uma porção indicadora. Essas composições, métodos, kits e sistemas permitem que a detecção de microrganismos seja alcançada em um período de tempo mais curto do que se pensava ser possível.

[0068] As modalidades das composições, métodos, kits, e sistema da invenção podem ser aplicadas à detecção de uma variedade de microrganismos (por exemplo, bactérias, fungos, leveduras) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, porém não limitadas a, detecção de patógenos a partir de amostras alimentares, de água, de laticínios, ambientais, comerciais, clínicas ou outras amostras biológicas. As modalidades de detecção a base de MDP aqui divulgadas podem ser adaptadas a quaisquer bactérias ou outros microrganismos de interesse (por exemplo, microrganismos patogênicos) para os quais um CBC está disponível o qual não tem reação cruzada com outros microrganismos. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade e especificidade de detecção rapidamente e sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional (por exemplo, cultivo). Assim, uma variedade de microrganismos pode ser detectada utilizando os métodos da invenção.

[0069] As modalidades dos métodos e sistemas da invenção podem ser aplicados à detecção e quantificação de uma variedade de microrganismos (por exemplo, bactérias, fungos, leveduras) em uma variedade de circunstâncias, incluindo porém não limitada à detecção de patógenos a partir de amostras alimentares, de água, de laticínios, ambientais, comerciais, clínicas ou outras amostras biológicas. Os métodos da presente invenção podem rapidamente fornecer alta sensibilidade e especificidade de detecção sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional (por exemplo, cultivo), o que é um aspecto surpreendente, uma vez que todos os métodos disponíveis com a sensibilidade e especificidade desejadas requerem cultivo.

[0070] São também aqui divulgados sistemas e métodos que utilizam um aparelho para detectar microrganismos em amostras teste (por exemplo, amostras alimentares, de água, de laticínios, ambientais, comerciais, clínicas ou outras amostras biológicas). O método utiliza um aparelho autônomo o qual compreende um suporte sólido, o qual pode ser utilizado para coletar a amostra. Em algumas modalidades, o suporte sólido é revestido com um componente de ligação celular que se liga com alta afinidade ao microrganismo de interesse na amostra. Isto permite que mais bactérias se liguem ao suporte sólido e aumentem a sensibilidade e especificidade do ensaio. O aparelho ainda compreende um primeiro compartimento compreendendo bacteriófago apresentando um constructo genético inserido dentro do genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador. O método compreende colocar em contato o bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento com a amostra de modo que o bacteriófago recombinante infecte um ou mais microrganismos na amostra assim produzindo um produto do gene indicador (“indicador”), e detectar o indicador. Em alguns aspectos, o aparelho ainda compreende um segundo compartimento, o qual contém um substrato específico para a detecção do indicador. Em algumas modalidades, o método ainda compreende colocar em contato a amostra que tenha sido infectada pelo bacteriófago com o substrato, assim detectando o indicador. Nestas modalidades,

cada compartimento é separado do compartimento imediatamente adjacente por uma vedação de ação instantânea, a qual quando rompida, permite que o conteúdo dos compartimentos saia do compartimento e misture com conteúdo da amostra ou conteúdos de outros compartimentos. Por exemplo, um usuário pode romper a vedação de ação instantânea de modo que o bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento entre em contacto com a amostra no suporte sólido, assim infectando microrganismos os quais se ligam no mesmo. Após a infecção dos microrganismos, o gene indicador é expresso para produzir uma proteína indicadora, a qual pode ser detectada por diversos dispositivos de detecção. A presença dos sinais indicam a presença dos microrganismos na amostra.

[0071] Modalidades do aparelho, composições, métodos, kits, e sistema da invenção podem ser aplicadas para a detecção de uma variedade de microrganismos (por exemplo, bactérias, fungos, leveduras) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, porém não limitado, a detecção de patógenos de amostras alimentares, de água, de laticínios, ambientais, comerciais, clínicas ou outras amostras biológicas. As modalidades de detecção aqui divulgadas podem ser adaptadas a qualquer bactéria ou outro microrganismo de interesse (por exemplo, microrganismos patogênicos) para os quais um CBC está disponível o qual não tem reação cruzadas com outros microrganismos. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade e especificidade de detecção rapidamente e sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional (por exemplo, cultivo). Este é um aspecto surpreendente uma vez que todos os métodos disponíveis com a sensibilidade e especificidade desejada requerem cultivo.

A detecção de microrganismos em uma amostra utilizando o aparelho autônomo, o qual acomoda reagentes requeridos para a detecção do microrganismo em compartimentos separados até o tempo de detecção, é conveniente e eficiente. O aparelho é fácil de utilizar e não requer treinamento extensivo. Amostras

[0072] Cada uma das modalidades das composições, métodos, kits, e sistemas da invenção permite a rápida detecção e / ou quantificação de micróbios em uma amostra. Por exemplo, os métodos de acordo com a presente invenção podem ser realizados em período de tempo encurtado com resultados superiores.

[0073] Em determinadas modalidades, um componente de ligação celular (CBC) é utilizado para detectar microrganismos de interesse. Os microrganismos os quais podem ser detectados pelas composições, métodos, kits e sistemas da presente invenção incluem patógenos os quais são de preocupação comercial, médica ou veterinária. Os referidos patógenos incluem bactérias Gram-negativas, bactérias Gram-positivas, micoplasmas, fungos, protozoários e leveduras. Qualquer microrganismo para o qual um componente de ligação celular (CBC) específico para o micróbio particular tenha sido identificado pode ser detectados pelos métodos da presente invenção. Um técnico no assunto irá apreciar que não há limite para a aplicação dos presentes métodos além da disponibilidade dos componentes de ligação celular específicos / pares de micróbios necessários.

[0074] Células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas, células bacterianas as quais são patógenos suportados em alimentos ou água. As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas, todas as espécies de Salmonella, todas as cepas de Escherichia coli, incluindo, porém não limitadas a E. coli O157:H7 (e outras cepas produtoras de enterotoxina e toxina Shiga de E. coli), todas as espécies de Listeria, incluindo, porém não limitadas a L. monocytogenes, e todas as espécies de Campylobacter. As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas, células bacterianas as quais são patógenos de significância médica ou veterinária. Os referidos patógenos incluem, porém não estão limitados, Bacillus spp., Bordetella pertussis, Brucella spp., Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Enterobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei, Yersinia spp., Vibrio spp. Staphylococcus aureus e Streptococcus spp..

[0075] A amostra pode ser uma amostra ambiental ou alimentar ou de água. Algumas modalidades podem incluir amostras médicas ou veterinárias. As amostras podem ser líquidas, sólidas ou semissólidas. As amostras podem ser swabs de superfícies sólidas. As amostras podem incluir materiais ambientais, tais como amostras de água, ou os filtros de amostras de ar, ou amostras de aerossol de coletores ciclone. As amostras podem ser de carne bovina, aves, alimentos processados, leite, queijo ou outros produtos de laticínios. Amostras médicas e veterinárias incluem, porém não estão limitadas a amostras de sangue, escarro, fluido cérebro-espinhal e fecal. Em algumas modalidades, as amostras podem ser diferentes tipos de swabs.

[0076] Em algumas modalidades, as amostras podem ser utilizadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação, concentração ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas, incluindo, porém, não limitadas a leite e sucos, podem ser diretamente avaliadas. Em outras modalidades, as amostras podem ser diluídas ou suspendidas em solução, a qual pode incluir, porém não está limitada a uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriana. Uma amostra que é sólida ou semissólida pode ser suspendida em um líquido ao picar, misturar ou macerar o sólido no líquido. Em algumas modalidades, uma amostra deve ser mantida dentro de uma faixa de pH que promova a ligação da MDP à célula bacteriana hospedeira. Em algumas modalidades, a faixa de pH preferida pode ser aquela adequada para o bacteriófago ligado a uma célula bacteriana. Uma amostra também deve conter as concentrações adequadas de cátions bivalentes e monovalentes, incluindo, porém, não limitado a Na+, Mg2+, e K+.

[0077] Em algumas modalidades, a amostra é mantida em uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula de patógeno presente na amostra. Durante as etapas nas quais o bacteriófago está ligado às células bacterianas, a amostra pode ser mantida em uma temperatura que facilita a atividade do bacteriófago. As referidas temperaturas são de pelo menos cerca de 25 ºC e não superiores a cerca de 45 ºC. Em algumas modalidades, a amostra é mantida a cerca de 37 ºC. Em algumas modalidades, as amostras são submetidas à mistura ou agitação suave durante a ligação ou fixação da MDP. Métodos de utilização das MDPs recombinantes para a detecção de microrganismo

[0078] Os ensaios podem incluir diversas amostras controle adequadas. Por exemplo, as amostras controle sem MDPs e / ou amostras controle contendo MDPs sem bactérias podem ser analisados como controles para os níveis de sinal de fundo.

[0079] Tal como aqui observado, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender métodos de utilização de sondas de detecção de microrganismo (MDPs) decoradas ou sinalizadas para a detecção de microrganismos. Os métodos da invenção pode ser incorporados em uma variedade de formas.

[0080] Em alguns aspectos, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse. O método pode utilizar uma MDP recombinante ou uma MDP conjugada para a detecção do microrganismo de interesse. Por exemplo, em determinadas modalidades, o microrganismo de interesse é uma bactéria e o componente de ligação celular (CBC) é derivado de um bacteriófago que reconhece especificamente a bactéria de interesse. Em determinadas modalidades, o método pode compreender a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra ao incubar a amostra com uma pluralidade de MDPs recombinantes as quais se ligam à bactéria de interesse. Uma pluralidade de MDPs ligadas a um único microrganismo é qualquer número superior a 1, porém é preferencialmente pelo menos 5 x 104, ou pelo menos 1 x 105, ou pelo menos 1 x 106, ou pelo menos 1 x 108, ou pelo menos 1 x 109, ou pelo menos 1 x 1010 de MDPs.

[0081] Em determinadas modalidades, a MDP recombinante compreende uma porção indicadora. Os métodos pode compreender detectar a porção indicadora da MDP, em que a detecção positiva da porção indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0082] Em algumas modalidades, a invenção pode compreender um método para detectar tão pouco quanto um único microrganismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com uma pluralidade de MDPs as quais se ligam ao microrganismo de interesse, em que a MDP compreende uma porção indicadora e um CBC sob condições de modo que o microrganismo se ligue à pluralidade de MDPs; separar as MDPs não ligadas da MDP ligada à célula; e detectar a porção indicadora na MDP ligada à célula, em que a detecção positiva da porção indicadora indica que o microrganismo de interesse está presente na amostra. A quantidade de MDPs incubadas com a amostra pode ser de 1 ng, ou 10 ng, ou 100 ng, ou 250 ng, ou 500 ng, ou 1000 ng. A quantidade de MDPs incubadas com a amostra pode ser de pelo menos 5 x 108, ou pelo menos 5 x 109, ou pelo menos 5 x 1010, ou pelo menos 5 x 1011, ou pelo menos 5 x 1012, ou pelo menos 5 x 1013.

[0083] Em algumas modalidades, a etapa de detecção irá requerer a adição de um substrato para a enzima indicadora atuar. Em outras modalidades, a etapa de detecção irá requerer a adição de uma enzima e um substrato para o cofator indicador atuar. A seleção de um indicador particular não é crítica para a presente invenção, porém o indicador será capaz de gerar um sinal detectável tanto por si só, ou ser instrumentalmente detectável, ou ser detectável em conjunto com um ou mais componentes adicionais de produção de sinal, tal como uma sistema produtor de sinal enzima / substrato.

[0084] Em algumas modalidades, uma pluralidade de MDPs se ligam a uma única bactéria. Uma pluralidade de MDPs ligadas a um único microrganismo é qualquer número maior do que 1, porém é preferencialmente pelo menos 5 x 104, ou pelo menos 1 x 105, ou pelo menos 1 x 106, ou pelo menos 1 x 108, ou pelo menos 1 x 109, ou pelo menos 1 x 1010 de MDPs.

[0085] Em determinadas modalidades, o ensaio pode ser realizado para utilizar uma MDP para identificar a presença de um microrganismo específico. O ensaio pode ser modificado para acomodar diferentes tipos ou tamanhos de amostra e formatos de ensaio. As modalidades que empregam MDP recombinante da invenção podem permitir a rápida detecção de cepas bacterianas específicas, com tempos de ensaio total inferiores a 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5,

6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0,

11.5, ou 12 horas, dependendo do tipo da amostra, tamanho da amostra e formato do ensaio. Por exemplo, a quantidade de tempo requerida pode ser um pouco mais curta ou mais longa dependendo da afinidade de uma MDPs e / ou os tipos de bactérias a serem detectados no ensaio, tipo e tamanho da amostra a ser testada, complexidade do ambiente físico / químico, e a concentração de contaminantes bacterianos endógenos não-alvo.

[0086] A Figura 1 ilustra uma modalidade de um ensaio para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando MDP 112 de acordo com uma modalidade da invenção. Uma MDP compreende uma porção indicadora 120 (por exemplo NANOLUC®) e um CBC 121. As alíquotas da amostra teste contendo quantidades conhecidas de bactéria 111 são distribuídas para poços individuais 102 de uma placa de múltiplos poços 104.

As alíquotas de MDP 112 são adicionadas a poços individuais 102 e incubadas 202 por um período de tempo (por exemplo, 5 - 60 minutos a 37 °C). A alíquota das MDPs 112 adicionadas ao poço individual nesta modalidade é de pelo menos 1 x 109 MDPs. Uma pluralidade de MDPs se ligam a uma única bactéria

116. A pluralidade de MDPs ligada à única bactéria de interesse nesta modalidade é de pelo menos 1 x 106. A captura da bactéria em uma superfície sólida e lavagem das bactérias capturadas 203 permite a remoção do excesso de MDP 113 não ligada. Os poços da placa contendo MDP ligado às bactérias alvo podem, então, ser avaliados 204 para medir a atividade de um indicador de MDP na placa 104 (por exemplo, ensaio da luciferase). Experimentos utilizando este método são aqui descritas. Em algumas modalidades, as amostras teste não são concentradas (por exemplo, por centrifugação) porém são incubadas diretamente com MDP por um período de tempo e subsequentemente avaliadas para o indicador (por exemplo, atividade da luciferase). Em outras modalidades, diversas ferramentas (por exemplo, uma centrífuga ou filtro) podem ser utilizadas para concentrar as amostras e ou capturar os microrganismos em amostras antes do enriquecimento ou antes do teste. Por exemplo, uma alíquota de 10 mL de uma amostra preparada pode ser extraída e centrifugada para peletizar células e detritos grandes. O pélete pode ser ressuspendido em um volume menor para teste. Em algumas modalidades, o pélete ressuspendido das células de microrganismo pode ser enriquecido antes do teste.

[0087] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de uma bactéria de interesse compreendendo a etapa de incubação de uma amostra teste com uma MDP recombinante ou conjugada. Em algumas modalidades, a amostra teste é incubada com uma concentração muito alta de MDP, ou um excesso de MDP. De forma surpreendente, altas concentrações de MDPs são adequadas para a ligação de um microrganismo de interesse.

[0088] Os métodos da invenção pode compreender diversas outras etapas para aumentas a sensibilidade. Por exemplo, tal como aqui discutido em mais detalhes, o método pode compreender uma etapa para a captura e lavagem da bactéria capturada e ligada, para remover o excesso de MDP e aumentar a relação do sinal para o ruído. Em algumas modalidades, a detecção positiva da porção indicadora requer que a relação do sinal para o fundo gerado para detectar a porção indicadora é de pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5.

[0089] Em algumas modalidades dos métodos para teste de amostras, o uso de um grande excesso de MDP necessita a separação de qualquer bactéria ligada à MDP ou outras entidades maiores na amostra do excesso de MDP não ligado. Isso pode ser alcançado de muitas maneiras diferentes, geralmente conhecidas por um técnico no assunto. As células de microrganismo podem ser separadas através da centrifugação, filtração por tamanho, ou imobilização seletiva. Em algumas modalidades, a filtração por tamanho é realizada por meio de poços filtrantes. Em outras modalidades, a separação magnética pode ser utilizada para a imobilização seletiva. Por exemplo, a amostra pode ser filtrada através de uma membrana de 0.45 μm ou 0.22 μm, tanto antes ou após a incubação com a MDP, para capturar o microrganismo alvo (por exemplo, bactéria) em um suporte sólido. O microrganismo capturado pode, então, ser lavado uma ou mais vezes no suporte sólido para garantir que apenas MDP especificamente ligada permaneça ou um mecanismo para a ligação específica ou não específica pode ser empregado para capturar o microrganismo em micro grânulos ou outra superfície sólida. Outros formatos para a decoração ou sinalização de microrganismos alvo e métodos para a lavagem para remover o excesso de MDP não ligada são possíveis.

[0090] Uma variedade de suportes sólidos pode ser utilizada. Em determinadas modalidades, o suporte sólido pode compreender uma placa de múltiplos poços, um filtro, um grânulo, uma faixa de fluxo lateral, uma faixa filtrante, disco de filtro, papel de filtro, ou filmes finos projetados para o cultivo de células (por exemplo, PetriFilm da 3M). Outros suportes sólidos podem também ser adequados. Por exemplo, em algumas modalidades, o microrganismo da amostra teste pode ser capturado pela ligação à superfície da placa, ou por filtração da amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, filtro spin com tamanho de poro de 0.45 μm ou placa filtrante). Em uma modalidade, o microrganismo capturado no filtro ou na superfície da placa é subsequentemente lavado uma ou mais vezes para remover o excesso de MDP não ligada.

[0091] Alternativamente, em algumas modalidades, a etapa de captura pode estar baseada em outras características do microrganismo de interesse, tal como tamanho. Em modalidades que utilizam a captura baseada no tamanho, o suporte sólido pode ser uma coluna filtrante spin. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma placa filtrante de 96 poços. Ou, o suporte sólido para a captura pode ser uma localização em uma matriz, ou um suporte móvel, tal como um grânulo.

[0092] Em algumas modalidades, a amostra pode ser enriquecida antes do teste pela incubação em condições que encorajem o crescimento. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou até 8 horas ou maior, dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0093] Em outras modalidades, a amostra pode ser enriquecida após a captura da bactéria em um suporte sólido. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou até 8 horas ou mais, dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0094] Então, em algumas modalidades, a MDP compreende uma porção indicadora detectável, e ligação a uma única célula patogênica (por exemplo, bactéria) pode ser detectado por um sinal amplificado gerado por meio da porção indicadora. Então, o método pode compreender a detecção de uma porção indicadora da MDP, em que a detecção do indicador indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0095] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o microrganismo pode ser detectado sem qualquer isolamento ou purificação dos microrganismos de uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma amostra contendo um ou mais microrganismos de interesse pode ser aplicada diretamente a um recipiente de ensaio tal como uma coluna spin, um poço de micro titulação, ou um filtro e o ensaio é conduzido neste recipiente de ensaio. Isto é, os microrganismos são capturados em uma membrana apresentando tamanho de poro muito pequeno para permitir que os microrganismos passem através. Diversas modalidades dos referidos ensaios são aqui divulgadas.

[0096] As alíquotas de uma amostra teste podem ser distribuídas diretamente em poços de uma placa de múltiplos poços, a MDP pode ser adicionada, e após um período de tempo suficiente para a ligação, as células podem ser capturadas em uma superfície sólida tal como uma placa, grânulo ou um substrato de filtro, de modo que o excesso de MDP não ligada possa ser removida em uma ou mais etapas de lavagem subsequentes. Então, um substrato para a porção indicadora (por exemplo, substrato de luciferase para um indicador de luciferase) é adicionado e avaliado para a detecção do sinal indicador. Algumas modalidades do método podem ser realizadas em placas de filtro. Algumas modalidades do método podem ser realizadas com ou sem a concentração da amostra antes da ligação com MDP.

[0097] Por exemplo, em muitas modalidades, as placas de múltiplos poços são utilizadas para conduzir os ensaios. A escolha das placas (ou qualquer outro recipiente no qual a detecção pode ser realizada) pode afetar a etapa de detecção. Por exemplo, algumas placas podem incluir um fundo colorido ou branco, o qual pode afetar a detecção de emissões de luz. Geralmente, as placas brancas apresentam sensibilidade maior, porém, também produzem um sinal de fundo maior. Outras cores de placas podem gerar sinal de fundo menor, porém, também possuem sensibilidade levemente menor. Adicionalmente, o sinal de fundo pode ser resultado do vazamento de luz de um poço para outro poço adjacente. Algumas placas apresentam poços brancos, enquanto o restante da placa é preto, permitindo assim um sinal alto dentro do poço enquanto evita vazamento de luz de um poço para outro poço. Esta combinação de poços brancos com placas pretas pode diminuir o sinal de fundo. Então, a escolha da placa ou outro recipiente de ensaio pode influenciar na sensibilidade e sinal de fundo para o ensaio. Em algumas modalidades, a detecção do microrganismo de interesse pode ser concluída sem a necessidade de cultivo da amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, o tempo total requerido para a detecção é menor do que 12.0 horas, 11.0 horas, 10.0 horas,

9.0 horas, 8.0 horas, 7.0 horas, 6.0 horas, 5.0 horas, 4.0 horas, 3.0 horas, 2.5 horas, 2.0 horas, 1.5 horas, 1.0 hora, 45 minutos ou menor do que 30 minutos. Minimizar o tempo de resultado é crítico em testes alimentares e ambientais para patógenos.

[0098] Em contraste com ensaios conhecidos na técnica, o método da invenção pode detectar microrganismos individuais. Então, em determinadas modalidades, o método pode detectar ≤ 10 células do microrganismo (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 microrganismos) ou ≤ 20, ou ≤ 30, ou ≤ 40, ou ≤ 50, ou ≤ 60, ou ≤ 70, ou ≤ 80, ou ≤ 90, ou ≤ 100, ou ≤ 200, ou ≤ 500, ou ≤ 1000 células do microrganismo presentes em uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, a MDP é altamente específica para S. Aureus, Listeria, Salmonella ou E. coli. Em uma modalidade, a MDP pode distinguir S. Aureus, Listeria, Salmonella ou E. coli na presença de mais do que 100 outros tipos de bactéria. Em uma modalidade, a MDP pode distinguir um sorotipo específico dentro de espécies de bactérias (por exemplo, E. coli O157:H7) na presença de mais do que 100 outros tipos de bactérias. Em determinadas modalidades, a MDP pode ser utilizada para detectar uma única bactéria do tipo específico na amostra. Em determinadas modalidades, a MDP recombinante detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 da bactéria específica na amostra.

[0099] Então, os aspectos da presente invenção fornecem métodos para a detecção de microrganismos em uma amostra teste por meio de uma porção indicadora. Em algumas modalidades, em que o microrganismo de interesse é uma bactéria, a porção indicadora pode estar associada com uma MDP. A porção indicadora pode reagir com um substrato para emitir um sinal detectável ou pode emitir um sinal intrínseco (por exemplo, proteína fluorescente). As proteínas fluorescentes fluorescem naturalmente (fluorescência intrínseca ou autofluorescência) pela emitindo energia como um fóton quando a porção fluorescente contendo elétrons absorve um fóton. As proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) podem ser expressas como uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a sensibilidade da detecção pode revelar a presença de tão pouco quanto 100, 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 células do microrganismo de interesse em uma amostra teste. Em algumas modalidades, até mesmo uma única célula do microrganismo de interesse podem fornecer um sinal detectável.

[0100] A seleção de uma porção indicadora particular não é crítica para a presente invenção, porém a porção indicadora será capaz de gerar um sinal detectável tanto por si só, ou ser instrumentalmente detectável, ou ser detectável em conjunto com um ou mais componentes adicionais de produção de sinal, tal como uma sistema de produção de sinal enzima / substrato. Um número de MDPs pode ser formado pela variação tanto da porção indicadora e / ou do CBC específico da MDP; será apreciado por um técnico no assunto que a escolha envolve a consideração do microrganismo a ser detectado e o meio de detecção desejado.

[0101] Por exemplo, um ou mais componentes de produção de sinal podem ser reagidos com a porção indicadora para gerar um sinal detectável. Em algumas modalidades, o indicador pode ser um composto bioluminescente. Se a porção indicadora é uma enzima, então, a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação da enzima com um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em um sistema de produção de sinal alternativo, o indicador pode ser um composto fluorescente em que nenhuma manipulação enzimática do indicador seja requerida para produzir o sinal detectável. Moléculas fluorescentes incluindo, por exemplo, fluoresceína e rodamina e seus derivados e análogos são adequados para o uso como indicadores no referido sistema. Ainda em outra modalidade alternativa, a porção indicadora pode ser um cofator, então, a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação do cofator com a enzima e um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em algumas modalidades, o sinal detectável é colorimétrico.

[0102] A porção indicadora detectável é uma característica chave da MDP, a qual pode ser detectada direta ou indiretamente. A porção indicadora fornece um sinal detectável através do qual a reação de ligação é monitorada fornecendo uma medida qualitativa e / ou quantitativa. A quantidade relativa e localização do sinal gerado pelos microrganismos decorados ou sinalizados pode servir para indicar a presença e / ou a quantidade do microrganismo. A porção indicadora também pode ser utilizada para selecionar e isolar microrganismos decorados ou sinalizados, tal como por separação por fluxo ou utilizando meio de separação magnética.

[0103] Em algumas modalidades, a porção indicadora da MDP pode ser detectável diretamente ou após a incubação com um substrato. Muitos diferentes tipos de biomoléculas detectáveis adequadas para uso como porções indicadoras são conhecidos no estado da técnica, e muitas estão comercialmente disponíveis. Em algumas modalidades, a MDP compreende uma enzima, a qual serve como a porção indicadora. Em algumas modalidades, a MDP codifica uma enzima detectável. A porção indicadora pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Diversas enzimas adequadas estão comercialmente disponíveis, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP), proteína verde fluorescente (GFP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem atuar como a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis também podem ser porções indicadoras adequadas.

[0104] Então, em algumas modalidades, a MDP recombinante dos métodos, sistemas ou kits é uma proteína de fusão preparada a partir da fusão de uma porção de um bacteriófago de tipo selvagem com a sequência de uma proteína indicadora, tal como uma proteína fluorescente ou uma proteína luciferase.

[0105] Os bacteriófagos são capazes de infectar e lisar bactérias específicas. Os genomas do bacteriófago codificam para três proteínas; holinas, endolisinas e espaninas, as quais, juntas, são responsáveis pela liberação da progênie durante o ciclo lítico do fago. Tal como mostrado na Figura 2, as endolisinas (também denominadas hidrolases de peptideoglicano ou hidrolases de mureína) se ligam e lisam a parede celular do tipo de bactéria particular que elas infectam. As moléculas de holina rompem a membrana citoplasmática, permitindo que as endolisinas acessem o peptideoglicano na parede celular. Nas bactérias Gram- positivas, as endolisinas são capazes de entrar em contato com o peptideoglicano das células; no entanto, a membrana externa das bactérias Gram-negativas evita a ligação entre as endolisinas e a parede celular. Geralmente, as endolisinas produzidas por fagos específicos para bactérias Gram- negativas apresentam apenas um único domínio catalítico, responsável pela lise. Em contraste, as endolisinas produzidas por fagos específicos para as bactérias Gram- positivas apresentam dois domínios: um domínio de atividade enzimática (EAD) para lise e um domínio de ligação à parede celular (CBD) para reconhecimento do hospedeiro e ligação de alta afinidade. Mais especificamente, um CBD da endolisina permite que o bacteriófago reconheça a bactéria com alta especificidade (a função de lise não é necessária). Em algumas modalidades, a porção de um bacteriófago de tipo selvagem é uma sequência da endolisina, especificamente um domínio de ligação celular, ou uma porção truncada do mesmo.

Tipicamente, o CBD está localizado na extremidade C- terminal, porém pode ser encontrado na extremidade N- terminal ou como um domínio central em alguns casos.

[0106] Outros tipos de agentes infecciosos similarmente empregam proteínas de ligação celular para especificidade. Em alguns casos, as sequências de ácido nucleico responsáveis pela ligação celular foram encontradas dentro do único EAD globular de endolisinas codificadas por bacteriófagos específicos para bactérias Gram-negativas. Um terceiro tipo de proteína, as espaninas, são responsáveis pelo rompimento da membrana externa em hospedeiros Gram- negativos. RZ1 é uma lipoproteína da membrana externa de um complexo de espanina. Durante o ciclo lítico, um complexo de espanina rompe a membrana externa após a destruição da parede celular pelas endolisinas. Em algumas modalidades, o componente de ligação celular irá compreender uma sequência de aminoácido conservada com funcionalidade de ligação a partir de pelo menos uma de uma endolisina ou uma espanina.

[0107] Em alguns casos, o fago pode se ligar a bactérias específicas através de proteínas de ligação ao receptor (RBPs). Interações entre uma RBP e a superfície celular de uma bactéria determina a especificidade da RBP. Em alguns fagos, as RBPs estão localizadas no eixo da cauda, fibras da cauda ou espigão da cauda. As proteínas da fibra da cauda do fago atuam em um papel em ambas a adsorção para a superfície celular e degradação do polissacarídeo. As proteínas do espigão da cauda são um componente da cauda de muitos bacteriófagos. As proteínas do espigão da cauda se ligam à superfície celular de hospedeiros bacterianos e mediam o reconhecimento do hospedeiro bacteriano.

[0108] É possível que a invenção possa ser utilizada para detectar bactérias Gram-negativas. Em geral, a membrana externa das bactérias Gram-negativas evita que as endolisinas entrem em contato a parede celular. No entanto, a membrana externa pode ser rompida (por exemplo, EDTA, detergentes, etc.) de modo que uma MDP possa fixar e se ligar à parede celular das bactérias Gram-negativas. Em algumas modalidades, um CBC é isolado a partir do domínio enzimático de uma endolisina codificada por um bacteriófago específico para bactérias Gram-negativas. Em algumas modalidades, sequências de aminoácidos conservadas dentro do domínio enzimático são responsáveis pela ligação celular e podem, portanto, ser usadas como um CBC. Em outras modalidades, a porção de um bacteriófago de tipo selvagem é uma o-espanina (RZ1), um espigão da cauda, ou uma fibra da cauda. Em outras modalidades, o CBC compreende sequências de aminoácidos conservadas com funcionalidade de ligação celular a partir de pelo menos uma das seguintes proteínas: endolisinas, holinas, espaninas, fibras da cauda, ou espigão da cauda.

[0109] Um CBC que se liga a um tipo de organismo particular pode ser derivado de um agente infeccioso particular e utilizado como parte de um indicador para identificar a presença desse organismo em uma amostra teste. Assim, a presente invenção propõe o uso de MDPs para decoração ou sinalização de células microbianas. Uma MDP pode ser uma proteína recombinante ou conjugada, ou então apresentar uma porção indicadora anexada. Assim, as modalidades da invenção aqui divulgada compreendem uma molécula decoradora ou sinalizadora apresentando uma porção de ligação celular e uma porção indicadora.

[0110] A função de lise da endolisina não é necessária – apenas a função de ligação celular. Então, em algumas modalidades, a porção indicadora é fundida a um CBD e compreende uma proteína que emite um sinal intrínseco, tal como uma proteína fluorescente ou proteína bioluminescente. O indicador pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Por exemplo, uma proteína fluorescente não requer substrato, porém é detectável diretamente com o equipamento adequado (por exemplo, microscópio fluorescente ou separação celular ativada por fluorescência (FACS)). Em algumas modalidades, o gene indicador codifica uma enzima (por exemplo, luciferase) que interage com um substrato para gerar o sinal. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase. Em algumas modalidades, um gene luciferase é um de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Renilla, luciferase de Gaussia externa, luciferase de Lucia ou uma luciferase projetada tal como NANOLUC®, Rluc8.6-535 ou nano-lanterna laranja.

[0111] Detecção do indicador pode incluir a detecção de emissões de luz. Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser utilizado para detectar a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com um substrato. A detecção das RLU pode ser alcançada com um luminômetro, ou outras máquinas ou dispositivos podem também ser utilizadas. Por exemplo, um espectrofotômetro, câmera CCD ou câmera CMOS podem detectar mudanças de cor e outras emissões de luz. As RLU absolutas são importantes para a detecção, porém a relação do sinal para o fundo também necessita ser alta (por exemplo, > 2.0, > 2.5, ou > 3.0) a fim de que células únicas ou baixos números de células sejam detectados de forma confiável.

[0112] Em algumas modalidades, a reação da porção indicadora (por exemplo, luciferase) com substrato pode continuar por 30 minutos ou mais, e a detecção em diversos pontos no tempo pode ser desejável para otimizar a sensibilidade. Por exemplo, nas modalidades que utilizam placas filtrantes de 96 como o suporte sólido e luciferase como o indicador, as leituras do luminômetro podem ser tomadas inicialmente e em intervalos de 3, ou 5, ou 10, ou 15 minutos até que a reação seja concluída.

[0113] Então, em algumas modalidades que utilizam MDP, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse compreendendo as etapas de capturar pelo menos uma bactéria da amostra; incubar a pelo menos uma bactéria com uma pluralidade de MDP; permitir tempo para a ligação da CBP ao microrganismo alvo na amostra; e detectar a porção indicadora, em que a detecção da porção indicadora demonstra que a bactéria está presente na amostra.

[0114] Por exemplo, em algumas modalidades, uma bactéria da amostra teste pode ser capturada pela ligação na superfície de uma placa, ou por filtração da amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, filtro spin de

0.45 μm de tamanho de poro ou placa filtrante). Em uma modalidade, a MDP é adicionada em um volume mínimo ou modesto à amostra capturada diretamente no filtro. Em uma modalidade, o microrganismo capturado no filtro ou superfície da placa é subsequentemente lavado uma ou mais vezes para remover o excesso de MDP não ligado.

[0115] Em algumas modalidades, as alíquotas de uma amostra teste compreendendo bactérias podem ser aplicadas a uma coluna spin e após a incubação com uma MDP recombinante e lavagem para remover qualquer MDP em excesso, a quantidade de indicador detectada será proporcional à quantidade de bactérias alvo presentes na amostra.

[0116] O indicador (por exemplo, luciferase) ligado às bactérias pode, então, ser medido e quantificado. Em uma modalidade, a solução é vertida através do filtro, e o filtrado é coletado para ensaio em um novo receptáculo (por exemplo, em um luminômetro) após a adição de um substrato para a enzima indicadora (por exemplo, substrato de luciferase). Alternativamente, o sinal indicador pode ser medido diretamente no filtro.

[0117] Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e a MDP inclui um CBC derivado de um bacteriófago. Em uma modalidade, a porção indicadora é luciferase. Então, em uma modalidade alternativa, o substrato indicador (por exemplo, substrato de luciferase) pode ser incubado com a porção da amostra que permanece em um filtro ou ligado à superfície da placa. De acordo, em algumas modalidades o suporte sólido é uma placa filtrante de 96 poços (ou placa de 96 poços regular), e a reação do substrato pode ser detectada pelo posicionamento da placa diretamente no luminômetro.

[0118] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria patogênica de interesse compreendendo as etapas de: ligar as células capturadas em uma placa filtrante de 96 poços com uma pluralidade de MDP; lavar o excesso de MDP; e detectar o indicador (por exemplo, luciferase) pela adição do substrato e medir a atividade enzimática diretamente na placa de 96 poços, em que a detecção da atividade enzimática indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0119] Em outra modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de um microrganismo de interesse, tal como S. Aureus, compreendendo as etapas de: ligar células em solução ou suspensão líquida em uma placa de 96 poços com uma pluralidade de MDP; lavar MDP não ligada das células apresentando MDP ligada; e detectar o indicador (por exemplo, luciferase) pela adição de substrato e medição da atividade enzimática diretamente na placa de 96 poços, em que a detecção da atividade enzimática indica que o microrganismo de interesse, tal como S. Aureus, está presente na amostra. Em algumas modalidades, o microrganismo de interesse pode ser capturado em um suporte sólido tal como em grânulos ou um filtro. Esta captura pode ocorrer tanto antes ou depois da incubação com a MDP. Em algumas modalidades, nenhuma etapa de captura é necessária.

[0120] Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser uma amostra teste consumível, tal como uma lavagem de vegetais. Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser lavagem de vegetais fortificada com caldo LB concentrado, caldo de soja tríptico / caldo triptona de soja, água peptonada, ou caldo nutriente. Em algumas modalidades, a solução ou suspensão líquida pode ser bactérias diluídas em caldo LB.

[0121] Em algumas modalidades, células de microrganismo alvo precisam estar intactas para a detecção adequada. Isto é, as células não precisam ser viáveis, porém, a parede celular deve estar estruturalmente intacta. Logo, é desejável minimizar a lise da bactéria antes da etapa de detecção.

[0122] Em algumas modalidades, uma etapa de concentração inicial para a amostra é útil. Isto é, quaisquer microrganismos ou outras substâncias relativamente grandes na amostra são concentradas para remover o líquido em excesso. No entanto, é possível realizar o ensaio sem uma etapa de concentração inicial. Algumas modalidades incluem uma etapa de concentração inicial, e em algumas modalidades esta etapa de concentração permite um tempo de incubação para o enriquecimento mais curto. Em outras modalidades, nenhum período de enriquecimento é necessário.

[0123] Algumas modalidades dos métodos de teste podem ainda incluir ensaios confirmatórios. Uma variedade de ensaios é conhecida na técnica por confirmar um resultado inicial, usualmente em um momento posterior. Por exemplo, as amostras podem ser cultivadas (por exemplo, ensaio CHROMAGAR® / DYNABEADS®), o PCR pode ser utilizado para confirmar a presença do DNA microbiano, ou outros ensaios de confirmação podem ser usados para confirmar o resultado inicial.

[0124] Modalidades dos ensaios de segurança alimentar incluem etapas de preparação da amostra. Algumas modalidades podem incluir o tempo de enriquecimento. Por exemplo, o enriquecimento por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 horas pode ser necessário, dependendo do tipo e tamanho da amostra. Após essas etapas de preparação da amostra, a ligação com uma alta concentração de MDP recombinante a qual compreende um repórter ou indicador pode ser realizada em uma variedade de formatos de ensaio, tal como aquele mostrado na Figura 1.

[0125] As modalidades de ensaios alimentares podem detectar uma única bactéria patogênica nos tamanhos da amostra que correspondem a padrões industriais, com uma redução no tempo para os resultados de pelo menos 20 %, ou pelo menos 30 %, ou pelo menos 40 % ou pelo menos 50 % ou pelo menos 60 % dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0126] Assim, algumas modalidades da presente invenção resolvem uma necessidade pelo uso de métodos baseados em proteínas recombinantes para amplificar um sinal detectável que indica a presença de bactérias. Em determinadas modalidades, tão pouco quanto uma única bactéria é detectada. Os princípios aqui aplicados podem ser aplicados na detecção de uma variedade de microrganismos. Por causa dos numerosos sítios de ligação para uma MDP geradora de sinal na superfície de um microrganismo, as porções dos indicadores de numerosas MDPs podem ser mais prontamente detectáveis do que o microrganismo por si só. Desta forma, as modalidades da presente invenção podem alcançar uma tremenda amplificação de sinal, mesmo a partir de uma única célula do microrganismo de interesse.

[0127] Aspectos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos componentes de ligação os quais podem se ligar a um microrganismo particular, tal como o componente de reconhecimento e ligação dos agentes infecciosos, como um meio para detectar e / ou quantificar o microrganismo específico em uma amostra. Em algumas modalidades, a presente invenção se aproveita da alta especificidade do domínio de ligação celular dos agentes infecciosos tal como o bacteriófago.

[0128] Algumas modalidades da invenção aqui divulgada e descrita utiliza a descoberta que um único microrganismo é capaz de se ligar a um grande número de MDPs. Este princípio permite a amplificação do sinal do indicador de uma ou poucas células baseadas no reconhecimento específico da superfície do microrganismo por inúmeras proteínas pequenas. Por exemplo, pela exposição de até mesmo uma única célula de uma bactéria para uma pluralidade de MDPs, o sinal indicador é amplificado de modo que uma única bactéria é detectável.

[0129] A velocidade e sensibilidade sem precedentes da detecção de um microrganismo com MDPs são resultados inesperados. Em algumas modalidades, os métodos da invenção requerem menos do que 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 horas para a detecção de um microrganismo de interesse. Esses prazos são mais curtos do que aqueles que previamente pensava-se ser possível. Em algumas modalidades, os métodos podem detectar tão pouco quanto 100, 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 células da bactéria de interesse. Em algumas modalidades, até mesmo uma única célula da bactéria é detectável. Em modalidades adicionais, a invenção compreende sistemas (por exemplo, sistemas de computador, sistemas automatizados ou kits) compreendendo componentes para a realização dos métodos aqui divulgados, e / ou uso das MDPs aqui descritas.

[0130] Os protocolos existentes para a detecção de bactérias patogênicas em alimentos são complicados, caros, lentos, trabalhosos e sujeitos a falsos positivos. Além disso, os métodos de detecção baseados em fago incluem a complicação adicional e as implicações regulatórias dos reagentes infecciosos. A detecção com uma MDP recombinante específica para um determinado patógeno oferece uma alternativa de teste eficaz, rápida e simples. Métodos de preparação MDP recombinante

[0131] Algumas modalidades dos métodos para fabricar MDP começa com a seleção de um bacteriófago de tipo selvagem para a sequência do domínio de ligação celular. Alguns bacteriófagos são altamente específicos para uma bactéria alvo. Isto apresenta uma oportunidade para a detecção altamente específica.

[0132] Logo, os métodos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos agentes de ligação associados com os agentes infeciosos para reconhecer e se ligar a um microrganismo particular de interesse. O potencial para um grande número de moléculas MDP em se ligar a um único microrganismo fornece meios para amplificar um sinal indicador e, assim, permitir a detecção de baixos níveis de um microrganismo (por exemplo, um único microrganismo) presente em uma amostra.

[0133] Os bacteriófagos são capazes de infectar e lisar bactérias específicas. Os genomas do bacteriófago codificam para três proteínas; holinas, endolisinas e espaninas, as quais, juntas, são responsáveis pela liberação da progênie durante o ciclo lítico do fago. Tal como mostrado na Figura 2, as endolisinas (também denominadas hidrolases de peptideoglicano ou hidrolases de mureína) se ligam e lisam a parede celular do tipo de bactéria particular que elas infectam. As moléculas de holina rompem a membrana citoplasmática, permitindo que as endolisinas acessem o peptideoglicano na parede celular. Nas bactérias Gram- positivas, as endolisinas são capazes de entrar em contato com o peptideoglicano das células; no entanto, a membrana externa das bactérias Gram-negativas evita a ligação entre as endolisinas e a parede celular. Geralmente, as endolisinas produzidas por fagos específicos para bactérias Gram- negativas apresentam apenas um único domínio catalítico responsável pela lise. Endolisinas produzidas por fagos específicos para bactérias Gram-positivas apresentam dois domínios: um domínio de atividade enzimática (EAD) para lise e um domínio de ligação à parede celular (CBD) para reconhecimento do hospedeiro e ligação de alta afinidade. Mais especificamente, um CBD da endolisina permite que o bacteriófago reconheça a bactéria com alta especificidade (a função de lise não é necessária). Outros tipos de agentes infecciosos similarmente empregam proteínas de ligação celular para especificidade. Em alguns casos, as sequências de ácido nucleico responsáveis pela ligação celular foram encontradas dentro do único EAD globular de endolisinas codificadas por bacteriófagos específicos para bactérias Gram-negativas.

[0134] Um terceiro tipo de proteína, as espaninas, são responsáveis pelo rompimento da membrana externa em hospedeiros Gram-negativos. RZ1 é uma lipoproteína da membrana externa do complexo de espanina. Durante o ciclo lítico, o complexo de espanina rompe a membrana externa após a destruição da parede celular pelas endolisinas. Em algumas modalidades, o CBC compreende sequências de aminoácidos conservadas com funcionalidade de ligação celular a partir de pelo menos uma das seguintes proteínas: endolisinas, holinas, espaninas, espigão da cauda, ou fibras da cauda. Em outras modalidades, o CBC compreende sequências de aminoácidos conservadas com funcionalidade de ligação celular a partir de endolisinas e sequências de aminoácidos conservadas a partir de pelo menos uma das holinas,

espaninas, espigão da cauda, ou fibras da cauda.

[0135] Em alguns casos, o fago pode se ligar nas bactérias específicas através das proteínas de ligação ao receptor (RBPs). As interações entre uma RBP e a superfície celular de uma bactéria determina a especificidade da RBP. Em alguns fagos, as RBPs estão localizadas no eixo da cauda, fibras da cauda, ou espigão da cauda. As proteínas da fibra da cauda do fago atuam em um papel na adsorção à superfície celular e degradação do polissacarídeo. As proteínas do espigão da cauda são um componente da cauda de muitos bacteriófagos. A proteína do espigão da cauda se liga à superfície celular de hospedeiros bacterianos e mediam o reconhecimento do hospedeiro bacteriano. O espigão da cauda do fago e / ou as proteínas da fibra da cauda atua em um papel na adsorção à superfície celular e degradação do polissacarídeo, permitindo que o fago se fixe nas bactérias.

[0136] Alguns fagos, incluindo CBA120, Vil e P22, apresentam espigão da cauda. Outros fagos, tais como T4, JG04, SEA1, Saka2 e Saka4 apresentam fibras da cauda. Um CBC que se liga a um tipo particular de organismo pode ser derivado de um agente infeccioso particular e utilizado como parte de um indicador para identificar a presença daquele organismo em uma amostra teste. Logo, a presente invenção propõe o uso de MDPs para decorar ou sinalizar células microbianas por adsorção. Uma MDP pode ser uma proteína recombinante ou conjugada ou, de outra forma, apresentar uma porção indicadora fixada. Em outras modalidades, o CBC compreende sequências de aminoácidos conservadas com funcionalidade de ligação celular a partir de endolisinas e sequências de aminoácidos conservadas a partir de pelo menos uma de holinas, espaninas, espigão da cauda, ou fibras da cauda. Logo, as modalidades da invenção aqui divulgada compreendem uma molécula de decoração ou sinalização apresentando uma porção de ligação celular e uma porção indicadora.

[0137] Agentes infecciosos podem ser altamente específicos para um tipo particular de organismo. Por exemplo, um bacteriófago pode ser específico para um gênero particular de uma bactéria, tal como Listeria. Por exemplo, o bacteriófago A511 é específico para o gênero Listeria ou um bacteriófago pode ser específico para uma espécie particular de bactéria, tal como E. coli. Para alguns tipos de bactérias, os bacteriófagos podem até mesmo reconhecer subtipos particulares daquele organismo com alta especificidade. Por exemplo, o bacteriófago CBA120 é altamente específico para E. coli O157:H7 e o bacteriófago φYeO3-12 é altamente específico para Y. enterocolitica do sorotipo O:3.

[0138] Em algumas modalidades das MDPs aqui descritas, o CBC é um aspecto de uma proteína recombinante ou uma proteína conjugada. Um trecho particular de aminoácidos, codificado por um segmento particular de um gene bacteriófago que codifica para a endolisina, pode servir como parte de um marcador de tipo celular altamente específico. O CBC pode ser derivado de T7, T4, tipo T4, ViI, tipo ViI, AR1, A511, A118, A006, A500, PSA, P35, P40, B025, B054,A97, phiSM101, phi3626, CBA120, SPN1S, 10, epsilon15, P22, LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20, P70, A511, P4W, K, Twort, ou SA97. Uma MDP também inclui uma porção indicadora, tal como uma porção fluorescente, uma proteína fluorescente, uma proteína bioluminescente, ou uma enzima, que permite que a MDP gere um sinal. Em uma MDP recombinante, diversos tipos de repórteres podem ser fixados ao CBP, para atuar como uma porção indicadora. Em algumas modalidades, a proteína de fusão da MDP inclui a sequência de aminoácidos para uma enzima, tal como uma luciferase, a qual é apenas detectável após a adição de um substrato adequado. Por exemplo, luciferase, fosfatase alcalina, e outras enzimas repórter reagem com um substrato adequado para fornecer um sinal detectável. Algumas modalidades de uma MDP recombinante compreendem um luciferase de tipo selvagem ou uma luciferase projetada, tal como NANOLUC®. Outras modalidades incluem uma proteína fluorescente ou outra proteína repórter.

[0139] Uma variedade de agentes infecciosos pode ser estudada e / ou pode servir como um modelo para o domínio de ligação celular do CBC. Em modalidades alternativas, os bacteriófagos, fagos, mico bacteriófagos (tal como para TB e paraTB), micófagos (tal como para fungos), fagos de micoplasma, e qualquer outro vírus que pode invadir bactérias vivas, fungos, micoplasma, protozoários, leveduras, e outros organismos vivos microscópicos podem ser estudados ou copiados para direcionar um microrganismo de interesse. Em uma modalidade, quando o microrganismo de interesse é uma bactéria, o CBC pode compreender um domínio de ligação celular de um bacteriófago. Por exemplo, fagos bem estudados de E. coli incluem T1, T2, T3, T4, T5, T7 e lambda; outros fagos de E. coli disponíveis na coleção ATCC, por exemplo, incluem phiX174, S13, Ox6, MS2, phiV1, fd, PR772 e ZIK1. Os fagos de Salmonella incluem SPN1S, 10, epsilon15, SEA1 e P22. Os fagos de Listeria incluem LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20,

P70 e A511. Os fagos de Staphylococcus incluem P4W, vírus K, Twort, phi11, 187, P68, e phiWMY.

[0140] Algumas modalidades de métodos para a preparação de uma MDP recombinante incluem sequenciar ou estudar sequências publicadas para diversos bacteriófagos a fim de garantir a localização e sequência precisa dos seus componentes de ligação celular. A sequência é caracterizada por encontra homologia entre componentes de ligação celular conhecidos e a sequência do fago. Por exemplo, a endolisina dos fagos de Listeria é deduzida a partir das sequências do fago de Listeria tal como comparado a outras sequências de endolisina. Logo, a sequência de um domínio de ligação celular específico para Listeria é selecionada ou projetada e utilizada como um aspecto de uma MDP para a detecção de Listeria.

[0141] Algumas modalidades da invenção utilizam a especificidade da ligação de uma MDP recombinante para o direcionamento rápido e sensível para se ligar e facilitar a detecção de uma bactéria de interesse. Sondas de detecção de microrganismo recombinantes

[0142] Tal como descrito aqui em maiores detalhes, as composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender sondas de detecção de microrganismo (MDPs) para uso na detecção de microrganismos patogênicos. Em determinadas modalidades, a invenção compreende uma MDP recombinante apresentando um componente de ligação celular (CBC) e um gene indicador ou repórter.

[0143] Em algumas modalidades, um fragmento do gene que codifica um CBC é isolado a partir de um bacteriófago específico para o alvo da detecção. Em algumas modalidades,

um CBC é derivado de um bacteriófago, tal como de T7, T4 ou outro fago similar. Um CBC de bacteriófago pode também ser derivado de tipo T4, tipo T7, ViI, tipo ViI, AR1, A511, A118, A006, A500, PSA, P35, P40, B025, B054, A97, phiSM101, phi3626, CBA120, SPN1S, 10, epsilon15, P22, LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20, P70, A511, P4W, K, Twort, ou SA97. Em algumas modalidades, o CBC pode ser um CBD de uma endolisina ou uma porção do mesmo que atua como um domínio de ligação funcional. Um domínio de ligação funcional pode ser uma sequência de aminoácidos conservada dentro do CBD responsável pela ligação de funções / especificidade da bactéria. Em outras modalidades, o CBC pode ser um domínio de ligação funcional de outro tipo de proteína codificada por um genoma do bacteriófago incluindo, porém não limitado a o-espaninas, espigão da cauda, e fibras da cauda. Em algumas modalidades, a o-espanina pode ser RZ1.

[0144] Em algumas modalidades, o CBC pode ser traduzido em reverso para DNA e sintetizado para a clonagem em uma proteína de fusão do indicador. Uma MDP pequena irá permitir que mais moléculas se liguem a uma única célula e gere um sinal. Com esta consideração, um produto do gene indicador menor pode também ser desejável (no entanto, observe que mesmo um MDP grande é provável que seja muito menor do que um anticorpo). As proteínas OpLuc e NANOLUC® são apenas cerca de 20 kDa (aproximadamente 500 - 600 bp para codificar), enquanto o FLuc é cerca de 62 kDa e requer aproximadamente 1,700 bp para codificar. Para comparação, o genoma de T7 está em torno de 40 kbp, enquanto o genoma de T4 é de cerca de 170 kbp. Em algumas modalidades, o CBC é clonado em um plasmídeo de fusão NANOLUC®. Em algumas modalidades, o plasmídeo de fusão é criado pela mutação do códon de parada e a inserção de um sítio de endonuclease de restrição por meio de uma mutagênese direcionada pelo sítio. Em algumas modalidades, o fragmento do gene do CBC é clonado nos sítios da enzima de restrição do plasmídeo de fusão resultando no constructo de MDP. O constructo da MDP pode ser transformado em E. coli e cultivado em meio LB. A expressão da MDP pode ser induzida pela adição do indutor adequado. Em uma modalidade, a adição de isopropil 1β-D-1 tiogalacto piranosídeo (IPTG) pode ser utilizada para induzir a expressão da MDP. Em algumas modalidades, a cultura pode ser agitada a fim de induzir a expressão da MDP.

[0145] Além disso, o indicador deve gerar uma alta relação do sinal para o fundo e deve ser prontamente detectável em tempo hábil. O NANOLUC® da Promega é uma luciferase de Oplophorus gracilirostris (camarão do fundo do mar) modificada. Em algumas modalidades, NANOLUC® combinado com NANO-GLO® da Promega, um substrato de imidazopirazinona (furimazina), pode fornecer um sinal robusto com fundo fraco.

[0146] Em algumas modalidades de MDP, uma porção indicadora é fundida ao CBC. Um indicador pode ser qualquer um de uma variedade de biomoléculas. O indicador pode ser um produto detectável ou uma enzima que produz um produto detectável ou um cofator para uma enzima que produz um produto detectável. Em algumas modalidades, a porção indicadora de uma MDP é um repórter, tal como uma enzima detectável. O produto do gene indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Diversas enzimas adequadas estão comercialmente disponíveis, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre

(HRP), ou luciferase (Luc). Por exemplo, em uma modalidade o indicador é uma enzima luciferase. Diversos tipos de luciferase podem ser utilizados. Em modalidades alternativas, e tal como aqui descrito em maiores detalhes, a luciferase é uma de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, luciferase de Renilla, ou uma luciferase projetada. Em algumas modalidades, a luciferase é derivada de Oplophorus. Em algumas modalidades, o indicador é uma luciferase geneticamente modificada, tal como NANOLUC®. Outras luciferases ou outras enzimas projetadas que geram sinais detectáveis podem também ser porções indicadoras adequadas. Em algumas modalidades, essas enzimas podem servir como a porção indicadora.

[0147] Em modalidades alternativas, a MDP compreende uma porção indicadora conjugada. Por exemplo, FITC pode ser conjugada a um CBC para criar uma MDP funcional. Em algumas modalidades, uma MDP pode incluir porções ou segmentos adicionais, tal como um segmento para a ligação a um suporte sólido para facilitar a separação de MDPs ligadas a partir de MDPs não ligadas. A conjugação com uma porção indicadora não afeta a afinidade do CBD para os microrganismos.

[0148] As composições da invenção podem compreender um ou mais MDPs derivados de um ou mais agentes infecciosos de tipo selvagem (por exemplo, bacteriófagos) e uma ou mais porções indicadoras. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes MDPs as quais podem gerar a mesma ou diferentes sinais indicadores. Isto é, uma composição para a detecção de um microrganismo pode incluir todos as mesmas MDPs ou MDPs diferentes.

[0149] Uma MDP aplicada tal como descrito acima compreende um componente de ligação celular (CBC) o qual facilita a detecção específica dos microrganismos baseada na especificidade do CBC. Em outra abordagem que pode utilizar um CBC para a especificidade, os ensaios previamente descritos utilizando bacteriófago recombinante o qual reconhece e se liga às bactérias específicas podem ser empregados. Os ensaios com bacteriófago recombinante podem ser realizados em um aparelho tal como aqui descrito posteriormente. Bacteriófago recombinante

[0150] Tal como aqui descrito em maiores detalhes, o aparelho, métodos, sistemas e kits da invenção compreendem bacteriófago recombinante para uso na detecção de microrganismos de interesse. Os bacteriófagos recombinantes estão compreendidos no primeiro compartimento do aparelho divulgado acima. Em algumas modalidades, a invenção pode incluir uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador incorporado no genoma do bacteriófago. Em algumas modalidades, o gene indicador está operacionalmente ligado a um promotor o qual não é um promotor nativo do bacteriófago. Em algumas modalidades, o gene indicador está operacionalmente ligado a um promotor nativo do bacteriófago. Os bacteriófagos recombinantes compreendendo o gene indicador ou repórter são também referidos como um bacteriófago indicador nesta divulgação.

[0151] Um bacteriófago recombinante pode incluir um gene repórter ou indicador. Em determinadas modalidades do bacteriófago, o gene indicador não codifica uma proteína de fusão. Por exemplo, em determinadas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de uma bactéria hospedeiro resulta em um produto de proteína indicadora solúvel. Em determinadas modalidades, o gene indicador pode estar inserido dentro de uma região de gene tardio do bacteriófago. Genes tardios são geralmente expressos em níveis mais altos do que outros genes de fago, uma vez que eles codificam para proteínas estruturais. A região do gene tardio pode ser uma região do gene de classe III e pode incluir um gene para uma proteína maior do capsídeo.

[0152] Algumas modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga à jusante do gene da proteína maior do capsídeo. Outras modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga à montante do gene da proteína maior do capsídeo. Em algumas modalidades, a sequência compreende um gene repórter otimizado por códon precedido por uma região não traduzida. A região não traduzida pode incluir um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada do ribossomo.

[0153] Em algumas modalidades, um bacteriófago indicador é derivado de A511, P100, fago de Listeria LMTA- 94, LMA4, LMA8, T7, T4 ou outro fago similar. Um bacteriófago indicador pode também ser derivado de P100virus, tipo T4, tipo T7, ViI, tipo ViI, bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, Listeria ou Staphylococcus, ou outro bacteriófago apresentando um genoma com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de homologia para T7, tipo T7, T4, tipo T4, P100virus,

bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, Listeria ou Staphylococcus, bacteriófagos ViI ou tipo ViI (ou tipo vírus Vi1, para GenBank/NCBI). Em algumas modalidades, o fago indicador é derivado de um bacteriófago que é altamente específico para um microrganismo patogênico particular. As modificações genéticas podem evitar deleções de genes do tipo selvagem e logo o fago modificado pode permanecer mais similar ao bacteriófago de tipo selvagem do que muitos fagos comercialmente disponíveis. Bacteriófagos derivados do ambiente pode ser mais específicos para bactérias que são encontradas no meio ambiente e, como tal, geneticamente distintos do fago comercialmente disponível.

[0154] Além disso, genes do fago considerados não essenciais podem apresentar função não reconhecida. Por exemplo, um gene aparentemente não essencial pode apresentar uma função importante para elevar o sinal do rompimento tal como corte sutil, encaixe ou funções de corte na montagem. Sendo assim, os genes de deleção para inserir um indicador podem ser prejudiciais. A maioria dos fagos pode empacotar um DNA que é poucos porcento maior do que seu genoma natural. Com esta consideração, um gene indicador menor pode ser uma escolha mais adequada para modificar um bacteriófago, especialmente um com um genoma menor. As proteínas OpLuc e NANOLUC® têm apenas cerca de 20 kDa (aproximadamente 500 - 600 bp para codificar), enquanto FLuc tem cerca de 62 kDa (aproximadamente 1700 bp para codificar). Para comparação, o genoma do T7 tem cerca de 40 kbp, enquanto o genoma do T4 tem cerca de 170 kbp, e o genoma do bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella ou Staphylococcus tem cerca de 157 kbp. Além disso, o gene repórter não deve ser expresso endogenamente pelas bactérias (isto é, não faz parte do genoma bacteriano), deve gerar uma alta relação do sinal para o fundo e deve ser prontamente detectável em tempo hábil. O NANOLUC® da Promega é uma luciferase de Oplophorus gracilirostris (camarão do fundo do mar) modificada. Em algumas modalidades, o NANOLUC® combinado com NANO-GLO® da Promega, um substrato de imidazopirazinona (furimazina), pode fornecer um sinal robusto com fundo fraco.

[0155] Em algumas modalidades de fago indicador, o gene indicador pode ser inserido dentro de uma região não traduzida para evitar o rompimento de genes funcionais, deixando os genes do fago de tipo selvagem intactos, o que pode levar a uma maior aptidão ao infectar cepas não laboratoriais de bactérias. Adicionalmente, incluir os códons de parada em todos os três quadros de leitura pode ajudar a aumentar a expressão ao reduzir a leitura, também conhecida como expressão vazada. Esta estratégia pode também eliminar a possibilidade de uma proteína de fusão ser feita a baixos níveis, o que se manifestaria como sinal de fundo (por exemplo, luciferase) que não pode ser separado do fago.

[0156] Um gene indicador pode expressar uma variedade de biomoléculas. O gene indicador é um gene que expressa um produto detectável ou uma enzima que produz um produto detectável. Por exemplo, em uma modalidade, o gene indicador codifica uma enzima luciferase. Diversos tipos de luciferase podem ser utilizados. Em modalidades alternativas, e tal como aqui descrito em maiores detalhes, a luciferase é uma de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, luciferase de Renilla, ou uma luciferase projetada. Em algumas modalidades, o gene da luciferase é derivado de Oplophorus. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene de luciferase geneticamente modificado, tal como NANOLUC®.

[0157] Logo, em algumas modalidades, a presente invenção compreende um bacteriófago geneticamente modificado compreendendo um gene indicador não bacteriófago na região de gene tardia (classe III). Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo está sob o controle de um promotor tardio. O uso de um promotor viral do gene tardio garante que o gene repórter (por exemplo, luciferase) não só se expresse em altos níveis, como as proteínas do capsídeo viral, mas também não se desligue como genes bacterianos endógenos ou mesmo genes virais precoces.

[0158] Em algumas modalidades, o promotor tardio é um promotor P100virus, tipo T4, tipo T7 ou tipo ViI, ou outro promotor de fago similar àquele encontrado no fago de tipo selvagem selecionado, isto é, sem modificação genética. A região do gene tardio pode ser uma região do gene de classe III, e o bacteriófago pode ser derivado de T7, T4, tipo T4, ViI, tipo ViI, bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, Staphylococcus, Listeria ou S. aureus, ou outro bacteriófago natural apresentando um genoma com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 % de homologia para T7, T4, tipo T4, ViI, tipo ViI, ou bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, Staphylococcus, Listeria ou S. aureus.

[0159] As modificações genéticas para bacteriófagos podem incluir inserções, deleções ou substituições de um pequeno fragmento de ácido nucleico, uma parte substancial de um gene, ou um gene inteiro. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos inseridos ou substituídos compreendem sequências não nativas. Um gene indicador não nativo pode ser inserido dentro de um genoma do bacteriófago de modo que esteja sob o controle de um promotor de bacteriófago. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não faz parte de uma proteína de fusão. Isto é, em algumas modalidades, uma modificação genética pode ser configurada de modo que o produto da proteína indicadora não compreenda polipeptídios do bacteriófago de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o produto da proteína indicadora é solúvel. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de uma bactéria de interesse compreendendo a etapa de incubar uma amostra teste com o referido bacteriófago recombinante.

[0160] Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador no bacteriófago da progênie após a infecção dos hospedeiros da bactéria resulta em um produto de proteína livre solúvel. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não é contíguo com um gene que codifica uma proteína de estrutural e, dessa forma, não fornece uma proteína de fusão. Diferente dos sistemas que empregam uma fusão de uma porção de detecção à proteína do capsídeo (isto é, uma proteína de fusão), algumas modalidades da presente invenção expressam um indicador ou repórter solúvel (por exemplo, luciferase solúvel). Em algumas modalidades, o indicador ou repórter está idealmente livre da estrutura do bacteriófago. Isto é, o indicador ou repórter não está fixado à estrutura do fago. Como tal, o gene para o indicador ou repórter não está fundido com outros genes no genoma do fago recombinante. Isso pode aumentar grandemente a sensibilidade do ensaio

(para uma única bactéria), e simplificar o ensaio, permitindo que o ensaio seja concluído em menos de uma hora para algumas modalidades, diferente de diversas horas devido às etapas adicionais de purificação requeridas com constructos que produzem proteínas de fusão detectáveis. Além disso, as proteínas de fusão podem ser menos ativas do que proteínas solúveis devido, por exemplo, a restrições de enovelamento de proteínas que podem alterar a conformação de um sítio ativo de enzima ou acesso ao substrato.

[0161] Além disso, as proteínas de fusão, por definição, limitam o número das porções fixadas a subunidades de uma proteína no bacteriófago. Por exemplo, utilizando um sistema comercialmente disponível designado para servir como uma plataforma para uma proteína de fusão resultaria em cerca de 415 cópias da porção de fusão, correspondente a cerca de 415 cópias do gene 10B da proteína do capsídeo em cada partícula de bacteriófago T7. Sem esta restrição, espera-se que bactérias infectadas expressem muito mais cópias da porção de detecção (por exemplo, luciferase) do que pode caber no bacteriófago. Adicionalmente, proteínas de fusão grandes, tal como uma fusão capsídeo - luciferase, podem inibir a montagem da partícula de bacteriófago, assim, fornecendo menos progênies do bacteriófago. Logo, um produto do gene indicador solúvel, não fundido pode ser preferível.

[0162] Em algumas modalidades, o fago indicador codifica um repórter, tal como uma enzima detectável. O produto do gene indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Diversas enzimas adequadas estão comercialmente disponíveis, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem servir como a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis podem também ser porções indicadoras adequadas.

[0163] Em algumas modalidades, o uso de uma porção de detecção solúvel elimina a necessidade de remover fago parental contaminante a partir do lisado das células da amostra infectada. Com um sistema da proteína de fusão, qualquer bacteriófago utilizado para infectar as células da amostra teria a porção de detecção fixada, e seria indistinguível a partir do bacteriófago filho também contendo a porção de detecção. Como a detecção das bactérias da amostra depende da detecção de uma porção de detecção recém criada (sintetizada de novo), utilizar constructos de fusão requer etapas adicionais para separar porções antigas (parental) de porções recém criadas (bacteriófago filho). Isso pode ser alcançado pela lavagem das células infectadas múltiplas vezes, antes da conclusão do ciclo de vida do bacteriófago, inativando o excesso de fago parental após a infecção por meios físicos ou químicos, e / ou modificando quimicamente o bacteriófago parental com a porção de ligação (tal como biotina), a qual pode então ser ligada e separada (tal como por grânulos de sepharose revestidos com estreptavidina). No entanto, mesmo com todas essas tentativas de remoção, o fago parental pode permanecer quando uma alta concentração de fago parental é utilizada para garantir a infecção de um baixo número de células da amostra, criando um sinal de fundo que pode obscurecer a detecção do sinal de fago da progênie celular infectada.

[0164] Por outro lado, com a porção de detecção solúvel expressa em algumas modalidades da presente invenção, a purificação do fago parental a partir do lisado final é desnecessária, uma vez que o fago parental não apresenta qualquer porção de detecção fixada. Logo, qualquer porção de detecção presente após a infecção deve ter sido criada de novo, indicando a presença de uma bactéria ou bactérias infectadas. Para aproveitar este benefício, a produção e preparação do fago parental pode incluir a purificação do fago de qualquer porção de detecção livre produzida durante a produção de bacteriófago parental na cultura bacteriana. Técnicas de purificação de bacteriófago padrão podem ser empregadas para purificar algumas modalidades do fago de acordo com a presente invenção, tal como centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, centrifugação em gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio, HPLC, cromatografia de exclusão de tamanho, e diálise ou tecnologias derivadas (tal como concentradores da marca Amicon – Millipore, Inc.). A ultracentrifugação isopícnica de cloreto de césio pode ser empregada como parte da preparação de fago recombinante da invenção, para separar partículas de fago parental de proteína luciferase contaminante produzida após a propagação do fago no hospedeiro bacteriano. Neste sentido, o bacteriófago parental recombinante da invenção está substancialmente livre de qualquer luciferase gerada durante a produção nas bactérias. A remoção de luciferase residual presente no estoque de fago pode substancialmente reduzir o sinal de fundo observado quando o bacteriófago recombinante é incubado com uma amostra teste.

[0165] Em algumas modalidades do bacteriófago modificado, o promotor tardio (promotor da classe III, por exemplo, de fago específico para Listeria, T7, T4 ou ViI) apresentam alta afinidade para a RNA polimerase do mesmo bacteriófago que transcreve genes para proteínas estruturais montadas na partícula do bacteriófago. Essas proteínas são as proteínas mais abundantes feitas pelo fago, uma vez que cada partícula de bacteriófago compreende dezenas ou centenas de cópias destas moléculas. O uso de um promotor tardio viral pode garantir otimamente alto nível de expressão da porção de detecção da luciferase. O uso de um promotor viral tardio derivado de, específico para, ou ativo sob o bacteriófago de tipo selvagem original, o fago indicador é derivado de (por exemplo, um promotor tardio do fago específico para Listeria, T4, T7 ou ViI com um sistema baseado em T4, T7 ou ViI) pode ainda garantir a expressão ótima da porção de detecção. O uso de um promotor bacteriano padrão (não viral / não bacteriófago) pode, em alguns casos, ser prejudicial à expressão, uma vez que esses promotores são, com frequência, regulados negativamente durante a infecção do bacteriófago (a fim de que o bacteriófago priorize as fontes bacterianas para a produção de proteínas do fago). Logo, em algumas modalidades, o fago é preferencialmente projetado para codificar e expressar em alto nível uma porção indicadora solúvel (livre), utilizando o posicionamento no genoma que não limita a expressão do número de subunidades de um componente estrutural do fago.

[0166] As composições da invenção podem compreender um ou mais bacteriófagos de tipo selvagem ou geneticamente modificados (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes fagos indicadores os quais podem codificar e expressar a mesma proteína indicadora ou proteínas indicadoras diferentes. Em algumas modalidades, o coquetel de bacteriófago compreende pelo menos dois diferentes tipos de bacteriófagos recombinantes. Aparelho

[0167] As modalidades da invenção estão direcionadas para métodos de detecção de microrganismos de interesse utilizando um aparelho autônomo. O aparelho compreende um suporte sólido, o qual pode ser utilizado para a coleta de uma amostra compreendendo os microrganismos de interesse. Em algumas modalidades, um aparelho de acordo com a invenção compreende um tubo com compartimentos separados, tanto dispostos sequencialmente ou em uma configuração ramificada (por exemplo, “orelhas” em um tubo). O aparelho pode compreender um número de compartimentos o qual pode ser configurado para misturas variadas de reagentes e tempo das etapas do método. Em algumas modalidades, o compartimento mais alto ou superior do tubo contém bacteriófago recombinante, e o compartimento do substrato está abaixo do compartimento do bacteriófago. Em algumas modalidades, o tubo contém meio de crescimento.

[0168] Nas modalidades mais simples, um primeiro compartimento contém bacteriófago recombinante, e um segundo compartimento contém substrato ou reagente de desenvolvimento. Nas referidas modalidades, ambos os reagentes são misturados com uma amostra (capturada no suporte sólido) ao mesmo tempo. Em outras modalidades, uma amostra é inicialmente adicionada ao primeiro compartimento para iniciar a infecção. Após um período de tempo, um conduíte para o segundo compartimento é aberto para permitir a adição e mistura do substrato ou reagente de desenvolvimento dentro da amostra infectada.

[0169] Em uma modalidade alternativa, o primeiro compartimento contém sondas de detecção de microrganismos (MDPs) e um segundo compartimento contém substrato ou reagente de desenvolvimento. Em algumas das referidas modalidades, ambos os reagentes são misturados com uma amostra (capturada no suporte sólido) ao mesmo tempo. Em outras modalidades, uma amostra é inicialmente adicionada ao primeiro compartimento. Após um período de tempo, um conduíte para o segundo compartimento é aberto para permitir a adição e mistura do substrato ou reagente de desenvolvimento na amostra infectada.

[0170] Em algumas modalidades, uma vedação separa compartimentos adjacentes, o usuário rompe a vedação(ões), ambos o substrato e o fago encontram o swab ao mesmo tempo. A luciferase é produzida e reage com o substrato para produzir a sinal detectável.

[0171] Em algumas modalidades, o compartimento do substrato pode estar posicionado entre um compartimento do meio e um compartimento do bacteriófago recombinante. Quando um usuário rompe a vedação para aplicar um reagente a uma amostra que é capturada no suporte sólido, ambos os reagentes são aplicados ao mesmo tempo.

[0172] Em modalidades alternativas, o compartimento do substrato pode estar posicionado entre um compartimento do meio e um compartimento da MDP. Quando um usuário rompe a vedação para aplicar um reagente a uma amostra que é capturada no suporte sólido, ambos os reagentes são aplicados ao mesmo tempo.

[0173] Em algumas modalidades, um suporte sólido é adicionado a um tubo em que o substrato ou desenvolvedor está no fundo do tubo; o suporte sólido é empurrado para o fundo para começar a reação entre a enzima e substrato ou outro repórter e reagente pareado. O suporte sólido pode estar fixado a um eixo para facilitar o manuseio.

[0174] As Figuras a seguir fornecem exemplos ilustrativos das modalidades da invenção.

[0175] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um sistema de aparelho de detecção de microrganismo autônomo. A Figura 12 mostra uma modalidade de um aparelho 100. O aparelho compreende um suporte sólido 16 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento 10 contém fago, o segundo compartimento 12 contém substrato, e o terceiro compartimento 14 contém meio. Este aparelho permite que o fago e o substrato sejam incubados com a amostra ao mesmo tempo.

[0176] A Figura 13 mostra uma segunda modalidade de um aparelho 200. O aparelho compreende um suporte sólido 26 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento 20 contém fago, o segundo compartimento 22 contém meio, e o terceiro compartimento 24 contém substrato. Em modalidades, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 13, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 13, o suporte sólido é encharcado com meio antes da coleta da amostra.

[0177] A Figura 14 mostra uma terceira modalidade de um aparelho 300. O aparelho compreende um suporte sólido 36 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento 30 contém meio, o segundo compartimento 32 contém fago, e o terceiro compartimento 34 contém substrato. Em modalidades, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 14, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 14, o suporte sólido é seco antes da coleta da amostra.

[0178] A Figura 15 mostra uma quarta modalidade de um aparelho 400. O aparelho compreende um suporte sólido 46 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento 40 contém meio, o segundo compartimento 42 contém fago, e o terceiro compartimento 46 contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de trava de parada para a mistura em fases dos reagentes. Em modalidades, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 15, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 15, o suporte sólido é encharcado com meio antes da coleta da amostra.

[0179] A Figura 16 mostra uma quinta modalidade de um aparelho 500. O aparelho compreende um suporte sólido 56 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma vedação de ação instantânea. O primeiro compartimento 50 contém meio, o segundo compartimento 52 contém fago, e o terceiro compartimento 54 contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de trava de parada para a mistura em fases dos reagentes. Em modalidades, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 16, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais, ao utilizar o aparelho mostrado na Figura 16, o suporte sólido é seco antes da coleta da amostra.

[0180] A Figura 17 mostra um método para a detecção de microrganismos compreendendo (i) enriquecer uma amostra durante a noite, (ii) utilizar um suporte sólido de um aparelho autônomo para coletar a amostra que tenha sido enriquecida durante a noite, (iii) infectar a amostra com fago contida dentro de um compartimento do aparelho autônomo, e (iv) detectar a presença de microrganismos na leitura / detecção do sinal produzido pela etapa de infecção.

[0181] Em algumas modalidades, os compartimentos contidos em projeções ou ramificações a partir do tubo central permite a mistura de reagentes a partir de mais do que 2 direções, por exemplo, na forma de “orelhas”. Por exemplo, dois bulbos de aperto poderiam ser utilizados para adicionar meio e então fago sequencialmente ou simultaneamente ao compartimento principal, ou para adicionar outros reagentes. Diversas disposições de outros compartimentos em relação a um compartimento central permitem a adição e mistura de diferentes reagentes dentro do compartimento adjacente maior. Suporte sólido revestido com componentes de ligação celular

[0182] Tal como discutido acima, o aparelho da divulgação pode compreender um suporte sólido. Uma variedade de suportes sólidos pode ser utilizada. Em determinadas modalidades, o suporte sólido pode compreender, um swab, um filtro, um grânulo, uma faixa de fluxo lateral, uma faixa filtrante, disco de filtro, papel de filtro, ou filmes finos projetados para o cultivo de células (por exemplo, PetriFilm por 3M). Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende materiais plásticos. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS), ácido polilático (PLA) e cloreto de polivinila (PVC). Em algumas modalidades, o suporte sólido é revestido com um componente de ligação celular o qual apresenta alta afinidade para os microrganismos a serem detectados. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um grânulo de poliestireno ou um grânulo feito de um material similar ou outro material (por exemplo, ácido polilático), de modo que o grânulo possa ser revestido com proteínas, porém não reaja com outros componentes no ensaio.

[0183] Em algumas modalidades, o grânulo é suficientemente grande de modo que uma pluralidade de um componente de ligação celular (CBC) que se liga a um microrganismo particular pode ser fixado ao grânulo. O grânulo deve também ser de um tamanho adequado de modo que ele se encaixe dentro do tubo do aparelho. Por exemplo, o grânulo pode variar em tamanho de 0.1 a 100 mm, 1 a 10 mm, 4 a 8 mm, ou de 6 a 7 mm, em diâmetro. A quantidade de CBC por suporte sólido pode variar. Ela geralmente dependes do tamanho do grânulo e também da concentração das bactérias na amostra. Em algumas modalidades, o número de CBCs em cada grânulo pode ser de pelo menos 5 x 107, ou pelo menos 5 x 108, ou pelo menos 5 x 1010 ou pelo menos 5 x 1013, ou pelo menos 5 x 1014, ou pelo menos 5 x 1016 moléculas.

[0184] O CBC revestido no suporte sólido do aparelho pode se ligar ao microrganismo de interesse com alta afinidade e, logo, enriquecer a quantidade de microrganismo que o suporte sólido pode capturar. Por exemplo, em determinadas modalidades, o CBC é altamente específico para S. aureus, Listeria, Salmonella ou E. coli. Em uma modalidade, o CBC pode distinguir S. aureus, Listeria, Salmonella ou E. coli na presença de mais do que 100 outros tipos de bactérias. Em uma modalidade, o CBC pode distinguir um sorotipo específico dentro de espécies de bactérias (por exemplo, E. coli O157:H7) na presença de mais do que 100 outros tipos de bactérias. Em determinadas modalidades, o método que utiliza o aparelho compreendendo o suporte sólido revestido com CBC pode ser utilizado para detectar uma única bactéria do tipo específico na amostra. Em determinadas modalidades, o CBC detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 das bactérias específicas na amostra. Logo, em determinadas modalidades, o método pode detectar ≤ 10 células do microrganismo (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 microrganismos) ou ≤ 20, ou ≤ 30, ou ≤ 40, ou ≤ 50, ou ≤ 60, ou ≤ 70, ou ≤ 80, ou ≤ 90, ou ≤ 100, ou ≤ 200, ou ≤ 500, ou

≤ 1000 células do microrganismo presente em uma amostra.

[0185] Em algumas modalidades, o CBC é uma proteína, também referida como uma proteína de detecção de microrganismo nesta divulgação. Em algumas modalidades, o CBC é uma proteína que se liga à parede celular das bactérias Gram-positivas. Em algumas modalidades, o CBC é uma proteína da cauda do fago que é utilizada para se fixar na superfície externa dos microrganismos específicos, incluindo bactérias Gram-negativas. Em algumas modalidades, a proteína da cauda do fago é uma proteína da cauda lambda do fago. Em algumas modalidades, o CBC é uma proteína produzida pela expressão de um fragmento do gene isolado a partir de um bacteriófago específico para a detecção do microrganismo.

[0186] Em algumas modalidades, o CBC que é utilizado para capturar um tipo particular de microrganismos pode ser derivado de um bacteriófago particular, por exemplo, T7, T4 ou outro fago similar. Em algumas modalidades, o CBC pode ser codificado por lisinas e expresso por fagos das bactérias. Um CBC de bacteriófago pode também ser derivado de tipo T4, tipo T7, ViI, tipo ViI, AR1, A511, A118, A006, A500, PSA, P35, P40, B025, B054, A97, phiSM101, phi3626, CBA120, SPN1S, 10, epsilon15, P22, LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20, P70, A511, P4W, K, Twort, ou SA97.

[0187] Em alguns casos, o CBC pode ser uma proteína de ligação ao receptor através da qual o fago pode se ligar a bactérias específicas. Interações entre uma RBP e a superfície celular das bactérias determina a especificidade da RBP. Em alguns fagos, as RBPs estão localizadas no eixo da cauda, fibras da cauda, ou espigão da cauda. As proteínas da fibra da cauda do fago atuam em um papel na adsorção para a superfície celular e degradação do polissacarídeo. A proteína do espigão da cauda é um componente da cauda de muitos bacteriófagos. A proteína do espigão da cauda se liga à superfície celular dos hospedeiros bacterianos e mediam o reconhecimento do hospedeiro bacteriano. Logo, em algumas modalidades, o CBC pode ser fibras da cauda, espigão da cauda do bacteriófago as quais é específica para os microrganismos.

[0188] Em algumas modalidades, o CBC pode ser um ou mais de endolisinas, holinas, espaninas ou um domínio de ligação de função das mesmas que pode se ligar aos microrganismos com alta afinidade. Essas três proteínas são codificadas pelo bacteriófago e, juntas, são responsáveis pela liberação da progênie durante o ciclo lítico do fago. Em algumas modalidades, o CBC compreende o domínio de ligação da parede celular (“CBD”) de uma endolisina, o qual permite que o bacteriófago reconheça a bactéria com alta especificidade. Em algumas modalidades, o CBC compreende a sequência de aminoácidos conservada, isto é, responsável pela ligação dos microrganismos. Tipicamente, o CBD está localizado na extremidade C-terminal, porém pode ser encontrado na extremidade N-terminal ou como um domínio central em alguns casos.

[0189] Em algumas modalidades, o CBC pode ser uma proteína que compartilha uma identidade de sequência de aminoácidos substancial com uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: endolisinas, holinas, espaninas, o-espaninas (por exemplo, RZ1), espigões da cauda, e fibras da cauda ou, ou um domínio de ligação funcional das mesmas. Um domínio de ligação funcional pode ser uma sequência de aminoácidos conservada dentro do polipeptídio, isto é, responsável pela ligação de funções / especificidade da bactéria. Por exemplo, o CBC pode compartilhar pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade da sequência de aminoácidos com endolisina (SEQ ID NO: 1; ou YP_001468459) ou o CBD da endolisina (SEQ ID NO: 2) ou qualquer uma das proteínas as quais são conhecidas por possuir alta afinidade para os microrganismos de interesse. Um exemplo de método de expressão do CBD da endolisina é mostrado no Exemplo 6.

[0190] Em algumas modalidades, o CBC pode ser traduzido em reverso para DNA e sintetizado para a clonagem em um vetor de expressão. A vetor de expressão do CBC pode ser transformado em E. coli e cultivado em meio LB. A expressão do CBC pode ser induzida pela adição do indutor adequado. Em uma modalidade, a adição de isopropil 1β-D-1 tiogalacto piranosídeo (IPTG) pode ser utilizada para induzir a expressão do CBC.

[0191] Diversos métodos para o revestimento de um suporte sólido são bem conhecidos no estado da técnica. Em uma modalidade, o suporte sólido pode compreender estreptavidina e CBC biotinilado, e o revestimento do suporte sólido envolve a interação biotina - estreptavidina. Em alguns casos, o CBC pode ser conjugado às aminas para facilitar a ligação às avidinas as quais foram ligadas à superfície do suporte sólido. Métodos de utilização do aparelho para a detecção de microrganismos

[0192] Tal como aqui observado, em determinadas modalidades, a invenção pode incluir métodos de detecção do microrganismo, o método compreendendo colocar em contato a amostra com um suporte sólido de modo que os microrganismos são capturados no suporte sólido, colocar em contato o bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento com os microrganismos capturados no suporte sólido por, por exemplo, rompimento de uma vedação de ação instantânea do primeiro compartimento. Durante e / ou após a infecção, o bacteriófago expressa o gene indicador para produzir um indicador, o qual pode ser detectado por diversos dispositivos de detecção. Em algumas modalidades, a detecção do indicador pode requerer a adição de um substrato, o qual reage com o indicador para produzir um sinal detectável. A presença dos sinais indica a presença dos microrganismos na amostra.

[0193] Em modalidades alternativas, a invenção pode incluir métodos de detecção do microrganismo, o método compreendendo colocar em contato a amostra com um suporte sólido de modo que os microrganismos sejam capturados no suporte sólido, colocar em contato as MDPs a partir do primeiro compartimento com os microrganismos capturados no suporte sólido por, por exemplo, rompimento de uma vedação de ação instantânea do primeiro compartimento. A porção indicadora da MDP pode ser detectada por diversos dispositivos de detecção. Em algumas modalidades, a detecção do indicador pode requerer a adição de um substrato, o qual reage com o indicador para produzir um sinal detectável. A presença dos sinais indicam a presença dos microrganismos na amostra. Amostragem

[0194] Em algumas modalidades, as amostras podem ser utilizadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação, concentração ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas, incluindo, porém, não limitada a leite e sucos, podem ser testadas diretamente. Em outras modalidades, as amostras podem ser diluídas ou suspendidas em solução, a qual pode incluir, porém não está limitada, uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriano. Uma amostra que é sólida ou semissólida pode ser suspendida em um líquido ao picar, misturar ou macerar o sólido no líquido. Em algumas modalidades, uma amostra deve ser mantida dentro de uma faixa de pH que promova a ligação do CBC à célula bacteriana hospedeira. Em algumas modalidades, a faixa de pH preferida pode ser uma adequada para o bacteriófago se fixar a uma célula bacteriana. Uma amostra deve também conter as concentrações adequadas de cátions bivalentes e monovalentes, incluindo, porém, não limitado à Na+, Mg2+ e K+.

[0195] Preferencialmente através dos ensaios de detecção, a amostra é mantida em uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula de patógeno presente na amostra. Durante as etapas nas quais o bacteriófago está fixado às células bacterianas, é preferível manter a amostra em uma temperatura que facilita a atividade do bacteriófago. As referidas temperaturas são pelo menos cerca de 25 ºC e não maiores do que cerca de 45 ºC. Em algumas modalidades, as amostras são mantidas a cerca de 37 ºC. Em algumas modalidades, as amostras são submetidas à mistura ou agitação suave durante a ligação ou fixação da CBC.

[0196] Os ensaios podem incluir diversas amostras controle adequadas. Por exemplo, amostras controle, por exemplo, amostras alimentares, sem bactérias podem ser avaliadas como controles para os níveis de sinal de fundo.

[0197] A amostragem pode ser realizada utilizando uma variedade de formas. Em algumas modalidades, as amostras, por exemplo, amostras alimentares são primeiro liquefeitas e o suporte sólido, por exemplo, o suporte sólido ou grânulo, é mergulhado na amostra líquida. Em algumas modalidades, o suporte sólido é primeiro encharcado no meio de cultura no tubo antes da amostragem. Em algumas modalidades, o suporte sólido é seco antes da amostragem. Em algumas modalidades, a amostra líquida é primeiro cultivada por um período de tempo (“enriquecimento de cultura”), por exemplo, menor do que 24 horas, menor do que 12 horas, menor do que um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

[0198] Em outras modalidades, a amostra pode ser enriquecida após a captura dos microrganismos no suporte sólido. Em algumas modalidades, o suporte sólido com microrganismos pode ser incubado em meio de crescimento no terceiro compartimento do aparelho para permitir que o microrganismo se expanda em número. Esta etapa é referida como enriquecimento de incubação. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou até 8 horas ou mais, dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0199] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os microrganismos podem ser detectados sem qualquer isolamento ou purificação dos microrganismos a partir de uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma amostra contendo um ou mais microrganismos de interesse pode ser aplicada diretamente no suporte sólido e o ensaio é conduzido no aparelho. Infecção

[0200] Os métodos aqui divulgados compreendem operar o aparelho para fazer com que o bacteriófago recombinante entre em contato com os microrganismos de interesse. Após o contato dos microrganismos, o bacteriófago se replica e expressa o gene indicador ou gene repórter. Vide a seção intitulada “Bacteriófago recombinante”. O tempo de infecção, isto é, um período de tempo entre o ponto no tempo quando a amostra é primeiro colocada em contato com bacteriófago e o ponto no tempo quando o substrato é adicionado à mistura, pode variar, dependendo do tipo de bacteriófago e concentração dos microrganismos na amostra. O uso do aparelho no qual as bactérias são capturadas no suporte sólido pode reduzir significativamente o tempo requerido para a infecção, por exemplo, o tempo de infecção pode ser uma hora ou menos, enquanto em um ensaio padrão, em que nenhum suporte sólido é utilizado para capturar as bactérias, a infecção é de tipicamente pelo menos 4 horas. Em determinadas modalidades, o tempo de infecção para os métodos aqui divulgados é menor do que 6.0 horas, 5.0 horas, 4.0 horas, 3.0 horas, 2.5 horas,

2.0 horas, 1.5 horas, 1.0 hora, 45 minutos, ou menos do que 30 minutos. Em algumas modalidades, o tempo de infecção é de cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, ou cerca de 3 horas. Desenvolvimento do sinal

[0201] O indicador, produzido pela expressão do gene indicador, pode ser detectado utilizando métodos bem conhecidos por um técnico no assunto. Por exemplo, um ou mais componentes de produção de sinal podem ser reagidos com o indicador para gerar um sinal detectável. Em algumas modalidades, o indicador pode ser um composto bioluminescente. Se o indicador é uma enzima, então a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação da enzima com um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em um sistema de produção de sinal alternativo, o indicador pode ser um composto fluorescente em que nenhuma manipulação enzimática do indicador é requerida para produzir o sinal detectável. Moléculas fluorescentes que incluem, por exemplo, fluoresceína e rodamina e seus derivados e análogos são adequados para uso como indicadores no referido sistema. Ainda em outra modalidade alternativa, a porção indicadora pode ser um cofator, então a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação do cofator com a enzima e um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em algumas modalidades, o sinal detectável é colorimétrico. É observado que a seleção de um indicador particular não é crítica para a presente invenção, porém o indicador será capaz de gerar um sinal detectável tanto por si só, ou ser instrumentalmente detectável, ou ser detectável em conjunto com um ou mais componentes adicionais de produção de sinal, tal como um sistema de produção de sinal enzima / substrato.

[0202] Em algumas modalidades, na etapa de detecção será requerida a adição de um substrato para a enzima indicadora atuar. O substrato pode ser adicionado em uma variedade de formas. Em algumas modalidades, o substrato está compreendido no segundo compartimento do aparelho e o rompimento da vedação de ação instantânea faz com que o fago

(no primeiro compartimento no aparelho) e o substrato entrem em contato com os microrganismos (capturados no suporte sólido) ao mesmo tempo. Vide a FIG. 12. Em algumas modalidades, as vedações de ação instantânea são rompidas sequencialmente, fazendo com que os microrganismos entrem em contato com o bacteriófago antes do contato com o substrato. Vide FIG. 13A e 13B. Em algumas modalidades, o método compreende a operação da trava de parada para permitir a mistura em fases de modo que os microrganismos entrem em contato com o bacteriófago antes de entrar em contato com o substrato.

[0203] Em algumas modalidades, a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com substrato pode continuar por 30 minutos ou mais, e a detecção em diversos pontos no tempo pode ser desejável para otimizar a sensibilidade. Em algumas modalidades, as leituras do luminômetro podem ser tomadas inicialmente e em intervalos de 3, ou 5, ou 10, ou 15 minutos até que a reação seja concluída. Detecção do sinal

[0204] A detecção do sinal produzido pelo indicador pode incluir a detecção da emissão de luz. Em algumas modalidades, o compartimento do aparelho no qual o substrato está misturado com a amostra teste é transparente, de modo que qualquer sinal que resulta da infecção e subsequente incubação com substrato é visível. Neste caso, o sinal pode ser detectado através da parede do compartimento. Em algumas modalidades, o aparelho contendo a amostra reagida está inserido dentro de um instrumento para a detecção do sinal que resulta. Em outras modalidades, um instrumento de detecção é utilizado para fazer a varredura do aparelho contendo a amostra reagida.

[0205] Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser utilizado para detectar o indicador (por exemplo, luciferase), por exemplo, GloMax® 20/20 e GloMax® da Promega (Madison, WI). Em algumas modalidades, um espectrofotômetro, câmera CCD ou câmera CMOS pode ser utilizado para detectar mudanças de cor e outras emissões de luz. As RLU absolutas são importantes para a detecção, porém a relação do sinal para o fundo também necessita ser alta (por exemplo, > 2.0, > 2.5, ou > 3.0) a fim de que únicas células ou baixos números de células sejam detectados de forma confiável. O sinal de fundo pode ser obtido pela medição da amostra controle que não contém microrganismo utilizando o mesmo procedimento tal como descrito acima. Em algumas modalidades, a detecção de sinal a partir do gene repórter ou indicador pode incluir, por exemplo, o uso de um instrumento que emprega a tecnologia de fotodiodo ou PMT (tubo foto multiplicador). Em algumas modalidades, um luminômetro portátil pode ser empregado para a detecção do sinal. Luminômetros de PMT portáteis adequados estão disponíveis a partir de 3M (Maplewood, MN), BioControl (Seattle, WA), e Charm Science (Lawrence, MA). Luminômetros de fotodiodo portáteis adequados estão disponíveis a partir de Hygiena (Camarillo, CA) e Neogen (Lansing, MI). Esses luminômetros portáteis produzem tipicamente leituras muito menores quando comparadas com os luminômetros tradicionais (GloMax ou GloMax 20/20) para a mesma amostra. Tal como mostrado nos Exemplos, múltiplos experimentos mostram que os sinais produzidos pelas reações foram suficientes para serem detectados por esses luminômetros portáteis. Os ensaios foram repetidos múltiplas vezes com diferentes tipos de microrganismos, incluindo L. monocytogenes e Salmonella, e resultados similares foram obtidos a cada vez. Isso indica que o método de detecção utilizando o aparelho é suficientemente sensível e robusto. Ser capaz de utilizar dispositivos portáteis para detectar o microrganismo também oferece conveniência e flexibilidade, as quais frequentemente faltam em métodos de detecção usando dispositivos de detecção não portáteis tradicionais. Sistemas e kits da invenção

[0206] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas (por exemplo, sistemas automatizados) ou kits compreendendo componentes para a realização dos métodos aqui divulgado. Em algumas modalidades, o aparelho está compreendido em sistemas ou kits de acordo com a invenção. Os métodos aqui descritos podem também utilizar os referidos sistemas ou kits. Algumas modalidades aqui descritas são particularmente adequadas para automação e / ou kits, dada a quantidade mínima de reagentes e materiais requeridos para a realização dos métodos. Em determinadas modalidades, cada um dos componentes de um kit pode compreender uma unidade autônoma, isto é, capaz de ser distribuída de um primeiro local para um segundo local.

[0207] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas ou kits para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra. Os sistemas ou kits podem, em determinadas modalidades, compreender: um aparelho tal como descrito acima, em que o suporte sólido compreende um componente de ligação celular tal como descrito acima, e um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal pode detectar o produto do gene indicador produzido a partir da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, o componente de detecção de sinal é um dispositivo portátil. Em algumas modalidades, o componente de detecção de sinal é um luminômetro portátil.

[0208] Logo, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema ou kit para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, compreendendo: aparelho compreende: um primeiro compartimento compreendendo bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido dentro de um genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador. O sistema ou kit pode ainda compreender um segundo compartimento que contém substrato, e / ou um terceiro compartimento que contém meio. Um ou mais destes compartimentos são vedados e separado da outra porção do aparelho por uma vedação de ação instantânea, e o rompimento da vedação de ação instantânea faz com que o conteúdo do compartimento deixe o compartimento e misture com a amostra.

[0209] Em algumas modalidades, o sistema pode compreender um componente para o isolamento do microrganismo de interesse a partir de outros componentes na amostra.

[0210] Em alguns sistemas e / ou kits, o mesmo componente pode ser utilizado por múltiplas etapas. Em alguns sistemas e / ou kits, as etapas são automatizadas ou controladas pelo usuário por meio de entrada de computador e / ou em que um robô de manuseio de líquidos executa pelo menos uma etapa. Em um sistema computadorizado, o sistema pode ser completamente automatizado, semiautomatizado, ou direcionado pelo usuário através de um computador (ou alguma combinação dos mesmos).

[0211] Esses sistemas e kits da invenção incluem diversos componentes. Tal como aqui utilizados, o termo “componente” é amplamente definido e inclui qualquer aparelho ou coleção de aparelhos adequados para a realização do método recitado. Os componentes não precisam estar integralmente conectados ou situados em relação uns aos outros de nenhuma maneira particular. A invenção inclui quaisquer disposições adequadas dos componentes em relação uns aos outros. Por exemplo, os componentes não precisam de estar no mesmo cômodo. Porém, em algumas modalidades, os componentes estão conectados uns aos outros em uma unidade integral. Em algumas modalidades, os mesmos componentes podem desempenhar funções múltiplas. Sistemas de computador e mídia legível por computador

[0212] Em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema. O sistema pode incluir pelo menos algumas das composições da invenção. Ainda, o sistema pode compreender pelo menos alguns dos componentes para a realização do método. Em determinadas modalidades, o sistema é formulado como um kit. Logo, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra. O sistema pode incluir pelo menos alguma das composições da invenção. Ainda, o sistema pode compreender pelo menos algum dos componentes para a realização do método. Em determinadas modalidades, o sistema é formulado como um kit. Logo, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, compreendendo um aparelho tal como descrito acima. Por exemplo, o aparelho pode compreender um primeiro compartimento compreendendo bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido dentro de um genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; em que o suporte sólido compreende um componente de ligação celular. Em algumas modalidades, o sistema também compreende um dispositivo de detecção portátil.

[0213] O sistema, tal como descrito na presente técnica ou qualquer um de seus componentes, pode ser incorporado na forma de um sistema de computador. Exemplos típicos de um sistema de computador incluem um computador de uso geral, um microprocessador programado, um microcontrolador, um elemento de circuito integrado periférico, e outros dispositivos ou arranjos de dispositivos os quais são capazes de implementar as etapas as quais constituem o método da presente técnica.

[0214] Um sistema de computador pode compreender um computador, um dispositivo de entrada, uma unidade de exibição e / ou a Internet. O computador pode ainda compreender um microprocessador. O microprocessador pode estar conectado a uma porta de comunicação. O computador pode também incluir uma memória. A memória pode incluir memória de acesso aleatório (RAM) e memória somente de leitura (ROM). O sistema de computador pode ainda compreender um dispositivo de armazenamento. O dispositivo de armazenamento pode ser uma unidade de disco rígido ou uma unidade de armazenamento removível, tal como uma unidade de disquete, unidade de disco óptico, etc. O dispositivo de armazenamento também pode ser outro meio similar para carregar programas de computador ou outras instruções no sistema de computador. O sistema de computador também pode incluir uma unidade de comunicação. A unidade de comunicação permite que o computador se conecte a outros bancos de dados e à Internet por meio de uma interface de E / S. A unidade de comunicação permite a transferência para, bem como a recepção de dados a partir de outras bases de dados. A unidade de comunicação pode incluir um modem, um cartão Ethernet, ou qualquer dispositivo similar que permita que o sistema de computador se conecte a bases de dados e redes tais como LAN, MAN, WAN e a Internet. O logotipo do sistema de computador pode facilitar as entradas de um usuário por meio do dispositivo de entrada, acessível ao sistema por meio da interface E / S.

[0215] Um dispositivo de computação irá incluir tipicamente um sistema operacional o qual fornece instruções de programa executáveis para a administração geral e operação desse dispositivo de computação, e tipicamente irá incluir um meio de armazenamento legível por computador (por exemplo, um disco rígido, memória de acesso aleatório, memória somente de leitura, etc.) que armazena instruções que, quando executadas por um processador do servidor, permitem que o dispositivo de computação realize suas funções pretendidas. Implementações adequadas para o sistema operacional e funcionalidade geral do dispositivo de computação são conhecidas ou estão comercialmente disponíveis, e são prontamente implementadas por pessoas versadas na técnica, particularmente à luz desta divulgação.

[0216] O sistema de computador executa um conjunto de instruções as quais são armazenadas em um ou mais elementos de armazenamento, a fim de processar os dados de entrada. Os elementos de armazenamento também podem conter dados ou outras informações, tal como desejado. O elemento de armazenamento pode estar na forma de uma fonte de informação ou um elemento de memória física presente na máquina de processamento.

[0217] O ambiente pode incluir uma variedade de armazenamentos de dados e outros meios de memória e armazenamento, tal como discutido acima. Eles podem residir em uma variedade de localizações, tal como em um meio de armazenamento local para (e / ou residente em) um ou mais computadores ou remotos a partir de qualquer ou todos os computadores ao longo da rede. Em um conjunto particular de modalidades, a informação pode residir em uma rede de área de armazenamento (“SAN”) familiar para um técnico no assunto. De forma similar, quaisquer arquivos necessários para desempenhar as funções atribuídas aos computadores, servidores, ou outros dispositivos de rede podem ser armazenados localmente e / ou remotamente, conforme o caso. Nos casos em que um sistema inclui dispositivos de computação, cada um desses dispositivos pode incluir elementos de hardware os quais podem estar eletricamente acoplados por meio de uma porta, os elementos incluindo, por exemplo, pelo menos uma unidade de processamento central (CPU), pelo menos um dispositivo de entrada (por exemplo, um mouse, teclado, controlador, tela de toque, ou teclado numérico), e pelo menos um dispositivo de saída (por exemplo, um dispositivo de exibição, impressora, ou alto-falante). O referido sistema também pode incluir um ou mais dispositivos de armazenamento, tais como unidades de disco, dispositivos de armazenamento óptico, e dispositivos de armazenamento de estado sólido, tal como memória de acesso aleatório (“RAM”) ou memória somente de leitura (“ROM”), bem como dispositivos de mídia removíveis, cartões de memória, cartões flash, etc.

[0218] Esses dispositivos também podem incluir um leitor de mídia de armazenamento legível por computador, um dispositivo de comunicação (por exemplo, um modem, uma placa de rede (sem fio ou com fio), um dispositivo de comunicação infravermelho, etc.) e memória de trabalho tal como descrito acima. O leitor de mídia de armazenamento legível por computador pode estar conectado com, ou configurado para receber, um meio de armazenamento legível por computador, representando dispositivos de armazenamento remoto, local, fixo e / ou removível, bem como mídia de armazenamento para conter temporariamente e / ou mais permanentemente , armazenamento, transmissão e recuperação de informações legíveis por computador. O sistema e diversos dispositivos também irão incluir tipicamente um número de aplicações de software, módulos, serviços, ou outros elementos localizados dentro de pelo menos um dispositivo de memória de trabalho, incluindo um sistema operacional e programas de aplicativo, tal como um aplicativo para o cliente ou navegador da Web. Deve ser apreciado que as modalidades alternativas podem apresentar inúmeras variações a partir daquelas descritas acima. Por exemplo, o hardware personalizado também pode ser utilizado e / ou elementos particulares podem ser implementados em hardware, software (incluindo software portátil, tal como applets), ou ambos. Além disso, a conexão a outros dispositivos de computação, tais como dispositivos de entrada / saída de rede, pode ser empregada.

[0219] Mídia de armazenamento não transiente e mídia legível por computador para conter código, ou partes de código, pode incluir qualquer mídia adequada conhecida ou utilizada na técnica, incluindo mídia de armazenamento e mídia de comunicação, tal como, porém não limitado, mídia volátil e não volátil, removível e não removível implementada em qualquer método ou tecnologia para o armazenamento e / ou a transmissão de informações, tal como instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programa, ou outros dados, incluindo RAM, ROM, EEPROM, memória flash ou outra tecnologia de memória, CD-ROM, disco versátil digital (DVD) ou outro armazenamento óptico, cassetes magnéticas, fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnético, ou qualquer outro meio que possa ser utilizado para armazenar a informação desejada e o qual possa ser acessado pelo dispositivo do sistema. Com base na divulgação e nos ensinamentos aqui fornecidos, uma pessoa com conhecimento comum na técnica irá apreciar outras maneiras e / ou métodos para implementar as diversas modalidades.

[0220] Um meio legível por computador pode compreender, porém não está limitado, um dispositivo de armazenamento eletrônico, óptico, magnético ou outro capaz de fornecer um processador com instruções legíveis por computador. Outros exemplos incluem, porém não estão limitados, um disquete, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memória, ROM, RAM, SRAM, DRAM, memória endereçável por conteúdo (“CAM”), DDR, memória flash tal como NAND flash ou NOR flash, um ASIC, um processador configurado, armazenamento óptico, fita magnética ou outro armazenamento magnético ou qualquer outro meio a partir do qual um processador do computados pode ler as instruções. Em uma modalidade, o dispositivo de computação pode compreender um único tipo de meio legível por computador tal como memória de acesso aleatório (RAM). Em outras modalidades, o dispositivo de computação pode compreender dois ou mais tipos de meio legível por computador tal como memória de acesso aleatório (RAM), uma unidade de disco, e cache. O dispositivo de computação pode estar em comunicação com um ou mais meios legível por computador externos, tal como uma unidade de disco rígido externa ou uma unidade de DVD ou Blu-Ray externa.

[0221] Tal como discutido acima, a modalidade compreende um processador o qual está configurado para executar instruções de programas executáveis em computador e / ou para acessar informações armazenadas na memória. As instruções podem compreender instruções específicas para processador geradas por um compilador e / ou intérprete a partir de um código escrito em qualquer linguagem de programação de computador adequada, incluindo, por exemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, JavaScript e ActionScript (Adobe Systems, Mountain View, Califórnia). Em uma modalidade, o dispositivo de computação compreende um único processador. Em outras modalidades, o dispositivo compreende dois ou mais processadores. Os referidos processadores pode compreender um microprocessador, um processador de sinal digital (DSP), um circuito integrado de aplicação específica (ASIC), matrizes de portas programáveis em campo (FPGAs), máquinas de estado. Os referidos processadores podem ainda compreender dispositivos eletrônicos programáveis, tais como PLCs, controladores de interrupção programáveis (PICs), dispositivos lógicos programáveis (PLDs), memórias somente de leitura programáveis (PROMs), memórias somente de leitura programáveis eletronicamente (EPROMs ou EEPROMs), ou outros dispositivos similares.

[0222] O dispositivo de computação compreende uma interface de rede. Em algumas modalidades, a interface de rede está configurada para comunicação por meio de links de comunicação com ou sem fio. Por exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação ao longo de redes por meio de Ethernet, IEEE 802.11 (Wi-Fi), 802.16 (Wi-Max), Bluetooth, infravermelho, etc. Como outro exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação ao longo de redes tal como CDMA, GSM, UMTS, ou outras redes de comunicação celular. Em algumas modalidades, a interface de rede pode permitir conexões ponto a ponto com outro dispositivo, como via porta serial universal (em inglês, universal serial bus - USB), 1394 FireWire, conexões em série ou paralelas ou interfaces similares. Algumas modalidades de dispositivos de computação adequados pode compreender duas ou mais interfaces de rede para a comunicação ao longo de uma ou mais redes. Em algumas modalidades, o dispositivo de computação pode incluir um armazenamento de dados em adição a ou no lugar da interface de rede.

[0223] Algumas modalidades de dispositivos de computação adequados podem compreender ou estar em comunicação com um número de dispositivos externos ou internos tais como um mouse, um CD-ROM, DVD, um teclado, uma exibição, alto-falantes de áudio, um ou mais microfones, ou qualquer outro dispositivo de entrada ou saída. Por exemplo, o dispositivo de computação pode estar em comunicação com diversos dispositivos de interface de usuário e uma exibição. A exibição pode utilizar qualquer tecnologia adequada incluindo, porém não limitada, LCD, LED, CRT e similares.

[0224] O conjunto de instruções para execução pelo sistema de computador pode incluir diversos comandos os quais instruem a máquina de processamento a realizar tarefas específicas tais como as etapas que constituem o método da presente técnica. O conjunto de instruções pode estar na forma de um programa de software. Além disso, o software pode estar na forma de uma coleção de programas separados, um módulo de programa com um programa maior ou uma porção de um módulo de programa, tal como na presente técnica. O software pode também incluir a programação modular na forma de programação orientada para objetos. O processamento de dados de entrada pela máquina de processamento pode ser em resposta a comandos do usuário, resultados de processamento prévio ou uma solicitação feita por outra máquina de processamento.

[0225] Embora a presente invenção tenha sido divulgada com referências a determinadas modalidades, inúmeras modificações, alterações e mudanças nas modalidades descritas são possíveis sem se afastar do escopo e âmbito da presente invenção, tal como definido nas reivindicações anexas. De acordo, pretende-se que a presente invenção não se limite às modalidades descritas, porém, que tenha o escopo completo definido pela linguagem das reivindicações a seguir, e equivalentes das mesmas.

EXEMPLOS

[0226] Os exemplos a seguir descrevem a detecção de um baixo número de células, até mesmo uma única bactéria, em um tempo para resultados encurtado e são para ilustrar, porém não para limitar a invenção. Exemplo 1. Criação de MDP recombinante para a detecção de Staphylococcus aureus.

[0227] Um fragmento do gene que codifica um CBC foi isolado a partir de fago Twort de Staphylococcus (GenBank: CAA 69021.1), traduzido em reverso para o DNA, e comercialmente sintetizado para a clonagem em um plasmídeo de fusão NANOLUC®. O plasmídeo de fusão His-NANOLUC - pET- 15b foi criado pela mutação do códon de parada e inserção de um sítio de endonuclease de restrição XhoI por meio de mutagênese direcionada pelo sítio. O fragmento do gene do CBC que codifica 75 aminoácidos foi então clonado nos sítios da enzima de restrição BamHI-XhoI do plasmídeo HIS-NANOLUC– pET15b, resultando em um constructo NANOLUC® - CBC de S. Aureus (MDP) N-terminal. O constructo NANOLUC® - CBC foi transformado na cepa de E. coli BL21 (DE3) pLysS. As células transformadas foram cultivadas em meio Luria-Bertani (LB) líquido a 37 ºC para uma densidade óptica (OD) de 0.5 - 1.0. A expressão da MDP foi induzida pela adição de isopropil β- D-1-tiogalacto piranosídeo (IPTG). A cultura foi agitada enquanto incubada por 5 horas a 37 ºC. Exemplo 2. Detecção bacteriana por meio de MDP utilizando colunas filtrantes spin

[0228] Em um exemplo experimental, S. aureus A300 foi cultivada em caldo Luria-Bertani (LB) a 37 °C com agitação. O NANOLUC®-CBC foi diluído para 1 µg / ml.

[0229] Para cada 1 mL de amostra, 0.1 mL foi adicionado a filtros em triplicata. Os filtros foram centrifugados a 600 g por 1 minuto. Em seguida, 40 µL de cada uma das proteínas de fusão NANOLUC® - CBC foi adicionado a cada filtro, seguido por incubação por 15 min em temperatura ambiente. Os filtros foram lavados duas vezes pela adição de 400 µL de PBS, seguido de centrifugação a 600 g por 1 minuto. Em seguida, 150 µL de LB foi adicionado e a suspensão foi transferida para uma placa de luminômetro de 96 poços LUMITRAC® 200, e um ensaio da luciferase foi realizado em um luminômetro Promega com injeção de 100 µL de NANO-GLO®. As relações de sinal para o fundo foram obtidas dividindo o sinal de cada poço pela média do sinal dos controles de célula zero. Exemplo 3. Detecção bacteriana por meio de MDP utilizando placa filtrante de 96 poços

[0230] As proteínas de fusão NANOLUC® - CBC foram diluídas para 1 µg / ml. Para cada amostra, 0.150 mL foi adicionado a poços múltiplos em uma placa filtrante de 96 poços. A placa filtrante de 96 poços foi centrifugada a 1200 rpm (263 rcf) por 3 minutos. Em seguida, 100 µL de MDP de NANOLUC® - CBC 1 µg / ml foi adicionado em cada filtro e incubado por 15 minutos em temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes pela adição de 300 µL de PBS seguida de centrifugação a 600 g por 1 minuto para remover MDP não ligada. O ensaio da luciferase foi realizado diretamente na placa filtrante original com injeção de 100 µL de NANO-GLO® utilizando um luminômetro Promega, e as placas foram lidas 3 minutos após a adição do substrato NANO-GLO®. As relações de sinal para o fundo foram obtidas dividindo o sinal de cada poço pela média do sinal dos controles de célula zero.

Exemplo 4. Detecção de Listeria por meio de MDP utilizando placa de 96 poços

[0231] As proteínas de fusão NANOLUC® - CBC são diluídas para 1 µg / ml. As amostras de 100 µL são transferidas para uma placa de 96 poços revestida com GtxListeria. A concentração celular mínima para as amostras é de 10 células / ml. Amostras com concentrações celulares menores do que 10 células / mL são enriquecidas antes do teste. As amostras são então incubadas na placa de 96 poços por 30 minutos a 30 ºC. Após a incubação, a placa é lavada 3 x com 300 µl de PBS. Em seguida, 100 µL de MDP de NANOLUC® - CBC 1 ug / ml é adicionado a cada poço e incubado por 15 minutos em temperatura ambiente. As células são lavadas duas vezes pela adição de 300 µL de PBS para remover MDP não ligada. O ensaio da luciferase é realizado diretamente na placa original com injeção de 100 µL de NANO-GLO® utilizando um luminômetro Promega, e as placas são lidas 3 minutos após a adição do substrato NANO-GLO®. As relações de sinal para o fundo foram obtidas dividindo o sinal de cada poço pela média do sinal dos controles de célula zero. Exemplo 5. Detecção do microrganismo de interesse em cultura bacteriana

[0232] Este exemplo demonstra que o uso do aparelho é capaz de detectar bactérias presentes em uma cultura bacteriana. Montagem do aparelho

[0233] 100 µl de coquetel de fago A511/P100 (1.2 x 109 UFC / mL) e 100 µl de meio BHI + 1mM de CaCl2 foram adicionados no bulbo superior do aparelho (primeiro compartimento). O fago A511/p100 é um fago que direciona

Listeria monocytogenes. Uma prensa de suporte sólido foi utilizada para pressionar os componentes superiores do aparelho juntos. O tubo do tubo do aparelho foi preenchido com 900 µl de meio BHI + 1 mM de CaCl2. O suporte sólido foi, então, posicionado no tubo do aparelho para absorver algum meio. O aparelho montado (contendo o suporte sólido embebido em meio) foi, então, mantido a 4 ºC durante a noite. Crescimento da cultura bacteriana

[0234] Listeria monocytogenes foi cultivado durante a noite em meio BHI (Beckton Dickinson, Sparks, MD, EUA) em uma incubadora com agitação. A cultura durante a noite foi, então, subcultivada em meio BHI para a fase log a 37 ºC. As células da fase log foram, então, diluídas para o número adequado de células (vide Figura 3). O suporte sólido foi removido do aparelho e as culturas diluídas foram inoculadas no suporte sólido nos níveis indicados de UFC. O suporte sólido que foi inoculado com as bactérias ou meio isolado (controle) foram posicionadas de volta no tubo do aparelho e o tubo foi gentilmente agitado para mistura o conteúdo. (Figura 3, Tabela 1).

[0235] Em um experimento similar, 2 suportes sólidos foram inoculados com 10 UFC cada das bactérias. Uma amostra não inoculada foi utilizada como um controle. Essas amostras foram incubadas durante a noite a 35 °C para expandir o número de bactérias antes da infecção e exposição do substrato (Figura 3, Tabela 2). Infecção

[0236] A válvula instantânea foi, então, rompida ao segurar firmemente o suporte sólido e romper a válvula com o polegar e o indicador. O fago(200 µl de 6 x 108 UFC / mL)

foi expelido ao apertar o bulbo na parte superior do tubo do suporte sólido. O conteúdo no tubo do suporte sólido foi gentilmente misturado por agitação. O suporte sólido foi então posicionado em incubadora a 30 °C por 4 horas para a infecção do fago das bactérias. O substrato NanoGlo (Promega, Madison, WI) foi diluído 1:4 com 70 % de etanol e 10 µl de substrato diluído foi adicionado no tubo do suporte sólido. O conteúdo do tubo do aparelho foi misturado por vórtex e então deixado assentar por 3 minutos. Detecção

[0237] Os três métodos de detecção foram utilizados. O tubo do suporte sólido foi inserido dentro do luminômetro portátil Hygiena. 1 mL da mistura de infecção foi removido e transferido para um tubo de micro centrífuga de 1.5 mL para leituras em luminômetro GloMax 20/20 (“GloMax 20/20”) e 150 µl da mistura de infecção foi transferido para uma placa de 96 poços para leitura em luminômetro GloMax (“GloMax”).

[0238] A detecção foi então realizada com suportes sólidos os quais foram imersos em meio durante a noite, com um tempo de infecção de 2 horas. Os resultados são mostrados na FIG. 5, as Tabelas 1 e 2 e as representações gráficas dos resultados são mostradas nas FIG. 4A e 4B. Os resultados mostram que com nenhum enriquecimento de crescimento (nenhum cultivo durante a noite da amostra antes da captura com o suporte sólido), o teste é sensível o suficiente para detectar 25000 UFC em um luminômetro portátil Hygiena (FIG. 4A) – as leituras para as amostras inoculadas com bactérias foram todas acima do limite de detecção do critério de 10 unidades de luminescência relativa (RLU) para amostras positivas e detecção de aproximadamente 5000 UFC em um GloMax 20/20 ou um GloMax (FIG. 4B). Exemplo 6. Detecção de microrganismo em amostra de peru Montagem do aparelho

[0239] O aparelho foi montado tal como descrito no Exemplo 1, exceto pelo fato de que o bulbo superior foi preenchido com 100 µl de coquetel de fago SEA1/TSP1 (1.2 x 107 UFC / mL) e 100 µl de meio TSB (ThermoFisher Oxoid, Grand Islan, NY, EUA) e o tubo do aparelho foi preenchido com 1 mL de meio TSB. O fago SEA1/TSP1 é um fago que direciona para Salmonella. Inoculação bacteriana do peru moído

[0240] A cultura de Salmonella foi cultivada durante a noite e diluída para amostras com alto e baixo UFCs tal como descrito abaixo.

[0241] 25 g de porções teste de peru moído foram divididas em três grupos: grupo não inoculado (5 amostras), grupo com alta inoculação (5 amostras), e grupo com baixa inoculação (20 amostras). Cada 25 g amostra do grupo com alta inoculação foi inoculado com 2 - 10 UFC de Salmonella, e cada amostra do grupo com baixa inoculação foi inoculada com 0.2 - 2 UFC de Salmonella. As amostras foram então posicionadas em sacos com amostras filtradas e armazenadas a 4 ºC por 48 - 72 horas. Enriquecimento das bactérias em peru moído inoculado

[0242] Meio TSB pré-aquecido (41 ºC) foi adicionado a cada amostra em uma relação de amostra para o meio de 1:3. A amostra foi, então, misturada em STOMACHER® por 30 segundos em configuração alta e, então, incubada a 41 ºC sem agitação por 24 horas para enriquecimento das bactérias na amostra.

Amostragem

[0243] A amostra teste foi obtida ao mergulhar o suporte sólido em cada amostra enriquecida e agitar em torno de 10 segundos para absorver a quantidade máxima de amostra. O suporte sólido foi posicionado no tubo do aparelho preenchido com meio TSB. O tubo foi gentilmente agitado para misturar o conteúdo no tubo, e então imediatamente infectado ou posicionado a 37 °C por uma mais uma hora após a infecção. Infecção

[0244] A válvula instantânea do compartimento que abriga o bacteriófago foi, então, rompida ao segurar firmemente o suporte sólido e romper a válvula com o polegar e o indicador. O fago (200 μl de 6 x 106 UFC / mL) foi expelido ao apertar o bulbo na parte superior do tubo do suporte sólido. O conteúdo no tubo do suporte sólido foi gentilmente misturado por agitação. O suporte sólido foi então posicionado em incubadora a 37°C por 30 min ou 2 horas para a infecção do fago das bactérias. O substrato NanoGlo (Promega, Madison, WI) foi diluído 1:4 com 70 % de etanol e 10 μl de substrato diluído foi adicionado no tubo do aparelho. O conteúdo do tubo do aparelho foi misturado por vórtex e então deixado assentar por 3 minutos. Os sinais foram detectados tal como descrito no Exemplo 1. Os resultados das amostras não inoculadas (grupo controle) são mostrados na Tabela 3 e amostras inoculadas (grupo experimental) são mostrados na Tabela 4. A representação gráfica dos resultados é mostrada na FIG. 6A e FIG. 6B.

[0245] Os resultados mostram que cada um dos três dispositivos de detecção utilizados foram capazes de detectar todas as amostras de peru as quais foram positivas para Salmonella após um enriquecimento de cultura de 24 horas. O sinal de GloMax e GloMax 20/20 foram muito mais altos do que o luminômetro Hygiena. O tempo de incubação (isto é, incubação do suporte sólido o qual tinha capturado as bactérias com o meio antes da infecção) e o tempo de infecção são fatores que podem afetar a intensidade do sinal. Dos diversos tempos de incubação e tempos de infecção adicionais testados, o tempo de incubação de 0 hora e o tempo de infecção de 2 horas resultou nos RLUs mais altos, seguido por amostras que apresentaram tempo de incubação de 1 hora e tempo de infecção de 0.5 hora, e então por amostras que apresentaram tempo de incubação de 0 hora e tempo de infecção de 0.5 hora. Os resultados também mostraram que a incubação por 0 hora e infecção por 2 horas apresentou o sinal de fundo mais baixo. Exemplo 7. Estudos adicionais para testar o efeito do tempo de infecção na sensibilidade do ensaio

[0246] O experimento foi configurado tal como descrito no Exemplo 2, exceto pelo fato de que após o suporte sólido ter sido mergulhada na amostra bacteriana de peru, o suporte sólido foi posicionado em meio e a infecção foi realizada imediatamente, isto é, sem tempo de incubação para as bactérias no suporte sólido crescerem. O tempo de infecção variou de 30 min a 2 horas. Os sinais foram detectados tal como descrito acima. Os resultados das três amostras são mostrados na FIG. 7 e os dados são plotados na FIG. 8A - 8C. Os resultados mostram que a infecção por 2 horas pode aumentar o sinal, tal como indicado nas amostras 24 e 26, não mostrando sinal em Hygiena em 30 min, porém mostraram para a infecção por 2 horas.

[0247] As FIG. 9A - 9C mostram a comparação entre os diferentes dispositivos GloMax e GloMax 20/20. O GloMax e o GloMax 20/20 mostraram resultados similares. Exemplo 8. Teste de amostras de esponjas ambientais L. monocytogenes 19115

[0248] L. monocytogenes foi inoculado em superfícies de telhas de cerâmica e permitidos secar e assentar em temperatura ambiente por 18 – 24 horas. As esponjas da amostra foram utilizadas para esfregar as telhas de cerâmica e as esponjas foram posicionadas em um saco para enriquecimento por 24 horas a 35 °C. O suporte sólido foi, então, utilizado para amostrar as amostras enriquecidas tal como descrito no Exemplo 2. 100 µl de fagos de Listeria (em uma concentração de 1.2 x 108 UFC / ml) foram utilizados para infectar as culturas bacterianas de peru por uma hora a 30 ºC. Os sinais foram detectados utilizando GloMax e Hygiena. Os resultados foram mostrados na FIG. 10. Os resultados mostram que Hygiena portátil pode detectar amostra ambiental contaminada com L. monocytogenes. Exemplo 9. Dispositivos de detecção diferentes

[0249] Experimentos foram configurados tal como descrito no Exemplo 2. O tempo de infecção do fago foi de 1 hora a 37 ºC. Os sinais foram lidos em GloMax, um luminômetro portátil 3M (“3M”), e os resultados da Hygiena são mostrados na FIG. 11. Ele mostra que 3M é mais sensível na detecção dos sinais. Exemplo 10. Criação de CBC para a detecção de microrganismos

[0250] Um fragmento gênico que codifica um CBD da endolisina (acesso NCBI YP_001468459) foi obtido ao realizar o PCR no DNA genômico do fago A511 utilizando iniciador forward: tttagcgggcagtagcggagggTATGCTTACTTAAGCTCATG e iniciador reverse: tcgtcagtcagtcacgatgcTTATTTTTTGATAACTGC TCCTG. A sequência foi, então, subclonada no vetor de expressão pGEX4T-3 utilizando Gibson Assembly seguindo as instruções do fabricante para produzir uma proteína de fusão GST-A511-CBD. O mapa do plasmídeo de expressão GST-A511-CBD é mostrado na FIG. 16. O constructo que codifica o CBD da endolisina foi, então, transformado na cepa de E. coli BL21( DE3) pLysS. As células transformadas foram cultivadas em meio líquido Luria-Bertani (LB) a 37 ºC até uma densidade óptica (OD) de 0.5 - 1.0. A expressão do CBC foi induzida pela adição de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A cultura foi incubada por 5 horas a 25 ºC com agitação.

[0251] As células foram colhidas a partir da cultura e lisadas e a proteína de fusão GST-A511-CBD foram purificadas utilizando resina GE glutationa sepharose 4B. As frações da eluição da resina foram agrupadas e as concentrações da proteína foram detectadas a 280 nm e aliquotadas e armazenadas a -20 ºC.

[0252] A proteína GST-A511-CBD foi, então, biotinilada e utilizada para se ligar aos grânulos magnéticos de estreptavidina (grânulos de estreptavidina Dynabeads M-280). Exemplo 11. Detecção de microrganismos utilizando um grânulo como o suporte sólido

[0253] 1 - 2 ml de amostra de peru contaminada com Listeria monocytogenes preparada tal como descrito no Exemplo 1 é transferido para um tubo. O grânulo que é revestido com o CBD da proteína da endolisina tal como descrito acima é mergulhado na amostra. O grânulo é mantido na amostra por um período de tempo a fim de capturar a quantidade máxima de bactérias. O grânulo é, então, transferido de volta para o tubo do aparelho e o meio é adicionado. O suporte sólido pode tanto ser incubado no meio para expandir o número de bactérias ou fago pode ser adicionado para iniciar o ciclo de infecção. Após o ciclo de infecção ser concluído, o substrato é adicionado e a amostra é lida em um luminômetro portátil. Sequências ilustrativas SEQ ID NO: 1 endolisina (YP_001468459)

MVKYTVENKIIAGLPKGKLKGANFVIAHETANSKSTIDNEVSYMTRNWKNAFVT HFVGGGGRVVQVANVNYVSWGAGQYANSYSYAQVELCRTSNATTFKKDYEVYCQLLVDL AKKAGIPITLDSGSKTSDKGIKSHKWVADKLGGTTHQDPYAYLSSWGISKAQFASDLAK VSGGGNTGTAPAKPSTPAPKPSTPSTNLDKLGLVDYMNAKKMDSSYSNRDKLAKQYGIA

NYSGTASQNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTSTAKKIYFPPNKGNWSVYPTNKAPVKA NAIGAINPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYEIQTDQFGRVQVYGAPSTGAVIKK* SEQ ID NO: 2 o domínio CBD da endolisina

YAYLSSWGISKAQFASDLAKVSGGGNTGTAPAKPSTPAPKPSTPSTNLDKLGLV DYMNAKKMDSSYSNRDKLAKQYGIANYSGTASQNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTST AKKIYFPPNKGNWSVYPTNKAPVKANAIGAINPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYEIQTDQF GRVQVYGAPSTGAVIKK

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a captura e detecção de tão pouco quanto um único microrganismo de interesse em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: incubar a amostra com uma pluralidade de sondas de detecção de microrganismo (MDPs) as quais se ligam ao microrganismo de interesse, em que a MDP compreende uma porção indicadora e um componente de ligação celular (CBC) sob condições de modo que o microrganismo se ligue à pluralidade de MDPs; separar as MDP não ligadas da MDP ligada à célula; e detectar a porção indicadora na MDP ligada à célula, em que a detecção positiva da porção indicadora indica que o microrganismo de interesse está presente na amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a pluralidade de MDPs ligada ao único microrganismo ser de pelo menos 1 x 106.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser específico para bactérias Gram-negativas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser específico para bactérias Gram-positivas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de a bactéria Gram-negativa ser uma Salmonella spp ou E. coli O157:H7.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de a bactéria Gram-positiva ser uma Listeria spp ou Staphylococcus spp.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,

CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser isolado a partir de uma endolisina ou uma espanina ou uma proteína de ligação ao receptor (RBP) específica para o microrganismo de interesse.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de a espanina ser uma espanina de membrana externa (RZ1) ou uma variante truncada da mesma.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de a RBP ser uma proteína da fibra da cauda ou uma variante truncada da mesma.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser isolado a partir de uma endolisina.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC isolado a partir de uma endolisina ser um domínio de ligação celular (CBD) ou uma variante truncada do mesmo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de um domínio de ligação apresentar ≥ 95 % de homologia para o CBC de pelo menos um dos seguintes bacteriófagos: fago de Salmonella SPN1S, fago de Salmonella 10, fago de Salmonella epsilon15, fago de Salmonella SEA1, fago de Salmonella Spn1s, fago de Salmonella P22, fago de Listeria LipZ5, fago de Listeria P40, fago de Listeria vB_LmoM_AG20, fago de Listeria P70, fago de Listeria A511, fago de Staphylococcus P4W, fago de Staphylococcus K, fago de Staphylococcus Twort, fago de Staphylococcus SA97, ou fago de Escherichia coli O157:H7 CBA120.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a separação compreender a captura do microrganismo de interesse em um suporte sólido.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido compreender pelo menos um de uma placa de múltiplos poços, um filtro, um grânulo, uma faixa de fluxo lateral, uma faixa filtrante, disco de filtro, e papel de filtro.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender uma etapa para lavar o microrganismo capturado, a fim de remover o excesso de MDP não ligado.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o microrganismo ligado à MDP estar fixado em um suporte sólido para exame por microscopia de fluorescência.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a MDP ser uma proteína recombinante ou uma proteína conjugada.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a porção indicadora compreender pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, ou uma enzima.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de a enzima compreender pelo menos uma de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase e uma glicosidase.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de a luciferase ser uma luciferase geneticamente projetada.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser uma amostra alimentar, ambiental, de água, comercial ou clínica.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o método detectar tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra compreender carne ou vegetais.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser não enriquecida antes da incubação com a pluralidade de MDPs.

26. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o tempo total para resultados ser menor do que 12 horas.

27. Sonda de detecção de microrganismo recombinante (MDP) CARACTERIZADA pelo fato de compreender um componente de ligação celular (CBC) e uma porção indicadora.

28. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de o CBC ser específico para bactérias Gram-negativas.

29. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de o CBC ser específico para bactérias Gram-positivas.

30. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação

27, CARACTERIZADA pelo fato de a bactéria Gram-negativa ser uma Salmonella spp ou E. coli O157:H7.

31. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de a bactéria Gram-positiva ser uma Listeria spp ou Staphylococcus spp.

32. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de o CBC ser isolado a partir de uma endolisina ou uma espanina ou uma RBP específica para o microrganismo de interesse.

33. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de a espanina ser uma espanina de membrana externa (RZ1) ou uma variante truncada da mesma.

34. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de a RBP ser uma proteína da fibra da cauda ou uma variante truncada da mesma.

35. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de o CBC ser isolado a partir da endolisina.

36. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de o CBC isolado a partir de uma endolisina ser um domínio de ligação celular (CBD) ou uma variante truncada do mesmo.

37. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de um domínio de ligação apresentar ≥ 95 % de homologia para o CBC de qualquer um dos seguintes bacteriófagos: fago de Salmonella SPN1S, fago de Salmonella 10, fago de Salmonella epsilon15, fago de Salmonella SEA1, fago de Salmonella Spn1s, fago de Salmonella P22, fago de Listeria LipZ5, fago de Listeria P40, fago de Listeria vB_LmoM_AG20, fago de Listeria P70, fago de Listeria

A511, fago de Staphylococcus P4W, fago de Staphylococcus K, fago de Staphylococcus Twort, fago de Staphylococcus SA97, ou fago de Escherichia coli O157:H7 CBA120.

38. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de a porção indicadora gerar um sinal intrínseco ou em que a porção indicadora compreende uma enzima que gera sinal após reação com substrato ou em que a porção indicadora compreende um cofator que gera sinal após reação com um ou mais componentes de produção de sinal adicionais.

39. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de a MDP ser um produto de gene recombinante ou uma proteína conjugada.

40. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de a porção indicadora compreender pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, e uma enzima.

41. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de a enzima compreender pelo menos um de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase, e uma glicosidase.

42. MDP recombinante, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADA pelo fato de a luciferase ser uma luciferase geneticamente projetada.

43. Método de preparação de uma MDP recombinante CARACTERIZADO pelo fato de compreender: gerar um CBC o qual é substancialmente idêntico a pelo menos um de um gene de endolisina, gene de espanina, ou gene da fibra da cauda de um bacteriófago de tipo selvagem ou grupo de bacteriófagos o qual infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um gene de fusão do CBC com uma porção indicadora, em que o produto da proteína de fusão é a MDP recombinante; transformar um vetor de expressão com o gene de fusão para sintetizar a MDP recombinante; e purificar a MDP recombinante.

44. Kit para a detecção de Listeria, Salmonella, Staphylococcus ou E. coli O157:H7 CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma MDP recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 29 a 45.

45. Kit, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender um substrato para reagir com uma porção indicadora da MDP.

46. Sistema para a detecção de Listeria, Salmonella, Staphylococcus ou E. coli O157:H7 CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma MDP recombinante.

47. Método para a detecção de um ou mais microrganismos de interesse em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: colocar em contato a amostra com um suporte sólido de um aparelho, em que o suporte sólido captura o um ou mais microrganismos na amostra, se presente, em que o aparelho compreende: um primeiro compartimento compreendendo bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido dentro de um genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; colocar em contato o bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento com a amostra de modo que o bacteriófago recombinante infecte o um ou mais microrganismos na amostra, produzindo, assim, o produto do gene indicador, e detectar o produto do gene indicador.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho ainda compreender um segundo compartimento compreendendo um substrato, e em que a detecção do produto do gene indicador é ao colocar em contato o produto do gene indicador com um substrato.

49. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido ser um grânulo.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 47 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido compreender polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS), ácido polilático (PLA) e cloreto de polivinila (PVC).

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 47 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido compreender uma ou mais moléculas de um componente de ligação celular (CBC), em que o CBC reconhece o um ou mais microrganismos de interesse na amostra.

52. Método, de acordo com a reivindicação 511, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser específico para bactérias Gram-negativas.

53. Método, de acordo com a reivindicação 511, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser específico para bactérias Gram-positivas.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de a bactéria Gram-negativa ser uma Salmonella spp ou E. coli O157:H7.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de a bactéria Gram-positiva ser uma Listeria spp ou Staphylococcus spp.

56. Método, de acordo com a reivindicação 511, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser isolado a partir de uma endolisina ou uma espanina ou uma proteína de ligação ao receptor (RBP) específica para o microrganismo de interesse.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de a espanina ser uma espanina de membrana externa (RZ1) ou uma variante truncada da mesma.

58. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de a RBP ser uma proteína da fibra da cauda ou uma variante truncada da mesma.

59. Método, de acordo com a reivindicação 511, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC ser isolado a partir de uma endolisina.

60. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de o CBC isolado a partir de uma endolisina ser um domínio de ligação celular (CBD) ou uma variante truncada do mesmo.

61. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho ainda compreender um segundo compartimento contendo um substrato, e em que o método ainda compreende: adicionar o substrato do segundo compartimento à amostra, simultaneamente com ou após a adição do bacteriófago recombinante.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 47 a 61, CARACTERIZADO pelo fato de o primeiro compartimento compreender uma vedação, e em que colocar em contato o bacteriófago recombinante com a amostra é por rompimento da vedação, em que o rompimento da vedação faz com que o bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento esteja em contato com a amostra e infecte o um ou mais microrganismos na amostra, produzindo, assim, o produto do gene indicador.

63. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago ser liofilizado.

64. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho compreender um terceiro compartimento contendo meio de crescimento.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, CARACTERIZADO pelo fato de o método compreender incubar o suporte sólido o qual tenha capturado o um ou mais microrganismos de interesse no meio de crescimento por um período de tempo antes da adição do bacteriófago recombinante.

66. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 65, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho compreender uma trava de parada para a mistura em fases do meio, o bacteriófago recombinante, e o substrato com a amostra.

67. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido ser seco antes de colocar em contato a amostra.

68. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido ser imerso em meio antes de colocar em contato a amostra.

69. Método, de acordo com a reivindicação 64, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido que tenha capturado o um ou mais organismos ser incubado com o meio de crescimento no terceiro compartimento antes de entrar em contato com o bacteriófago recombinante.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, CARACTERIZADO pelo fato de a incubação ser de 0 - 2 horas.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 47 a 70, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago ter sido colocado em contato com a amostra por

0.5 a 3 horas antes de detectar o produto do gene indicador.

72. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o produto do gene indicador compreender pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, e uma enzima.

73. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de a enzima compreender pelo menos um de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase, e uma glicosidase.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de a luciferase ser uma luciferase geneticamente projetada.

75. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser uma amostra alimentar, ambiental, de água, comercial ou clínica.

76. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de o método detectar tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.

77. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra compreender carne ou vegetais.

78. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser uma amostra alimentar, de água, de laticínios, ambiental, comercial ou clínica.

79. Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

80. Método para a detecção de um ou mais microrganismos de interesse em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: colocar em contato a amostra com um suporte sólido de um aparelho, em que o suporte sólido captura o um ou mais microrganismos na amostra, se presente, em que o aparelho compreende: um primeiro compartimento compreendendo a MDP conforme definida na reivindicação 1, colocar em contato a MDP a partir do primeiro compartimento com a amostra, e detectar o produto do gene indicador.

81. Sistema para a detecção de microrganismo de interesse em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender: um aparelho compreendendo: um primeiro compartimento compreendendo bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido dentro de um genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador;

em que o suporte sólido compreende um componente de ligação celular, e um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal pode detectar o produto do gene indicador produzido a partir da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante.

82. Sistema, de acordo com a reivindicação 81, CARACTERIZADO pelo fato de o componente de detecção de sinal ser um luminômetro portátil.